第10单元 小单元3 第37讲 基因工程的基本工具和基本操作程序-【金版教程】2026年高考生物一轮复习创新方案课件PPT（创新版 不定项版）

　　　　　　　　　　　　　 第十单元　生物技术与工程 小单元3　基因工程及生物技术的安全性和伦理问题 第37讲　基因工程的基本工具和基本操作程序 1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。3.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。4.DNA的粗提取与鉴定。5.DNA片段的扩增及电泳鉴定。 2 目录 CONTENTS 02 考点二 01 考点一 03 考点三 04 跨章节知识联系 05 课时作业 1．(2023·重庆，12)某小组通过PCR[假设引物长度为8个碱基(短于实际长度)]获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(如图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是(　　) A．其中一个引物序列为5′－TGCGCAGT－3′ B．步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得 了2个片段 D．酶切片段和载体连接时，可使用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶 4 解析：由于引物只能引导子链从5′到3′合成，分析图中扩增获得的DNA片段可知，其中一个引物序列为5′－TGCGCAGT－3′，A正确；根据三种限制酶的识别序列和酶切后的DNA片段两侧的黏性末端可知，步骤①所用的酶是NheⅠ和CfoⅠ，B错误；用步骤①的两种酶对载体进行酶切，至少切断2处，切割之后至少获得了2个片段，C正确；图中形成的是黏性末端，E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶都能连接黏性末端，D正确。 5 2．(2023·全国乙卷，38，改编)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题： (1)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体，其模式图如图所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为________；②为________，其作用是______________________ ______________________；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是_____________________________________________________________________。 终止子 启动子 被RNA聚合酶识别并结合，驱动GFP突变基因的转录 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来 6 (2)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是___________________________________ ___________________________(答出1点即可)。 (3)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是______________________________ _____________________________________________________________。 密码子具有简并性，GFP基因突变后编码的蛋白质与突变前相同 获取YFP基因并构建基因表达载体，之后将基因表达载体导入真核细胞，检测其是否会发黄色荧光 7 解析：(1)一个基因表达载体的组成，除了目的 基因外，还必须有启动子、终止子以及标记基因等。 启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的 首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它 才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。终止子相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停止下来。终止子位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNA短片段。标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来，该题中的氨苄青霉素抗性基因就可以作为这种基因。 8 (2)结合题中信息可知，将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现有的大肠杆菌发绿色荧光，即GFP蛋白的荧光颜色，推测发绿色荧光的可能原因是密码子具有简并性，GFP基因突变后编码的蛋白质与突变前相同。 (3)欲通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，可通过基因工程的方法将目的基因导入真核细胞，之后检测真核细胞是否发黄色荧光，如果发黄色荧光，则可证明YFP基因能在真核细胞中表达，否则，不能证明YFP基因能在真核细胞中表达。 9 01 考点一 1．基因工程概念 (1)概念 指按照人们的愿望，通过_______等技术，赋予生物新的__________，创造出更符合人们需要的新的___________________。从技术操作层面看，由于基因工程是在______________上进行设计和施工的，因此又叫_______________。 (2)原理：__________ (广义)。 (3)操作环境：生物体外。 转基因 遗传特性 生物类型和生物产品 DNA分子水平 重组DNA技术 基因重组 考点一　基因工程的基本工具 11 2．重组DNA技术的基本工具 (1)限制性内切核酸酶——分子手术刀 原核生物 核苷酸序列 磷酸二酯键 黏性末端或平末端 考点一　基因工程的基本工具 12 (2)DNA连接酶——分子缝合针 磷酸二酯键 大肠杆菌 黏性末端 考点一　基因工程的基本工具 13 (3)基因进入受体细胞的载体——分子运输车 环状双链DNA分子 考点一　基因工程的基本工具 14 一个至多个 便于重组DNA分子的筛选 考点一　基因工程的基本工具 15 下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　) A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 [例1]　(2023·新课标卷，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。 考点一　基因工程的基本工具 16 解析：用酶3切割质粒和目的基因产生的是平末端，而E.coli DNA连接酶连接平末端的效率低，A错误；用酶1切割目的基因，产生的是黏性末端，用酶3切割质粒，产生的是平末端，无法连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用T4 DNA连接酶连接，使目的基因定向插到质粒中，C正确；酶2和酶4切割后产生的黏性末端相同，易导致目的基因和质粒自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，并且用酶4切割会破坏标记基因，D错误。 考点一　基因工程的基本工具 17 如表是外源基因插入(插入点有a、b、c)后细菌的生长情况。下列有关叙述正确的是(　　) 项目 细菌在含氨苄青霉素的培养基上生长情况 细菌在含四环素的培养基上生长情况 ① 能生长 不能生长 ② 能生长 能生长 ③ 不能生长 能生长 [例2]　(不定项)质粒是基因工程中最常用的载体，质粒有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。质粒上箭头表示三种限制酶的酶切位点。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同。 考点一　基因工程的基本工具 18 A.质粒的复制原点上有RNA聚合酶的结合位点 B．