复习专题03 基因工程（下）（串讲课件）-2024-2025学年高二生物下学期期末考点大串讲（浙科版2019）

1 复习专题03 基因工程（下） 期末考点大串讲 浙科版2019|高二期末复习 目录 1. 课程标准 2. 考点梳理 高频命题点01 基因工程及其工具 高频命题点02 DNA的粗提取和鉴定 高频命题点03 基因工程的基本操作步骤 高频命题点04 PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定 高频命题点05 基因工程的应用 高频命题点06 蛋白质工程 3. 真题检测 1. 课程标准 概念5 基因工程赋予生物新的遗传特性 5.1 基因工程是一种重组DNA技术 5.1.1 概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的 5.1.2 阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具 5.1.3 阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤 5.1.4 举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质 5.2 蛋白质工程是基因工程的延伸 5.2.1 概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质 5.2.2 举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程 2. 考点梳理 高频命题点04 PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定 （一）PCR扩增DNA片段 基因长度已知 实验目的： 1. 实验思路 2. 考点梳理 高频命题点04 PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定 （一）PCR扩增DNA片段 耐高温的DNA聚合酶 （Taq酶） DNA模板 引物 稳定的缓冲溶液 （一般添加Mg2+） 四种脱氧核苷酸(dNTP) 激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶 2. PCR反应的条件 2. 考点梳理 高频命题点04 PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定 （一）PCR扩增DNA片段 微量移液器 微量离心管 3. 实验步骤 提高反应速率 1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理。 2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套 5.PCR扩增不能随意加大试剂用量 6.若电泳缓冲液使DNA带负电荷，加样孔侧应连电极的负极 2. 考点梳理 高频命题点04 PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定 （一）PCR扩增DNA片段 2. 考点梳理 高频命题点04 PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定 （一）PCR扩增DNA片段 1.细胞内DNA复制时是否需要引物?为什么? 2.PCR过程中,如果两种引物之间互补序列较长,会有什么样的结果? 3.PCR过程中,退火的目的是什么? 4. PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗? 需要。因为DNA聚合酶不能从头开始合成DNA单链,只能将游离的脱氧核苷酸连接在一条DNA单链的3'端,所以细胞内DNA复制时需要引物。 可能会导致在退火过程中,引物之间相互结合,从而使引物不能很好地与模板DNA链结合。 使2个引物分别与各自互补的DNA单链结合 不是，PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段 2. 考点梳理 高频命题点04 PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定 （二）琼脂糖凝胶电泳 P107 磷酸基团、脱氧核糖、含氮碱基？ 其他因素：电场强度、带电粒子所带电荷量、缓冲液pH 2. 