第10章 专题突破10 综合PCR的基因工程问题(教用Word)-【金榜题名】2026年高考生物一轮总复习

专题突破10　综合PCR的基因工程问题 高考目标定位 阐述常规PCR、重叠延伸PCR、荧光定量PCR等的过程与原理，举例说明不同的PCR技术有着不同的应用。 类型一　利用PCR技术获取目的基因 【基本模型】 　获取目的基因是基因工程操作的第一步。获取目的基因的方法有多种，现在常用PCR特异性地快速扩增目的基因。PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。该技术由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得了诺贝尔化学奖。 【典例突破】 1．“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。下列叙述错误的是(　　 ) A．第一轮复制得到2个DNA分子，即①②各一个 B．第二轮复制得到4个DNA分子，即①②③④各一个 C．第四轮复制得到16个DNA分子，其中有4个X基因 D．经五轮循环后产物中有五种不同的DNA分子 【答案】　C 【解析】　据图分析可知，第一轮复制形成2个DNA分子，即①②各一个，A正确；第二轮复制得到22＝4(个)DNA分子，即①复制得①和③、②复制得②和④，即得到①②③④各一个，B正确；第四轮复制得到16个DNA分子，其中有8个⑤(X基因)，C错误；经五轮循环后共形成32个DNA分子，其中①②各一个，③④各四个，22个⑤，故产物中有五种不同的DNA分子，D正确。 类型二　利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式 【基本模型】 　检测目的基因在受体细胞内是否稳定存在是基因工程操作的重要步骤，可以借助载体上的标记基因、PCR技术和核酸分子杂交技术等方法鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。在实际操作中，PCR技术不仅可以精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因，还可以通过引物的巧妙设计鉴定目的基因的连接方式。 【典例突破】 2．(2019·江苏，33节选)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是____________________。 【答案】　乙、丙　目的基因反向连接 【解析】　分析题图可知，理论上可以选择的引物组合有甲和丙、乙和丙两种情况。如果选择甲和丙这对引物，则无论目的基因是否正确插入，扩增的片段都是50＋300＋100＝450(bp)，不符合要求；如果选择乙和丙这对引物，正向连接和反向连接后所得结果不同，所以应选择乙和丙这对引物进行PCR鉴定。如果目的基因和质粒反向连接，则引物乙会出现在重组质粒的外侧，此时若加入引物甲和乙，则可以扩增出300＋100＝400(bp)的片段。 类型三　利用PCR技术引导基因定点突变 【基本模型】 　重叠延伸PCR技术是指在PCR技术的基础上，采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，通过重叠链的延伸，将不同来源的片段重叠拼接起来的一项新技术。该技术在基因的定点突变、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有着独特的应用。 【典例突破】 3．水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。 注：图中的引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点。 (1)由以上事例可知，要对蛋白质的结构进行改造，需要通过________________来完成。 (2)若拟突变位点的碱基对为A－T，则需要让其突变为______________才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为____________(假设引物为单链DNA)。 (3)在第一阶段获得2种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生____种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因为________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (4)利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起，设计基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在设计这4种引物时，特别要注意的问题是___________________________________________。 【答案】　(1)改造基因(或基因定点突变)　(2)T－A或C－G　A或G　(3)3　引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时会结合而失去作用　(4)M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段 【解析】　(2)若拟突变位点的碱基对为A－T，则需要让其突变为T－A或C－G，对应的密码子由AAU变成AAA或由AAC变成AAG，可使天冬酰胺替换为赖氨酸。(3)若两个反应系统均进行一次复制， 则会产生3种不同的DNA分子，因为引物1和4产生的DNA分子是一样的。(4)重叠互补引物的设计是重叠延伸PCR技术成功的关键。拼接基因M和N时，设计引物时需要注意的是，需要找到两种基因的重叠部分，即M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段。 类型四　利用PCR技术扩增未知基因序列 【基本模型】 　利用PCR技术进行基因扩增时，为了便于设计引物，要求目的基因两侧的序列是已知的。当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。 【典例突破】 4．