①②③三种转基因细菌的外源基因插入点①是a， ②是c，③是b C．质粒被一种限制酶切开时，被断开的磷酸二酯键有2个 D．将外源基因与质粒连接时需用DNA连接酶 解析：质粒的复制原点上有DNA聚合酶的结合位点，A错误；①②③三种转基因细菌的外源基因插入点①是b，②是c，③是a，B错误；将外源基因与质粒连接时需用DNA连接酶，D正确。 考点一　基因工程的基本工具 19 1．与DNA有关的几种酶的比较 考点一　基因工程的基本工具 20 2．基因工程的理论基础 考点一　基因工程的基本工具 21 3．图解限制酶的选择原则 (1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶， 以使将目的基因“切出”，如图可选择PstⅠ。 ②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶， 防止破坏目的基因，如图不能选择SmaⅠ。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种限制酶的切割位点，而且这两种限制酶切割后不会完全破坏标记基因)。 考点一　基因工程的基本工具 22 (2)根据质粒的特点确定限制酶的种类 考点一　基因工程的基本工具 23 (3)根据Ti质粒的T­DNA片段选择限制酶，图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。 考点一　基因工程的基本工具 24 (1)根据美西螈CD14基因的核苷酸序列，合成引物，利用PCR扩增CD14片段。已知DNA聚合酶催化引物的3′－OH与加入的脱氧核苷酸的5′－P形成磷酸二酯键，则新合成链的延伸方向是_______(填“5′→3′”或“3′→5′”)。 [例3]　(2022·福建，21，改编)美西螈具有很强的再生能力。研究表明，美西螈的巨噬细胞在断肢再生的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制，科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14的单克隆抗体，其中利用基因工程制备抗原的具体方法如下。回答下列问题： 5′→3′ 考点一　基因工程的基本工具 25 (2)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切序列如图所示。用XhoⅠ和SalⅠ分别酶切CD14和载体后连接，CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA。可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，理由是_____________________________________________________________________ _______________________________________________________________________。 (3)培养能表达CD14蛋白的大肠杆菌， 分离纯化目的蛋白。 正向连接的重组DNA有这两种酶的酶切位点(限制酶的识别序列)；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点(没有限制酶的识别序列) 考点一　基因工程的基本工具 26 解析：(1)PCR扩增过程中，引物链的延伸方向为5′→3′。 (2)两种酶虽然能切出相同的黏性末端，但正向连接的重组DNA，限制酶的识别序列没有变，仍能用原来的两种酶进行酶切；反向连接的重组DNA，不存在XhoⅠ和SalⅠ两种限制酶的识别序列，无法再进行酶切。 考点一　基因工程的基本工具 27 持续一段时间。限制性内切核酸酶的切点分别是BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析正确的是(　　) A．构建DNA疫苗时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒 B．图乙中只用EcoRⅠ切割后的质粒，含有1个游离的磷酸基团 C．用EcoRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，只产生1种连接产物 D．抗原基因在体内表达时需要解旋酶 [例4]　第三代疫苗——DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因(如图甲)插入到适宜的质粒(如图乙)中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答，且可 考点一　基因工程的基本工具 28 解析：质粒是环状DNA分子，其上只有一个EcoRⅠ的切点，因此被EcoRⅠ切割后，质粒变为线性双链DNA分子，因每条链上含有一个游离的磷酸基团，因此切割后含有两个游离的磷酸基团，B错误；基因表达包括转录和翻译，转录时不需要解旋酶，在RNA聚合酶的作用下，DNA即可解旋，D错误。 考点一　基因工程的基本工具 29 考点二 02 1．目的基因的筛选与获取 (1)筛选合适的目的基因 ①目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变_____________或获得______________等的基因。主要是指____________的基因。 ②筛选目的基因的方法：从相关的已知_____________清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 受体细胞性状 预期表达产物 编码蛋白质 结构和功能 考点二　基因工程的基本操作程序 31 (2)获取目的基因的方法 ①人工合成目的基因。 ②通过构建基因文库获取。 ③常用_______特异性地快速扩增目的基因。 PCR DNA半保留复制 目的基因的核苷酸序列 考点二　基因工程的基本操作程序 32 4种脱氧核苷酸 耐高温的DNA聚合酶 短单链核酸 2种 3′端 考点二　基因工程的基本操作程序 33 90 ℃ 50 ℃ 72 ℃ 考点二　基因工程的基本操作程序 34 指数 琼脂糖凝胶电泳 考点二　基因工程的基本操作程序 35 [归纳总结]DNA体内复制与体外复制(PCR技术)条件的比较 PCR技术 DNA复制 相同点 原则 碱基互补配对 条件 DNA母链作为模板、引物(体内引物RNA、体外引物DNA)、4种脱氧核苷酸为原料 延伸方向 新链都是从5′端向3′端延伸 考点二　基因工程的基本操作程序 36 不同点 解旋方式 90 ℃以上高温解旋 解旋酶催化 场所 PCR扩增仪 主要在细胞核 延伸用酶 耐高温的DNA聚合酶 DNA聚合酶 温度 控制温度，需要在不同温度下进行 体内温和条件 过程 结果 大量的DNA片段(目的基因) 形成完整的子代DNA　 考点二　基因工程的基本操作程序 37 2．基因表达载体的构建 (1)构建基因表达载体的目的 ①使目的基因在受体细胞中__________，并且可以______给下一代。 ②使目的基因能够______和发挥作用。 稳定存在 遗传 表达 考点二　基因工程的基本操作程序 38 (2)基因表达载体的组成 RNA聚合酶 转录 考点二　基因工程的基本操作程序 39 (3)基因表达载体的构建过程 考点二　基因工程的基本操作程序 40 3．将目的基因导入受体细胞 (1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内_______________的过程。 (2)过程 维持稳定和表达 生物类型 方法 受体细胞 过程 植物 花粉管通道法 — 可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊 考点二　基因工程的基本操作程序 41 植物 农杆菌 转化法 体细胞或受精卵 将目的基因插入到农杆菌Ti质粒的T­DNA片段上→转入农杆菌→用农杆菌侵染植物细胞→目的基因整合到植物细胞染色体DNA上→目的基因表达 动物 _______________ ________ 提纯含目的基因的表达载体→取卵(受精卵)→显微注射→胚胎早期发育，移植→获得具有新性状的动物 微生物 Ca2＋处理法 _________ Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中__________的生理状态→基因表达载体导入 显微注射法 受精卵 原核细胞 DNA分子 考点二　基因工程的基本操作程序 42 4.目的基因的检测与鉴定 PCR 抗原—抗体 抗性接种 考点二　基因工程的基本操作程序 43 1．