重难02 单克隆抗体与细胞工程 高频重难题型通关（重难点突破讲义）高二生物下学期人教版

重难02 单克隆抗体与细胞工程 高频重难题型通关 1. 理解植物细胞工程的理论基础，掌握植物组织培养与植物体细胞杂交的原理和流程。 2. 掌握动物细胞培养的条件、过程及关键操作，明确与植物组织培养的区别。 3. 理解动物体细胞核移植的原理、过程及应用前景。 4. 熟练掌握单克隆抗体制备的全过程，理解杂交瘤细胞的特点及单克隆抗体的应用。 5. 能辨析动植物细胞工程的技术差异，准确判断各步骤的目的与原理。 一、植物细胞工程 （1）理论基础 植物细胞的全能性：已分化的植物细胞，仍具有发育成完整个体的潜能。 （2）核心技术 ① 植物组织培养技术 过程阶段 核心内容 外植体处理 取自植物的离体器官、组织或细胞，消毒后接种 脱分化 在生长素、细胞分裂素诱导下，形成愈伤组织（未分化、高度液泡化的薄壁细胞团） 再分化 调整激素比例，诱导愈伤组织分化出芽、根，形成试管苗 移栽成活 试管苗炼苗后，移栽至大田，发育为完整植株 ② 植物体细胞杂交技术 步骤 核心内容 原生质体制备 用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，获得原生质体 原生质体融合 物理法（离心、振动、电激）/ 化学法（PEG 聚乙二醇）诱导融合 再生细胞壁 融合细胞再生出细胞壁，标志融合成功 植物组织培养 对杂种细胞进行脱分化、再分化，培育为杂种植株 技术意义 克服远缘杂交不亲和的障碍，培育作物新品种 （3）关键条件 1　 植物组织培养：无菌环境、适宜的温度 /pH、光照、生长素与细胞分裂素的比例调控 2　 植物体细胞杂交：原生质体需在等渗溶液中操作，防止吸水涨破 二、动物细胞工程 （1）动物细胞培养技术 ① 原理 细胞增殖（动物体细胞不具有发育成完整个体的全能性） ② 培养过程 阶段 核心内容 原代培养 用胰蛋白酶 / 胶原蛋白酶处理动物组织，制成细胞悬液，初次培养 传代培养 细胞贴壁生长、接触抑制后，用胰蛋白酶处理，分瓶继续培养 细胞株 / 细胞系 传代培养中，遗传物质未改变的为细胞株；遗传物质改变、无限增殖的为细胞系 ③ 培养条件 a. 无菌、无毒的环境：定期更换培养液，清除代谢废物 b. 营养：血清、血浆等天然成分，糖、氨基酸、无机盐等 c. 适宜温度（36.5±0.5℃）和 pH（7.2~7.4） d. 气体环境：95% 空气（细胞代谢）+5% CO₂（维持培养液 pH） （2）动物体细胞核移植技术 ① 原理 动物体细胞核的全能性（已分化的体细胞核，仍具有发育成完整个体的潜能） ② 操作过程 步骤 核心内容 供体细胞处理 取动物体细胞，培养至传代 10 代以内，保持正常核型 受体细胞准备 采集MⅡ 中期的卵母细胞，显微操作去除细胞核 核移植与融合 将供体细胞注入去核卵母细胞，电刺激使两细胞融合 胚胎激活与培养 用物理 / 化学方法激活重构胚，培养至桑椹胚或囊胚 胚胎移植 将胚胎移植到代孕母体子宫，发育为克隆动物 （3）动物细胞融合技术 1　 诱导方法：PEG、电激、灭活的病毒（特有方法，如仙台病毒） 2　 应用：单克隆抗体制备、基因工程、细胞生物学研究 三、单克隆抗体制备技术 （1）原理 ①B 淋巴细胞（浆细胞）：能产生特异性抗体，但不能无限增殖 ②骨髓瘤细胞：能无限增殖，但不能产生抗体 ③融合后获得杂交瘤细胞：兼具两者特点，既能无限增殖，又能产生专一抗体 （2）制备过程 步骤 核心内容 免疫小鼠 用特定抗原注射小鼠，使小鼠产生能分泌相应抗体的 B 淋巴细胞 细胞融合 将 B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞混合，用 PEG / 灭活病毒诱导融合 第一次筛选 在选择培养基上培养，筛选出杂交瘤细胞（淘汰未融合、自身融合细胞） 第二次筛选 克隆化培养 +抗体检测（抗原 - 抗体杂交），筛选出能产生所需特异性抗体的杂交瘤细胞 大量培养 体外培养（培养液）或体内培养（小鼠腹腔），提取单克隆抗体 （3）单克隆抗体特点与应用 1) 特点：特异性强、灵敏度高、可大量制备 2) 应用：① 诊断试剂：精准检测病原体、肿瘤标志物等② 治疗疾病：靶向治疗（生物导弹，将药物与单克隆抗体结合，定向作用于病灶）③ 运载药物：作为载体，精准递送药物 四、动植物细胞工程关键差异 对比项目 植物细胞工程 动物细胞工程 理论基础 植物细胞的全能性 细胞增殖、动物体细胞核的全能性 工具酶 纤维素酶、果胶酶（去壁） 胰蛋白酶 / 胶原蛋白酶（分散细胞） 融合方法 物理法、化学法 物理法、化学法、灭活病毒法 培养结果 完整植株 细胞株 / 细胞系、克隆动物 特殊条件 激素调控（生长素、细胞分裂素） 血清 / 血浆、CO₂培养箱 五、核心易错拓展 1. 植物体细胞杂交的终点是培育出杂种植株，而非仅获得融合细胞 2. 动物细胞培养的接触抑制：细胞贴壁生长到表面相互接触时，停止分裂增殖 3. 核移植选用 MⅡ 中期卵母细胞的原因：细胞质中含有激发细胞核全能性的物质 4. 单克隆抗体制备需两次筛选，两次筛选的目的、方法完全不同 5. 植物组织培养中，生长素比例高促进生根，细胞分裂素比例高促进生芽 题型01 植物组织培养技术综合分析题 【方法与技巧】 核心突破：紧扣植物细胞全能性这一理论基础，牢记 “外植体→愈伤组织→试管苗” 的流程，重点辨析脱分化、再分化的概念及激素调控规律。 分类 核心内容 易错点秒杀 ① 外植体必须是离体的器官、组织或细胞，死细胞 / 高度分化的筛管细胞无法培养；② 激素调控：生长素 / 细胞分裂素比例高→促生根；比例低→促生芽；比例适中→维持愈伤组织；③ 植物组织培养属于无性生殖，能保持母本遗传性状，不发生基因重组；④ 脱分化需要避光，再分化需要光照（叶绿素合成需光）；⑤ 愈伤组织是无定形、高度液泡化、薄壁、未分化的细胞团，不是高度分化。 解题步骤 先定位流程步骤→判断对应生理过程（脱分化 / 再分化）→分析培养基条件与激素配比→验证育种原理。 【典例解析】 【典例1】马铃薯长期进行无性繁殖易积累病毒，导致种性退化。科研人员采用植物组织培养技术培育脱毒马铃薯，并进一步研究了不同大小茎尖外植体对脱毒效果和成苗率的影响，结果如表所示。下列叙述错误的是（　　） 茎尖长度/mm 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 脱毒率/% 95 88 70 45 20 成苗率/% 10 40 75 85 88 A．选取茎尖分生组织是因为该细胞高度分化，易表达出全能性 B．由表可知，外植体越小，脱毒效果越好，成苗率越低 C．生产中应综合考虑脱毒率和成苗率来选择合适的茎尖 D．脱毒苗移栽前需要使其逐渐适应外界环境，以提高成活率 【典例2】植物组织培养技术在科学研究和生产实践中得到了广泛的应用。研究表明：在植物组织培养过程中，外源的生长调节剂的比例会影响愈伤组织的生长和分化，相对高的IAA（生长素）/KT（细胞分裂素类似物）有利于根形成，反之有利于芽形成。研究人员先将离体的烟草细胞培养形成愈伤组织，然后将愈伤组织分割接种到含有不同比例IAA和KT的MS培养基中培养。实验处理与结果如下表。（表中各培养基的生长调节剂浓度单位是mg/L）。回答下列问题： 编号 MS培养基中的激素含量 分化情况 IAA KT 1 0 0 不分化 2 0 2 分化芽 3 2 0 分化根 4 0.2 2 分化芽 5 2 0.2 不分化 6 0.02 2 分化芽 7 2 0.02 分化根 （1）植物微型繁殖技术的原理是　 　 。 （2）为了获得脱毒苗，可以选取植物的　 　 进行组织培养。若为了获得细胞产物，则只需培养到　 　 阶段。 （3）从叶片的叶肉细胞到获得胚状体的过程中，需要经过　 　 。 ①无丝分裂 ②有丝分裂 ③减数分裂 ④植物体细胞杂交 ⑤细胞融合 ⑥脱分化 ⑦再分化 A．①⑤⑥ B．②⑥⑦ C．②④⑥ D．②④⑥⑦ （4）利用植物组织培养技术将一个细胞培养成一个完整植株的基本程序是　 　 （用文字和箭头图表示）。需要在培养基中加入植物激素调整细胞分裂、分化的是　 　 阶段。 （5）愈伤组织形成和生长、分化常在MS培养基上进行，据此推断MS培养基中的碳源是　 　 （填“有机碳源”或“无机碳源”）。 （6）上述实验结果支持题干中的观点，判断的依据是　 　 。 题型02 植物体细胞杂交技术与育种应用题 【方法与技巧】 核心突破：掌握 “去壁→融合→再生壁→组织培养” 的完整逻辑，理解该技术克服远缘杂交不亲和的重大意义。 分类 核心内容 易错点秒杀 ① 去壁酶为纤维素酶 + 果胶酶，不可用蛋白酶；② 融合成功的最终标志是再生出新的细胞壁，而非原生质体融合完成；③ 杂种植株的培育终点是完整植株，不是仅获得融合细胞；④ 融合方法为物理法（离心、振动、电激）、化学法（PEG），无灭活病毒法；⑤ 原理是细胞膜流动性和植物细胞全能性，不是基因重组。 解题步骤 先分析酶解步骤→判断融合方法→确认杂合细胞类型（杂种细胞）→梳理培育流程的终点（获得杂种植株）。 【典例剖析】 【典例1】动物细胞融合技术与植物体细胞杂交技术均完成了两种细胞遗传物质的融合。下列关于两者的叙述，错误的是（　　） 选项 项目 动物细胞融合 植物体细胞杂交 A 融合原理 细胞膜具有流动性 细胞膜具有流动性 B 诱导融合的手段 可用灭活病毒诱导法 一般采用物理法和化学法 C 实验的结果 获得杂交细胞，生产细胞产品 可获得杂种植株 D 用途 制备单克隆抗体 高效、快速地实现种苗的大量繁殖 A．A B．B C．C D．D 【典例2】某种细菌感染植物后可导致植物死亡，甲植物的细胞核基因具有抗该种细菌感染的效应，乙植物的细胞质基因具有高产效应。为获得具备优良特性的杂种植株，某研究人员进行了如下实验，①﹣④表示相关过程或操作。请回答下列问题： （1）过程①可用 　 　 酶去除细胞壁获得原生质体。从细胞结构的角度分析，对甲原生质体A1和乙原生质体B1进行“失活处理”的部分分别是 　 　 。过程②可代表人工诱导原生质体融合，常用的化学方法是 　 　 、　 　 等（答出两点）。 （2）过程③、④分别称为 　 　 。如表表示不同浓度的2，4﹣D和6﹣BA组合对杂种细胞形成愈伤组织的影响（诱导率），诱导杂种细胞形成愈伤组织的最佳激素配比浓度为 　 　 。 处理 激素浓度（mg/L） 诱导率/% 2，4﹣D 6﹣BA 1 3 0 52.1±2.2 2 5 0 55.2±2.1 3 3 0.1 42.4±1.9 4 5 0.1 46.9±2.0 5 7 0.1 38.6±1.4 6 3 0.3 43.7±2.8 （3）该杂种植物的培育过程中利用了植物体细胞杂交技术，与传统杂交技术相比，植物体细胞杂交技术在 　 　 等方面展示出独特的优势。 题型03 动物细胞培养与核移植技术辨析题 【方法与技巧】 核心突破：区分原代培养与传代培养，掌握接触抑制现象；核移植重点在于理解MⅡ 中期卵母细胞的选择原理。 分类 核心内容 易错点秒杀 ① 接触抑制：动物细胞贴壁生长至表面相互接触时，停止分裂，只能形成单层细胞；② 动物细胞培养需加血清 / 血浆，植物组织培养不需要；③ 核移植必须选MⅡ 中期卵母细胞，因其细胞质含激发核全能性的物质；④ 气体环境为95% 空气 + 5% CO₂，CO₂的作用是维持培养液 pH；⑤ 原代培养是初次培养，传代培养是分瓶培养，10-50 代细胞遗传物质可能改变，50 代后才可能癌变。 解题步骤 先识别细胞培养阶段→判断是否存在接触抑制→分析核移植受体细胞的选择理由→验证培养条件的合理性。 【典例剖析】 【典例1】羊乳的成分更接近于人乳，可作为牛乳过敏体质者最理想的替代乳品。但研究表明山羊乳中β﹣乳球蛋白也是引起人体过敏反应的一种主要致敏原，为实现羊乳“人源化”改造，研究人员利用CRISPR/Cas9系统敲除了山羊乳腺细胞中致敏原β﹣乳球蛋白（BLG）基因，同时在相应位点导入人乳铁蛋白（hLF）基因（通常只在乳腺细胞中表达）。该研究为培育羊乳中低致敏原和富含人乳铁蛋白功能营养成分的转基因山羊新品种提供了科学依据。如图为研究人员利用该技术获得转基因山羊的操作过程。回答下列问题： （1）上述技术中的目的基因是 　 　 ，可通过PCR技术快速扩增目的基因，扩增时引物的作用是 　 　 。 （2）CRISPR/Cas9系统主要包含向导RNA和Cas9蛋白两个部分，利用CRISPR/Cas9系统敲除山羊乳腺细胞中致敏原β﹣乳球蛋白（BLG）基因时，科研人员设计了sgBLG引导序列，sgBLG能够通过 　 　 方式与山羊基因组中BLG基因的靶位点结合。 （3）Cas9蛋白类似于基因工程中常用到的 　 　 酶，但Cas9蛋白特性与该酶的区别是 　 　 。 （4）检测发现过程②中，hLF基因成功插入在母羊乙成纤维细胞中的一条常染色体上。上图过程①②运用到的技术有 　 　 ，过程③④⑤中，运用到的技术有 　 　 （编号选填）。 ①显微注射技术 ②动物细胞培养技术 ③胚胎移植技术 ④DNA重组技术 ⑤动物细胞融合技术 ⑥细胞核移植技术 （5） 筛选后得到的早期胚胎细胞中没有检测到该蛋白，能否说明目的基因没有成功导入并表达，理由是 　 　 。 【典例2】白暨豚是研究鲸类进化的珍贵“活化石”，曾经广泛分布于长江流域，但由于多种因素，在自然环境中，白暨豚已经无法维持其种群的繁衍能力。如图表示利用现代生物技术拯救白暨豚的构想，回答下列问题： （1）图中所用的现代生物技术除动物细胞培养、动物细胞核移植外，还有 　 　 。体细胞进行体外培养时需要无菌、无毒的环境，具体操作是 　 　 ，图中过程应将卵母细胞培养到 　 　 期再去除细胞核，去除细胞核的常用方法是 　 　 。 （2）重构胚是指人工重新构建的胚胎，需要用物理或化学方法进行激活，使其完成细胞分裂和发育进程，激活重构胚的化学物质有 　 　 （答出2点），通过核移植技术获得的克隆白暨豚与提供细胞核的白暨豚并不完全相同，请分析可能的主要原因：　 　 。 （3）重构胚早期发育通过卵裂方式进行分裂，卵裂时期胚胎的特点是 　 　 。 题型04 单克隆抗体制备与应用综合题 【方法与技巧】 核心突破：彻底掌握两次筛选的目的、杂交瘤细胞的特点（无限增殖 + 产专一抗体）、单克隆抗体的优点。 分类 核心内容 易错点秒杀 ① 两次筛选目的不同：第一次用选择培养基筛选杂交瘤细胞，第二次用抗原 - 抗体杂交筛选能产特异性抗体的杂交瘤细胞；② 杂交瘤细胞特点：既能无限增殖，又能产生专一抗体；③ 单克隆抗体优点：特异性强、灵敏度高、可大量制备；④ 动物细胞融合可用 PEG、电激、灭活病毒（特有），并非只能用灭活病毒；⑤ “生物导弹” 是单克隆抗体 + 药物，抗体起导向作用，药物起杀伤作用。 解题步骤 先识别细胞融合结果→定位筛选阶段→描述杂交瘤细胞特性→应用推导（生物导弹原理）→验证两次筛选的区别。 【典例剖析】 【典例1】癌细胞具有自身的抗原性，人体的特异性免疫系统能识别并去除癌细胞。人乳头瘤病毒（HPV）可将自身DNA整合到人体特定细胞，引发癌变并形成肿瘤。为了研究同一HPV引发的肿瘤是否具有相同的抗原性，科学小组展开了研究。回答下列问题：材料和药剂：遗传背景完全相同成年雄性小鼠若干只，HPV病毒株 实验思路： 取小鼠若干只，随机均分为甲、乙、丙三组 分组和处理如下：甲组：小鼠+HPV+正常饮食；乙组：小鼠+HPV+正常饮食 丙组：小鼠+_____ 饲养一段时间后，去除甲组和乙组的肿瘤（体外培养肿瘤细胞）后进一步处理如下： 组①：部分甲组小鼠+来自甲的肿瘤细胞 组②：部分乙组小鼠+_____ 观察癌细胞在小鼠体内形成肿瘤的情况 （1）丙组的处理是 　 　 ，处理的作用是 　 　 。组②的处理是 　 　 。 结果证实同一HPV引发的肿瘤只具有少部分相同的抗原性，检测准确性较低，因此科研人员根据抗HPV的单克隆抗体可以准确检测出HPV，进行了HPV45的抗L1蛋白单克隆抗体的制备与研究，如图是制备出单克隆抗体的过程： （2）图中给小鼠注射的特定的抗原是 　 　 。产生抗体的淋巴细胞（效应B细胞）需要与骨髓瘤细胞融合的原因是 　 　 ，过程需要用到 　 　 作为化学诱导剂，单克隆抗体制备过程运用了 　 　 和 　 　 等技术手段。 （3）图中单克隆抗体的制备过程中通常有两次筛选，第一次筛选的目的是 　 　 ，获得的细胞过程⑥中将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔细胞培养板上，尽量使每个孔只接种1个杂交瘤细胞，然后通过ELISA法（又称酶联免疫吸附试验法）检测各孔上清液中细胞分泌的 　 　 。 （4）⑦过程的目的是 　 　 ，最终在小鼠的 　 　 获得大量单克隆抗体。 【典例2】人类乳头瘤病毒（HPV）有多种亚型，HPV45属于高危型，与宫颈癌的发生密切相关。L1蛋白是组成HPV病毒衣壳的主要结构蛋白，科研人员进行了HPV45的抗L1蛋白单克隆抗体的制备与研究。回答下列问题： （1）提取HPV45的L1蛋白，注射到小鼠体内，其目的是 　 　 。一段时间后，取小鼠脾脏组织，剪碎用 　 　 酶处理，使其分散成单个细胞制成细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞诱导融合，筛选出杂交瘤细胞。 （2）将得到的杂交瘤细胞接种到多孔培养板进行 　 　 培养，分别取其上清液进行 　 　 检测，检测的原理及操作流程如图1。经多次筛选后，取A、B、C、D四种杂交瘤细胞上清液进行检测，结果如图2。 ①据图分析，实验过程中需将 　 　 作为抗原固定在固相载体上，分别取 　 　 加入反应体系，经洗涤后加入酶标抗体形成复合物，再次洗涤，加入相应底物，复合物携带的酶可与相应底物反应显色，测吸光值，颜色越深吸光值越高。 ②图2结果表明 　 　 。 ③依据图2结果，研究人员推测A、B、C、D四种上清液中，A上清液的抗体与L1蛋白结合的位点是HPV45型病毒识别并侵染人体细胞的关键位点。为探究此推测，进行实验， 实验步骤如下： 步骤一：将小鼠宫颈细胞悬液均分为四组，编号甲、乙、丙、丁； 步骤二：从稀释倍数为1：320的A、B、C、D（杂交瘤细胞）上清液中分离提纯抗体，　 　 。 步骤三：在相同且适宜的条件下培养一段时间，检测培养液中被侵染的宫颈细胞比例。实验预期结果与结论：若 　 　 ，则推测正确。 （3） 科研人员制备HPV45的抗L1蛋白单克隆抗体，在医学方面的应用有 　 　 。 题型05 动植物细胞工程技术对比与综合大题 【方法与技巧】 核心突破：综合考查动植物细胞工程的原理、工具、结果差异，是期中压轴大题的常见形式。 分类 核心内容 易错点秒杀 ① 原理差异：植物细胞工程原理是细胞全能性，动物细胞培养原理是细胞增殖，核移植原理是细胞核全能性；② 工具酶差异：植物用纤维素酶、果胶酶去壁，动物用胰蛋白酶 / 胶原蛋白酶分散细胞；③ 融合方法差异：植物只有物理、化学法，动物多了灭活病毒法；④ 培养条件差异：植物需植物激素，动物需血清、CO₂培养箱；⑤ 产物差异：植物最终获得完整植株，动物获得细胞群 / 克隆动物。 解题步骤 审题圈画关键词（植物 / 动物、去壁 / 分散、植株 / 细胞）→对应原理、工具、条件的差异→逐一判断选项 / 填空→规范使用教材术语作答。 【典例剖析】 【典例1】如表格表示高等动植物亲代个体产生新个体的3种不同途径，请根据表中信息分析并回答问题： 生物 途径 主要流程 动植物 甲 亲代个体→受精卵→新个体 植物 乙 亲代个体→体细胞→试管苗→新个体 动物 丙 亲代个体→核移植细胞→早期胚胎→新个体 （1）甲、乙、丙途径中属于有性生殖的是 　 　 （填“甲”“乙”或“丙”）。 （2）相比于甲，乙、丙途径在应用上的优点是 　 　 （写出两点）。乙途径依据的原理是 　 　 。 （3）丙途径中，早期胚胎→新个体的流程中需要采用的生物工程技术是 　 　 。该途径获得的新个体与供核的亲代个体性状不完全相同的原因是 　 　 。 （4）若从乙、丙途径获得的新个体中各取一小块组织进行体外培养。下列叙述错误的有 　 　 （填字母）。 a．前者需先用盐酸解离，后者需先用胰蛋白酶处理 b．前者培养基中一般加入蔗糖，后者一般加入葡萄糖 c．