备课素材——DNA测序技术的发展（双脱氧链终止法测序）

DNA测序技术的发展 1、 第一代测序技术 第一代测序技术以桑格﹣库森法为代表。桑格﹣库森法又叫作双脱氧法，它以 DNA合成反应为基础。桑格﹣库森法测定 DNA 序列的原理如图所示。首先，在每个反应体系中加入同位素标记的引物，待测的 DNA 片段，足够量的脱氧核苷三磷酸（ dATP 、 dGTP 、 dCTP 和 dTTP ）和DNA 聚合酶。然后，在四个反应体系中分别加入少量的双脱氧核苷三磷酸（ ddATP 、 ddGTP 、 ddCTP 和 ddTTP ）进行 PCR 反应。以加入 ddATP 的反应体系为例，每次合成反应如果配对的为 ddATP ，反应就会停止，如果为 dATP ，反应可以继续，直到与 ddATP 配对反应才会停止，所以在该反应体系中我们会得到长短不一的，以 ddA 结尾的片段。再利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离四个反应体系中的产物并进行放射自显影，得到图谱后就可以读取核苷酸的排列顺序了。 具体过程 ①扩增出足够多的待测样本，加热解旋，保留单链作为测序模板链。 ②测序模板链结合引物后，加入试管中，并向试管中加入足量的DNA聚合酶、4种dNTP和1种特定的ddNTP。 ③延伸。在进行DNA扩增时，一旦ddNTP与模板链发生互补配对，子链延伸就停止了，从而得到不同长度的扩增产物。 ④将扩增得到的不同长度的产物进行电泳分离，得到子链种某种ddNTP的相对含量。 ⑤按照相同的方法，得到分别加入ddTTP、ddGTP、ddCTP的扩增产物电泳图。 ⑥根据扩增产物电泳图，分析测序模板链的碱基序列。由于小片段在前，大片段在后，因此我们需要逆向读取序列。 桑格﹣库森法操作简便，获得了科研人员的广泛认可，基于桑格﹣库森法的原理衍生出了多种测序技术。人类基因组计划的大部分测序工作就是通过桑格﹣库森法衍生出的技术平台完成的。以桑格﹣库森法为代表的第一代测序技术可测长约1000 bp 的 DNA 片段，测序结果可靠，准确率高达99.999%。但第一代测序技术的通量低、成本相对较高，这限制了它的大规模应用。 2、第二代测序技术 20世纪90年代，为了满足基因组学发展的需求，科研人员开发了通量更高、成本更低的测序技术。为了与第一代测序技术进行区分，他们将后来发展的测序技术称为第二代测序技术。第二代测序技术通常先将样品 DNA 打断成几百个碱基对长的片段，再在片段两端加接头，进行 PCR 扩增和序列分析。第二代测序技术也有一些缺点：测序产生的都是一些较短的序列，后续序列拼接的工作比较复杂； PCR 扩增前后 DNA 片段数的比值会有差异，不利于进行生物信息学分析。 3．第三代测序技术 为了更加精确与高效地挖掘 DNA 的序列信息，科研人员研究、开发出了第三代测序技术，即单分子测序技术。第三代测序技术与第一代、第二代测序技术不同，测序时不再需要进行 PCR 扩增，而是基于单分子水平边合成边测序，从而实现了对每个 DNA 分子的单独测序。 第三代测序技术与第二代测序技术相比，获得的序列较长，后续序列拼接的工作相对简单。总的来说，第三代测序技术相较于前两代测序技术，具有超长读长、运行快、无须模板扩增、可直接检测表观遗传修饰位点等特点，它主要用于基因组测序、甲基化研究、突变鉴定等领域，所得数据适于进行生物信息学分析。虽然第三代测序技术的优点非常多，但该技术尚处于发展阶段，还未成熟和实现多元化，成本较高，目前多用于科学研究，商业化程度较低。 1 学科网（北京）股份有限公司 $$