信息获取与加工 [例1]　(2023·湖北，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落 考点二　基因工程的基本操作程序 44 解析：若用HindⅢ酶切质粒和含有目的基因的DNA片段，用DNA连接酶将两者连接成重组质粒，目的基因和质粒有正向连接和反向连接两种连接形式，因此，目的基因转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，会破坏氨苄青霉素抗性基因， 在含Tet(四环素)培养基中的菌落可能是含有目的基因的重组质粒，也可能是质粒自身连接的普通质粒，因此，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；若用SphⅠ酶切，由于重组质粒和普通质粒的碱基对数不同，因此可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；若用SphⅠ酶切，会破坏四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因不受影响，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，不能在含Tet(四环素)的培养基中形成菌落，D错误。 考点二　基因工程的基本操作程序 45 2．模型建构 [例2]　(2022·辽宁，12)抗虫和耐除草剂玉米双抗12­5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据，采用PCR方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是(　　) A．预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制 B．后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分 C．延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制 D．转基因品种经检测含有目的基因后即可上市 考点二　基因工程的基本操作程序 46 解析：预变性的温度为94 ℃，在这个温度下，双链DNA解旋为单链，但模板链不易和引物结合，不能进行复制，A错误；延伸的目的是合成新的子链，后延伸延长了延伸时间，使目的基因的扩增更加充分，B正确；延伸过程需要引物与模板链结合，使DNA聚合酶在引物的3′端加上相应的脱氧核苷酸，C错误；转基因品种经检测含有目的基因且已经表达使生物体表现出相应性状后，还需要经过系列的安全性评价，符合相应标准后才能上市，D错误。 考点二　基因工程的基本操作程序 47 3．逻辑推理与论证 [例3]　(不定项)某一质粒如图所示，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因。有人将此质粒用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化后得到多种大肠杆菌，并利用培养基乙和丙筛选出导入重组质粒的大肠杆菌。下列叙述正确的是(　　) 注：影印接种指用灭菌后的“印章”在培养基中轻按一下， 将乙中菌落按相同位置接种到培养基丙。 A．如图所示的质粒中还应含有复制原点和终止子等结构 B．将经转化处理后的大肠杆菌菌液接种至培养基乙使用 的是稀释涂布平板法 C．配制培养基乙时应加入氨苄青霉素 D．培养基丙中生长的菌落即为导入重组质粒的大肠杆菌 考点二　基因工程的基本操作程序 48 解析：如图所示的质粒中还应含有复制原点、启动子和终止子等结构，A正确；由培养基乙中菌落的分布，可推测培养基乙的接种方法为稀释涂布平板法，B正确；由于用BamHⅠ酶切并插入目的基因后，四环素抗性基因被破坏，因此含空白质粒的大肠杆菌有两种抗性，含重组质粒的大肠杆菌只有氨苄青霉素抗性， 培养基乙中应加入氨苄青霉素，含有空白质粒或含有重组质粒的大肠杆菌可以生长，将乙中的菌落影印至含四环素的培养基丙中，含重组质粒的大肠杆菌不能生长，这样培养基乙上能生长而培养基丙上不能生长的菌落即为导入重组质粒的大肠杆菌，C正确，D错误。 考点二　基因工程的基本操作程序 49 如何筛选出含有目的基因的受体细胞 (1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如下图，目的基因插入四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。 (2)被转化的细菌有三种：含自身环化目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。 考点二　基因工程的基本操作程序 50 (3)筛选方法：将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含重组质粒的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。 考点二　基因工程的基本操作程序 51 4．科学探究 [例4]　(2023·全国甲卷，38，改编)接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题： (1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是____________ _________________________________________________________________________________________________。 重组乙肝疫苗的主要成分是乙肝病毒表面抗原，由于不含乙肝病毒的遗传物质，接种该疫苗不会在人体中产生乙肝病毒 考点二　基因工程的基本操作程序 52 (2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是_______________________________________________________ ____________________________________________。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是____________。 (3)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。__________________________________________________________ ________________________。 鉴别受体细胞(酵母菌)中是否含有目的基因(乙肝病毒表面抗原基因)，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来 RNA聚合酶 从转基因酵母菌中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，观察是否有杂交带出现。 考点二　基因工程的基本操作程序 53 解析：(3)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，应从转基因酵母菌中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已表达出蛋白质。 考点二　基因工程的基本操作程序 54 5．长句表达 [例5]　(2025·八省联考内蒙)在人胰岛素A链基因前端加入甲硫氨酸编码序列，置于β－半乳糖苷酶基因(不含终止编码序列)末端，插入到质粒中，并转化大肠杆菌(缺失内源性β－半乳糖苷酶基因)，经培养、切割和纯化等得到成熟胰岛素A链，回答下列问题： (1)使用限制酶________和________对质粒和插入DNA片段进行切割。 (2)在转化大肠杆菌前，一般先用______处理大肠杆菌细胞，使其处于容易吸收重组DNA分子的生理状态。 HindⅢ BamHⅠ Ca2＋ 考点二　基因工程的基本操作程序 55 (3)重组DNA分子在大肠杆菌中开始转录时，RNA聚合酶首先结合的位点是________。 (4)将经过转化的大肠杆菌涂布在含氨苄青霉素和X－gal的培养基中培养，若观察到____色菌落，可以确定大肠杆菌成功表达胰岛素A链，原因是________________________________________________________________________________________________________________________。