考点梳理 高频命题点04 PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定 （二）琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶 电泳 1. 哪一侧是正极？ 2. 长短片段的分布有什么特点？ 长片段电泳速度慢，靠近起点——负极 2. 考点梳理 高频命题点04 PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定 （二）琼脂糖凝胶电泳 ① ③ ② ①在电泳前将EB与琼脂糖粉、EDTA缓冲液和水混合以形成凝胶基质。EB会均匀地分散在整个基质中。到凝胶电泳完成时，每个DNA分子都吸收了大量的溴化乙锭。在紫外光存在下，EB显示出荧光。技术人员会在凝胶上照射经过特殊校准的紫外线，而机器会捕获发光碎片的图像。 2. 考点梳理 高频命题点04 PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定 （二）琼脂糖凝胶电泳 再放在波长300nm的紫外灯下观察 ① ③ ② ②具有明显疏水性的阴离子亚甲基蓝分子的氯化物盐会渗透整个凝胶基质。但是，整个DNA中的氢键会导致染色分子积聚。DNA染色密度的增加会产生肉眼可见的深蓝色阴影。 2. 考点梳理 高频命题点04 PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定 （二）琼脂糖凝胶电泳 再放在波长300nm的紫外灯下观察 倒入0.1% 亚甲基蓝溶液，没过凝胶约5 mm，染色8 min。凝胶下表面与培养皿之间，不要留有气泡。 75%乙醇脱色1min, 不断晃动培养皿。 染色方案二：向盛有凝胶的培养皿中倒入0.002% 亚甲基蓝溶液，并没过凝胶。盖上培养皿盖，4℃冷藏过夜。 冷蒸馏水脱色。可更换被染蓝的蒸馏水。 P113 染色方案一 2. 考点梳理 高频命题点04 PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定 （二）琼脂糖凝胶电泳 不同的染色方法可以从照片中判断出来 Q：目的基因是841bp，如何鉴别是哪个条带？ 2. 考点梳理 高频命题点04 PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定 （二）琼脂糖凝胶电泳 2. 考点梳理 高频命题点04 PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定 （二）琼脂糖凝胶电泳 Q：为什么DNA加样孔在负极端？ DNA带负电，往正极移动 Q：根据图2，EcoRI和HindIII哪个酶在双链DNA上的酶切位点多？ Q：所有条带中分子量最大的是？含量最多的是？ HindIII 1. DNA片段离加样孔越远，分子量越小。具体分子量根据Marker上的标准DNA片段判断 2. 同一个条带中DNA分子量一致 3. DNA片段含量根据条带宽度判断，越宽的条带，DNA含量越高。 （若用荧光或放射性染料染色，还可以观察亮度，见图3） 2. 考点梳理 高频命题点04 PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定 （二）琼脂糖凝胶电泳 浓缩50倍的母液 抑制DNA酶活性，防止核DNA被酶解 （二）琼脂糖凝胶电泳 梳子 模具 1. 如果未出现条带，可能原因是什么？ 2. 如果出现不止一条条带，可能原因是什么？ 抄书上：①漏加了PCR反应成分②各反应成分的用量不当③PCR程序设置不当等 ①引物设计不合理，能够与非目的序列的非特异性结合形成杂交带；或形成引物—引物聚合体。 ②退火温度过低，非特异性结合的概率高 ③DNA聚合酶质量不好 2. 考点梳理 高频命题点04 PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定 （二）琼脂糖凝胶电泳 【例】PCR技术可用于临床上病原菌的检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①利用PCR扩增DNA片段；②从病人组织样本中提取DNA；③分析PCR扩增结果；④采集病人组织样本。下列有关叙述正确的是（    ） A．若要得到正确的检测结果，操作顺序应该为②①③④ B．PCR扩增的原理是DNA半保留复制，所用缓冲液中常加入Mg2+ C．利用PCR扩增病原菌DNA时，需要设计两种碱基互补配对的引物 D．