两者培养过程中均需要保证无菌条件，以防止杂菌污染 【典例2】Ⅰ.供体细胞的分化状态和表观遗传修饰模式是影响体细胞核移植胚胎发育的重要因素。为研究供体细胞RNAmA修饰（即RNA某位点的甲基化）水平对猪核移植胚胎发育的影响，研究者进行系列实验。 （1）核移植的受体是 　 　 细胞，核移植后的重构胚发育至 　 　 阶段可利用 　 　 技术转移到代孕母体子宫内以获得子代个体，从早期胚胎中分离获得的具有自我更新和分化潜能的 　 　 可用于医学研究。 （2）RNAm6A修饰可通过提高mRNA结构稳定性来影响早期胚胎发育。猪骨髓间充质干细胞（甲组）属于多能干细胞，猪胎儿成纤维细胞（乙组）则是处于分化终端的体细胞。研究者比较了两细胞内RNAm6A修饰水平及其作为核供体时重构胚的发育效率，结果如图1、2。结果表明，核供体细胞的分化程度越高，　 　 越低。 Ⅱ.兰花人工种子由人工种皮、原球茎和人工胚乳构成。原球茎是由胚性细胞组成、形态类似球茎的结构，可发育成完整植株，人工胚乳可调控原球茎的休眠，并为原球茎的发育提供营养成分和激素。回答下列问题： （3）从盆兰花获取茎尖，对其进行 　 　 处理后接种于培养基，茎尖通过 　 　 后生长为原球茎。原球茎在发芽培养基上可很快长出幼叶，然后在生根培养基中形成完整植株。 （4）将原球茎切成小块，转入增殖培养基进行继续培养，可以得到大量原球茎，实现兰花的快速繁殖。在增殖培养基中添加椰子水，原球茎会长得更饱满。不同成熟度椰子的椰子水对原球茎生长的促进效果不同，推测原因是不同成熟度椰子的椰子水中 　 　 和 　 　 的含量存在差异。 （5）某实验研究发现，与添加用过滤除菌法处理的椰子水（A组）相比，人工胚乳中添加用湿热灭菌法处理的椰子水（B组）使原球茎的休眠时间变短。研究人员推测B组原球茎休眠时间短的原因是脱落酸被破坏。作出上述推测的依据是：椰子水中有脱落酸； 　 　 ；脱落酸不耐高温。为了验证上述推测，可增加一组实验（C组），C组的处理是：　 　 。 1.下列关于植物组织培养的叙述，符合最新教材表述且正确的是（） A. 外植体经灭菌处理后接种，可防止杂菌污染 B. 脱分化过程需要光照，以促进叶绿素的合成 C. 愈伤组织细胞具有细胞壁薄、高度液泡化、未分化的特点 D. 生长素与细胞分裂素比例适中时，可促进愈伤组织分化出芽和根 2.利用植物体细胞杂交技术培育 “白菜 — 甘蓝” 杂种植株，下列关键操作及原理分析错误的是（） A. 去壁需用纤维素酶和果胶酶，不损伤原生质体 B. 原生质体融合依赖细胞膜流动性，可用 PEG 或电激诱导 C. 融合成功的标志是原生质体融合形成多核细胞 D. 杂种植株培育需经脱分化和再分化，体现细胞全能性 3.关于动物细胞培养的条件及过程，下列说法错误的是（） A. 培养液需添加动物血清，提供生长因子 B. 气体环境为 95% 空气＋5% CO₂，CO₂维持培养液 pH C. 传代培养细胞在培养瓶壁可形成多层，突破接触抑制 D. 原代培养细胞传至 10 代左右，遗传物质通常稳定 4.体细胞核移植技术中，选择 MⅡ 中期卵母细胞作为受体细胞的核心原因是（） A. 体积大，便于显微操作 B. 细胞质中含有激发体细胞核全能性的物质 C. 细胞核结构完整，遗传物质稳定 D. 能无限增殖，提供充足营养 5.下列有关动植物细胞工程技术的对比，错误的是（） A. 植物细胞工程基于全能性，动物细胞工程不涉及全能性 B. 植物去壁用纤维素酶，动物分散细胞用胰蛋白酶 C. 植物培养加激素，动物培养加血清 D. 植物融合无灭活病毒法，动物可以用 6.棉花黄萎病是由大丽轮枝菌引起的严重棉花病害。科学家从海岛棉中提取出抗黄萎病关键基因GbVel，拟通过农杆菌转化法将其导入易感病棉花品种“中棉所12号”。如图为GbVel基因转录非模板链部分序列（GbVel基因区域无图示限制酶切割序列）及载体部分结构和酶切位点。请回答下列问题： （1）科学家先从海岛棉中获取GbVel基因的mRNA，然后经过RT﹣PCR技术可获得大量GbVel基因，该技术需要　 　 酶参与，这种方法获得的基因与直接从海岛棉中获取GbVel基因相比，其片段长度　 　 （填“更长”或“更短”）。 （2）为了使GbVel基因正确插入载体中，应选择限制酶　 　 处理载体。在利用PCR扩增GbVel基因时，可以选择的引物为　 　 。 A．5'﹣GAATTCATGGCT﹣3' B．5'﹣TCAGAGCTCCGA﹣3' C．5'﹣TCGGAGCTCTCTGA﹣3' D．5'﹣CTTAAGTACCGA﹣3' （3）将构建好的重组质粒先导入经　 　 处理的农杆菌细胞中，然后再导入棉花的愈伤组织中。以下是研究者利用植物组织培养技术快速繁殖该棉花植株的实验流程，请完成下表： 实验目的 简要操作步骤 外植体消毒与准备 选取健康茎尖，用①　 　 消毒30s，再用②　 　 溶液消毒30min 无菌冲洗 用无菌水冲洗2～3次，在超净工作台上将茎尖切成约0.5cm的小块 诱导愈伤组织 将外植体小块接种到含有适量③　 　 （植物激素）的MS培养基上 ④　 　 用含GbVcl基因的农杆菌处理愈伤组织 增殖与分化 将愈伤组织转接到一定激素比例的培养基上诱导生芽 ⑤　 　 将健壮的无根苗转接到调整了激素比例的培养基上 （4） 若要从个体水平上检测其是否抗大丽轮枝菌，应将获得的转基因棉花进行　 　 处理。 7.对疑似PRRS（猪繁殖与呼吸综合征）的病料（从得病的动物身上采集的组织或器官）进行病毒分离鉴定，获得一株高致病性PRRSV（猪繁殖与呼吸综合征病毒），通过对高致病性PRRSV的N蛋白进行研究来探讨该蛋白的抗原特性，并制备抗N蛋白的单克隆抗体。回答下列问题： （1）PRRSV N蛋白基因的克隆：提取PRRSV中的总RNA，以其中相应的RNA作为模板，利用　 　 酶逆转录成cDNA．再以cDNA为模板进行　 　 扩增，而获得N蛋白基因。 （2）表达N蛋白细胞的制备：用重组质粒　 　 合适的大肠杆菌细胞，为提高该过程的效率，需考虑重组质粒的　 　 等。将筛选过的受体细胞37℃培养液培养。 （3）单克隆抗体的制备与检测：取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合待融合细胞生长到培养孔底面积的时进行　 　 （填物质）筛选。检出的阳性孔用有限稀释法进行多次克隆化，建立单克隆抗体　 　 。最终获得的单克隆抗体是否达到实验要求的标志是　 　 ，与无关蛋白不发生反应。 （4）猪干细胞的应用：胚胎干细胞可以进行　 　 ，获得适合猴子移植的猪器官，减弱或消除排斥反应。 8.植物受伤后的再生是植物细胞工程研究的重要方向。研究者以拟南芥为材料，探究了水对植物伤口再生方向的调控机制。 （1）植物组织培养时，培养基中除无机盐、蔗糖等营养物质外，还需添加一定比例的　 　 ，以调控细胞的脱分化和再分化。 （2）研究者用拟南芥幼叶进行离体培养，设置不同琼脂浓度的培养基模拟不同水分条件：高水分组（0.75%琼脂）和低水分组（3%琼脂），检测叶柄伤口组织再生方向（图1A）。 图1A说明　 　 。研究者在琼脂培养基上放置封口膜（不透气、不透水）进行对照实验（图1B），该实验的目的是排除　 　 。 （3）为解析水分信号的下游通路，研究者检测乙烯合成基因ACS6的转录情况，结果如图2。 由此推测，水分可能通过乙烯信号通路调控伤口再生方向。为验证该推测，设计了两个实验方案，其中实验组的设计如下表。 实验方案 组别 实验处理 检测指标 一 Ⅰ组 高水分+AVG 伤口再生方向 Ⅱ组 低水分+AVG 二 Ⅰ组 高水分+AVG Ⅱ组 低水分+ACC 注：AVG为乙烯合成抑制剂、ACC为乙烯前体物质。 方案　 　 更严谨，理由是　 　 。 （4）研究发现，高水分条件下，生长素最大值出现在稍远离伤口处的根原基起始位点；而低水分条件下，最大值集中在伤口附近，且发现乙烯前体物质ACC处理可诱导生长素运输蛋白（PIN1）在根原基起始部位富集。综上研究，总结水分调控植物伤口再生方向的机制（从高水分和低水分两种条件中任选其一）。　 　 9．某同学在观察蚕豆根尖分生区组织细胞的有丝分裂实验，如图是他利用光学显微镜观察到的分裂图像。据图回答： （1）在培养蚕豆根尖的过程中，发现根尖越来越长，这是细胞生长和　 　 结果。在制作装片的过程中，染色之前需要完成的2个步骤依次是　 　 、　 　 。 （2）请根据图1的观察结果，有丝分裂分裂期的顺序依次是：　 　 。（用图1中数字和箭头来表示）。此时，图1中③所指细胞中染色体：染色单体：核DNA＝　 　 。 （3）科研人员利用植物组织培养技术将蚕豆表皮细胞培养成为一个完整的植株，其原理是该细胞含有发育所需的全套　 　 ，实验证明高度分化的植物细胞具有　 　 。 （4）镉是一种对生物有毒害作用的重金属元素。科学家用镉处理蚕豆根尖分生区的细胞，观察细胞的分裂指数和微核率来研究水中镉的毒性，实验结果如图2所示。微核是真核生物细胞中的一种异常结构，通常认为是在有丝分裂后期由丧失着丝粒的染色体片段产生。 镉离子在相对浓度为0﹣50内，对微核率的影响是　 　 。综合分析，当镉离子相对浓度达到100时，分生区细胞的微核率显著下降，原因可能是　 　 。 / 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $ 重难02 单克隆抗体与细胞工程 高频重难题型通关 1. 理解植物细胞工程的理论基础，掌握植物组织培养与植物体细胞杂交的原理和流程。 2. 掌握动物细胞培养的条件、过程及关键操作，明确与植物组织培养的区别。 3. 理解动物体细胞核移植的原理、过程及应用前景。 4. 熟练掌握单克隆抗体制备的全过程，理解杂交瘤细胞的特点及单克隆抗体的应用。 5. 能辨析动植物细胞工程的技术差异，准确判断各步骤的目的与原理。 一、植物细胞工程 （1）理论基础 植物细胞的全能性：已分化的植物细胞，仍具有发育成完整个体的潜能。 （2）核心技术 ① 植物组织培养技术 过程阶段 核心内容 外植体处理 取自植物的离体器官、组织或细胞，消毒后接种 脱分化 在生长素、细胞分裂素诱导下，形成愈伤组织（未分化、高度液泡化的薄壁细胞团） 再分化 调整激素比例，诱导愈伤组织分化出芽、根，形成试管苗 移栽成活 试管苗炼苗后，移栽至大田，发育为完整植株 ② 植物体细胞杂交技术 步骤 核心内容 原生质体制备 用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，获得原生质体 原生质体融合 物理法（离心、振动、电激）/ 化学法（PEG 聚乙二醇）诱导融合 再生细胞壁 融合细胞再生出细胞壁，标志融合成功 植物组织培养 对杂种细胞进行脱分化、再分化，培育为杂种植株 技术意义 克服远缘杂交不亲和的障碍，培育作物新品种 （3）关键条件 1　 植物组织培养：无菌环境、适宜的温度 /pH、光照、生长素与细胞分裂素的比例调控 2　 植物体细胞杂交：原生质体需在等渗溶液中操作，防止吸水涨破 二、动物细胞工程 （1）动物细胞培养技术 ① 原理 细胞增殖（动物体细胞不具有发育成完整个体的全能性） ② 培养过程 阶段 核心内容 原代培养 用胰蛋白酶 / 胶原蛋白酶处理动物组织，制成细胞悬液，初次培养 传代培养 细胞贴壁生长、接触抑制后，用胰蛋白酶处理，分瓶继续培养 细胞株 / 细胞系 传代培养中，遗传物质未改变的为细胞株；遗传物质改变、无限增殖的为细胞系 ③ 培养条件 a. 无菌、无毒的环境：定期更换培养液，清除代谢废物 b. 营养：血清、血浆等天然成分，糖、氨基酸、无机盐等 c. 适宜温度（36.5±0.5℃）和 pH（7.2~7.4） d. 气体环境：95% 空气（细胞代谢）+5% CO₂（维持培养液 pH） （2）动物体细胞核移植技术 ① 原理 动物体细胞核的全能性（已分化的体细胞核，仍具有发育成完整个体的潜能） ② 操作过程 步骤 核心内容 供体细胞处理 取动物体细胞，培养至传代 10 代以内，保持正常核型 受体细胞准备 采集MⅡ 中期的卵母细胞，显微操作去除细胞核 核移植与融合 将供体细胞注入去核卵母细胞，电刺激使两细胞融合 胚胎激活与培养 用物理 / 化学方法激活重构胚，培养至桑椹胚或囊胚 胚胎移植 将胚胎移植到代孕母体子宫，发育为克隆动物 （3）动物细胞融合技术 1　 诱导方法：PEG、电激、灭活的病毒（特有方法，如仙台病毒） 2　 应用：单克隆抗体制备、基因工程、细胞生物学研究 三、单克隆抗体制备技术 （1）原理 ①B 淋巴细胞（浆细胞）：能产生特异性抗体，但不能无限增殖 ②骨髓瘤细胞：能无限增殖，但不能产生抗体 ③融合后获得杂交瘤细胞：兼具两者特点，既能无限增殖，又能产生专一抗体 （2）制备过程 步骤 核心内容 免疫小鼠 用特定抗原注射小鼠，使小鼠产生能分泌相应抗体的 B 淋巴细胞 细胞融合 将 B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞混合，用 PEG / 灭活病毒诱导融合 第一次筛选 在选择培养基上培养，筛选出杂交瘤细胞（淘汰未融合、自身融合细胞） 第二次筛选 克隆化培养 +抗体检测（抗原 - 抗体杂交），筛选出能产生所需特异性抗体的杂交瘤细胞 大量培养 体外培养（培养液）或体内培养（小鼠腹腔），提取单克隆抗体 （3）单克隆抗体特点与应用 1) 特点：特异性强、灵敏度高、可大量制备 2) 应用：① 诊断试剂：精准检测病原体、肿瘤标志物等② 治疗疾病：靶向治疗（生物导弹，将药物与单克隆抗体结合，定向作用于病灶）③ 运载药物：作为载体，精准递送药物 四、动植物细胞工程关键差异 对比项目 植物细胞工程 动物细胞工程 理论基础 植物细胞的全能性 细胞增殖、动物体细胞核的全能性 工具酶 纤维素酶、果胶酶（去壁） 胰蛋白酶 / 胶原蛋白酶（分散细胞） 融合方法 物理法、化学法 物理法、化学法、灭活病毒法 培养结果 完整植株 细胞株 / 细胞系、克隆动物 特殊条件 激素调控（生长素、细胞分裂素） 血清 / 血浆、CO₂培养箱 五、核心易错拓展 1. 植物体细胞杂交的终点是培育出杂种植株，而非仅获得融合细胞 2. 动物细胞培养的接触抑制：细胞贴壁生长到表面相互接触时，停止分裂增殖 3. 核移植选用 MⅡ 中期卵母细胞的原因：细胞质中含有激发细胞核全能性的物质 4. 单克隆抗体制备需两次筛选，两次筛选的目的、方法完全不同 5. 植物组织培养中，生长素比例高促进生根，细胞分裂素比例高促进生芽 题型01 植物组织培养技术综合分析题 【方法与技巧】 核心突破：紧扣植物细胞全能性这一理论基础，牢记 “外植体→愈伤组织→试管苗” 的流程，重点辨析脱分化、再分化的概念及激素调控规律。 分类 核心内容 易错点秒杀 ① 外植体必须是离体的器官、组织或细胞，死细胞 / 高度分化的筛管细胞无法培养；② 激素调控：生长素 / 细胞分裂素比例高→促生根；比例低→促生芽；比例适中→维持愈伤组织；③ 植物组织培养属于无性生殖，能保持母本遗传性状，不发生基因重组；④ 脱分化需要避光，再分化需要光照（叶绿素合成需光）；⑤ 愈伤组织是无定形、高度液泡化、薄壁、未分化的细胞团，不是高度分化。 解题步骤 先定位流程步骤→判断对应生理过程（脱分化 / 再分化）→分析培养基条件与激素配比→验证育种原理。 【典例解析】 【典例1】马铃薯长期进行无性繁殖易积累病毒，导致种性退化。科研人员采用植物组织培养技术培育脱毒马铃薯，并进一步研究了不同大小茎尖外植体对脱毒效果和成苗率的影响，结果如表所示。下列叙述错误的是（　　） 茎尖长度/mm 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 脱毒率/% 95 88 70 45 20 成苗率/% 10 40 75 85 88 A．选取茎尖分生组织是因为该细胞高度分化，易表达出全能性 B．由表可知，外植体越小，脱毒效果越好，成苗率越低 C．生产中应综合考虑脱毒率和成苗率来选择合适的茎尖 D．脱毒苗移栽前需要使其逐渐适应外界环境，以提高成活率 【答案】A 【解答】解：A、选取茎尖分生组织是因为茎尖分生组织细胞分化程度低、分裂能力旺盛，全能性更容易表达，且病毒极少，甚至无病毒，A错误； B、结合表格数据可知，茎尖外植体长度越小，脱毒率越高即脱毒效果越好，同时成苗率越低，B正确； C、生产中需要同时满足脱毒效果和产量要求，因此要综合脱毒率和成苗率两个指标选择合适的茎尖长度，C正确； D、组培苗是在无菌、温湿度适宜的人工环境中培育的，对外界自然环境适应能力差，移栽前需逐步炼苗使其适应外界环境，提高移栽成活率，D正确。 故选：A。 【典例2】植物组织培养技术在科学研究和生产实践中得到了广泛的应用。研究表明：在植物组织培养过程中，外源的生长调节剂的比例会影响愈伤组织的生长和分化，相对高的IAA（生长素）/KT（细胞分裂素类似物）有利于根形成，反之有利于芽形成。研究人员先将离体的烟草细胞培养形成愈伤组织，然后将愈伤组织分割接种到含有不同比例IAA和KT的MS培养基中培养。实验处理与结果如下表。（表中各培养基的生长调节剂浓度单位是mg/L）。回答下列问题： 编号 MS培养基中的激素含量 分化情况 IAA KT 1 0 0 不分化 2 0 2 分化芽 3 2 0 分化根 4 0.2 2 分化芽 5 2 0.2 不分化 6 0.02 2 分化芽 7 2 0.02 分化根 （1）植物微型繁殖技术的原理是　 　 。 （2）为了获得脱毒苗，可以选取植物的　 　 进行组织培养。若为了获得细胞产物，则只需培养到　 　 阶段。 （3）从叶片的叶肉细胞到获得胚状体的过程中，需要经过　 　 。 ①无丝分裂 ②有丝分裂 ③减数分裂 ④植物体细胞杂交 ⑤细胞融合 ⑥脱分化 ⑦再分化 A．①⑤⑥ B．②⑥⑦ C．②④⑥ D．②④⑥⑦ （4）利用植物组织培养技术将一个细胞培养成一个完整植株的基本程序是　 　 （用文字和箭头图表示）。需要在培养基中加入植物激素调整细胞分裂、分化的是　 　 阶段。 （5）愈伤组织形成和生长、分化常在MS培养基上进行，据此推断MS培养基中的碳源是　 　 （填“有机碳源”或“无机碳源”）。 （6）上述实验结果支持题干中的观点，判断的依据是　 　 。 【答案】（1）植物细胞的全能性 （2）茎尖/分生组织 愈伤组织 （3）B （4）外植体→愈伤组织→胚状体/丛芽→完整植株 脱分化和再分化 （5）有机碳源（MS培养基通常添加蔗糖） （6）第2、4、6组（KT＞IAA）分化出芽；第3、7组（IAA＞KT）分化出根；第1、5组（比例接近或无激素）不分化（或答：IAA/KT比例高利于根分化，比例低利于芽分化） 【解答】解：（1）植物组织培养（包括微型繁殖）的理论基础是植物细胞的全能性，即已分化的植物细胞仍具有发育成完整个体的潜能。 （2）茎尖几乎不含病毒，取茎尖细胞组织培养可以获得脱毒苗。愈伤组织的细胞代谢快，因此若为了获得细胞产物，则只需培养到愈伤组织阶段。 （3）从叶片的叶肉细胞到获得胚状体的过程中，需要经过②有丝分裂、⑥脱分化和⑦再分化过程，即ACD错误，B正确。 （4）利用植物组织培养技术将一个细胞培养成一个完整植株的基本程序是：离体的植物细胞→愈伤组织根、芽→植株。决定植物脱分化和再分化的关键因素是植物激素的种类和比例，所以需要在培养基中加入激素调整细胞分裂、分化的是脱分化和再分化阶段。 （5）愈伤组织细胞内没有叶绿体，不能进行光合作用，愈伤组织形成和生长、分化常在MS培养基上进行，据此推断MS培养基中的碳源是有机碳源。 （6）该实验自变量为MS培养基中的激素含量，因变量为分化情况，其余变量为无关变量。研究表明：在植物组织培养过程中，外源的生长调节剂的比例会影响愈伤组织的生长和分化，相对高的IAA（生长素）/KT（细胞分裂素类似物）有利于根形成，反之有利于芽形成。根据表格数据可知，分化成根的3号和7号培养基中的IAA/KT的值明显大于分化成芽的2号、4号、6号培养基中的IAA/KT的值，因此支持题干中的观点。 