另一种颜色的菌落中可能不含重组DNA分子，在不考虑突变的情况下，这些菌落不含重组DNA分子的原因是__________________。 启动子 蓝 大肠杆菌缺失内源性β－半乳糖苷酶基因，而导入成功后含有内源性β－半乳糖苷酶基因，表达出的β－半乳糖苷酶分解X－gal产生蓝色 导入的是普通质粒 考点二　基因工程的基本操作程序 56 (5)溴化氰可以在甲硫氨酸残基C端切割肽链，成熟的人胰岛素A链不含甲硫氨酸残基。使用溴化氰在甲硫氨酸残基C端切割的目的是________________________________ _____________________________________________。 切割β－半乳糖苷酶和胰岛素A链结合而成的融合蛋白，获得成熟的人的胰岛素A链 考点二　基因工程的基本操作程序 57 解析：(1)据图分析，EcoRⅠ和EcoRⅤ都会破坏目的基因，故不能选择，且SacⅠ不在启动子和终止子之间，也不能选择，则目的基因左侧只能选择BamHⅠ，右侧应选择HindⅢ，故使用限制酶BamHⅠ和HindⅢ对质粒和插入DNA片段进行切割。 (3)启动子是RNA聚合酶识别与结合的位点，可用于驱动基因的转录，故重组DNA分子在大肠杆菌中开始转录时，RNA聚合酶首先结合的位点是启动子。 (4)大肠杆菌缺失内源性β－半乳糖苷酶基因，若导入成功，则重组质粒中含有β－半乳糖苷酶基因，表达出的β－半乳糖苷酶分解X－gal产生蓝色；由于导入率并非100%，另一种颜色(白色)的菌落中导入的是普通质粒。 考点二　基因工程的基本操作程序 58 [例6]　锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2＋的功能。为研究该植物某种锌转运蛋白与吸收Zn2＋相关的生物学功能，通过基因工程对锌吸收缺陷型酵母进行转化。回答下列问题： (1)扩增锌转运蛋白基因时，以该植物_________为材料提取并纯化mRNA，通过________合成cDNA，设计引物进行PCR扩增，PCR完成以后产物通常采用________________来鉴定。 根部细胞 逆转录 琼脂糖凝胶电泳 考点二　基因工程的基本操作程序 59 (2)为便于锌转运蛋白基因与质粒连接，需在PCR引物的______端加上限制酶识别序列，且两种引物含不同的限制酶识别序列，主要目的是为了防止构建基因表达载体时出现_____________________________________________________(答出一点即可)。为保证锌转运蛋白基因的表达，常利用酵母质粒作为载体，并借助质粒上原有基因的________________，并将目的基因插入在它们之间。 (3)酵母菌转化，取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，活化、培养后用重组表达载体转化酵母菌。转化前一般用醋酸锂处理酵母菌细胞，目的是______________________，通过___________________检测目的基因在受体细胞中表达锌转运蛋白水平的高低。 5′ 目的基因自身环化；质粒的自身环化；目的基因的反向连接 启动子与终止子 使细胞易于吸收外源DNA 抗原—抗体杂交法 考点二　基因工程的基本操作程序 60 (4)已知锌吸收缺陷型酵母增殖较慢，通过设置一个固体培养基来鉴定转化酵母是否赋予了锌吸收特性。配制含适量Zn2＋的(酵母菌)固体培养基、灭菌，分成a、b两半区域，a区接种涂布少量的缺陷型酵母，b区接种涂布少量的转化酵母，在适宜的条件下培养一段时间后，如何判断有转化成功的酵母？______________________________。 b区有些菌落明显大于a区的菌落 考点二　基因工程的基本操作程序 61 解析：(1)锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，所以以该植物的根为材料提取并纯化mRNA，逆转录合成cDNA。PCR完成以后产物通常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 (2)PCR过程中，由于DNA子链是从引物的3′端开始延伸，因此在设计引物时，只能在两条引物的5′端加上限制酶识别序列。两种引物含不同的限制酶识别序列，主要目的是为了防止构建基因表达载体时出现目的基因自身环化、质粒的自身环化或目的基因的反向连接。要将锌转运蛋白基因插入到质粒的启动子和终止子之间，才能保证锌转运蛋白基因的表达。 考点二　基因工程的基本操作程序 62 (3)转化前一般用醋酸锂处理酵母菌细胞，目的是改变细胞膜的通透性，使细胞易于吸收外源DNA。可采用抗原—抗体杂交法检测目的基因在受体细胞中表达锌转运蛋白水平的高低。 (4)配制含适量Zn2＋的(酵母菌)固体培养基、灭菌，分成a、b两半区域，a区接种涂布少量的缺陷型酵母，b区接种涂布少量的转化酵母，由于锌吸收缺陷型酵母增殖较慢，转化成功的酵母赋予了锌吸收特性后增殖较快，在适宜的条件下培养一段时间后，b区有些菌落明显大于a区的菌落。 考点二　基因工程的基本操作程序 63 [例7]　(2024·湖南，21，改编)百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题： (1)体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前，先用_________________去除细胞壁获得原生质体，使原生质体融合，得到杂种细胞后，继续培养，常用____________________(填植物激素名称)诱导愈伤组织形成和分化，获得完整的杂种植株。 纤维素酶和果胶酶 生长素和细胞分裂素 考点二　基因工程的基本操作程序 64 (2)单倍体育种。常用_______________的方法来获得单倍体植株，鉴定百合单倍体植株的方法是______________________________________ ______________。 (3)基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。 花药离体培养 利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目 考点二　基因工程的基本操作程序 65 ①研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取目的片段，首先选用_________________酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草(P1、P2和P3)进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知，三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中__________的诱导作用最强。 HindⅢ和BamHⅠ 交链格孢 考点二　基因工程的基本操作程序 66 ②现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路：______________________________________________ _________________________。 利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL 考点二　基因工程的基本操作程序 67 解析：(1)植物细胞细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，因此获得原生质体的方法是用纤维素酶和果胶酶对植物细胞进行处理。原生质体融合后形成杂种细胞，给予适宜的条件培养杂种细胞，并添加生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织形成和分化，从而获得完整的杂种植株。 (2)获得单倍体植株的常用方法是花药(花粉)离体培养；鉴定百合单倍体植株的方法是利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目，如果染色体数目为百合植株根尖有丝分裂中期的一半，则获得的植株为单倍体植株。 考点二　基因工程的基本操作程序 68 (3)①根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，若要获得pL并将其连接到质粒上，可选用限制酶HindⅢ、BamHⅠ进行酶切，以替换Ti质粒中的启动子，从而达到根据GUS酶活性反映病原微生物对启动子pL活性的影响的目的。