第十单元 小单元3 第1课时 基因工程的基本工具和基本操作程序-【金版教程】2026年高考生物一轮复习解决方案全书word（经典版 多选版）

学科网书城围 品牌书店·知名教辅·正版资源 b.ZxXk.c0m○ 您身边的互联网+教辅专家 小单元3 基因工程 第课时基因工程的基本工具和基本操作程序 1概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。 2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。 3.闸明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因 导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。4DNA的粗提取与鉴定。5DNA 片段的扩增及电泳鉴定。 知识自主梳理 基因工程的概念及基本工具 1.基因工程概念 (1)手段：按照supl(01)人们的愿望，通过supl(02)转基因等技术，赋予生物新的遗传特性。 (2)目的：创造出更符合人们需要的新的sup1(O3)生物类型和supl(04)生物产品。 (3)水平：supl(O5)分子水平。由于在DNA分子水平上进行设计和施工，因此又叫作 supI(O6重组DNA技术。 知识拓展基因工程的理论基础 ①基因是控制生物性状的遗传 外源基因在受 理论 物质的结构和功能单位 体细胞内表达基通 ②遗传信息的传递都邋猫中心 法则 ③生物界共用一套遣传密码 重组DNA: 载体+目的基同 (性状) ①DNA的蒸本组成单位都是四种 脱氧核苷酸 基因拼接 理论②DNA分子都遵循碱基互补配对 基础 原刘 3双链DNA分子的空间结构都是 规则的双螺旋结构 2.重组DNA技术的基本工具 (1)限制性内切核酸酶（简称：sup1(O7)限制酶） 学科网书城 品牌书店·知名教辅·正版资源 b.zxxk.com● 您身边的互联网+教辅专家 存在)主要存在于原核生物中 识别双链DNA分子的特定国核苷酸序列，并 作用 使每一条链中特定部位的圆磷酸二酯键断开 「一种限制酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸 特性序列，并且能在特定的位点上切割DNA分子 产生末端的种类)一回黏性末端和平末端 (2)DNA连接酶 ①作用：将限制酶切割下来的DNA片段supl(I1)拼接成新的DNA分子 ②类型 常用类型 E.coli DNA连接酶 T4DNA连接酶 来源 supl(12)大肠杆菌 T4噬菌体 “缝合”supl(I3)黏性末端和平末端。E,coli DNA连接酶连接平末端的效率远 功能 远低于T4DNA连接酶 结果 恢复被限制酶切开的supl(14)磷酸二酯键 (3)载体 ①种类：质粒（常用载体，是环状双链DNA分子、supl(15)噬菌体、动植物病毒等。 国有一个至多个限制酶切割位点 ②质粒 携带外源DNA片段的质粒进人受体细 胞后，能在细胞中进行☑自我复制， 特点 或整合到图受体DNA上，随受体DNA 同步复制 常有特殊的©标记基因，便于四重组 DNA分子的筛选 对受体细胞无害 ③作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。 二基因工程的基本操作程序 1,目的基因的筛选与获取 ()目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞supl(OI)性状或获得预期 sup1(02)表达产物等的基因。 2 学科网书城画 品牌书店·知名教辅·正版资源 b.ZXXk.com○ 您身边的互联网+教辅专家 (2)筛选合适的目的基因 从相关的已知sup1(O3)结构和功能清晰的基因中进行缔选是较为有效的方法之一。利用序列 数据库和序列比对工具进行筛选。 (3)目的基因的获取 ①人工合成目的基因。 ②常用supl(O4)PCR(聚合酶链式反应)特异性地快速扩增目的基因 在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸 PCR定义 序列进行大量复制的技术 PCR原理 DNAs\upl(O5)半保留复制 模板 supl(O6目的基因的两条链 原料 4种脱氧核苷酸 酶 耐高温的supl(O7DNA聚合酶 条件 小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链supl(O8)核酸。2 引物 种 在一定的缓冲溶液中进行：需要控制温度的变化 当温度supl(O9)超过90℃时，双链DNA解聚为单链 变性 多红mm多 190-95℃ 3-m5'5'-3 温度下降到supl1O)50℃左右时，两种引物通过supl(11)碱基互补配对 PCR 与两条单链DNA结合 反应 复性 过程 r55'T 引物1 引物1 72℃左右时，在sup1(12)耐高温的DNA聚合酶作用下，从引物3'端开始 延伸 进行互补链的合成 aIr多Tm山T 引物1 引物Ⅱ 扩增 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,而只能从引物的3端延伸DNA链， 方向 即DNA的合成方向，总是从子链的supl(13)5'端向3'端延伸 方式 指数形式扩增（约为2”，n为扩增循环的次数） 3 学科网书城围 品牌书店·知名教辅·正版资源 5.ZxXk.com● 您身边的互联网+教辅专家 结果 supl(14)短时间内大量扩增目的基因 产物鉴定 琼脂糖凝胶电泳 知识拓展 L.在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作为合成DNA 子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。 2.引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物 ,一般为RNA片段。 3.真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添 加Mg2+。 ③还可以通过构建基因文库来获取目的基因。 2.基因表达载体的构建一基因工程的核心工作 (1)操作目的 使目的基因在受体细胞中supl(15)稳定存在，并且supl(16遗传给下一代，同时，使月的基 因能够supl(17)表达和发挥作用。 (2)基因表达载体组成 目的基因：编码蛋白质的基因或具有 调控作用的因子 位置：基因的9上游 8启 功能：是四RNA聚合酯识别 动子 和结合的部位，驱动基 因的网转录 「位置：基因的☒下游 复制 ☑终 原点 止 功能：团BNA聚合酶脱离部 位，终止②阿转录 团标记基因：鉴别受体细胞中是否含有团目的基因 (3)构建过程 学科网书城围 品牌书店·知名教辅·正版资源 b.zxxk.com 您身边的互联网+教辅专家 限制酶切割位点 启动子终止子 目的基因一 质粒 复制 原点 ·限制酶切割位点 网标i记 限制酶 基因 了四限制酸 获取目的基因 @DNA连接 酵D 重组 DNA 分子 3.将目的基因导入受体细胞 细胞类型 方法 原理/操作步骤 ①可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入supl(31)子 花粉管 房中： 通道法 ②可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在 supl(32)花柱切面上，使目的基因借助supl(33)花粉管通道进入胚囊 植物细胞 农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Tⅰ质粒上的 农杆菌 supl(34)TDNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合 转化法 到该细胞的supl(35)染色体DNA上。如果将目的基因插入Ti质粒的 TDNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞 \s\up1(3 动物细胞 6显微 将含有目的基因的表达载体提纯一→取卵（受精卵）一→显微注射一受精卵 (受精卵 注射技 发育一获得具有新性状的动物 术 微生物细 Ca2+处 用supl(37)Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 胞（原核 理法 分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中 细胞) 4目的基因的检测与鉴定 5 学科网书城 品牌书店·知名教辅·正版资源 b.ZXXk.com● 您身边的互联网+教辅专家 目的基因转 mRNA 翻 蛋白质 个体 是否插入录 译 检测 检测 检测 检测 抗原一抗 PCR等技术 抗虫、抗病 体杂交 接种实验等 分子水平检测 个体生物学 水平鉴定 三实验 1.DNA的粗提取与鉴定 (1)基本原理 ①提取原理：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在supl(O1)物理和化学性质方面存在差异，可以 利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。例如，DNA不溶于supl(O2) 酒精，但某些蛋白质溶于supl(O3)酒精；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能 溶于2molL-1的supl04)NaC溶液。 ②鉴定原理：在一定温度下，DNA遇s\upl(O5)二苯胺试剂会呈现蓝色。 (2)实验步骤（以洋葱为例 研磨材料 洋葱切碎，加丽研磨液充分研磨 获取含DNA 过滤（纱布），4℃冰箱中静置后取上 的滤液 清液。或直接离心取☑上清液 在上清液中加入体积相等的体积分数 为☒95%的预冷的酒精，静置2-3mim DNA的析出 后用玻璃棒沿四一个方向搅拌，卷起 丝状物。或离心取沉淀物 溶解DNA 将丝状物或沉淀物溶解在四2mol/L的 NaCl溶液中 在溶有DNA的溶液中加人四二苯胺试 DNA的鉴定 剂，混合均匀后，将试管置于沸水中 加热☑5min,待试管冷却后，可观察 到明显的颜色反应（变成图蓝色） 特别提醒 1.加入酒精后用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加别DNA分子的断裂，导致DNA分子 不能形成丝状沉淀。 2.本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞 6 学科网书城 品牌书店·知名教辅·正版资源 b.zxxk.com 您身边的互联网+教辅专家 核（无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。 2.DNA片段的扩增及电泳鉴定 (I)PCR仪 PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。 (2)电泳鉴定PCR产物的原理 ①PCR原理：利用了DNA的热变性原理。 ②电泳 DNA分子具有可解离的基团，在一定的supl(I4)pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。 在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相supl(I5)反的电极移动，这个过程就 是电泳。 ③鉴定原理 PCR的产物一般通过supl(I6)琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与 supl(IT)凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以 在波长300nm的紫外灯下被检测出来。 (3)实验步骤 ①PCR实验操作步骤 用微量移液器按照配方或PCR试剂盒的说 移液 明书.向微量离心管中依次加入各组分 待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖 离心 子。将微量离心管放入离心机里，离心约 0s,使反应液集中在管的底部 设置好PCR仪的循环程序，将装有反应液 反应 的微量离心管放入PCR仪中进行反应 ②DNA的电泳鉴定 7 学科网书城围 品牌书店·知名教辅·正版资源 b.zxxk.com 您身边的互联网+教辅专家 琼脂糖凝胶制备：根据待分高DNA片段的大 小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液（一股质 量分数为0.8%~12%)。熔化琼脂糖，稍冷 却后，加入适量的核酸染料混匀 凝胶板制备：将温热的琼脂糖溶液倒人模具， 插人梳子形成加样孔，凝胶溶液完全凝固后 拔出梳子，将凝胶放入电泳槽内 电 泳 点样：加电泳缓冲液，没过凝胶1mm为宜。 鉴 然后用微量移液器将扩增得到的PCR产物与 定 凝胶载样缓冲液（内含指示剂）的混合液注人 加样孔，留一孔加标准参照物 电泳：接通电源，设定好电压，一般为1-5 Vlem,进行电泳。待指示剂前沿迁移接近凝 胶边缘时，停止电泳 观察：取出凝胶置于网紫外灯下观察和照相 (4)注意事项 ①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用 前必须进行supl(19)高压灭菌处理。 ②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在sup1(20)一20℃储 存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 ③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 ④在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 易错判断 1.DNA连接酶可以连接目的基因与载体的氢键，形成重组DNA。(×) 2.质粒通常采用抗生素合成基因作为标记基因。(×) 3.目的基因一定是编码蛋白质的基因。(×) 4.基因表达载体中的启动子和终止子决定着翻译的开始与结束。(×) 5.Ti质粒上的TDNA可与植物受体细胞的染色体DNA整合在一起。（√） 6.为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。(×) 7.检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原—抗体杂交技术。(×) 8.基因工程中所用的质粒大都是天然质粒，在受体细胞中自我复制。(X) 9.限制酶只能用于切割目的基因。(×) 学科网书城 品牌书店·知名教辅·正版资源 b.ZxXk.c0m○ 您身边的互联网+教辅专家 10.若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性内切核酸酶，则一定有利于该重组质 粒进入受体并保持结构稳定。(×) 11.载体质粒的标记基因可以有一个或多个。（√） 12.用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物。（√） 13.PCR中加热到50℃左右的目的是在Tag DNA聚合酶作用下合成子链。(X) 14.农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物常采用的方法。（√） 15.通过接种病原体对转基因的植株进行抗病性鉴定。（√） 16.只有用相同的限制酶处理含目的基因的DNA片段和质粒，才能形成重组质粒。(×) 17.构建重组质粒时，使用两种限制酶可避免质粒和目的基因的环化，还能避免目的基因与 质粒反向连接。（√） 18.将基因表达载体导入小鼠的受精卵中常用显微注射法。（√） 19.只要目的基因进入受体细胞就能实现表达。(×) 20.限制酶能够识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的氢键 断开。(×) 21.DNA连接酶是将单个脱氧核苷酸连接在已有DNA片段上的酶。(×) 22.引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。（√） 23.启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了 它才能驱动DNA的复制过程。(×) 24.构建基因表达载体是基因工程的核心工作。（√） 25.转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。（√） 26.“DNA的粗提取与鉴定”实验中，过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA 降解。（√） 27.在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，离心研磨液是为了加速DNA的沉淀。(X) 28.用二苯胺试剂鉴定DNA时，溶液蓝色深浅反映DNA含量的多少。（√） 29.粗提取的DNA溶于2 mol/L NaC1溶液中，加入二苯胺试剂后显蓝色。(×) 30.凝胶中的DNA分子通过染色，可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。（√） 31.电泳时，应有一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。（√） 32.以新鲜洋葱为材料进行DNA粗提取实验，若研磨、过滤不充分，则会直接影响提取的 DNA量。（√） 9 学科网书城 品牌书店·知名教辅·正版资源 b.ZxXk.com● 您身边的互联网+教辅专家 33.DNA粗提取所依据的原理是加入体积分数为7O%的冷酒精，DNA会从溶液中析出。( ×) 经典考题训练 考向一结合基因工程所需工具酶和载体，考查科学思维能力 [例1](2023新课标，6)某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具， 将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组 表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 5-GAATTC-3'5'-GGATCC-3 3-CTTAAG-5'3-CCTAGG-5 32酵1 南1 2 抗生素 4 抗性基因 5-CCCGGG-3 5'-AGATCT-3 3-GGGCCC-5'3'-TCTACA-5' 南3 商 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是( ) A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA连接酶连接 C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA连接酶连接 D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 答案：C 解析：用酶3切割质粒和目的基因产生的是平末端，而E.coli DNA连接酶连接平末端的效率 低，A错误；用酶1切割目的基因，产生的是黏性末端，用酶3切割质粒，产生的是平末端， 无法连接，B错误：质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用T4DNA连接酶连接， 使目的基因定向插到质粒中，C正确：酶2和酶4切割后产生的黏性末端相同，易导致目的 基因和质粒自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，并且用酶4切割会破坏标记基因， D错误。 [例2]（多选）第三代疫苗一DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因（如图甲）插入到适 宜的质粒（如图乙）中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直 接诱导机体免疫应答，且可持续一段时间。限制性内切核酸酶的切点分别如图所示。下列分 析错误的是() 10