设计的引物中G、C碱基所占比例越高，复性所需的温度越低 B 【详解】A、依据题干信息，若要得到正确的检测结果，操作顺序应该为④②①③，A错误； B、PCR扩增的原理是DNA半保留复制，所用缓冲液中常加入Mg2+，以激活耐高温的DNA聚合酶的活性，B正确； C、PCR扩增所需要的两引物不需要彼此碱基互补配对，C错误； D、设计的引物中G、C碱基所占比例越高，氢键的数目就越多，复性所需的温度越高，D错误。 【例】带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳。下列关于电泳的叙述，正确的是（    ） A．电泳中带电粒子迁移速率只与所带电荷有关 B．电泳的过程要在一定的pH下进行，所以要使用缓冲液 C．DNA片段根据长度大小在凝胶上分开，形成连续的条带 D．切断电源后即可用肉眼观察到DNA条带在凝胶上的位置 B 【详解】A、电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异及分子本身大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离，可见，待测样品中各种分子的形状、大小及带电性质的差异等会影响其在电泳中的迁移速度，A错误； B、电泳的过程要在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电，故需要使用缓冲液以保持pH的稳定，B正确； C、DNA片段根据长度大小在凝胶上分开，形成不连续的条带，且每个条带包含的DNA段长度是相同的，C错误； D、DNA条带在凝胶上的位置需要在紫外灯下进行观察，D错误。 【例】人血清白蛋白（HSA）是血浆蛋白的主要成分，具有维持血浆渗透压和进行物质运输的功能。科学家利用转基因技术获得转HSA基因的大肠杆菌，通过发酵工程，实现HSA的大量生产。下图表示HSA基因，有关叙述正确的是（    ）  A．PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是第三步 B．扩增出HSA基因并用于表达载体的构建，应选择引物Ⅱ和引物Ⅲ C．在PCR反应缓冲液中加入Ca²⁺的作用是激活耐高温的DNA聚合酶 D．基因工程的核心环节是目的基因导入受体细胞 B 【详解】A、PCR过程每次循环一 般可以分为变性、复性和延伸三步，变性温度一般是90℃左右，复性温度一般是50℃左右，延伸温度一般是72℃左右，可见温度最低的一步是第二步：复性，A错误； B、引物结合在模板链的3'端，使子链从5'→3'延伸，扩增出HSA基因并用于表达载体的构建，应选择引物Ⅱ和引物Ⅲ，B正确； C、在PCR反应缓冲液中加入Mg2+的作用是激活耐高温的DNA聚合酶，催化脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成，C错误； D、基因工程的核心环节是构建重组DNA，D错误。 阅读下列材料，完成下面小题。 科研人员通过切割pET-SEA质粒上SEA基因和终止子之间的部分序列，将猪流行性腹泻病毒的S基因插入，以构建pET-SEA-S重组质粒，并在大肠杆菌中高效表达SEA-S融合蛋白。 【例】目的基因导入受体细胞后，可用PCR技术筛选出成功导入pET-SEA-S融合表达质粒的细菌。下列各项所列引物用来进行筛选最合适的是（　　） A．引物1和引物4 B．引物3和引物4 C．引物1和引物5 D．引物2和引物5 A 据题干信息可知，需要用PCR技术筛选出含有pET-SEA-S融合表达质粒的细菌，即扩增出的DNA片段含有SEA基因和S基因，故选引物1和引物4，A正确，BCD错误。 阅读下列材料，完成下面小题。 科研人员通过切割pET-SEA质粒上SEA基因和终止子之间的部分序列，将猪流行性腹泻病毒的S基因插入，以构建pET-SEA-S重组质粒，并在大肠杆菌中高效表达SEA-S融合蛋白。 【例】选择HPaⅠ酶和BamHⅠ酶对pET-SEA-S进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，电泳结果如图甲所示。若蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.12kDa，将表达的SEA-S融合蛋白进行凝胶电泳，图乙中显示的条带应是（　　） B A.Ⅰ B.Ⅱ C.Ⅲ D.