根据图c的结果可知，交链格孢处理的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高，可确定其诱导作用最强。②欲提高百合B中L基因的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，可利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL。 考点二　基因工程的基本操作程序 69 考点三 03 1．DNA的粗提取与鉴定 (1)实验原理 ①提取原理：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在_______________方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。 例如，DNA不溶于_____，但某些蛋白质溶于_____；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于___ mol·L－1的NaCl溶液。 ②鉴定原理：在一定温度下，DNA遇________试剂会呈现蓝色。 物理和化学性质 酒精 2 酒精 二苯胺 考点三　实验：DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 71 (2)实验步骤 考点三　实验：DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 72 等体积的、预冷的体积分数为95%的酒精 考点三　实验：DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 73 二苯胺 沸水 (3)实验结果 溶有DNA的试管变蓝色，另一支试管不变色。 考点三　实验：DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 74 [特别提醒]　 1.加入酒精后用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。 2.本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。 考点三　实验：DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 75 2．DNA片段的扩增及电泳鉴定 (1)原理 ①PCR原理：利用了______________原理。 ②电泳：DNA分子具有_____________，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷______的电极移动，这个过程就是电泳。 ③鉴定：PCR的产物一般通过_______________来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、DNA分子的____________等有关。 DNA的热变性 可解离的基团 琼脂糖凝胶电泳 凝胶的浓度 大小和构象 相反 考点三　实验：DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 76 (2)实验步骤 ①PCR实验操作步骤 微量移液器 底部 考点三　实验：DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 77 ②DNA的电泳鉴定 微量移液器 紫外灯 考点三　实验：DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 78 (3)注意事项 ①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行__________处理。 ②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在 －20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 ③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 ④在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 高压灭菌 考点三　实验：DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 79 [例1]　(2024·山东，13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是(　　) A．整个提取过程中可以不使用离心机 B．研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中 C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰 解析：DNA的提取过程中可以不使用离心机，可将研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，直接取上清液放入烧杯中，A正确，B错误；鉴定过程需要沸水浴加热，DNA分子在高温下会解螺旋，双螺旋结构会发生改变，C错误；加热是唯一变量，设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。 考点三　实验：DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 80 [例2]　在基因工程操作过程中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如下图所示。以下相关叙述中，错误的是(　　) A．该载体最可能为链状DNA分子 B．两种限制酶在载体上各有一个酶切位点 C．限制酶R1与R2的切点最短相距约200 bp D．限制酶作用于识别位点会导致磷酸二酯键断裂 考点三　实验：DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 81 解析：当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度的DNA片段，因此该载体最有可能为环状DNA分子，A错误；当仅用一种限制酶切割载体时，两种限制酶切割产生的DNA片段等长，而两种限制酶同时切割时则产生两种长度的DNA片段，所以两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，B正确；两种限制酶同时切割时产生约600 bp和200 bp两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点最短相距约200 bp，C正确；限制酶切割DNA分子，破坏的是作用位点上两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，D正确。 考点三　实验：DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 82 [例3]　人体内一些正常或异常细胞脱落破碎后，其DNA会以游离的形式存在于血液中，称为cfDNA。近几年，结合PCR及电泳鉴定、DNA测序等技术，cfDNA在临床上得到了广泛应用。下列相关说法错误的是(　　) A．PCR反应中设置不同的温度是为了使DNA聚合酶催化不同的反应 B．在琼脂糖凝胶中，cfDNA的迁移速率与cfDNA分子的大小、构象等有关 C．在进行电泳时，要预留一个加样孔，加入指示分子大小的标准参照物 D．对cfDNA进行检测，可以用于肿瘤的早期筛查 解析： PCR反应中温度的周期性改变是为了解旋变性、复性、延伸，A错误；cfDNA是人体内一些正常或异常细胞脱落破碎后形成的游离DNA，所以可通过检测cfDNA中的相关基因，判断其来自正常或异常细胞，并进行癌症的筛查，D正确。 考点三　实验：DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 83 [例4]　(不定项)用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，2～10号为PCR产物；其中2号的模板为野生型植株DNA，3～9号的模板为转基因植株的DNA，10号使用蒸馏水代替模板DNA。PCR产物电泳结果如下图所示。据此作出的分析不合理的是(　　) A．目的基因PCR产物的分子大小在250～500 bp之间 B．