专题五 基因工程（期末复习课件）高二生物下学期沪科版

专题五 基因工程 01 基因工程的基本工具 1.1 基因工程的理论依据和技术支撑 1、理论依据 揭示DNA是遗传物质 确立DNA双螺旋结构 确立中心法则 破译遗传密码 这项遗传学研究是基因工程中基因转移操作的先驱性工作。 这些分子生物学原理为基因工程中提升目的基因的复制和表达水平奠定了基础。 为基因的鉴别和合成等提供了理论依据。 1.1 基因工程的理论依据和技术支撑 2、技术支撑 为DNA的切割、连接以及基因的获取奠定了技术基础。 发现运载工具 开发工具酶 实现DNA体外重组 成功构建了第一个体外重组DNA分子。 为基因转移找到了一种运载工具。 1.2 基因工程的三个工具 1.2 基因工程的三个工具 1、限制酶（限制性内切核酸酶） 作用：识别双链DNA特定的序列，断裂相邻两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。 EcoRI限制酶能专一识别5'-GAATTC-3'序列，并在G和A之间将这段序列切开。 识别序列的特点：回文序列 1.2 基因工程的三个工具 1、限制酶（限制性内切核酸酶） 1.细菌合成限制性内切核酸酶的意义是什么? 2.限制性内切核酸酶为什么不会切割细菌自身的DNA？ 当外源DNA侵入时，细菌合成的限制性内切核酸酶会切割外源DNA，以保证自身安全。 细菌会表达一种DNA甲基化酶，催化限制性内切核酸酶识别序列内某种碱基的甲基化（即修饰效应），从而使其抗限制性内切核酸酶的切割。 思考：细菌合成限制性内切核酸酶的意义是什么？ 1.2 基因工程的三个工具 1、限制酶（限制性内切核酸酶） EcoRⅠ PstⅠ 黏性末端 黏性末端 黏性末端 黏性末端 1.2 基因工程的三个工具 2、DNA连接酶 将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 注意：不是连接氢键 （氢键的形成不需要酶的催化） 1.2 基因工程的三个工具 2、DNA连接酶 1.2 基因工程的三个工具 3、载体 复制原点 标记基因 启动子 终止子 Hind Ⅲ NdeⅠ EcoRⅠ BamHⅠ 质粒 1.复制原点：能够自我复制，并且使得外源基因也能在受体细胞中稳定存在且复制。 2.多个酶切位点：使外源基因插入质粒的合适位置。 4.启动子和终止子：能够使外源基因在受体细胞中表达出相应蛋白质。 3.标记基因（如抗性基因)：帮助宿主抵御环境不利因素影响，便于重组DNA分子的筛选。 02 基因工程的步骤 2 基因工程步骤 获取目的基因 Screening and acquisition of target genes 01 基因表达载体的构建 Construction of gene expression vector 02 Detection and identification of target genes 筛选含目的基因的受体细胞 04 将DNA分子导入受体细胞 Introduce the target gene into the recipient cell 03 2 基因工程步骤 1、获取目的基因 指人们为了达到基因工程特定目标而导入受体细胞的基因。 目的基因 （1）获取目的基因的三种方法 2 基因工程步骤 1、获取目的基因 （2）利用PCR获取和扩增目的基因 2 基因工程步骤 1、获取目的基因 （2）利用PCR获取和扩增目的基因 PCR扩增仪 95℃ 55-68℃ 75℃ 2 基因工程步骤 1、获取目的基因 （2）利用PCR获取和扩增目的基因 设计合成引物 DNA模板 引物 耐热DNA聚合酶 4种脱氧核苷三磷酸 （dNTP） 缓冲液系统 将试剂加入PCR试管 设置PCR基本程序 变性 退火 聚合 循环 比较细胞内DNA的复制与PCR技术 细胞内DNA复制 PCR技术 区别 解旋 方式 解旋酶催化 边解旋边复制 场所 主要在细胞核内 酶 解旋酶、DNA聚合酶等 温度 细胞内温和条件 结果 合成整个DNA分子 联系 ①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原料:均为四种脱氧核苷酸三磷酸 ③酶:均需DNA聚合酶 DNA在高温下变性解旋 全部解旋后再复制 细胞外(主要在PCR扩增仪内) 耐高温的DNA聚合酶 控制温度，需在不同温度下进行 扩增特定的DNA片段或基因 19 2 基因工程步骤 2、基因表达载体构建 （1）基因表达载体的组成 质粒 标记基因 复制原点 启动子 终止子 限制酶切位点 位于基因的上游，紧挨转录起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位，具有驱动基因转录的作用。 位于基因下游，使转录在所需的地方停止下来。 