故答案为： （1）植物细胞的全能性 （2）茎尖/分生组织 愈伤组织 （3）B （4）外植体→愈伤组织→胚状体/丛芽→完整植株 脱分化和再分化 （5）有机碳源（MS培养基通常添加蔗糖） （6）第2、4、6组（KT＞IAA）分化出芽；第3、7组（IAA＞KT）分化出根；第1、5组（比例接近或无激素）不分化（或答：IAA/KT比例高利于根分化，比例低利于芽分化） 题型02 植物体细胞杂交技术与育种应用题 【方法与技巧】 核心突破：掌握 “去壁→融合→再生壁→组织培养” 的完整逻辑，理解该技术克服远缘杂交不亲和的重大意义。 分类 核心内容 易错点秒杀 ① 去壁酶为纤维素酶 + 果胶酶，不可用蛋白酶；② 融合成功的最终标志是再生出新的细胞壁，而非原生质体融合完成；③ 杂种植株的培育终点是完整植株，不是仅获得融合细胞；④ 融合方法为物理法（离心、振动、电激）、化学法（PEG），无灭活病毒法；⑤ 原理是细胞膜流动性和植物细胞全能性，不是基因重组。 解题步骤 先分析酶解步骤→判断融合方法→确认杂合细胞类型（杂种细胞）→梳理培育流程的终点（获得杂种植株）。 【典例剖析】 【典例1】动物细胞融合技术与植物体细胞杂交技术均完成了两种细胞遗传物质的融合。下列关于两者的叙述，错误的是（　　） 选项 项目 动物细胞融合 植物体细胞杂交 A 融合原理 细胞膜具有流动性 细胞膜具有流动性 B 诱导融合的手段 可用灭活病毒诱导法 一般采用物理法和化学法 C 实验的结果 获得杂交细胞，生产细胞产品 可获得杂种植株 D 用途 制备单克隆抗体 高效、快速地实现种苗的大量繁殖 A．A B．B C．C D．D 【答案】D 【解答】解：A、动物细胞融合和植物细胞融合依据的原理都是细胞膜具有流动性，A正确； B、诱导植物细胞融合一般采用物理法和化学法，如：电融合法，聚乙二醇融合法，灭活病毒诱导法是诱导动物细胞融合特有的方法，B正确； C、动物细胞融合获得杂种细胞，生产细胞产品，如：单克隆抗体；植物体细胞杂交利用植物细胞具有全能性可获得杂种植株，C正确； D、植物体细胞杂交可获得杂种植株，不能高效、快速地实现种苗的大量繁殖，D错误。 故选：D。 【典例2】某种细菌感染植物后可导致植物死亡，甲植物的细胞核基因具有抗该种细菌感染的效应，乙植物的细胞质基因具有高产效应。为获得具备优良特性的杂种植株，某研究人员进行了如下实验，①﹣④表示相关过程或操作。请回答下列问题： （1）过程①可用 　 　 酶去除细胞壁获得原生质体。从细胞结构的角度分析，对甲原生质体A1和乙原生质体B1进行“失活处理”的部分分别是 　 　 。过程②可代表人工诱导原生质体融合，常用的化学方法是 　 　 、　 　 等（答出两点）。 （2）过程③、④分别称为 　 　 。如表表示不同浓度的2，4﹣D和6﹣BA组合对杂种细胞形成愈伤组织的影响（诱导率），诱导杂种细胞形成愈伤组织的最佳激素配比浓度为 　 　 。 处理 激素浓度（mg/L） 诱导率/% 2，4﹣D 6﹣BA 1 3 0 52.1±2.2 2 5 0 55.2±2.1 3 3 0.1 42.4±1.9 4 5 0.1 46.9±2.0 5 7 0.1 38.6±1.4 6 3 0.3 43.7±2.8 （3）该杂种植物的培育过程中利用了植物体细胞杂交技术，与传统杂交技术相比，植物体细胞杂交技术在 　 　 等方面展示出独特的优势。 【答案】（1）纤维素酶、果胶 细胞质、细胞核 PEG融合法 高Ca2+﹣高pH融合法 （2）脱分化和再分化 5.0mg/L的2，4﹣D、不添加6﹣BA （3）打破生殖隔离、克服远缘杂交不亲和的障碍，培育作物新品种 【解答】解：（1）植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，过程①可用纤维素酶和果胶酶进行去壁处理。根据题意可知，需要甲的细胞核基因和乙的细胞质基因，故失活处理是让A1的细胞质基因和B1的细胞核基因失活。常用PEG融合法、高Ca2+﹣高pH融合法诱导原生质体融合。 （2）③表示脱分化，④表示再分化。根据表格处理可知，处理2诱导率最高，说明该组的处理5.0mg/L的2，4﹣D、不添加6﹣BA处理，最有利于诱导杂种细胞形成愈伤组织。 （3）植物体细胞杂交的明显优点是：打破生殖隔离、克服远缘杂交不亲和的障碍，培育作物新品种。 题型03 动物细胞培养与核移植技术辨析题 【方法与技巧】 核心突破：区分原代培养与传代培养，掌握接触抑制现象；核移植重点在于理解MⅡ 中期卵母细胞的选择原理。 分类 核心内容 易错点秒杀 ① 接触抑制：动物细胞贴壁生长至表面相互接触时，停止分裂，只能形成单层细胞；② 动物细胞培养需加血清 / 血浆，植物组织培养不需要；③ 核移植必须选MⅡ 中期卵母细胞，因其细胞质含激发核全能性的物质；④ 气体环境为95% 空气 + 5% CO₂，CO₂的作用是维持培养液 pH；⑤ 原代培养是初次培养，传代培养是分瓶培养，10-50 代细胞遗传物质可能改变，50 代后才可能癌变。 解题步骤 先识别细胞培养阶段→判断是否存在接触抑制→分析核移植受体细胞的选择理由→验证培养条件的合理性。 【典例剖析】 【典例1】羊乳的成分更接近于人乳，可作为牛乳过敏体质者最理想的替代乳品。但研究表明山羊乳中β﹣乳球蛋白也是引起人体过敏反应的一种主要致敏原，为实现羊乳“人源化”改造，研究人员利用CRISPR/Cas9系统敲除了山羊乳腺细胞中致敏原β﹣乳球蛋白（BLG）基因，同时在相应位点导入人乳铁蛋白（hLF）基因（通常只在乳腺细胞中表达）。该研究为培育羊乳中低致敏原和富含人乳铁蛋白功能营养成分的转基因山羊新品种提供了科学依据。如图为研究人员利用该技术获得转基因山羊的操作过程。回答下列问题： （1）上述技术中的目的基因是 　 　 ，可通过PCR技术快速扩增目的基因，扩增时引物的作用是 　 　 。 （2）CRISPR/Cas9系统主要包含向导RNA和Cas9蛋白两个部分，利用CRISPR/Cas9系统敲除山羊乳腺细胞中致敏原β﹣乳球蛋白（BLG）基因时，科研人员设计了sgBLG引导序列，sgBLG能够通过 　 　 方式与山羊基因组中BLG基因的靶位点结合。 （3）Cas9蛋白类似于基因工程中常用到的 　 　 酶，但Cas9蛋白特性与该酶的区别是 　 　 。 （4）检测发现过程②中，hLF基因成功插入在母羊乙成纤维细胞中的一条常染色体上。上图过程①②运用到的技术有 　 　 ，过程③④⑤中，运用到的技术有 　 　 （编号选填）。 ①显微注射技术 ②动物细胞培养技术 ③胚胎移植技术 ④DNA重组技术 ⑤动物细胞融合技术 ⑥细胞核移植技术 （5） 筛选后得到的早期胚胎细胞中没有检测到该蛋白，能否说明目的基因没有成功导入并表达，理由是 　 　 。 【答案】（1）人乳铁蛋白基因（HLF基因）；使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 （2）碱基互补配对 （3）限制性内切核酸（限制）；Cas9蛋白没有专一识别DNA分子特定核苷酸序列的特性 （4）①②④；②③⑥ （5）不能，人乳铁蛋白基因只能在转基因动物的乳腺细胞内表达 【解答】解：（1）本研究是为了培育羊乳中低致敏原和富含人乳铁蛋白功能营养成分的转基因山羊新品种，因此目的基因是人乳铁蛋白基因（HLF基因），可通过PCR技术快速扩增目的基因，扩增时引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。 （2）sgBLG通过碱基互补配对与山羊基因组中BLG基因座的第一外显子（Ex1）中的靶位点结合。 （3）Cas9蛋白可切割DNA，类似于基因工程中常用到的限制酶，但Cas9蛋白特性与该酶的区别是Cas9蛋白没有限制性内切核酸酶所具有的专一识别DNA分子特定核苷酸序列的特性。 （4）上图过程①是基因替换，属于DNA重组技术，②是将目的基因导入受体细胞，用到显微注射技术，因此运用到的技术有①②④，过程③是核移植，④是早期胚胎培养，即需要动物细胞培养技术，⑤为胚胎移植，因此运用到的技术有②③⑥。 （5）人乳铁蛋白（目的）基因只能在转基因动物的乳腺细胞内表达，因此在的早期胚胎细胞中不表达，没有检测到该蛋白不能说明目的基因是否成功导入。 【典例2】白暨豚是研究鲸类进化的珍贵“活化石”，曾经广泛分布于长江流域，但由于多种因素，在自然环境中，白暨豚已经无法维持其种群的繁衍能力。如图表示利用现代生物技术拯救白暨豚的构想，回答下列问题： （1）图中所用的现代生物技术除动物细胞培养、动物细胞核移植外，还有 　 　 。体细胞进行体外培养时需要无菌、无毒的环境，具体操作是 　 　 ，图中过程应将卵母细胞培养到 　 　 期再去除细胞核，去除细胞核的常用方法是 　 　 。 （2）重构胚是指人工重新构建的胚胎，需要用物理或化学方法进行激活，使其完成细胞分裂和发育进程，激活重构胚的化学物质有 　 　 （答出2点），通过核移植技术获得的克隆白暨豚与提供细胞核的白暨豚并不完全相同，请分析可能的主要原因：　 　 。 （3）重构胚早期发育通过卵裂方式进行分裂，卵裂时期胚胎的特点是 　 　 。 【答案】（1）胚胎移植 对培养液和所有培养用具进行灭菌处理，以及在无菌环境下进行操作；定期更换培养液以便清除代谢物 MⅡ显微操作法 （2）Ca2+载体、乙醇和蛋白酶合成抑制剂 通过核移植技术获得的克隆白暨豚的细胞质中的遗传物质来自卵母细胞供体 （3）细胞数量不断增加，但胚胎总体积不增加 【解答】解：（1）分析题图，图中所用的现代生物技术除动物细胞培养、动物细胞核移植外，还有胚胎移植；体细胞进行体外培养时需要无菌、无毒的环境，具体操作是对培养液和所有培养用具进行灭菌处理，以及在无菌环境下进行操作，定期更换培养液以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害；应将采集的卵母细胞培养至MⅡ期再去核；去除细胞核的常用方法是显微操作法。 （2）可用物理或化学方法激活受体细胞，使其完成细胞分裂和发育过程，比如具体的方法包括：电脉冲、钙离子载体、乙醇、蛋白酶抑制剂等等，即激活重构胚的化学物质有Ca2+载体、乙醇和蛋白酶合成抑制剂。因为通过核移植技术获得的克隆白暨豚的细胞质中的遗传物质来自卵母细胞供体，故通过核移植技术获得的克隆白暨豚与提供细胞核的白暨豚并不完全相同。 （3）卵裂时期胚胎的特点是细胞数量不断增加，但胚胎总体积不增加。 题型04 单克隆抗体制备与应用综合题 【方法与技巧】 核心突破：彻底掌握两次筛选的目的、杂交瘤细胞的特点（无限增殖 + 产专一抗体）、单克隆抗体的优点。 分类 核心内容 易错点秒杀 ① 两次筛选目的不同：第一次用选择培养基筛选杂交瘤细胞，第二次用抗原 - 抗体杂交筛选能产特异性抗体的杂交瘤细胞；② 杂交瘤细胞特点：既能无限增殖，又能产生专一抗体；③ 单克隆抗体优点：特异性强、灵敏度高、可大量制备；④ 动物细胞融合可用 PEG、电激、灭活病毒（特有），并非只能用灭活病毒；⑤ “生物导弹” 是单克隆抗体 + 药物，抗体起导向作用，药物起杀伤作用。 解题步骤 先识别细胞融合结果→定位筛选阶段→描述杂交瘤细胞特性→应用推导（生物导弹原理）→验证两次筛选的区别。 【典例剖析】 【典例1】癌细胞具有自身的抗原性，人体的特异性免疫系统能识别并去除癌细胞。人乳头瘤病毒（HPV）可将自身DNA整合到人体特定细胞，引发癌变并形成肿瘤。为了研究同一HPV引发的肿瘤是否具有相同的抗原性，科学小组展开了研究。回答下列问题：材料和药剂：遗传背景完全相同成年雄性小鼠若干只，HPV病毒株 实验思路： 取小鼠若干只，随机均分为甲、乙、丙三组 分组和处理如下：甲组：小鼠+HPV+正常饮食；乙组：小鼠+HPV+正常饮食 丙组：小鼠+_____ 饲养一段时间后，去除甲组和乙组的肿瘤（体外培养肿瘤细胞）后进一步处理如下： 组①：部分甲组小鼠+来自甲的肿瘤细胞 组②：部分乙组小鼠+_____ 观察癌细胞在小鼠体内形成肿瘤的情况 （1）丙组的处理是 　 　 ，处理的作用是 　 　 。组②的处理是 　 　 。 结果证实同一HPV引发的肿瘤只具有少部分相同的抗原性，检测准确性较低，因此科研人员根据抗HPV的单克隆抗体可以准确检测出HPV，进行了HPV45的抗L1蛋白单克隆抗体的制备与研究，如图是制备出单克隆抗体的过程： （2）图中给小鼠注射的特定的抗原是 　 　 。产生抗体的淋巴细胞（效应B细胞）需要与骨髓瘤细胞融合的原因是 　 　 ，过程需要用到 　 　 作为化学诱导剂，单克隆抗体制备过程运用了 　 　 和 　 　 等技术手段。 （3）图中单克隆抗体的制备过程中通常有两次筛选，第一次筛选的目的是 　 　 ，获得的细胞过程⑥中将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔细胞培养板上，尽量使每个孔只接种1个杂交瘤细胞，然后通过ELISA法（又称酶联免疫吸附试验法）检测各孔上清液中细胞分泌的 　 　 。 （4）⑦过程的目的是 　 　 ，最终在小鼠的 　 　 获得大量单克隆抗体。 【答案】（1）正常饮食 作为对照，排除无关变量对实验结果的影响 来自甲的肿瘤细胞 （2）L1蛋白 能产生抗体的B淋巴细胞没有增殖能力 聚乙二醇 动物细胞融合 动物细胞培养 （3）筛选出杂交瘤细胞 抗体 （4）克隆化培养 腹腔 【解答】解：（1）丙组作为对照组，应不注射 HPV，处理为“小鼠+正常饮食”，其作用是作为对照，排除除 HPV 外其他因素对实验结果的影响。组②为了探究同一 HPV 引发的肿瘤是否有相同抗原性，应给部分乙组小鼠注射“来自甲的肿瘤细胞”。 （2）要制备HPV45的抗 L1 蛋白单克隆抗体，给小鼠注射的特定抗原是“L1 蛋白”。由于能产生抗体的B淋巴细胞没有增殖能力，因此产生抗体的淋巴细胞（效应B细胞）需要与骨髓瘤细胞融合。动物细胞融合过程常用聚乙二醇（PEG）作为化学诱导剂。单克隆抗体制备过程运用了动物细胞培养技术来培养细胞，运用了动物细胞融合技术将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合。 （3）单克隆抗体制备过程中第一次筛选的目的是筛选出杂交瘤细胞（将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后会产生多种融合细胞以及未融合的细胞，第一次筛选就是要把杂交瘤细胞选出来）。由于杂交瘤细胞能产生特点的抗体，因此过程⑥中将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔细胞培养板上，然后通过 ELISA 法检测各孔上清液中细胞分泌的抗体。 （4）⑦过程的目的是克隆化培养，最终将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内培养，目的是让杂交瘤细胞在小鼠腹腔内大量增殖，最终在小鼠的腹腔腹水中获得大量单克隆抗体。 故答案为： （1）正常饮食 作为对照，排除无关变量对实验结果的影响 来自甲的肿瘤细胞 （2）L1蛋白 能产生抗体的B淋巴细胞没有增殖能力 聚乙二醇 动物细胞融合 动物细胞培养 （3）筛选出杂交瘤细胞 抗体 （4）克隆化培养 腹腔 【典例2】人类乳头瘤病毒（HPV）有多种亚型，HPV45属于高危型，与宫颈癌的发生密切相关。L1蛋白是组成HPV病毒衣壳的主要结构蛋白，科研人员进行了HPV45的抗L1蛋白单克隆抗体的制备与研究。回答下列问题： （1）提取HPV45的L1蛋白，注射到小鼠体内，其目的是 　 　 。一段时间后，取小鼠脾脏组织，剪碎用 　 　 酶处理，使其分散成单个细胞制成细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞诱导融合，筛选出杂交瘤细胞。 （2）将得到的杂交瘤细胞接种到多孔培养板进行 　 　 培养，分别取其上清液进行 　 　 检测，检测的原理及操作流程如图1。经多次筛选后，取A、B、C、D四种杂交瘤细胞上清液进行检测，结果如图2。 ①据图分析，实验过程中需将 　 　 作为抗原固定在固相载体上，分别取 　 　 加入反应体系，经洗涤后加入酶标抗体形成复合物，再次洗涤，加入相应底物，复合物携带的酶可与相应底物反应显色，测吸光值，颜色越深吸光值越高。 ②图2结果表明 　 　 。 ③依据图2结果，研究人员推测A、B、C、D四种上清液中，A上清液的抗体与L1蛋白结合的位点是HPV45型病毒识别并侵染人体细胞的关键位点。为探究此推测，进行实验， 实验步骤如下： 步骤一：将小鼠宫颈细胞悬液均分为四组，编号甲、乙、丙、丁； 步骤二：从稀释倍数为1：320的A、B、C、D（杂交瘤细胞）上清液中分离提纯抗体，　 　 。 步骤三：在相同且适宜的条件下培养一段时间，检测培养液中被侵染的宫颈细胞比例。实验预期结果与结论：若 　 　 ，则推测正确。 （3） 科研人员制备HPV45的抗L1蛋白单克隆抗体，在医学方面的应用有 　 　 。 【答案】（1）诱导小鼠产生能够分泌抗L1蛋白抗体的B淋巴细胞 胰蛋白/胶原蛋白酶 （2）克隆化 抗体阳性/抗体 L1蛋白 不同稀释倍数（浓度）的4种杂交瘤细胞上清液和未免疫小鼠血清 四种杂交瘤细胞上清液均含有能与L1蛋白结合的抗体，且上清液A中抗体与L1蛋白结合能力最强 分别与HPV45型病毒混合，再加入到小鼠宫颈细胞悬液甲、乙、丙、丁中 甲组中被侵染的宫颈细胞比例最低/甲组中被侵染的宫颈细胞比例低于其他组 （3）用于HPV45病毒感染的诊断、治疗、运载药物（或诊断试剂、治疗疾病、运载药物） 【解答】解：（1）在抗L1蛋白单克隆抗体的制备过程中，提取HPV45的L1蛋白（抗原），注射到小鼠体内，其目的是诱导小鼠产生能够分泌抗L1蛋白抗体的B淋巴细胞。把动物组织分散成单个细胞需要胰蛋白酶（或胶原蛋白酶）用处理。 （2）在单克隆抗体制备的第二次筛选中，将得到的杂交瘤细胞接种到多孔培养板进行克隆化培养，分别取其上清液进行抗体阳性（或抗体）检测，利用的原理是抗体﹣抗原的特异性结合。 ①能与抗L1蛋白单克隆抗体特异性结合的抗原为L1蛋白，故实验过程中需将L1蛋白作为抗原固定在固相载体上。由图2可知，分别取不同稀释倍数（浓度）的4种杂交瘤细胞上清液和未免疫小鼠血清加入反应体系，经洗涤后加入酶标抗体形成复合物，再次洗涤，加入相应底物。 ②吸光值越高说明抗体与抗原特异性结合的能力越强，图2中未免疫小鼠血清作为对照组，据图2分析可知，A、B、C、D四种杂交瘤细胞上清液均产生了抗体阳性反应，且上清液A中抗体的亲和力最强，因此图2结果表明四种杂交瘤细胞上清液均含有能与L1蛋白结合的抗体，且上清液A中抗体与L1蛋白结合能力最强。 ③实验是为了探究A上清液的抗体与L1蛋白结合的位点是HPV45型病毒识别并侵染人体细胞的关键位点，因此步骤二为从稀释倍数为1：320的A、B、C、D（杂交瘤细胞）上清液中分离提纯抗体，分别与HPV45型病毒混合，再加入到小鼠宫颈细胞悬液甲、乙、丙、丁中。若A上清液的抗体与L1蛋白结合的位点是HPV45型病毒识别并侵染人体细胞的关键位点，则A中的抗体处理HPV45型病毒将会使其失去侵染宫颈细胞的能力，因此若甲组中被侵染的宫颈细胞比例最低（A上清液的抗体结合位点是HPV45侵染人体细胞的关键位点），则推测正确。 （3）单克隆抗体在医学上的作用：①作为诊断试剂：最广泛的用途，具有准确、高效、简易、快速的优点。②用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症，可制成“生物导弹”，因此科研人员制备HPV45的抗L1蛋白单克隆抗体，在医学方面的应用有用于HPV45病毒感染的诊断、治疗、运载药物（或诊断试剂、治疗疾病、运载药物）。 题型05 动植物细胞工程技术对比与综合大题 【方法与技巧】 核心突破：综合考查动植物细胞工程的原理、工具、结果差异，是期中压轴大题的常见形式。 分类 核心内容 易错点秒杀 ① 原理差异：植物细胞工程原理是细胞全能性，动物细胞培养原理是细胞增殖，核移植原理是细胞核全能性；② 工具酶差异：植物用纤维素酶、果胶酶去壁，动物用胰蛋白酶 / 胶原蛋白酶分散细胞；③ 融合方法差异：植物只有物理、化学法，动物多了灭活病毒法；④ 培养条件差异：植物需植物激素，动物需血清、CO₂培养箱；⑤ 产物差异：植物最终获得完整植株，动物获得细胞群 / 克隆动物。 解题步骤 审题圈画关键词（植物 / 动物、去壁 / 分散、植株 / 细胞）→对应原理、工具、条件的差异→逐一判断选项 / 填空→规范使用教材术语作答。 