3号样品植株导入的目的基因一定能成功表达 C．9号样品对应植株不是所需的转基因植株 D．10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰 考点三　实验：DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 84 解析：PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段。3～9号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型植株和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500 bp，A合理；3号PCR结果包含250～500 bp片段，包含目的基因，但导入的目的基因不一定能成功表达，B不合理；9号PCR结果不包含250～500 bp片段，所以不是所需转基因植株，C合理；10号使用蒸馏水代替模板DNA，可排除反应体系等对实验结果的干扰，D合理。 考点三　实验：DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定 85 跨章节知识联系 04 跨章节知识联系 87 课时作业 05 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 难度 ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★★ ★★ ★★ ★ ★★★ ★★ 对点 限制酶 限制酶的选择 基因工程基本操作程序 DNA的粗提取与鉴定 基因工程基本操作程序 基因工程基本操作程序 PCR 基因工程基本操作程序 基因工程基本操作程序 基因工程基本操作程序 基因工程的基本工具 基因工程基本操作程序 基因工程基本操作程序 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 89 1．如图所示三个DNA片段依次表示EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制酶的识别序列与切割位点。下列有关叙述错误的是(　　) A．三种限制酶切割产生的末端的长度大小相同 B．这三种限制酶切割后形成的都是黏性末端 C．BamHⅠ和Sau3AⅠ切割DNA片段形成的末端不能彼此连接 D．图中的DNA片段被EcoRⅠ切割后，会增加两个游离的磷酸基团 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 90 解析：根据题图并结合三种限制酶的切割位点可知，这三种限制酶切割后形成的都是黏性末端，且长度大小相同，A、B正确；用BamHⅠ和Sau3AⅠ切割DNA片段会形成相同的黏性末端，故BamHⅠ和Sau3AⅠ切割DNA片段形成的末端能按照碱基互补配对彼此连接，C错误；图中的DNA片段被EcoRⅠ切割后，会断裂两个磷酸二酯键，从而增加两个游离的磷酸基团，D正确。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 91 2．图1为某种质粒简图，图2表示某外源DNA上的目的基因，小箭头所指分别为限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ的酶切位点。下列有关叙述错误的是(　　) A．在基因工程中若只用一种限制酶完成对质粒和外源DNA的切割，则可选EcoRⅠ B．如果将一个外源DNA分子和一个质粒分别用EcoRⅠ酶切后，再用DNA连接酶连接，形成一个含有目的基因的重组DNA，此重组DNA中EcoRⅠ切割位点有1个 C．为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，酶切时可使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒和目的基因 D．一个如图1所示的质粒分子经EcoRⅠ切割后，含有2个游离的磷酸基团 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 92 解析：图中目的基因两侧都有EcoRⅠ酶切位点，质粒上也存在EcoRⅠ酶切位点，若只用一种限制酶完成对质粒和外源DNA的切割，可选EcoRⅠ，A正确；EcoRⅠ切割外源DNA分子和质粒，再用DNA连接酶连接，形成的含目的基因的重组DNA分子中，EcoRⅠ切割位点有2个，B错误；为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，酶切时可使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒和目的基因，C正确；该质粒分子经EcoRⅠ切割后，产生两个黏性末端，含有2个游离的磷酸基团，D正确。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 93 A．用PCR技术可检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞中 B．将棉花细胞接种在含氨苄青霉素的培养基上可筛选出转基因细胞 C．用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA－ACA融合基因 D．与只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确 3．如图所示，研究人员将雪花莲凝集素基因(GNA)和尾穗苋凝集素基因(ACA)与载体(pBI121)结合，然后导入棉花细胞。下列操作不符合实验目的的是(　　) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 94 解析：根据GNA－ACA融合基因的两端序列设计合适的引物，可以利用PCR技术检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞中，A正确；由于重组质粒含有卡那霉素的抗性基因，故将棉花细胞接种在含卡那霉素的培养基上可筛选出转基因细胞，B错误；雪花莲凝集素基因(GNA)和尾穗苋凝集素基因(ACA)均有BsaBⅠ酶切位点，所以用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA－ACA融合基因，C正确；图中质粒与ACA－GNA上都含有KpnⅠ和XhoⅠ的酶切位点，与只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确，D正确。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 95 4．下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(　　) A．向放有洋葱的研钵中加入适量研磨液研磨后会释放DNA B．在含DNA的上清液中加入95%的冷酒精会出现白色丝状物 C．将丝状物加入2 mol/L的NaCl溶液的目的是溶解DNA D．将丝状物直接加入二苯胺试剂中，沸水浴冷却后会出现蓝色 解析：将丝状物溶于2 mol/L的NaCl溶液后，再加入二苯胺试剂，沸水浴冷却后会出现蓝色，D错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 96 5．某课题组为得到青蒿素产量高的新品系，使青蒿素合成过程中的某一关键酶基因fps在野生青蒿中过量表达，其过程如图所示。下列有关叙述错误的是(　　) A．也可用PCR技术直接扩增RNA来获取目的基因 B．酶1、酶2和酶3作用的化学键都是磷酸二酯键 C．本过程中，可以采用一种、两种甚至四种酶2 D．通过抗原—抗体杂交技术可检测fps基因是否表达出蛋白质 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 97 解析：PCR技术不能直接扩增RNA来获取目的基因，A错误；据图可知，酶1表示逆转录酶，酶2表示限制酶，酶3表示DNA连接酶，酶1、酶2和酶3作用的化学键都是磷酸二酯键，B正确；不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，因此为了成功构建表达载体，可以采用一种、两种甚至四种酶2切割含fps基因的DNA片段和质粒a，C正确。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 98 6．