(2020·江苏，33节选)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoR Ⅰ酶切为例)： 请据图回答问题： (1)步骤Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一种______________酶，它通过识别特定的________________切割特定位点。 (2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′－羟基与5′－磷酸间形成____________；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得__________________；Taq DNA聚合酶的作用是催化________________________________________________________________________。 (3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。 DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列) 已知 序列 PCR 引物 ①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′ ②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′ ③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′ ④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′ 【答案】　(1)限制性内切核酸(或限制)　核苷酸序列　(2)磷酸二酯键　DNA单链　以DNA为模板的DNA链的延伸　(3)②④ 【解析】　(3)PCR过程中，根据已知的DNA序列合成两个引物，要注意模板链和引物的方向是相反的，引物的核苷酸序列要能够和相应模板的核苷酸序列发生碱基互补配对，环状DNA图中显示PCR过程是从已知DNA序列的两端分别向相反方向形成子链，一个引物是与已知DNA序列的第一条链的左端互补结合，向右侧方向延伸形成子链，该引物是④，另一个引物是与已知DNA序列的第二条链的右端互补结合，向左侧方向延伸形成子链，该引物是②。 类型五　利用PCR技术快速检测病原体 【基本模型】 　病原体检测是诊断和控制传染病的重要手段，为迅速而准确地确定病原体的存在和种类，发展了许多快速检测方法。PCR技术是一种基于DNA扩增原理的快速病原体检测方法，它能够在几小时内扩增和检测极小量的病原体DNA，并且具备高度的特异性和敏感性。 【典例突破】 5．猴痘是由猴痘病毒(一种RNA病毒)感染所致的一种病毒性人畜共患病，临床上表现为发热、皮疹、淋巴结肿大等。猴痘病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。 (1)首先，从样本中提取病毒RNA，经________酶作用生成cDNA；然后以cDNA为模板进行实时荧光PCR扩增，测定样品中病毒核酸量。 (2)通过实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被Taq DNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到(如图1)。 ①当样本中有目的基因时，引物和探针与目的基因复性时，通过________________原则而特异性结合。 ②在PCR循环的延伸阶段，Taq DNA聚合酶催化子链的合成并水解探针。检测到的荧光强度与反应体系中DNA分子数呈__________(填“正相关”或“负相关”)关系。 (3)通过实时荧光PCR检测猴痘病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图2所示。 ①与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，原因可能有________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 ②Ct值的含义：在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就____________。 ③某新猴痘病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct>40或无Ct值判定为阴性。图2所示猴痘病毒核酸检测结果应判定为____________。 (4)(多选)阴性结果也不能排除猴痘病毒感染，可能产生假阴性的因素有____________。 a．取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR检测阈值 b．样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解 c．病毒发生变异 【答案】　(1)逆转录　(2)①碱基互补配对　②正相关　(3)①Taq DNA聚合酶活性下降、引物浓度下降、原料dNTP浓度下降　②越小　③阳性　(4)abc 【解析】　(1)由病毒RNA生成cDNA的过程属于逆转录，需要逆转录酶的催化。(2)①当样本中有目的基因时，引物和探针与目的基因复性时，通过碱基互补配对形成氢键而特异性结合。②在PCR循环的延伸阶段，Taq DNA聚合酶催化子链的合成并水解探针。根据题干信息“荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步”可知，检测到的荧光强度与反应体系中DNA分子数呈正相关关系。(3)①与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，有可能是底物浓度降低导致的，也有可能是酶的活性缓慢下降导致的。②样本中初始模板越多时，达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数就越少，Ct值就越小。③Ct≤37判定为阳性，Ct>40或无Ct值判定为阴性。图2中荧光阈值大概是36，猴痘病毒核酸检测结果应判定为阳性。(4)阴性结果也不能排除猴痘病毒感染，可能产生假阴性的因素有取样太早，样本中病毒量少，达不到实验时荧光PCR检测阈值；样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解，从而导致样本中病毒量少；病毒发生变异，检测不出来，从而出现假阴性。 学科网（北京）股份有限公司 $$