【典例剖析】 【典例1】如表格表示高等动植物亲代个体产生新个体的3种不同途径，请根据表中信息分析并回答问题： 生物 途径 主要流程 动植物 甲 亲代个体→受精卵→新个体 植物 乙 亲代个体→体细胞→试管苗→新个体 动物 丙 亲代个体→核移植细胞→早期胚胎→新个体 （1）甲、乙、丙途径中属于有性生殖的是 　 　 （填“甲”“乙”或“丙”）。 （2）相比于甲，乙、丙途径在应用上的优点是 　 　 （写出两点）。乙途径依据的原理是 　 　 。 （3）丙途径中，早期胚胎→新个体的流程中需要采用的生物工程技术是 　 　 。该途径获得的新个体与供核的亲代个体性状不完全相同的原因是 　 　 。 （4）若从乙、丙途径获得的新个体中各取一小块组织进行体外培养。下列叙述错误的有 　 　 （填字母）。 a．前者需先用盐酸解离，后者需先用胰蛋白酶处理 b．前者培养基中一般加入蔗糖，后者一般加入葡萄糖 c．两者培养过程中均需要保证无菌条件，以防止杂菌污染 【答案】（1）甲 （2）可快速繁殖优良品种 植物细胞的全能性 （3）胚胎移植 卵母细胞细胞质中的遗传物质会对克隆动物的性状产生影响且性状还受环境影响 （4）a 【解答】解：（1）如表格表示高等动植物亲代个体产生新个体的3种不同途径，甲途径是自然繁殖过程，属于有性生殖；乙途径是植物组织培养技术，属于无性生殖；丙途径是核移植技术，属于无性生殖，因此甲、乙、丙途径中属于有性生殖的是甲。 （2）相比于甲，乙、丙途径在应用上的优点是可快速繁殖优良品种，乙途径为植物组织离体后直接进行组织培养操作，依赖细胞的全能性。 （3）丙途径中，早期胚胎→新个体的流程还需要采用的生物工程技术是胚胎移植。该途径获得的新个体的遗传物质由供核的亲代的核基因和供质的亲代的质基因共同组成，而卵母细胞的细胞质中的遗传物质会对克隆动物的性状产生影响，且性状还受环境影响，故新个体性状与供核亲本不完全相同。 （4）a、乙途径为植物组织离体后直接进行组织培养操作，不需先用盐酸解离，丙途径进行动物细胞培养时，需先用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，将组织分散成单个细胞后再进行培养，a错误； b、前者培养过程为植物组织培养，培养基中一般加入蔗糖，后者为动物细胞培养，培养液中一般加入葡萄糖，b正确； c、两者培养过程中均需要保证无菌条件，这是实验成功的关键，c正确。故选：a。 【典例2】Ⅰ.供体细胞的分化状态和表观遗传修饰模式是影响体细胞核移植胚胎发育的重要因素。为研究供体细胞RNAmA修饰（即RNA某位点的甲基化）水平对猪核移植胚胎发育的影响，研究者进行系列实验。 （1）核移植的受体是 　 　 细胞，核移植后的重构胚发育至 　 　 阶段可利用 　 　 技术转移到代孕母体子宫内以获得子代个体，从早期胚胎中分离获得的具有自我更新和分化潜能的 　 　 可用于医学研究。 （2）RNAm6A修饰可通过提高mRNA结构稳定性来影响早期胚胎发育。猪骨髓间充质干细胞（甲组）属于多能干细胞，猪胎儿成纤维细胞（乙组）则是处于分化终端的体细胞。研究者比较了两细胞内RNAm6A修饰水平及其作为核供体时重构胚的发育效率，结果如图1、2。结果表明，核供体细胞的分化程度越高，　 　 越低。 Ⅱ.兰花人工种子由人工种皮、原球茎和人工胚乳构成。原球茎是由胚性细胞组成、形态类似球茎的结构，可发育成完整植株，人工胚乳可调控原球茎的休眠，并为原球茎的发育提供营养成分和激素。回答下列问题： （3）从盆兰花获取茎尖，对其进行 　 　 处理后接种于培养基，茎尖通过 　 　 后生长为原球茎。原球茎在发芽培养基上可很快长出幼叶，然后在生根培养基中形成完整植株。 （4）将原球茎切成小块，转入增殖培养基进行继续培养，可以得到大量原球茎，实现兰花的快速繁殖。在增殖培养基中添加椰子水，原球茎会长得更饱满。不同成熟度椰子的椰子水对原球茎生长的促进效果不同，推测原因是不同成熟度椰子的椰子水中 　 　 和 　 　 的含量存在差异。 （5）某实验研究发现，与添加用过滤除菌法处理的椰子水（A组）相比，人工胚乳中添加用湿热灭菌法处理的椰子水（B组）使原球茎的休眠时间变短。研究人员推测B组原球茎休眠时间短的原因是脱落酸被破坏。作出上述推测的依据是：椰子水中有脱落酸； 　 　 ；脱落酸不耐高温。为了验证上述推测，可增加一组实验（C组），C组的处理是：　 　 。 【答案】（1）去核的卵母 桑葚胚或囊胚 胚胎移植 胚胎干细胞 （2）RNA修饰水平和核移植重构胚的发育效率 （3）消毒 脱分化 （4）营养物质 激素 （5）脱落酸促进休眠 人工胚乳中先添加用高压蒸汽灭菌法处理的椰子水后加脱落酸 【解答】解：（1）核移植的受体一般是去核的卵母细胞，当胚胎发育到桑葚胚或囊胚时，可以进行胚胎移植。另外，从早期胚胎中分离获得的胚胎干细胞，由于具有自我更新和分化潜能，可用于医学研究。 （2）猪骨髓间充质干细胞（甲组）属于多能干细胞，猪胎儿成纤维细胞（乙组）则是处于分化终端的体细胞，前者分化程度比后者低，由图1和图2分析可知，核供体细胞的分化程度越高，RNA修饰水平和核移植重构胚的发育效率越低。 （3）进行植物组织培养时，需要进行无菌操作，即对外植体进行消毒，对培养基及其他器械进行灭菌等；将消毒后的外植体接种在培养基上，通过控制培养基中各种激素的比例来控制细胞的分裂分化，先诱导茎尖脱分化形成原球茎，再转移至发芽培养基上诱导其发芽，然后转移至生根培养基上诱导其生根。 （4）由于椰子水中含有营养物质和激素，故增殖培养基中添加椰子水，原球茎会长得更饱满，但由于不同成熟度椰子的椰子水中营养物质和激素的含量存在差异，故对原球茎生长的促进效果不同。 （5）脱落酸主要由根冠和萎蔫的叶片合成，作用是抑制细胞分裂、促进气孔关闭、促进叶和果实衰老和脱落、维持种子休眠。高压蒸汽灭菌法处理的椰子水（B 组）使原球茎的休眠时间短于过滤除菌法处理的椰子水（A组），由于椰子水中有脱落酸、脱落酸促进休眠、脱落酸不耐高温，可推测B 组原球茎休眠时间短的原因是脱落酸被破坏。可增加一组实验：人工胚乳中先添加用高压蒸汽灭菌法处理的椰子水后加脱落酸，若原球茎的休眠时间比B组长，即可验证推测。 1.下列关于植物组织培养的叙述，符合最新教材表述且正确的是（） A. 外植体经灭菌处理后接种，可防止杂菌污染 B. 脱分化过程需要光照，以促进叶绿素的合成 C. 愈伤组织细胞具有细胞壁薄、高度液泡化、未分化的特点 D. 生长素与细胞分裂素比例适中时，可促进愈伤组织分化出芽和根 【答案】：C 【解析】：A 错误，外植体只能消毒，灭菌会导致细胞死亡；B 错误，脱分化需要避光，再分化才需要光照；C 正确，为教材中愈伤组织的典型特征；D 错误，比例适中维持愈伤组织，比例高生根、比例低生芽。 2.利用植物体细胞杂交技术培育 “白菜 — 甘蓝” 杂种植株，下列关键操作及原理分析错误的是（） A. 去壁需用纤维素酶和果胶酶，不损伤原生质体 B. 原生质体融合依赖细胞膜流动性，可用 PEG 或电激诱导 C. 融合成功的标志是原生质体融合形成多核细胞 D. 杂种植株培育需经脱分化和再分化，体现细胞全能性 【答案】：C 【解析】：A、B、D 均正确；C 错误，植物体细胞融合成功的标志是再生出细胞壁，不是形成多核细胞。 3.关于动物细胞培养的条件及过程，下列说法错误的是（） A. 培养液需添加动物血清，提供生长因子 B. 气体环境为 95% 空气＋5% CO₂，CO₂维持培养液 pH C. 传代培养细胞在培养瓶壁可形成多层，突破接触抑制 D. 原代培养细胞传至 10 代左右，遗传物质通常稳定 【答案】：C 【解析】：A、B、D 正确；C 错误，正常动物细胞具有接触抑制，只能形成单层细胞，不会多层生长。 4.体细胞核移植技术中，选择 MⅡ 中期卵母细胞作为受体细胞的核心原因是（） A. 体积大，便于显微操作 B. 细胞质中含有激发体细胞核全能性的物质 C. 细胞核结构完整，遗传物质稳定 D. 能无限增殖，提供充足营养 【答案】：B 【解析】：A 是次要原因；B 正确，为教材强调的核心原因；C 错误，卵母细胞需要去核；D 错误，卵母细胞不能无限增殖。 5.下列有关动植物细胞工程技术的对比，错误的是（） A. 植物细胞工程基于全能性，动物细胞工程不涉及全能性 B. 植物去壁用纤维素酶，动物分散细胞用胰蛋白酶 C. 植物培养加激素，动物培养加血清 D. 植物融合无灭活病毒法，动物可以用 【答案】：A 【解析】：A 错误，动物体细胞核移植依据动物细胞核的全能性；B、C、D 均为教材正确对比。 6.棉花黄萎病是由大丽轮枝菌引起的严重棉花病害。科学家从海岛棉中提取出抗黄萎病关键基因GbVel，拟通过农杆菌转化法将其导入易感病棉花品种“中棉所12号”。如图为GbVel基因转录非模板链部分序列（GbVel基因区域无图示限制酶切割序列）及载体部分结构和酶切位点。请回答下列问题： （1）科学家先从海岛棉中获取GbVel基因的mRNA，然后经过RT﹣PCR技术可获得大量GbVel基因，该技术需要　 　 酶参与，这种方法获得的基因与直接从海岛棉中获取GbVel基因相比，其片段长度　 　 （填“更长”或“更短”）。 （2）为了使GbVel基因正确插入载体中，应选择限制酶　 　 处理载体。在利用PCR扩增GbVel基因时，可以选择的引物为　 　 。 A．5'﹣GAATTCATGGCT﹣3' B．5'﹣TCAGAGCTCCGA﹣3' C．5'﹣TCGGAGCTCTCTGA﹣3' D．5'﹣CTTAAGTACCGA﹣3' （3）将构建好的重组质粒先导入经　 　 处理的农杆菌细胞中，然后再导入棉花的愈伤组织中。以下是研究者利用植物组织培养技术快速繁殖该棉花植株的实验流程，请完成下表： 实验目的 简要操作步骤 外植体消毒与准备 选取健康茎尖，用①　 　 消毒30s，再用②　 　 溶液消毒30min 无菌冲洗 用无菌水冲洗2～3次，在超净工作台上将茎尖切成约0.5cm的小块 诱导愈伤组织 将外植体小块接种到含有适量③　 　 （植物激素）的MS培养基上 ④　 　 用含GbVcl基因的农杆菌处理愈伤组织 增殖与分化 将愈伤组织转接到一定激素比例的培养基上诱导生芽 ⑤　 　 将健壮的无根苗转接到调整了激素比例的培养基上 （4） 若要从个体水平上检测其是否抗大丽轮枝菌，应将获得的转基因棉花进行　 　 处理。 