专题五 基因工程（期末复习知识清单）高二生物下学期沪科版

专题五 基因工程 【思维导图】 【知识梳理】 1、基因工程的诞生 概念 又称重组DNA技术，是指将一种或多种生物（供体）的______与______在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新产物或新性状。基因工程是现代生物工程的核心技术 科学意义 _____________________________________________ 理论基础 揭示______是遗传物质、确立DNA双螺旋结构和中心法则、破译______ 应用价值 探究基因功能、改良遗传性状、制造生产产品 应用领域 医学领域如生产乙肝疫苗、基因治疗等；农牧业领域如转基因抗虫棉、大豆等；食品工业领域如改良生产菌株提高谷氨酸产量等 2、 基因工程的三种工具 （1）_______________（又称限制酶）——“分子手术刀” 1　 功能：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的__________键断开。 2　 结果：产生_____末端或平末端。 3　 例：已知限制酶EcoR Ⅰ和Sma Ⅰ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓AATTC和CCC↓GGG，在图中写出两种限制酶切割DNA后产生的末端并写出末端的种类。 EcoR Ⅰ限制酶和Sma Ⅰ限制酶识别的碱基序列不同，切割位点不同（填“相同”或“不同”），说明限制酶具有专一性。 （2）_____酶——“分子缝合针” 作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的__________ （3）_____——“分子运输车” 1　 种类 1) _____：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的、环状的、裸露的DNA分子，独立于拟核之外。 2) λ噬菌体的衍生物和动植物_____等。 2　 目的 1) 将目的基因转运到宿主细胞中去。 2) 在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 3　 必备条件 1) ______________________________。 2) 有多个_______________切割位点。 3) 有一定的__________，便于筛选。 4) 对受体细胞无害。 3、基因工程的基本步骤 （1）____________________ 方法 前提 目的基因的完整序列已知 基因序列未知 目的基因的部分序列已知 ①PCR概念：是一项模拟细胞内______过程的DNA体外扩增技术。 ②PCR意义：利用这项技术可由微量的DNA样品特异、高效、准确地扩增特定区域的DNA序列。 ③PCR前提：目的基因两侧的序列已知，以便人工化学合成______。 ④PCR体系：缓冲液、DNA模板、四种dNTP（脱氧核苷三磷酸）、______酶、两种______和双蒸水。 ⑤PCR基本程序： 基本程序 控制温度 变化 95℃ 使待扩增双链DNA样品解旋，形成单链模板 55～68℃ 使两条不同的引物分别与两条单链DNA模板结合 75℃左右 DNA聚合酶催化从两条引物的一端以相反方向合成新的DNA子链 重复上述操作n次，理论上可从1分子双链DNA模板扩增至______个分子。 （2）_________________________ 先“切割”和“连接”：将目的基因和合适的载体用相应的____________酶切割出黏性末端，然后加入______酶将目的基因和载体连接为一体，形成含目的基因且能表达的表达载体。 表达载体构建需注意： ①若用同一种限制性内切核酸酶切割目的基因和载体，目的基因两侧的黏性末端相同，能以正反两种方式等概率接入载体；载体两端的黏性末端相同，可能______，导致载体空载。 ②只要目的基因和载体的黏性末端______，并不必须用同一种酶切开。 ③用两种识别序列不同、但黏性末端相同的限制性内切核酸酶分别切开目的基因和载体DNA，那么两者连接后原来的限制性内切核酸酶识别序列会______。 （3）_________________________ 先“转化”后“扩增”：为了提高DNA分子进入受体细胞的效率，通常需要对受体细胞进行特殊的处理，这一操作称为转化。转化后的细胞需要经过一段时间的培养，使得用于筛选的性状得以表达，这个过程称为扩增。 转化方法 实例 物理方法 电击法、____________（动物细胞） 化学方法 ____________法 生物方法 ____________法、病毒感染 （4）_________________________ “筛选与鉴定”：借助有效的实验技术快速、准确地找到正确导入（甚至高效表达）目的基因的受体细胞。 筛选含目的基因的受体细胞常用抗药性筛选法和显色筛选法。 抗药性筛选法 实施的前提条件是载体DNA携带______的抗性基因（作为标记基因）。将转化扩增的细菌涂布在含有______的固体平板上，理论上能长出的菌落便是转化成功的克隆 显色筛选法 有些质粒上含有标记基因，其表达的酶蛋白可将一种无色的化合物（X-gal）水解成蓝色产物。外源DNA插在标记基因内部，转化扩增的细菌涂布在同时含有抗生素和______的固体培养基上，在长出来的克隆中，______色克隆即为含重组质粒的克隆 4、蛋白质工程 蛋白质工程，又称第二代基因工程，是由______或______基因进而操纵蛋白质结构和性质的过程。包括____________和____________两大方面。 （1）修饰改造天然蛋白 修饰改造天然蛋白一方面可实现______序列改造，优化其功能；另一方面还可以确定多肽链中某个______残基在蛋白质结构和功能上的作用，以收集有关氨基酸残基线性序列与其空间构象和生物功能之间的对应关系，为设计制作新型的突变蛋白提供理论依据。 操作策略 突变型目的基因获取途径 ①基因的____________：在DNA水平上改变蛋白质特定位点的氨基酸序列。如突变型人胰岛素、新型L-天冬酰胺酶、优质t-PA突变蛋白等 突变型目的基因较短，按照设计好的编码序列进行____________是首选方法 突变型目的基因较长，采取____________获取更经济。首先人工化学合成含有突变序列的突变引物和不含突变序列的正常引物，然后使用这两种引物以正常基因为模板进行PCR ②基因的____________：在DNA水平上随机改变蛋白质任一位点的氨基酸序列 在体外对特定基因实施随机突变，然后借助适当的筛选程序准确、迅速地获得所需要的突变基因 （2）设计制造全新蛋白 根据已经掌握的蛋白质结构与功能的关系，借助特殊的电脑程序自行设计、拼装感兴趣的全新基因序列，然后借助重组DNA技术使之表达，进而检测这种全新蛋白的性能是否能达到设计标准。 1 学科网（北京）股份有限公司 $$ 专题五 基因工程 【思维导图】 【知识梳理】 1、基因工程的诞生 概念 又称重组DNA技术，是指将一种或多种生物（供体）的____DNA__与___载体___在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新产物或新性状。基因工程是现代生物工程的核心技术 科学意义 打破物种之间遗传信息交流的屏障 理论基础 揭示_DNA__是遗传物质、确立DNA双螺旋结构和中心法则、破译___遗传密码子___ 应用价值 探究基因功能、改良遗传性状、制造生产产品 应用领域 医学领域如生产乙肝疫苗、基因治疗等；农牧业领域如转基因抗虫棉、大豆等；食品工业领域如改良生产菌株提高谷氨酸产量等 2、 基因工程的三种工具 （1）限制性内切核酸酶（又称限制酶）——“分子手术刀” 1　 功能：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 2　 结果：产生黏性末端或平末端。 3　 例：已知限制酶EcoR Ⅰ和Sma Ⅰ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓AATTC和CCC↓GGG，在图中写出两种限制酶切割DNA后产生的末端并写出末端的种类。 EcoR Ⅰ限制酶和Sma Ⅰ限制酶识别的碱基序列不同，切割位点不同（填“相同”或“不同”），说明限制酶具有专一性。 （2）DNA连接酶——“分子缝合针” 作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 （3）载体——“分子运输车” 1　 种类 1) 质粒：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的、环状的、裸露的DNA分子，独立于拟核之外。 2) λ噬菌体的衍生物和动植物病毒等。 2　 目的 1) 将目的基因转运到宿主细胞中去。 2) 在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 3　 必备条件 1) 在宿主细胞中保存下来并大量复制。 2) 有多个限制酶切割位点。 3) 有一定的标记基因，便于筛选。 4) 对受体细胞无害。 3、基因工程的基本步骤 （1）获取目的基因 方法 前提 化学合成法 目的基因的完整序列已知 基因文库法 基因序列未知 PCR 目的基因的部分序列已知 ①PCR概念：是一项模拟细胞内_DNA复制_过程的DNA体外扩增技术。 ②PCR意义：利用这项技术可由微量的DNA样品特异、高效、准确地扩增特定区域的DNA序列。 ③PCR前提：目的基因两侧的序列已知，以便人工化学合成__引物__。 ④PCR体系：缓冲液、DNA模板、四种dNTP（脱氧核苷三磷酸）、____耐高温的DNA聚合（Taq）__酶、两种__引物和双蒸水。 ⑤PCR基本程序： 基本程序 控制温度 变化 变性 95℃ 使待扩增双链DNA样品解旋，形成单链模板 退火 55～68℃ 使两条不同的引物分别与两条单链DNA模板结合 聚合 75℃左右 DNA聚合酶催化从两条引物的一端以相反方向合成新的DNA子链 重复上述操作n次，理论上可从1分子双链DNA模板扩增至___2n___个分子。 （2）构建表达载体 先“切割”和“连接”：将目的基因和合适的载体用相应的__限制___酶切割出黏性末端，然后加入____DNA连接__酶将目的基因和载体连接为一体，形成含目的基因且能表达的表达载体。 表达载体构建需注意： ①若用同一种限制性内切核酸酶切割目的基因和载体，目的基因两侧的黏性末端相同，能以正反两种方式等概率接入载体；载体两端的黏性末端相同，可能___自身环化___，导致载体空载。 ②只要目的基因和载体的黏性末端___相同___，并不必须用同一种酶切开。 ③用两种识别序列不同、但黏性末端相同的限制性内切核酸酶分别切开目的基因和载体DNA，那么两者连接后原来的限制性内切核酸酶识别序列会___消失___。 （3）导入受体细胞 先“转化”后“扩增”：为了提高DNA分子进入受体细胞的效率，通常需要对受体细胞进行特殊的处理，这一操作称为转化。转化后的细胞需要经过一段时间的培养，使得用于筛选的性状得以表达，这个过程称为扩增。 转化方法 实例 物理方法 电击法、_____显微注射法_____（动物细胞） 化学方法 __氯化钙___法 生物方法 _农杆菌转化___法、病毒感染 （4）筛选和鉴定含目的基因的受体细胞 “筛选与鉴定”：借助有效的实验技术快速、准确地找到正确导入（甚至高效表达）目的基因的受体细胞。 筛选含目的基因的受体细胞常用抗药性筛选法和显色筛选法。 抗药性筛选法 实施的前提条件是载体DNA携带___抗生素___的抗性基因（作为标记基因）。将转化扩增的细菌涂布在含有_____抗生素_的固体平板上，理论上能长出的菌落便是转化成功的克隆 显色筛选法 有些质粒上含有标记基因，其表达的酶蛋白可将一种无色的化合物（X-gal）水解成蓝色产物。外源DNA插在标记基因内部，转化扩增的细菌涂布在同时含有抗生素和___X-gal___的固体培养基上，在长出来的克隆中，__白____色克隆即为含重组质粒的克隆 4、蛋白质工程 蛋白质工程，又称第二代基因工程，是由___人为突变___或____设计__基因进而操纵蛋白质结构和性质的过程。包括__修饰改造天然蛋白_____和____设计制造全新蛋白________两大方面。 （1）修饰改造天然蛋白 修饰改造天然蛋白一方面可实现___氨基酸___序列改造，优化其功能；另一方面还可以确定多肽链中某个__氨基酸____残基在蛋白质结构和功能上的作用，以收集有关氨基酸残基线性序列与其空间构象和生物功能之间的对应关系，为设计制作新型的突变蛋白提供理论依据。 操作策略 突变型目的基因获取途径 ①基因的_____定点突变_______：在DNA水平上改变蛋白质特定位点的氨基酸序列。如突变型人胰岛素、新型L-天冬酰胺酶、优质t-PA突变蛋白等 突变型目的基因较短，按照设计好的编码序列进行_____化学合成____是首选方法 突变型目的基因较长，采取____ PCR方案___获取更经济。首先人工化学合成含有突变序列的突变引物和不含突变序列的正常引物，然后使用这两种引物以正常基因为模板进行PCR ②基因的__ 定向进化__：在DNA水平上随机改变蛋白质任一位点的氨基酸序列 在体外对特定基因实施随机突变，然后借助适当的筛选程序准确、迅速地获得所需要的突变基因 （2）设计制造全新蛋白 根据已经掌握的蛋白质结构与功能的关系，借助特殊的电脑程序自行设计、拼装感兴趣的全新基因序列，然后借助重组DNA技术使之表达，进而检测这种全新蛋白的性能是否能达到设计标准。 学科网（北京）股份有限公司 $$