2.2动物细胞工程课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

人教版高中生物 选择性必修3 动物细胞工程 第2节 第2章　细胞工程 1 认同动物细胞培养是模拟体内生理条件在体外进行的培养，由此分析、推出培养动物细胞需要满足的基本条件。 2 尝试建构动物细胞培养的基本流程，认同动物细胞培养是动物细胞工程的基础。 3 简述干细胞的应用；通过探讨干细胞在临床上的应用所产生的效益与风险，理性看待生物技术的应用，增强社会责任感。 4 阐明动物细胞融合技术的概念，举例说出诱导动物细胞融合的方法。 5 概述单克隆抗体的制备过程，认同单克隆抗体在临床上具有重要的应用价值。 动物细胞工程的发展历程 1890年：希普首例胚胎移植成功。 1958年：格登、童第周：体细胞核移植成功。 2006年：山中伸弥获得诱导多能干细胞。 1959年：试管家兔诞生。 2014年：单细胞基因组测序进行遗传病筛查的试管婴儿诞生。 1996年:克隆羊多莉诞生。 1978年：胚胎分割移植成功。 1907年：哈里森:首创动物组织体外培养法。 1951年：张明觉发现哺乳动物精子获能现象。 1975年：米尔斯坦和科勒：创立单克隆抗体技术。 1981年：埃文斯成功分离和培养小鼠的胚胎干细胞。 2017年:我国科学家首次培育了体细胞克隆猴。 ¦ 科技探索之路 ¦ 思考：动物细胞工程常用的技术有哪些？ 动物细胞工程常用的技术动物细胞培养、动物细胞融合、动物细胞核移植、生产单克隆抗体。 是最基础的技术 1 动物细胞培养的条件和过程 2 干细胞培养及其应用 3 动物细胞融合技术 4 单克隆抗体及其应用 目录 人体再生术的秘密—人造皮肤 小面积烧伤：患者通过切除 + 植皮(自身)后恢复 1）使用他人皮肤如何？ 患者自身皮肤的不够用，如何解决？ 大面积烧伤？ 2）培养自身细胞？ 目前，科学家还在研究对皮肤干细胞进行培养，以获得适合临床上使用的人造皮肤。 情境导入 一、动物细胞培养的条件和过程 动物细胞培养 从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适当的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。 【思考】：动物组织的选择： 幼龄动物 or 老龄动物 幼龄个体的细胞生命力旺盛，分化程度低、分裂能力强，易培养。 动物体 组织 单个细胞 细胞生长和增殖 取出 分散 适宜条件 原理 地位 对象 目的 细胞增殖 （有丝分裂） 动物细胞工程的基础 获得细胞或细胞产物 胚胎或幼龄动物的细胞 Why ? 营养容易供应， 代谢废物容易排出 欲使动物细胞培养顺利进行，应营造怎样的环境？ 思考讨论: 模拟体内的生理条件进行培养 新知讲授 （一）动物细胞培养的条件 糖类、氨基酸、 无机盐、维生素 …… 无菌、无毒的环境 适宜的温度、pH和渗透压 适宜的气体环境 培养基的构成： + 合成培养基 血清等天然成分 将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基 含有尚未全部研究清楚的细胞所需的营养物质。 一般使用液体培养基，也称为培养液 1.营养： 新知讲授 血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中，蛋白质主要为白蛋白和球蛋白；氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本原料，且有些氨基酸是动物细胞本身不能合成的（称为必需氨基酸），必须由培养液提供；激素有胰岛素、生长激素等。 血清还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，它们能促进细胞的生长、增殖和贴附。因此，在培养动物细胞时，为保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需在培养基中添加10%~20％的血清等天然成分。 动物细胞培养通常要添加血清的原因 拓 展 （一）动物细胞培养的条件 糖类、氨基酸、 无机盐、维生素 …… 无菌、无毒的环境 适宜的温度、pH和渗透压 适宜的气体环境 2.无菌、无毒的环境： （1）培养液、培养用具：灭菌处理； （2）在无菌环境下进行操作； （3）定期更换培养液 清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。 （可根据实际情况适量添加抗生素） 无菌 无毒 [拓展]动物和人体的免疫系统可抵御各种微生物对机体的入侵，因此体内细胞生活的内环境几乎是无菌、无毒的。而离体培养的细胞对微生物和有毒物质的防御能力极低，所以其培养环境中一旦有细菌、真菌或病毒等微生物的污染，培养的细胞就会死亡。 新知讲授 （一）动物细胞培养的条件 糖类、氨基酸、 无机盐、维生素 …… 无菌、无毒的环境 适宜的温度、pH和渗透压 适宜的气体环境 哺乳动物细胞培养的温度多以36.5±0.5℃为宜； 多数动物细胞生存的适宜pH为7.2-7.4； （1）适宜的温度： （2）适宜的pH： （3）适宜的渗透压： 维持细胞正常的形态和功能。 3.适宜的温度、pH和渗透压： 4.适宜的气体环境 （1）气体组成及作用: O2(细胞代谢所必需)； CO2(维持培养液的pH)。 （2）具体操作： 培养皿或松盖培养瓶 含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱 置于 培养皿 松盖培养瓶 CO2培养箱 新知讲授 （二）动物细胞培养的过程 悬浮培养的细胞:直接用离心法收集 贴壁细胞:用胰蛋白酶处理分散成单个细胞，用离心法收集 取动物组织 用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理 分散成单个细胞 解决 悬浮生长 贴壁生长 (大多数） 细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏等 接触抑制 传代培养 制成细胞悬液 原代培养 分瓶 培养 加培养液 在培养皿或培养瓶内 细胞分裂受阻 ② 制成细胞悬液，分瓶培养 ① 收集细胞 （动物胚胎或幼龄动物） (10代以内) (10代以后) 新知讲授 （二）动物细胞培养的过程 取动物组织 用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理 分散成单个细胞 传代培养 制成细胞悬液 原代培养 分瓶 培养 加培养液 在培养皿或培养瓶内 (动物胚胎或幼龄动物) (10代以内) (10代以后) (1)培养前为什么分散成单个细胞？ ①成块组织中细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长与增殖； ②利于细胞与培养液充分接触，保证细胞所需的O2与营养供应、保证细胞内代谢物及时排出。 (2)进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么？用胃蛋白酶可以吗？为什么？ 动物细胞间的物质主要是蛋白质。 胃蛋白酶不可以，pH不适宜; 原因是多数动物细胞生存的适宜pH为7.2-7.4；当pH大于6时，胃蛋白酶（适宜pH约为1.5）就会失去活性。 纤维蛋白、胶原蛋白等 新知讲授 （二）动物细胞培养的过程 取动物组织 用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理 分散成单个细胞 传代培养 制成细胞悬液 原代培养 分瓶 培养 加培养液 在培养皿或培养瓶内 (动物胚胎或幼龄动物) (10代以内) (10代以后) (3)酶解法较温和，一定不会对动物细胞造成损伤，对吗？ 不对；使用胰蛋白酶时，要控制好用量和处理时间，因为胰蛋白酶不仅能分解细胞间的蛋白质，长时间作用还会分解细胞膜蛋白等，对细胞造成损伤。 (4)体外培养的动物细胞类型？ ①悬浮生长类： 能够悬浮在培养液中生长增殖。 需要贴附于某些基质表面才能生长增殖（细胞贴壁），大多数细胞属于此类。 ②贴壁生长类： 什么是细胞贴壁？ 要求：培养瓶（皿）内表面光滑、无毒、易于贴附 新知讲授 （二）动物细胞培养的过程 取动物组织 用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理 分散成单个细胞 传代培养 制成细胞悬液 原代培养 分瓶 培养 加培养液 在培养皿或培养瓶内 (动物胚胎或幼龄动物) (10代以内) (10代以后) (5)“细胞增殖到互相接触的时候，糖蛋白识别了这种信息，就会使细胞停止分裂繁殖，出现接触抑制的现象”。试结合上述解释，举例说明哪种细胞无接触抑制现象，并阐述原因？ 癌细胞无接触抑制现象； 癌细胞的细胞膜上糖蛋白等物质减少 圆球形细胞刚开始 铺展贴壁生长 （100×） 培养的动物细胞贴壁生长并进行有丝分裂（100×） 细胞单层贴壁生长铺满瓶壁后出现接触抑制（100×） 单层细胞 多层细胞 新知讲授 （二）动物细胞培养的过程 取动物组织 用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理 分散成单个细胞 传代培养 制成细胞悬液 原代培养 分瓶 培养 加培养液 在培养皿或培养瓶内 (动物胚胎或幼龄动物) (10代以内) (10代以后) (6)什么是原代培养和传代培养？ ①原代培养： 将动物组织处理后的初次培养（10代内）。 分瓶后的细胞培养（10代后）。 ②传代培养： 判断依据：是否分瓶！ 初次培养 10代细胞 50代细胞 无限增殖 保持细胞正常二倍体核型 部分细胞核型改变 遗传物质改变 突破细胞寿限 获得不死性 危机1 危机2 原代培养 传代培养 （遗传物质没改变） （遗传物质有的改变） 使用或保存的细胞通常为10代以内，为什么？ 这一阶段的细胞 称为细胞株 这一阶段的细胞称为细胞系 分 瓶 新知讲授 （二）动物细胞培养的过程 取动物组织 用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理 分散成单个细胞 传代培养 制成细胞悬液 原代培养 分瓶 培养 加培养液 在培养皿或培养瓶内 (动物胚胎或幼龄动物) (10代以内) (10代以后) (7)原代培养和传代培养都用到胰蛋白酶处理，对象相同吗？ 原代培养：用胰蛋白酶对剪碎的动物组织进行处理，使其分散成单个细胞后进行培养。 传代培养：细胞培养过程中出现接触抑制，用胰蛋白酶使其从瓶壁上脱离下来，然后，将其分散到多个培养瓶中继续培养。 区分两种“培养”的关键是看用胰蛋白酶处理的对象 归纳:请列表比较动物细胞培养和植物组织培养 新知讲授 比较项目 植物组织培养 动物细胞培养 原理 培养基性质 培养基特有成分 取材 培养过程 培养结果 培养目的 相同点 获得细胞或细胞产物 固体培养基 完整植株 葡萄糖、动物血清 液体培养基 细胞增殖 植物细胞的全能性 许多细胞 快速繁殖等 蔗糖、植物激素 1.培养过程中细胞都进行有丝分裂，不涉及减数分裂； 原代培养、传代培养 脱分化、再分化 2.均需无菌操作、无菌培养，需要适宜的温度、pH等条件。 植物幼嫩的部位或花药等 动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织 核心归纳 (1)动物细胞培养体现了动物细胞的全能性(　　) 动物细胞培养未体现动物细胞的全能性，其原理是细胞增殖。 × (2)培养保留接触抑制的细胞可在培养瓶的瓶壁上形成多层细胞(　　) × 培养保留接触抑制的细胞可在培养瓶的瓶壁上形成单层细胞。 (3)悬浮培养的细胞直接用离心法收集，贴壁细胞需要用胰蛋白酶等处理后再用离心法收集(　　) √ (4)培养动物细胞的第一代(即第一次细胞增殖)被称为原代培养(　　) 原代培养指动物组织经处理后的初次培养，不一定是第一次细胞增殖。 × 判断正误 18 落实　思维方法 1.(2022·湖北)某兴趣小组开展小鼠原代神经元培养的研究，结果发现其培养的原代神经元生长缓慢，其原因不可能是 A.实验材料取自小鼠胚胎的脑组织 B.为了防止污染将培养瓶瓶口密封 C.血清经过高温处理后加入培养基 D.所使用的培养基呈弱酸性 √ 落实　思维方法 2.如图是动物细胞培养过程中可能出现的接触抑制现象，下列有关叙述错误的是 A.正常动物细胞培养过程中均会出现接触抑制现象 B.癌细胞无接触抑制因而培养时可形成多层细胞 C.出现接触抑制时细胞将停止分裂活动 D.出现接触抑制后需要用胰蛋白酶等处理后才可进行传代培养 √ 接触抑制是体外细胞培养时贴附型细胞生长的特性，悬浮型细胞不会出现接触抑制现象，A错误。 1 动物细胞培养的条件和过程 2 干细胞培养及其应用 3 动物细胞融合技术 4 单克隆抗体及其应用 目录 干细胞技术带来延长生命的可能 情境导入 细胞壁阻碍着细胞间的杂交（阻碍了原生质体间的融合） 二、干细胞培养及其应用 定义： 分布、种类： 功能： 动物和人体内保留的具有分裂和分化能力的细胞。 干细胞存在于早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中，包括胚胎干细胞和成体干细胞等。 存在于早期胚胎中 具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。 ES细胞在体外分化成心肌细胞、神经元细胞和造血干细胞等 必须从胚胎中获取 ，涉及伦理问题；因而限制了在医学上的应用。 应用: 特点: 局限性: 分布: 胚胎干细胞（简称ES细胞） 在一定条件下，可以分化成其他类型的细胞。 也叫全能干细胞 形态特点：通常呈圆球形或椭球形，细胞体积小，细胞核大，核仁明显。 新知讲授 二、干细胞培养及其应用 成体干细胞 存在于成体组织或器官内。 具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织， 不具有发育成完整个体的能力。 举例: 特点: 应用实例: 分布: 治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等）。 治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病。 造血干细胞： 神经干细胞： 有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、器官的发育、再生和修复等密切相关。 发现最早、研究最多、应用最成熟 造血干细胞（骨髓、外周血和脐带血中） 精原干细胞（睾丸中） 神经干细胞（神经系统中） 血细胞和免疫细胞 神经细胞 精原细胞 治疗细胞损伤造成的疾病 新知讲授 细胞壁阻碍着细胞间的杂交（阻碍了原生质体间的融合） 植物细胞去除细胞壁后的原生质体具有生命活力，应放在等渗或略高渗的溶液中。 制备原生质体和诱导原生质体融合时，不能在低渗溶液中进行。 通常在等渗或高渗溶液(有利于原生质体的分离及防止原生质体吸水胀破)中利用酶解法(加入纤维素和果胶酶)制备原生质体 植物体细胞杂交的培养基中要添加蔗糖溶液且浓度略大于原生质体内的浓度，这样不仅能为原生质体提供营养，而且还能维持一定的渗透压，使原生质体保持正常的形态。 二、干细胞培养及其应用 诱导多能干细胞(iPS细胞) 制备: 优点: 应用: 概念: 通过体外诱导小鼠成纤维细胞得到的类似胚胎干细胞的一种细胞。 ①将特定基因或特定蛋白导入细胞(成纤维细胞、已分化的T细胞、B细胞)； ②用小分子化合物诱导形成。 ①诱导过程无须破坏胚胎； ②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应。 可治疗镰状细胞贫血症； 在治疗阿尔茨海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展。 新知讲授 细胞壁阻碍着细胞间的杂交（阻碍了原生质体间的融合） 植物细胞去除细胞壁后的原生质体具有生命活力，应放在等渗或略高渗的溶液中。 制备原生质体和诱导原生质体融合时，不能在低渗溶液中进行。 通常在等渗或高渗溶液(有利于原生质体的分离及防止原生质体吸水胀破)中利用酶解法(加入纤维素和果胶酶)制备原生质体 植物体细胞杂交的培养基中要添加蔗糖溶液且浓度略大于原生质体内的浓度，这样不仅能为原生质体提供营养，而且还能维持一定的渗透压，使原生质体保持正常的形态。 二、干细胞培养及其应用 iPS细胞的应用前景： iPS细胞用于治疗人类疾病示意图 移植 取成纤维细胞等 iPS细胞 转入相关因子 细胞发生转化 分化 胰岛细胞 神经元 血细胞 肠上皮细胞 心肌细胞 肝细胞 病人 ①取成纤维细胞 ②转入相关因子 ③细胞转化为iPS细胞 ④诱导iPS细胞定向分化为多种组织细胞 ⑤移植回病人体内 治疗糖尿病疾病 治疗神经疾病 治疗心血管疾病 治疗消化道疾病 新知讲授 细胞壁阻碍着细胞间的杂交（阻碍了原生质体间的融合） 植物细胞去除细胞壁后的原生质体具有生命活力，应放在等渗或略高渗的溶液中。 制备原生质体和诱导原生质体融合时，不能在低渗溶液中进行。 通常在等渗或高渗溶液(有利于原生质体的分离及防止原生质体吸水胀破)中利用酶解法(加入纤维素和果胶酶)制备原生质体 植物体细胞杂交的培养基中要添加蔗糖溶液且浓度略大于原生质体内的浓度，这样不仅能为原生质体提供营养，而且还能维持一定的渗透压，使原生质体保持正常的形态。 (1)过程④的实质是什么？ 基因的选择性表达。 (2)诱导多能干细胞用于治疗人类的某些顽症的原理是什么？ 诱导多能干细胞可以被诱导分化形成新的组织细胞，经移植可使坏死或退化部位得以修复并恢复正常功能。 二、干细胞培养及其应用 ①取成纤维细胞 ②转入相关因子 ③细胞转化为iPS细胞 ④诱导iPS细胞定向分化为多种组织细胞 ⑤移植回病人体内 (3)诱导多能干细胞为什么可以解决供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问题？ 通过干细胞体外诱导分化，可以培育出人造器官，从而解决供体器官不足的问题；又因人造器官是由病人自身细胞经诱导分化形成的，所以可以避免免疫排斥反应。 (4)科学家已尝试采用多种方法来制备iPS细胞，请说出几种获取iPS细胞的方法。 借助载体将特定基因导入细胞中，直接将特定蛋白导入细胞中或者用小分子化合物等来诱导形成iPS细胞。 iPS细胞最初是由成纤维细胞转化而来的，后来发现已分化的T细胞、B细胞等也能被诱导为iPS细胞。 新知讲授 现在关于iPS细胞的研究正在不断深入。请你从以下两个方面来查阅资料进行思考。（1）由于诱导iPS细胞、促使其分化都需要时间，因此用某人特异的iPS细胞进行医疗只限于时间比较充裕的情形。从实际事故、疾病发生的不可预测性方面考虑，如果要将这些细胞用于紧急情况，应该提前采取什么措施? 像建立骨髓库一样，有研究团队正在尝试建立HLA(Human Leukocyte Antigen,人类白细胞抗原)多态性丰富的iPS细胞库，可以为需要的人找到HIA匹配度较高的iPS细胞，这样不仅可以节省时间、成本，还能减轻异体干细胞移植后发生的免疫排斥反应。 （2）如果诱导iPS细胞定向分化为生殖细胞的技术发展成熟，该技术可能会有哪些应用？又可能带来哪些问题？ 该技术可能被用于治疗不孕症；获得足够量的生殖细胞来进行濒危物种的克隆研究；获得生殖细胞进行转基因操作，再经过受精、胚胎发育等过程来获得转基因动物。 该技术可能带来一系列的伦理问题。例如，如果用同一个人的iPS细胞分别诱导形成精子和卵子，两者受精可能培育出“单亲”婴儿；有的人还可能有目的地选择iPS细胞，从而“设计”婴儿。 拓 展 (1)干细胞都来源于早期胚胎(　　) 干细胞存在于早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中，包括胚胎干细胞和成体干细胞等。 × (2)iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，可以避免免疫排斥反应(　　) (3)不同类型的干细胞，它们的分化潜能完全相同(　　) √ × 不同类型的干细胞，它们的分化潜能是有差别的，如胚胎干细胞的分化潜能大于成体干细胞。 判断正误 29 落实　思维方法 3.研究人员研究肥胖机理时发现了一种与脂肪细胞的分化形成有关的蛋白质M，其细胞分化过程如图所示。下列有关叙述错误的是 A.已分化的细胞不可能继续 分化为其他类型的细胞 B.肌肉细胞与脂肪细胞中均含控制蛋白质M合成的基因 C.促进蛋白质M的合成是解决肥胖问题的一条途径 D.间充质细胞是一种成体干细胞，其分化过程具有组织特异性 √ 已分化的细胞也可能继续分化为其他类型的细胞，如人体的干细胞可分化为间充质细胞，间充质细胞又分化为肌肉细胞或脂肪细胞，A错误。 落实　思维方法 4.将Oct3/4、Sox2、c－Myc和Klf4基因通过逆转录病毒转入小鼠成纤维细胞后得到类似于小鼠胚胎干细胞的一种细胞，命名为诱导多能干细胞(iPS细胞)。与ES细胞相比，iPS细胞更容易获得，广泛应用于药物筛选或基因治疗。下列说法错误的是 A.逆转录病毒充当了将目的基因导入成纤维细胞的载体 B.iPS细胞的应用中存在分化成肿瘤细胞的风险 C.体细胞经诱导产生iPS细胞后再转化为需要的细胞给病人治病，会引起 免疫排斥反应 D.欲验证iPS细胞的产生是由于外源基因的作用，应设置不转入外源基因 的对照组 √ 无菌、无毒 营养 温度、pH和渗透压 气体环境 制备细胞悬液 原代培养 传代培养 动物细胞培养 动物细胞培养的条件 动物细胞培养的过程 干细胞的培养和应用 干细胞的种类、特点及应用 iPS细胞的培养和应用 情境导入 小 结 五分钟查落实 【要语必背】 1.动物细胞工程常用的技术包括动物细胞培养、动物细胞融合和动物细胞核移植等，其中动物细胞培养是动物细胞工程的基础。 2.动物细胞培养的条件：营养；无菌、无毒的环境；温度、pH和渗透压；气体环境。 3.人们通常将分瓶之前的细胞培养，即动物组织经处理后的初次培养称为原代培养，将分瓶后的细胞培养称为传代培养。 4.在进行传代培养时，悬浮培养的细胞直接用离心法收集；贴壁细胞需要重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集。之后，将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养。 5.干细胞存在于早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中，包括胚胎干细胞和成体干细胞等。 【长句表达】 1.动物细胞培养需要添加血清的原因：_____________________________ 。 2.动物细胞培养时所需的气体环境是 ，O2是________ ，CO2的主要作用是 。 3. 称为细胞贴壁。贴壁细胞在生长增殖时，会发生接触抑制现象，即___________________________________ 的现象。 