【答案】（1）逆转录酶和Taq；更短 （2）EcoRⅠ和SacⅠ；AC （3）Ca2+；体积分数70%的酒精；次氯酸钠；生长素和细胞分裂素；农杆菌转化；诱导生根 （4）大丽轮枝菌接种 【解答】解：（1）利用RT﹣PCR技术以GbVcl基因的mRNA为原料，获得大量的GbVcl基因，首先需要逆转录酶合成DNA单链，然后在TaqDNA聚合酶的作用下合成互补链，综上该技术需要逆转录酶和TaqDNA聚合酶，由于mRNA不含有内含子序列转录成的核糖核苷酸序列，所以这种方法获得的基因与直接从海岛棉中获取GbVcl基因相比，其片段长度变短。 （2）依据题干信息可知，GbVel基因的非模板链序列为5'﹣GAATTCATGGCT......（GbVel基因）........TCGGAGCTCAGA﹣3'，按照碱基互补配对，模板链为3'﹣CTTAAGTACCGA.........（GbVel基因）.......AGCCTCGAGTCT﹣5'，结合限制酶的识别序列和转录方向，且切割后的目的基因必需插入到启动子和终止子之间，所以应选择EcoRⅠ和SacⅠ。设计引物时，引物应包含两个部分，一是限制酶的识别序列，二是GbVel基因的部分碱基序列，综合分析可知AC符合要求，故应选择的引物为A和C。 （3）农杆菌是细菌，故将构建好的重组质粒先导入经Ca2+处理的农杆菌细胞中，使细胞处于一种能吸收周围环境中的DNA分子的生理状态，然后然后再导入棉花的愈伤组织中。具体流程包括：①外植体的消毒与准备：选取健康茎尖，用体积分数为70%的酒精消毒30s，再用次氯酸钠溶液消毒30min；②无菌冲洗：用无菌水冲洗2～3次，在超净工作台上将茎尖切成约0.5cm的小块；③诱导愈伤组织：将外植体小块接种到含有适量生长素和细胞分裂素的MS培养基上；④农杆菌转化：用含GbVcl基因的农杆菌处理愈伤组织；⑤增殖与分化：将愈伤组织转接到一定激素比例的培养基上诱导生芽；⑥诱导生根：将健壮的无根苗转接到调整了激素比例的培养基上。 （4）目的是检测其是否抗大丽轮枝菌，所以在个体水平上，应将获得的转基因棉花进行接种大丽轮枝菌处理。 7.对疑似PRRS（猪繁殖与呼吸综合征）的病料（从得病的动物身上采集的组织或器官）进行病毒分离鉴定，获得一株高致病性PRRSV（猪繁殖与呼吸综合征病毒），通过对高致病性PRRSV的N蛋白进行研究来探讨该蛋白的抗原特性，并制备抗N蛋白的单克隆抗体。回答下列问题： （1）PRRSV N蛋白基因的克隆：提取PRRSV中的总RNA，以其中相应的RNA作为模板，利用　 　 酶逆转录成cDNA．再以cDNA为模板进行　 　 扩增，而获得N蛋白基因。 （2）表达N蛋白细胞的制备：用重组质粒　 　 合适的大肠杆菌细胞，为提高该过程的效率，需考虑重组质粒的　 　 等。将筛选过的受体细胞37℃培养液培养。 （3）单克隆抗体的制备与检测：取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合待融合细胞生长到培养孔底面积的时进行　 　 （填物质）筛选。检出的阳性孔用有限稀释法进行多次克隆化，建立单克隆抗体　 　 。最终获得的单克隆抗体是否达到实验要求的标志是　 　 ，与无关蛋白不发生反应。 （4）猪干细胞的应用：胚胎干细胞可以进行　 　 ，获得适合猴子移植的猪器官，减弱或消除排斥反应。 【答案】（1）逆转录 PCR （2）转化 质量和浓度 （3）抗体 细胞株 N蛋白可与抗 N 蛋白的单抗发生特异性的结合 （4）基因敲除 【解答】解：（1）PRRSV N蛋白基因的克隆：提取PRRSV中的总RNA，以其中相应的RNA作为模板，利用逆转录酶逆转录成cDNA．再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得N蛋白基因。 （2）表达N蛋白细胞的制备：用重组质粒转化合适的大肠杆菌细胞，为提高该过程的效率，需考虑重组质粒的质量和浓度等，将筛选过的受体细胞37℃培养箱中培养。 （3）单克隆抗体的制备与检测：取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合待融合细胞生长到培养孔底面积的时进行抗体筛选，检出的阳性孔，用有限稀释法进行多次克隆化，建立单克隆抗体细胞株。最终获得的单克隆抗体是否达到实验要求的标志是N蛋白可与抗N蛋白的单抗发生特异性的结合，与无关蛋白不发生反应。 （4）猪干细胞的应用：胚胎干细胞可以进行基因敲除，除去抗原决定基因，获得适合猴子移植的猪器官，减弱或消除排斥反应。 8.植物受伤后的再生是植物细胞工程研究的重要方向。研究者以拟南芥为材料，探究了水对植物伤口再生方向的调控机制。 （1）植物组织培养时，培养基中除无机盐、蔗糖等营养物质外，还需添加一定比例的　 　 ，以调控细胞的脱分化和再分化。 （2）研究者用拟南芥幼叶进行离体培养，设置不同琼脂浓度的培养基模拟不同水分条件：高水分组（0.75%琼脂）和低水分组（3%琼脂），检测叶柄伤口组织再生方向（图1A）。 图1A说明　 　 。研究者在琼脂培养基上放置封口膜（不透气、不透水）进行对照实验（图1B），该实验的目的是排除　 　 。 （3）为解析水分信号的下游通路，研究者检测乙烯合成基因ACS6的转录情况，结果如图2。 由此推测，水分可能通过乙烯信号通路调控伤口再生方向。为验证该推测，设计了两个实验方案，其中实验组的设计如下表。 实验方案 组别 实验处理 检测指标 一 Ⅰ组 高水分+AVG 伤口再生方向 Ⅱ组 低水分+AVG 二 Ⅰ组 高水分+AVG Ⅱ组 低水分+ACC 注：AVG为乙烯合成抑制剂、ACC为乙烯前体物质。 方案　 　 更严谨，理由是　 　 。 （4）研究发现，高水分条件下，生长素最大值出现在稍远离伤口处的根原基起始位点；而低水分条件下，最大值集中在伤口附近，且发现乙烯前体物质ACC处理可诱导生长素运输蛋白（PIN1）在根原基起始部位富集。综上研究，总结水分调控植物伤口再生方向的机制（从高水分和低水分两种条件中任选其一）。　 　 【答案】（1）生长素和细胞分裂素 （2）高水分促进根再生，低水分促进愈伤组织再生 物理接触、机械压力等无关因素对伤口再生的影响 （3）二 方案一只使用AVG，仅能验证乙烯对根再生的必要性；方案二同时使用AVG、ACC，可同时验证乙烯对根再生的必要性与充分性，证据链完整 （4）高水分→激活乙烯信号通路→诱导PIN1在根原基起始位点富集→生长素最大值出现在根原基起始位点→促进根再生 【解答】解：（1）植物组织培养时，培养基中除常规营养物质外，还需添加一定比例的生长素和细胞分裂素，以调控细胞的脱分化和再分化，生长素浓度高时，诱导根的分化，细胞分裂素浓度高时，诱导芽的分化，二者浓度相当时，诱导愈伤组织的形成。 （2）由图可知，图1中A高水分组促进根的生长，低水分组促进愈伤组织的形成。图1B中封口膜直接包裹形成机械压力，封口膜中加水，制造物理接触，所以该实验的目的是排除物理接触、机械压力等无关因素对伤口再生的影响。 （3）据表可知，方案一只使用AVG，仅能验证乙烯对根再生的必要性；方案二同时使用AVG、ACC，可同时验证乙烯对根再生的必要性与充分性，证据链完整，所以方案二更严谨。 （4）由题意可知，高水分条件下，生长素最大值出现在稍远离伤口处的根原基起始位点，而低水分条件下，最大值集中在伤口附近，说明高水分条件可激活乙烯信号通路，进而诱导PIN1在根原基起始位点富集，使生长素最大值出现在根原基起始位点，从而促进根再生。 9．某同学在观察蚕豆根尖分生区组织细胞的有丝分裂实验，如图是他利用光学显微镜观察到的分裂图像。据图回答： （1）在培养蚕豆根尖的过程中，发现根尖越来越长，这是细胞生长和　 　 结果。在制作装片的过程中，染色之前需要完成的2个步骤依次是　 　 、　 　 。 （2）请根据图1的观察结果，有丝分裂分裂期的顺序依次是：　 　 。（用图1中数字和箭头来表示）。此时，图1中③所指细胞中染色体：染色单体：核DNA＝　 　 。 （3）科研人员利用植物组织培养技术将蚕豆表皮细胞培养成为一个完整的植株，其原理是该细胞含有发育所需的全套　 　 ，实验证明高度分化的植物细胞具有　 　 。 （4）镉是一种对生物有毒害作用的重金属元素。科学家用镉处理蚕豆根尖分生区的细胞，观察细胞的分裂指数和微核率来研究水中镉的毒性，实验结果如图2所示。微核是真核生物细胞中的一种异常结构，通常认为是在有丝分裂后期由丧失着丝粒的染色体片段产生。 镉离子在相对浓度为0﹣50内，对微核率的影响是　 　 。综合分析，当镉离子相对浓度达到100时，分生区细胞的微核率显著下降，原因可能是　 　 。 【答案】（1）细胞分裂；解离；漂洗 （2）①③④⑤；1：2：2 （3）遗传信息；全能性 （4）导致微核率升高；高浓度的镉离子抑制了细胞的有丝分裂 【解答】解：（1）在培养蚕豆根尖的过程中，发现根尖越来越长，这是细胞生长和细胞分裂（细胞增殖）的结果；制作蚕豆根尖有丝分裂临时装片的实验步骤为解离→漂洗→染色→制片，故在制作装片的过程中，染色之前需要完成的2个步骤依次是解离和漂洗。 （2）据图可知，①是前期，②是间期，③是中期，④是后期，⑤是末期，故有丝分裂分裂期的顺序依次是①③④⑤；图1中③所指细胞中期，此时每条染色体含有2个姐妹染色单体，细胞中染色体：染色单体：核DNA＝1：2：2。 （3）将蚕豆表皮细胞培养成为一个完整的植株，其原理是该细胞含有发育所需的全套遗传信息（遗传物质），实验证明高度分化的植物细胞具有全能性。 （4）据图可知，镉离子在相对浓度为0﹣50内，对微核率的影响是会导致微核率升高当镉离子相对浓度达到100时，细胞的有丝分裂被抑制，由于微核形成于有丝分裂后期，故形成的微核会下降。 / 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $