3.1DNA的粗提取和鉴定课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

DNA的粗提取和鉴定 （一）实验原理 2.DNA不溶于酒精，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA和蛋白质。 1.DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。 3.在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可作为鉴定DNA的试剂。 （提取原理） （提取原理） （鉴定原理） DNA + 二苯胺 沸水浴 蓝色 四、 DNA的提取与分离 DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。 （注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。） 1.选材： 2.试剂： ①研磨液 ②体积分数为95%的酒精 ④二苯胺试剂 ⑤蒸馏水 ——含有 2mol/L NaCl、EDTA、 SDS、Tris和HCl ——析出DNA ——鉴定DNA，要现配现用 研磨液、二苯胺的配制方法 课本P117 SDS:使蛋白质变性与DNA分离; EDTA:是一种DNA酶的抑制剂，可防止细胞破碎后DNA酶降解DNA;从而保护DNA Tris:提供缓冲体系，DNA在这个缓冲体系中呈稳定状态。 2mol/L NaCl：溶解DNA HCl：调节pH 四、 DNA的提取与分离 （三）实验步骤 取材、研磨 过滤 分离 鉴定 结果观察 四、 DNA的提取与分离 1.取材、研磨 称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL 研磨液，充分研磨 ①研磨的目的？ 破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中 2.过滤或离心取上清液 在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。 也可直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。 ①上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？ 可能含有核蛋白、多糖等杂质 ②低温放置几分钟的作用？可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解 四、 DNA的提取与分离 3.预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA 在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分； 或将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。 ①搅拌时应轻缓、并沿一个方向？ 减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子 ②酒精预冷的作用？ 同“低温放置的作用” 四、 DNA的提取与分离 4.NaCl溶液溶解DNA并鉴定 取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。 实验组 对照组 水浴加热 *溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关。 四、 DNA的提取与分离 思考：1．鸟类和哺乳动物的红细胞都适合用来提取DNA吗？请说明理由。 2．实验过程要充分地搅拌和研磨，如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？ 哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核，不适合作材料提取DNA。 研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，导致看不到丝状物或沉淀物，用二苯胺鉴定不显示蓝色。 四、 DNA的提取与分离 （五）结果分析与评价 1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？ 观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。 本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。 2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？ 四、 DNA的提取与分离 （五）结果分析与评价 3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。 本实验可以采取分组的方式进行。可以选取不同的实验材料；也可以查阅资料了解其他提取DNA的方法，对同种材料采用不同的方法。最后从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。 四、 DNA的提取与分离 （六）进一步探究 本实验只是对DNA进行了粗提取，请查阅资料，了解实验室提取纯度较高的DNA的一种方法，并与本实验中所使用的方法进行比较，总结两种方法的异同。 实验室提取纯度较高的DNA的方法有不少。例如，可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24：1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。此外由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。 四、 DNA的提取与分离 练习与应用 一、概念检测 1. DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是 （ ） A. 能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 B. 能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C. 能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 D. 只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端 C 练习与应用 练习与应用 一、概念检测 2. 在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是 （ ） A. 大肠杆菌的质粒 B. 切割DNA分子的酶 C. DNA片段的黏性末端 D. 用来识别特定基因的DNA探针 A 练习与应用 练习与应用 二、拓展应用 1. 想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？ 是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。 练习与应用 2．有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶Hind Ⅲ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。 A片段 B片段 练习与应用 二、拓展应用 练习与应用 练习与应用 二、拓展应用 A片段 B片段 （1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？ XbaⅠ。 因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。 练习与应用 练习与应用 二、拓展应用 A片段 B片段 (2)不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？ 识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建重组DNA分子时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。 练习与应用 Lavf58.20.100 $$