图甲为培育转基因生物时选用的载体，图乙是含有目的基因的一段DNA序列，图中标注了相关限制酶的酶切位点。下列叙述错误的是(　　) A.若通过PCR技术提取该目的基因，应该选用引物a和引物c B.构建表达载体时可选用BclⅠ和HindⅢ这两种限制酶 C.若将基因表达载体导入大肠杆菌中，需用Ca2＋处理大肠杆菌 D.只利用含四环素的培养基就可以直接筛选出成功导入表达载体的受体细胞 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 99 解析：根据图甲可知，BamHⅠ会导致两种抗性基因都被破坏，所以不宜选用BamHⅠ，为防止目的基因自身环化，可选用BclⅠ和HindⅢ两种限制酶切割，B正确；由于选择BclⅠ和HindⅢ这两种限制酶，破坏了氨苄青霉素抗性基因，但没有破坏四环素抗性基因，因此应该先用含四环素的培养基筛选出含有基因表达载体和普通质粒的大肠杆菌，再用含氨苄青霉素的培养基筛选含重组质粒的大肠杆菌，D错误。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 100 7．农杆菌Ti质粒上的T­DNA可以转移并随机插入到被侵染植物的染色体DNA中。研究者将下图中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T­DNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定T­DNA插入的具体位置。下列说法不正确的是(　　) 注：子链从引物的3′端开始延伸。 A．PCR扩增依据的是DNA分子半保留复制的原理 B．进行PCR扩增需要热稳定DNA聚合酶 C．利用图中的引物②、③组合可扩增出两侧的未知序列 D．通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T­DNA的插入位置 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 101 解析：PCR扩增依据的是DNA分子半保留复制的原理，是体外扩增DNA的一种方式，A正确；PCR技术需要在高温条件下进行变性，故进行PCR扩增需要热稳定DNA聚合酶，B正确；由于DNA的两条链反向平行，且子链从引物的3′端开始延伸，故利用图中的引物①、④组合可扩增出两侧的未知序列，C错误；通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T­DNA的插入位置，D正确。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 102 8．我国科学家利用XbaⅠ和SacⅠ两种限制酶，并运用农杆菌转化法，将富含赖氨酸的蛋白质编码基因(含678 bp)导入某植物细胞，再经植物组织培养获得转基因植株，使赖氨酸的含量比对照组明显提高，如图表示相关培育过程(质粒的其他部位和目的基因内部均无XbaⅠ、SacⅠ、HindⅢ的识别位点)，下列说法不正确的是(　　) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 103 A．一个内含目的基因的模板DNA经PCR扩增4次，共产生6个等长DNA分子 B．也可采用花粉管通道法将目的基因导入植物细胞 C．植物组织培养过程中，培养基需添加卡那霉素以便筛选转基因植株 D．使用SacⅠ和HindⅢ切割重组质粒后能得到1500 bp左右的片段 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 104 解析：一个内含目的基因的模板DNA经PCR扩增4次共产生等长的DNA分子数24－2×4＝8(个)，A错误；因为插入植物细胞染色体上的是质粒的T­DNA，而卡那霉素抗性基因不在此片段上，导入成功的植物细胞对卡那霉素无抗性，C错误；根据切割目的基因的限制酶在质粒上的切割位点，可知由于重组质粒上移除1900 bp而补充了含678 bp的目的基因，加上未移除的822 bp，所以用SacⅠ和HindⅢ切割重组质粒后，可得到822＋678＝1500(bp)左右的新片段，D正确。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 105 9．双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了下图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析正确的是(　　) A．可用农杆菌转化法将构建好的表达载体导入植物细胞 B．为连入GUS基因，需用SalⅠ和SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 C．在培养基中添加潮霉素可初步筛选导入表达载体的微生物受体细胞 D．可通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子的作用 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 106 解析：将基因表达载体导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，A正确；如果用SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒时就会破坏LUC基因，B错误；如果成功导入含有潮霉素抗性基因的基因表达载体，受体细胞就具有抗潮霉素的能力，在含有潮霉素的培养基上能生存，因此可以初步筛选导入表达载体的微生物受体细胞，C正确；双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β­葡萄糖苷酶，催化底物分别产生荧光和生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，D正确。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 107 10．如图为构建苘麻抗除草剂基因A重组质粒的技术流程，其中NptⅡ是卡那霉素抗性基因，GUS基因仅在真核细胞中表达，表达产物可催化底物呈蓝色。下列说法错误的是(　　) A．PCR扩增A时可在引物中加入BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位点 B．在培养基中添加卡那霉素初步筛选导入重组质粒的农杆菌 C．用农杆菌转化植物愈伤组织选择呈现蓝色的组织进行培养 D．启动子若为除草剂诱导启动子将减少细胞物质和能量浪费 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 108 解析： PCR扩增A后，为使A能替换Bt基因，需要在A的两侧加入相应的限制酶的酶切位点，即在引物中加入PstⅠ和XhoⅠ的酶切位点，A错误；由图可知，卡那霉素抗性基因是标记基因，因此在培养基中添加卡那霉素初步筛选导入重组质粒的农杆菌，B正确；由题可知，GUS基因表达产物可催化底物呈蓝色，但是重组质粒中不含GUS基因，导入重组质粒的愈伤组织中也不含该基因，故不会出现蓝色组织，C错误；A为抗除草剂基因，若启动子为除草剂诱导启动子，即只有在除草剂存在的情况下才诱导其表达，没有除草剂时不表达，这就减少了细胞物质和能量的浪费，D正确。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 109 11．(2021·全国乙卷改编)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。 回答下列问题： (1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中_____________酶切割后的DNA片段最好用E.coli DNA连接酶连接。上图中_____________________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。 EcoRⅠ、PstⅠ EcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和EcoRⅤ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 110 (2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒 载体片段之间形成的化学键是___________。 (3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能__________；质粒DNA分子上有________________________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是________________________________________________________________________。 (4)表达载体含有启动子，启动子是指__________________________________ _______________________________________________。 磷酸二酯键 自我复制 一至多个限制酶切割位点 用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞 位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 111 (4)启动子是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得需要的蛋白质。 解析：(1)限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，两种酶都能将双链DNA片段连接起来，但E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率远远低于T4 DNA连接酶。 (3)质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制性核酸内切酶的酶切位点，便于目的基因的导入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 112 12．(2025·八省联考四川)细菌中的蛋白激酶Y感受外界刺激后，利用ATP将特异性底物A蛋白磷酸化，改变A蛋白的活性从而应答外界刺激，调控细菌的生长。研究者将Y基因(编码蛋白激酶Y)与GFP基因(编码绿色荧光蛋白)拼接成Y－GFP融合基因(Y－GFP基因)，导入载体，并表达出融合蛋白(Y－GFP蛋白)，以分析蛋白激酶Y的功能，实验过程如图所示。回答下列问题。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 113 (1)Y基因含有735个碱基对(bp)，其编码的肽链含有_____个氨基酸。通过PCR分别扩增Y基因与GFP基因，配制的两个反应体系中不同的有____(填标号)。 a．模板 b．引物 c．DNA聚合酶 d．反应缓冲液 (2)构建Y基因与GFP基因的融合基因时，应将Y基因中编码终止密码子的序列删除，理由是__________________________________________________________。 (3)据图步骤一分析，为确保Y－GFP基因插入载体后完整表达，在构建重组基因表达载体时不能选择EcoRⅠ限制酶，理由是_____________________________ __________________________________________。 245 ab 核糖体移动到终止密码子多肽链就断开，蛋白GFP就不能翻译出来 Y基因结构内部含有EcoRⅠ限制酶的酶切位点，Y基因结构会被EcoRⅠ限制酶破坏 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 114 __________________________________________________________________________________，利用表达的具有绿色荧光的Y－GFP蛋白还可开展的实验有________________________ (答出1个即可)。 (4)为检测Y－GFP蛋白的激酶活性，用Y－GFP蛋白、A蛋白和ATP组合实验，四组实验的条件及电泳结果如图步骤二所示。磷酸化的A蛋白可被磷酸化抗体特异性识别。若Y－GFP蛋白有激酶活性，则后续实验用磷酸化抗体检测，能从电泳条带检测到信号的是____泳道(从泳道①～④中选填序号)，从Y－GFP蛋白功能角度分析，理由是 ④ 磷酸化的A蛋白可被磷酸化抗体特异性识别，A蛋白的磷酸化需要蛋白激酶Y和ATP同时存在 分析A蛋白被磷酸化的水平 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 115 解析：(1)基因片段上的碱基数目与转录出的mRNA上的碱基数目与翻译出的氨基酸数目比例为6∶3∶1，不考虑终止密码子，则该蛋白质最多由735÷3＝245个氨基酸组成。PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液。进行PCR扩增目的基因时，配制的两个反应体系中不同的有模板(待扩增的DNA片段)、引物。 (4)Y－GFP蛋白具有使A蛋白被磷酸化的功能，利用这一特性，还可用表达具有绿色荧光的Y－GFP蛋白来分析A蛋白被磷酸化的水平。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 116 13．(2025·八省联考山西、陕西、宁夏、青海)科研人员基于合成生物学原理在大肠杆菌中构建了合成产物Z的完整途径，其基因表达载体如图a，基因1、2和3为该途径的必需基因，基因大小分别为2650 bp、1240 bp和3476 bp。回答下列问题。 (1)图a中，构建基因表达载体时用到的酶是____________________，片段X是________。 限制酶、DNA连接酶 复制原点 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 117 (2)基因表达载体导入大肠杆菌前，需要用Ca2＋处理大肠杆菌使其处于一种__________________________的生理状态，导入后在含卡那霉素的培养基上筛选到3个抗性菌落，分别对其所含DNA进行PCR和琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图b。据图可知，PCR时选用的引物对是图a中的______________，选择该引物对进行鉴定的原因是______________________________________________________________；菌落B中未检测到目标条带，其原因是____________________________________。 能吸收周围环境中DNA分子 引物2和引物5 两种引物扩增的区段包含了完整的基因2以及基因1和基因3的部分片段 菌落B中导入的是普通质粒而非重组质粒 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 118 (3)工程菌株合成产物Z的产量受到温度、pH和溶解氧等发酵条件的影响，请针对其中任一因素，探究其对产物Z产量的影响，写出简要的实验思路______________________________________________________________________________________________________________________________。 将工程菌株平均分成若干份，分别培养在一系列不同温度(或pH或溶解氧)的培养液中，其他环境条件相同且适宜，一段时间后测定产物Z的产量 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 119 解析：(2)电泳检测的目的是判断3个抗性菌落是否都含有目的基因(基因1、2和3)，电泳结果显示，菌落A和C电泳条带显示基因大小介于2000～3000之间，结合目的基因上的引物分析，应该选择引物2和引物5，两种引物扩增了基因2(1240 bp)以及基因1和基因3的 部分片段，片段大小应该在2000～3000之间，且两种引物扩增的区段包含了完整的基因2以及基因1和基因3的部分片段，这样可以很好的判断大肠杆菌中是否成功导入了目的基因。菌落B中未检测到目标条带，即不含目的基因但含抗性基因，其原因是菌落B中导入的是普通质粒而非重组质粒。 (3)本实验的实验目的是探究温度、pH和溶解氧等发酵条件对产物Z产量的影响，实验自变量是温度或pH或溶解氧，检测指标是产物Z的产量。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 课时作业 120 　　　　　　　　　　　　　 R $$