供目的基因插入载体中 便于重组DNA的筛选 能够在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上 2 基因工程步骤 2、基因表达载体构建 （2）基因表达载体的过程 同种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶切割 DNA 连接酶 获取目的基因 限制酶切割位点 质粒 重组 DNA分子 限制酶 限制酶 2 基因工程步骤 2、基因表达载体构建 （2）基因表达载体的过程 ①仅用一种限制酶 2 基因工程步骤 2、基因表达载体构建 （2）基因表达载体的过程 ② 用两种限制酶 2 基因工程步骤 3、重组DNA导入受体细胞 （1）常用的受体细胞及导入方法 植物细胞： 动物细胞： 微生物细胞： 农杆菌转化法 显微注射技术 Ca2+处理法(感受态细胞法) 2 基因工程步骤 3、重组DNA导入受体细胞 ① 农杆菌转化法 （1）常用的受体细胞及导入方法 2 基因工程步骤 3、重组DNA导入受体细胞 ② 显微注射法 （1）常用的受体细胞及导入方法 2 基因工程步骤 3、重组DNA导入受体细胞 ③ Ca2+处理法 大肠杆菌 感受态细胞 Ca2+ 混合 表达载体 缓冲液 溶于 吸收DNA，完成转化 用CaCl2处理大肠杆菌，增加细菌细胞膜的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入宿主细胞。 （1）常用的受体细胞及导入方法 2 基因工程步骤 3、重组DNA导入受体细胞 （2）导入结果 2 基因工程步骤 4、借助标记基因筛选和鉴定含目的基因的受体细胞 （1）标记基因种类 标记基因通常有： 抗生素的抗性基因，如：抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(tetr)； ——抗药性筛选法 荧光蛋白基因，如：绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)； 其他标记基因，如lacZ基因； ——显色筛选法 2 基因工程步骤 4、借助标记基因筛选和鉴定含目的基因的受体细胞 （2）抗药性筛选法 （1）构建完成的重组质粒对__________抗生素有抗性，对___________抗生素敏感。 （2）先在培养基 A 中加入________抗生素，形成的菌落（1-5）为_______（填编号） A.导入重组质粒的菌 B.导入空载质粒的菌 C.未导入的菌 青霉素 四环素 青霉素 AB 补充 影印法筛选 2 基因工程步骤 4、借助标记基因筛选和鉴定含目的基因的受体细胞 （2）抗药性筛选法 （3）将培养基 A 中的菌落用无菌绒布影印至加入_________抗生素的培养基 B 上（保证菌落在培养基上的位置不改变），一段时间后菌落 1、2、4 在培养基 B 上继续生长为 1‘、2’、4‘，这些菌落为___________（填编号） A.导入重组质粒的菌 B.导入空载质粒的菌 C.未导入的菌 （4）从培养结果看，符合筛选需求的目标菌为图中编号_____________。 （5）构建重组质粒还可以选择的的方案是__________。 四环素 B 3和5 A 2 基因工程步骤 4、借助标记基因筛选和鉴定含目的基因的受体细胞 （3）荧光蛋白基因筛选 如：目的基因插入在BFP荧光基因位点 受体细胞→ 空载质粒+受体细胞→ 重组质粒+受体细胞→ 卡那霉素敏感，无法在卡那霉素培养基上生长 抗卡那霉素，可以在卡那霉素培养基上生长 呈蓝色荧光 抗卡那霉素，可以在卡那霉素培养基上生长 无蓝色荧光 2 基因工程步骤 4、借助标记基因筛选和鉴定含目的基因的受体细胞 （4）蓝白斑筛选 若 lacZ 基因完整，LacZ基因的表达产物能将无色反应物X-gal水解成蓝色，形成蓝色菌落圈； 若 lacZ 基因中插入了外源基因，带有重组质粒大肠杆菌将形成白色菌落。 思考：如何筛选出含重组质粒的大肠杆菌？ 培养基中加入氨苄青霉素用以筛选出导入了质粒的受体菌； 培养基中加入X-gal用以鉴别出含重组质粒的受体菌； 含有重组质粒的大肠杆菌的菌落颜色是白色。 2 基因工程步骤 4、借助标记基因筛选和鉴定含目的基因的受体细胞 （5）检测目的基因是否含有和表达 筛选含目的基因的受体细胞常用方法： 抗药性筛选法 显色筛选法 类型 检测内容 方法 分子水平的检测 个体生物学水平的鉴定 受体细胞的染色体DNA上是否正确插入了目的基因 目的基因是否转录出了mRNA PCR等技术 目的基因是否翻译成蛋白质 抗原-抗体杂交技术 个体是否具有相应性状 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 03 蛋白质工程 3 蛋白质工程 1、基础：蛋白质分子的 及其与_________的关系。 2、操作方法和对象： 。 3、目的： 蛋白质或 的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 4、地位：在_________的基础上延伸出来的工程。 改造或合成基因 结构 功能 基因工程 修饰改造天然 设计制造全新 3 蛋白质工程 5、蛋白质工程思路 （1）天然蛋白质合成过程： 天然蛋白质合成的过程是按照________进行的。 中心法则 基因 表达 形成具有特定氨基酸序列的多肽链 形成具有高级结构的蛋白质 形式生物功能 转录和翻译 （2）蛋白质工程思路: 从_______________出发→设计______________→推测____________ →找到并改变___________________或_________→获得所需要的蛋白质 蛋白质工程与天然蛋白质合成的过程_____。 相反 预期的蛋白质功能 预期的蛋白质结构 应有的氨基酸序列 相对应的脱氧核苷酸序列 合成新基因 3 蛋白质工程 6、修饰改造天然蛋白操作策略 （1）基因的定点突变：在DNA水平上改变蛋白质特定位点的氨基酸序列，称为基因的定点突变； （2）定向进化：在DNA水平上随机改变蛋白质任一位点的氨基酸序列，则称为基因的定向进化。 3 蛋白质工程 6、修饰改造天然蛋白操作策略 （1）定点突变 例：人胰岛素的改造 人胰岛素样生长因子在与人胰岛素B链对应的第28位和第29位氨基酸分别是赖氨酸和脯氨酸 人胰岛素在这两处的氨基酸序列是脯氨酸和赖氨酸. 人胰岛素易聚合形成多分子,降低降糖效果； 人胰岛素样生长因子的结构和性质与人胰岛素高度相似，但它不易聚合形成多分子。 3 蛋白质工程 6、修饰改造天然蛋白操作策略 （1）定点突变 例1：人胰岛素的改造 3 蛋白质工程 6、修饰改造天然蛋白操作策略 （1）定点突变 例：人胰岛素的改造 3 蛋白质工程 6、修饰改造天然蛋白操作策略 （1）定点突变 例：人胰岛素的改造 依照待突变位点旁侧序列设计一对含突变碱基的局部引物 P1 和 P2，同时设计合成突变基因(或片段)两端的全匹配引物 P3 和 P4； P1和 P2 引物介导的 PCR 反应将产生缩短型含突变碱基的扩增产物； P3 和 P4 引物的存在又引导其合成各自的互补链； 这两组缩短突变型的双链片段在随后的退火过程中，可形成交叉互补结构，并实现两端延伸，最终合成出突变型的全长基因或片段； 值得注意的是，由于 P3 和 P4 全匹配引物的存在,基于上述程序合成的 DNA 分子中含有高比例的非突变型基因或片段； 一般而言,高浓度的P1、P2 倾向于突变型扩增产物的富集;而高浓度的 P3、P4 则有利于扩增产物总产量的提高。 3 蛋白质工程 6、修饰改造天然蛋白操作策略 （2）定向进化 （模拟自然进化） 现代进化理论： 种群是生物进化的单位 可遗传变异为生物进化提供原材料 自然选择主导生物进化的方向 隔离是新物种形成的必要条件 变异是不定向 自然选择是定向的 3 蛋白质工程 6、修饰改造天然蛋白操作策略 （2）定向进化 针对某个特定的基因采用PCR技术进行扩增，在过程中通过改变反应条件故意让 DNA 复制发生随机错误，便能创建一系列随机突变的新基因序列。 再将这些新基因序列导入合适的受体细胞中，表达出相应的一系列随机突变蛋白。 根据我们的需求从中筛选出具有特定优良功能或结构的目的蛋白。 蛋白质工程——难度大 蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而这种高级结构往往十分复杂。 要设计出更加符合人类需要的蛋白质，还需要不断地攻坚克难。随着科技的深入发展，蛋白质工程将会给人类带来更多的福祉。 三 级 结 构 一 级 结 构 四 级 结 构 二 级 结 构 项目 蛋白质工程 基因工程 操作对象 操作起点 操作水平 操作流程 结果 实质 联系 基因 基因 DNA分子水平 DNA分子水平 预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新基因→获得所需要的蛋白质 目的基因的筛选与获取→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 可生产自然界没有的蛋白质 生产自然界已有的蛋白质 通过改造或合成基因来定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质 将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状 ①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的工程； ②蛋白质工程离不开基因工程，其包含基因工程的基本操作。 预期蛋白质功能 目的基因 蛋白质工程和基因工程的比较 $$