血清中含有尚未全部研究清楚的 细胞所需的营养物质 95%空气和5%CO2 细胞代谢 所必需的 维持培养液的pH 细胞贴附在培养瓶的瓶壁上的现象 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时， 细胞通常会停止分裂增殖 4.动物细胞的整个培养过程中可能多次用到胰蛋白酶或胶原蛋白酶，第一次使用的目的是 ；贴壁细胞传代培养时使用的目的是 。 5.成体干细胞的特点：具有 ，只能分化成 ，不具有 的能力。 6.诱导多能干细胞是通过体外诱导成纤维细胞，所获得的类似___________ 的一种细胞，简称iPS细胞。优点是________________________________ 。 使组织细胞分散开 使细胞从瓶壁上脱离下来，分散成单个细胞，便于分瓶培养 组织特异性 特定的细胞或组织 发育成完整个体 胚胎干细胞 不涉及伦理问题，理论上可以避免免 疫排斥反应 问题探究： 1.视频中了解到针对新冠肺炎真正的特效药是什么？ 2.这种特效药有着怎样的特点呢？ 针对新冠病毒的单克隆抗体。 这种单克隆抗体可以和新冠病毒特异性结合，准确定位、药效强、持续时间久，并且可以大量储备生产。 【回顾旧知】 ①什么细胞能产生抗体？ ②能产生抗体的细胞能否大量增殖？ ③什么细胞具有无限增殖的能力？ ④能否培养出一种能分泌抗体且增殖力强的细胞？ 浆细胞 浆细胞没有增殖能力 肿瘤细胞 动物细胞融合技术 1 动物细胞培养的条件和过程 2 干细胞培养及其应用 3 动物细胞融合技术 4 单克隆抗体及其应用 目录 人—鼠细胞融合 融合细胞 细胞融合 37℃ 40min 正在融合的细胞 红色荧光染料标记膜蛋白 绿色荧光染料标记膜蛋白 人细胞 小鼠细胞 该实验说明： 细胞膜具有流动性 三、动物细胞融合技术 1.概念： 2.原理： 结果： 3.融合方法： 4.意义： 5.应用： 使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。 细胞膜的流动性 PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等。 （化学法、 物理法、 生物法） 突破了有性杂交的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。 动物细胞融合特有 具有原来两个或多个细胞的遗传信息 ①研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。 ②特别是杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。 形成单核杂交细胞 常用：仙台病毒、疱疹病毒、腮腺炎病毒 新知讲授 什么是灭活病毒？灭活病毒诱导细胞融合的原理是？ 灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。 原理：病毒的糖蛋白和一些酶可以与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞膜的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。 过程： 病毒颗粒 灭活的病毒颗粒粘附于细胞表面，使细胞互相凝聚 细胞膜融合 细胞核融合 形成杂交细胞 细胞膜打开 细胞质融合 动物细胞融合实质及完成的标志： 细胞核融合 拓 展 资料1 19世纪30年代，科学家曾在患肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。 如何解释这一现象？ 病人体内的病毒等诱导多个体细胞融合，形成了多核细胞。 肺结核病人病理切片 拓 展 动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较 植物体细胞杂交 动物细胞融合 原理 细胞融合前的处理方法 诱导细胞融合的方法 细胞融合成功的标志 结果 意义 遗传信息 细胞膜具有一定的流动性、 植物细胞的全能性 细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖 用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁 用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞 物理法：电融合法、离心法； 化学法：聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法 PEG融合法、电融合法、 ▲灭活病毒诱导法 再生出细胞壁 细胞核的融合 杂种植株 杂交细胞 打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种 突破了有性杂交的局限， 使远缘杂交成为可能 具有原来两个或多个细胞的遗传信息 情境导入 小 结 (1)与植物原生质体融合相比，动物细胞融合特有的诱导因素有聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒(　　) 与植物原生质体融合相比，动物细胞融合特有的诱导因素是灭活的病毒。 × (2)灭活的含义是用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构(　　) √ 判断正误 44 落实　思维方法 1.如图表示仙台病毒诱导动物细胞融合的部分过程，下列叙述正确的是 A.细胞a和细胞b必须为同种细胞才能融合 B.细胞c同时有细胞a和细胞b的遗传物质 C.该融合过程体现了细胞膜具有选择透过性 D.此过程的原理是动物细胞具有全能性 √ 落实　思维方法 2.对比动物细胞融合和植物体细胞杂交技术，下列论述正确的是 A.均可使用PEG、电融合或灭活病毒诱导细胞融合 B.两者都可以跨越种属间的生殖隔离 C.两者都可以体现细胞的全能性 D.在适宜的条件下，均可产生完整个体 √ 1 动物细胞培养的条件和过程 2 干细胞培养及其应用 3 动物细胞融合技术 4 单克隆抗体及其应用 目录 产量低，纯度低，特异性差 反复 注射 动物体内 抗原 多种浆细胞 多种抗体（血清） 缺点 （2）什么细胞分泌抗体？ 浆细胞（B淋巴细胞分化） （3）抗体主要分布在哪里？ 血清 （4）早期获得抗体的方法有哪些？ 1.传统抗体的制备 2.大量制备单一抗体的思路和需解决的问题 单 克 隆 抗 体 一个B淋巴细胞 细胞群 抗体 克隆 （1）什么是抗体？ 机体受抗原刺激后产生的，能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 B淋巴细胞不可能无限增殖 情境导入 四、单克隆抗体及其应用 １：什么细胞具有无限增殖的能力？ ２：有什么方法能培养出既能分泌抗体且无限增殖的细胞？ 骨髓瘤细胞（癌细胞） 动物细胞融合 一个极富创造力的方案： 1975年，发明了单克隆抗体的制备技术； 1984年，诺贝尔生理学或医学奖 米尔斯坦【英国】 柯勒【德国】 动物细胞融合 杂交细胞 动物细胞培养 单克隆抗体 骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖 一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体 杂交瘤细胞 既能迅速大量增殖，又能产生特定抗体 新知讲授 四、单克隆抗体及其应用 注射到腹腔 注射抗原 培养骨髓瘤细胞 多种B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 细胞融合 多种杂交细胞 诱导融合 抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞 体外培养 用特定抗原对小鼠进行免疫，并从其脾中获取能产生特定抗体的B淋巴细胞 用特定的选择培养基进行筛选：只有融合的杂交瘤细胞才能生长 多次克隆化培养和抗体检测，再筛选 体外大规模培养或注射到小鼠腹腔内增殖 从培养液或小鼠腹水中获得大量的单克隆抗体 杂交瘤细胞 单克隆抗体 第一次筛选：获得杂交瘤细胞 第二次筛选：获得能产生特定抗体的杂交瘤细胞 能产生抗体，但不能大量繁殖 能大量繁殖，但不能产生抗体 既能大量繁殖 又能产生抗体 既能大量繁殖 又能产生特定抗体 新知讲授 尝试构建制备单克隆抗体的流程 新知讲授 思考1:进行诱导融合后，培养基中共出现几种细胞？其中融合的细胞有几种？(若融合的话，只考虑两两融合) 5种 骨髓瘤+B细胞 骨髓瘤+骨髓瘤 B细胞+B细胞 骨髓瘤(未融合) B细胞(未融合) 理论上融合的细胞有3种。 体系中出现多种类型细胞的原因? 细胞融合是随机的，且融合率达不到100%。 思考2:单克隆抗体制备过程中，第一次筛选的目的是什么？方法是什么？ 资料：已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。 ①免疫的B淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但它不能分裂增殖，其本身也不 能在体外长期存活。 ②鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但它能不断分裂增殖。如果它的D途径 被阻断的话，它会因不能合成DNA而死亡。 筛选出杂交瘤细胞 特定的选择培养基筛选 B淋巴细胞 合成DNA S途径 D途径 不能分裂增殖 骨髓瘤细胞 合成DNA D途径 能无限增殖 杂交瘤细胞 合成DNA S途径 D途径 能无限增殖 培养基中加入氨基喋呤 B淋巴细胞+B淋巴细胞 能合成DNA，不能无限增殖，死亡 骨髓瘤细胞+骨髓瘤细胞 不能合成DNA，不能增殖，死亡 杂交瘤细胞（B淋巴+骨髓瘤） 能合成DNA且能无限增殖，存活 核心探讨 资料：在单克隆抗体制备过程中，要用特定的HAT选择培养基筛选出杂交瘤细胞，筛选的过程利用了哺乳动物DNA合成的原理。哺乳动物DNA合成有两个途径，物质A可以阻断其中的全合成途径（D途径）(如图)。正常细胞内含有补救合成途径（S途径）所必需的转化酶和激酶，制备单克隆抗体时选用的骨髓瘤细胞中缺乏转化酶。 请据图分析回答下列问题： 在培养基中含有H、A、T的情况下，会导致骨髓瘤细胞和B细胞死亡的原因是什么？ 只有杂交瘤细胞才能存活并增殖，原因是什么? 培养基含有物质A且骨髓瘤细胞中缺乏转化酶，因此，骨髓瘤细胞不能合成DNA，不能增殖而导致死亡； B细胞为成熟细胞，没有增殖能力，也会死亡。杂交瘤细胞可以利用B细胞中的转化酶，通过补救合成途径合成DNA，能存活并增殖。 拓 展 思考3:单克隆抗体制备过程中，第二次筛选的目的、方法及其原理是什么？ 筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞 方法是抗体检测，其原理是抗原—抗体的特异性结合 克隆化培养和抗体检测 ★ 有限稀释法 每一个孔中尽量只接种 一个杂交瘤细胞（克隆化培养） 侧面模拟图 克隆化培养一段时间 取上清液进行抗体检测 上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔 阳性孔中的细胞还 保证是来自单个细胞，挑选 孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为 能产生特定抗体的杂交瘤细胞。 不能 阳性 项目 腹腔培养 体外培养 优点 缺点 易于控制培养条件 可大规模培养、大量生产 规模小，产量少 需要人为控制培养基，成本相对较高 核心探讨 使用96孔板培养杂交瘤细胞，尽可能每一个孔只接种一个杂交瘤细胞，即将单个杂交瘤细胞单独培养，通过克隆化培养+抗体检测，即可获得大量产生所需抗体的杂交瘤细胞。 【两次筛选的比较】 项目 第一次筛选 第二次筛选（需要多次筛选） 筛选原因 筛选方法 筛选结果 诱导融合后得到的细胞中， 除杂交瘤细胞之外， 还有未融合的亲本细胞， 也有融合的具有同种核的细胞。 用特定的选择培养基筛选： 未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。 筛选获得杂交瘤细胞（多种） 因为小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择培养基筛选获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞。 用96孔板培养，在每个孔中尽量接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到足够数量的能分泌特定抗体的细胞 获得能分泌特定抗体的杂交瘤细胞 情境导入 小 结 分析单克隆抗体的应用 资料1：用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的"早早孕诊断试剂盒"，在妊娠第8天就可以作出诊断，这比原来的方法提前了10d左右。可以避免孕妇在知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成了不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。 核心探讨 分析单克隆抗体的应用 资料2：使用高效的细胞毒素类药物进行化疗，可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体—药物偶联物（antibody-drug conjugates，ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。 抗体 药物接头 细胞凋亡 ADC被细胞吞噬 核心探讨 分析单克隆抗体的应用 (1)ADC的抗体和药物各具有什么作用？ 抗体主要发挥靶向运输作用，即通过特异性结合靶细胞表面的抗原，将连接的药物输送到靶细胞； (2)除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？ 药物发挥治疗效应，如杀伤靶细胞。 (3)单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势？ ①可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗； ②一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行疾病治疗。 ①单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原发生反应，因此检测的特异性和灵敏度大大提高；生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用，有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒。②ADC在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点，原因是ADC中的单克隆抗体能将细胞毒素定向带到癌细胞所在位置，在原位杀死癌细胞，不损伤正常细胞。 核心探讨 ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。 单克隆抗体的优点 （1）能准确地识别抗原的细微差异； （2）与特定抗原发生特异性结合； （3）可以大量制备。 单克隆抗体的应用 （1）广泛用作诊断试剂 利用同位素或荧光标记的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。 （2）用于治疗疾病和运载药物： 四、单克隆抗体及其应用 优点：准确、高效、简易、快速。 a、特异性强、灵敏度高，可以大量制备。 生物导弹——单克隆抗体＋抗癌药物+放射性同位素 b、位置准确、疗效高、毒副作用小。 结合同位素的单抗 治疗B细胞淋巴瘤 新知讲授 四、单克隆抗体及其应用 诱导其融合的方法有哪些？ 注射特定抗原的目的是什么？ 大量增殖杂交瘤细胞获得单克隆抗体的方法 两次筛选的目的 获得能产生特定抗体的B淋巴细胞 物理：电融合法 第1次筛选：得到杂交瘤细胞（多种）。 体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖。 多种B淋巴细胞 B淋巴细胞 注射特定抗原 骨髓瘤细胞 融合 B-B细胞 杂交瘤细胞 瘤-瘤细胞 多种杂交瘤细胞 符合要求的杂交瘤细胞 抗原—抗体杂交法 筛选2 克隆化培养 体外培养 小鼠腹腔内增殖 单克隆抗体 B细胞 瘤细胞 选择培养基 筛选1 化学：聚乙二醇 （PEG）融合法 生物：灭活病毒诱导法 第2次筛选：得到能产生特定抗体的杂交瘤细胞。 情境导入 小 结 四、单克隆抗体及其应用 单克隆抗体制备过程中应用到的细胞工程技术手段 杂交瘤细胞特点 单克隆抗体的优点 原理 既可以产生抗体，又可以大量增殖 动物细胞融合、 动物细胞培养 细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖 多种B淋巴细胞 B淋巴细胞 注射特定抗原 骨髓瘤细胞 融合 B-B细胞 杂交瘤细胞 瘤-瘤细胞 选择性培养基 多种杂交瘤细胞 符合要求的杂交瘤细胞 抗原—抗体杂交法 筛选2 克隆化培养 体外培养 小鼠腹腔内增殖 单克隆抗体 B细胞 瘤细胞 筛选1 ① 能准确地识别抗原的细微差异。 ② 与特定抗原发生特异性结合。 ③ 可以大量制备。 情境导入 小 结 (1)B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后，得到的都是杂交瘤细胞(　　) B淋巴细胞与骨髓瘤细胞如两两融合，得到的融合细胞有3种，即B淋巴细胞自身融合细胞、骨髓瘤细胞自身融合细胞和杂交瘤细胞，需要筛选才能得到杂交瘤细胞。 × (2)单克隆抗体制备过程中两次筛选的目的相同(　　) 单克隆抗体制备过程中第一次筛选是为了筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选是为了获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。 × (3)ADC的抗体具有靶向运输作用，药物具有治疗作用(　　) √ 判断正误 62 落实　思维方法 3.(2023·北京，12)甲状旁腺激素(PTH)水平是人类多种疾病的重要诊断指标。研究者制备单克隆抗体用于快速检测PTH，有关制备过程的叙述不正确的是 A.需要使用动物细胞培养技术 B.需要制备用PTH免疫的小鼠 C.利用抗原－抗体结合的原理筛选杂交瘤细胞 D.筛选能分泌多种抗体的单个杂交瘤细胞 √ 落实　思维方法 4.(2023·河南焦作高二月考)如图表示抗人体胃癌的单克隆抗体的制备过程，下列有关叙述正确的是 A.图中实验小鼠注射的甲是能与抗人体胃癌抗原特异性结合的抗体 B.只能利用化学方法(如聚乙二醇)和物理方法(如电激)等诱导细胞融合获得乙 C.用特定的选择培养基对乙进行筛选，融合细胞均能生长，未融合细胞均不能生长 D.丙需进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选后可获得大量能分泌所需抗体的丁 √ 动物细胞融合技术 单克隆抗体的制备 单克隆抗体的应用 1.动物细胞融合的概念、结果、原理、意义是什么？ 2.动物细胞融合常用的方法； 3.动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较。 1.诊断试剂 2.运载药物 3.治疗疾病 1.单克隆抗体制备的研究背景 2.单克隆抗体制备 动物细胞融合技术与单克隆抗体 情境导入 总 结 五分钟查落实 【要语必背】 1.动物细胞融合技术就是使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。 2.诱导动物细胞融合的常用方法有PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等。 3.细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。目前，这一技术已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段，特别是利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。 4.经过多次筛选获得的能产生所需抗体的杂交瘤细胞可以在体外条件下大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖。最终从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体。 【长句表达】 1.单克隆抗体制备过程中，首先给小鼠注射特定抗原的目的是_________ 。 2.单克隆抗体制备过程中涉及两次筛选：第一次筛选的目的是_________ ，方法是 ；第二次筛选的目的是 ，方法是 ，其原理是 。 3.杂交瘤细胞的特点是 。 诱导小鼠 产生能够分泌特定抗体的B淋巴细胞 筛选出杂 交瘤细胞 用特定的选择培养基进行筛选 筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞 抗体检测 抗原—抗体的特异性结合 既能迅速大量增殖，又能产生足够数量的特定抗体 4.单克隆抗体的优点是___________________________________________ 。 5.ADC在临床应用上的优势是_____________________________________ ______________________________________________________________________________ 。 能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生 特异性结合，并且可以大量制备 能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用 和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用，因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点 Lavf57.25.100 EVCapture4.2.2软件录制 Lavf57.25.100 本视频由湖南一唯信息科技开发的EV录屏软件录制，www.ieway.cn Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.7.57 $$