Ⅳ 选择HPaⅠ酶和BamHⅠ酶对pET-SEA-S进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，电泳结果如图甲所示，1200bp（大约）和5100bp（大约）两个片段，SEA和S基因融合片段小，故为大小1200bp，1bp表示一个碱基对，经转录翻译后，氨基酸个数为400个，若蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.12kDa，则该蛋白质的分子量为400×0.12=48kDa，故对应图乙中的条带Ⅱ，B正确，ACD错误。 【例】N一乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）在骨关节炎治疗领域具有广泛应用价值。某科研团队以大肠杆菌菌株M为初始菌株，设计改造合成GlcNAc的关键代谢途径，探索发酵生产GlcNAc的优化策略，相关流程如图1所示（图中相关基因控制相应途径中所需酶的合成）。 (1)为获取大肠杆菌S基因和酿酒酵母L基因的核苷酸序列信息，可采用     技术。为保障两种基因在工程菌中能被大量表达，在     中须添加     序列。 (2)常用CaCl2处理获得感受态菌株M，将重组表达载体导入其中进行     ，一段时间后将菌液接种至含特定抗生素的固体培养基进行培养和筛选，获得工程菌RY-1菌落。将菌株M和RY-1接种至     （选填“液体培养基”或“固体培养基”），一段时间后测定其GlcN和GlcNAc的含量，结果如图2所示，导致菌株RY-1能成功合成GlcNAc的关键是引入     基因。 (3)为继续探索生产GlcNAc的优化策略，利用基因工程技术敲除菌株M的A和B基因，构建工程菌RY-2。进行     检测基因是否成功敲除，其结果如图3所示。据结果判断泳道     对应的菌株为所需的RY-2，判断依据是     。 (4)将含S基因和L基因的重组表达载体导入工程菌RY-2中，获得工程菌RY-3。为     的效果，以RY-3作为实验组，并以RY-1菌株作对照，适宜条件下进行发酵培养，检测到RY-3的GlcN和GlcNAc的产量均有较大幅度提高。 【答案】(1) 基因测序 引物 启动子 (2) 转化 液体培养基 L (3) PCR和凝胶电泳 5 凝胶电泳测定时分子量越小迁移距离越远，由于RY-2目标条带会比未敲除的短，则迁移距离较远，图示甲和乙中条带5均是迁移最远的 (4)验证A和B基因敲除 2. 考点梳理 高频命题点05 基因工程的应用 法医鉴定 农牧业育种 医疗制药 基因工程的应用 保护生态环境 ①基因诊断 ②基因治疗 ②基因工程药物 ②研究疾病机理的模型 ①抗虫 ②抗病 ③抗除草剂 ④产品品质 抗逆性 是否基因突变 是否被病原体感染 导入正常基因 乳腺生物反应器、工程菌 基因敲除 第1步：PCR扩增待检者镰状细胞β-球蛋白基因 第2步：Mst Ⅱ识别并剪切扩增后的DNA 第3步：琼脂糖凝胶电泳分离酶切后的DNA片段，与标记的探针杂交，显影检测后判断待检者的基因组成。 判断各泳道基因型？ （一）医疗制药：（1）基因诊断 检测患者自身携带的缺陷基因 正常基因被酶切后？ 突变基因被酶切后？ →小片段 →大片段 （一）医疗制药：（1）基因诊断 诊断患者是否感染某种病原体 实例：检测血液中的HIV病毒基因组 第1步：PCR扩增待检者血清中微量基因 第2步：琼脂糖凝胶电泳检测是否有HIV病毒的cDNA 感染 未感染 PCR能否直接扩增HIV病毒的RNA? 微量待测基因(限制酶切/逆转录处理) 大量待测基因 显影检测 PCR扩增 凝胶电泳分离 （一）医疗制药：（2）基因治疗 基因治疗定义P123：向有基因缺陷的细胞中引入正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷，从而达到治疗的目的。 应用：主要针对一些严重威胁人类健康的遗传病。（基因突变引起） 实例：如血友病、重度免疫缺陷病、治疗恶性肿瘤的重组人p53腺病毒注射液 正常功能的基因 载体（修饰过？的病毒） 如腺病毒、逆转录病毒 2. 考点梳理 高频命题点05 基因工程的应用 如图所示为人体正常红细胞和镰刀形细胞贫血症患者红细胞形态及镰刀形细胞贫血症的基因治疗过程。请回答以下问题： (1)____图细胞为镰刀形细胞贫血症的红细胞。这种病是由_________造成的。 乙 基因突变 (2)图中A为__________________， D为_______________________。 合成血红蛋白的正常基因(或目的基因) 造血干细胞 (3)该方法属于_____(填“体内”或“体外”)基因治疗，其特点是_______________________。 体外 操作复杂但效果较为可靠 （一）医疗制药：（2）基因治疗 2. 考点梳理 高频命题点05 基因工程的应用 34 (3)写出图中过程的操作内容： ①______________________； ②用携带正常基因的载体(病毒)侵染造血干细胞； ③___________________________________________； ④________________________________________________________。 将正常基因插入载体中 将载体(携带正常基因)导入造血干细胞染色体上 将经过改造的造血干细胞输入患者骨髓中并产生正常的血细胞 （一）医疗制药：（1）基因治疗 2. 考点梳理 高频命题点05 基因工程的应用 35 2. 考点梳理 高频命题点05 基因工程的应用 （一）医疗制药：（3）基因工程药物 乳腺生物反应器 动物乳腺生物反应器是基于转基因技术，使外源基因导入动物基因组中并定位表达于动物乳腺，利用动物乳腺天然、高效合成并分泌蛋白的能力，在动物的乳汁中生产一些具有重要价值产品的转基因动物的总称。 优点： ①乳汁可以连续合成 ②频繁采集不会对动物产生危害 ③乳汁成分相对简单、明确，便于药物的提纯。 人抗凝血酶基因 乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件 基因表达载体 显微注射 受精卵 泌乳期分泌乳汁 转基因动物 抗凝血酶 早期胚胎培养 胚胎移植 早期胚胎 （一）医疗制药：（3）基因工程药物 乳腺生物反应器 2. 考点梳理 高频命题点05 基因工程的应用 1.为什么将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起？ 2.药用蛋白基因存在于转基因动物的哪些细胞中？为什么？ 3.生物反应器除了用乳腺，还可以用什么器官？ 4. 膀胱生物反应器哪些方面优于乳腺生物反应器？ 药用蛋白基因只在乳腺细胞中特异性表达 几乎所有细胞。因为目的基因导入了受精卵，所有细胞都是由同一个受精卵分裂、分化而来的 膀胱 (1)正常尿液中蛋白质含量很少，所以从尿液中更容易提取分离产物。 (2)不受性别与年龄的限制，受体来源更广泛。 2. 考点梳理 高频命题点05 基因工程的应用 （一）医疗制药：（3）基因工程药物 工程菌 动物基因只能导入到动物细胞中生产药物蛋白吗？ 可以转入动物、植物或微生物体内 原理： 所有生物共用一套遗传密码 优点： 1. 利用活细胞作为表达系统，表达效率高。无需大型装置和大面积厂房就可以生产出大量药品。 2.可以解决传统制药中原料不足的问题。利用基因工程菌发酵生产就不需要从动物或人体上获取原料。 3. 降低生产成本，减少生产人员和管理人员。 2. 考点梳理 高频命题点05 基因工程的应用 比较项目 乳腺（房）生物反应器 基因工程菌生产药物 基因产物 受体细胞 目的基因导入方式 生产条件 产物提取 与天然蛋白质完全相同 细菌细胞内缺少内质网、高尔基体等细胞器，合成的蛋白质可能不具有生物活性 哺乳动物的受精卵 微生物细胞 显微注射法 感受态细胞法 不需要严格的灭菌，温度等外界条件对其影响不大 需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件 从动物乳汁中提取，相对简单 （一般经过工业发酵后）从微生物细胞（或发酵液）中提取，相对复杂 乳腺生物反应器与基因工程菌生产药物比较 （一）医疗制药：（3）基因工程药物 工程菌 （一）医疗制药：（4）研究疾病机理的模型 基因敲除 2. 考点梳理 高频命题点05 基因工程的应用 基因敲除P125：通过在基因中插入DNA片段使该基因永久地失活。 应用：通过观察转基因生物性状变化，推测该基因的功能。 实例：科学家发现敲除肠碱性磷酸酶基因的小鼠更容易发胖，从而推测该基因有“保持身材”的作用，也许不久的将来肥胖会被“根治”。 （一）医疗制药：（4）研究疾病机理的模型 基因敲除 2. 考点梳理 高频命题点05 基因工程的应用 CRISPR/Cas9技术可以识别出外源DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达。CRISPR全称Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats——成簇的规律间隔的短回文重复序列。在上游还有一个基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用，因此，该基因被命名为CRISPR关联基因（CRISPR associated，Cas），由它们编码的蛋白质叫Cas蛋白，Cas蛋白具有核酸酶、解旋酶等活性。间隔序列彼此不同，它们由俘获的外源DNA组成，当含有同样序列的外源DNA入侵细菌时，可以被细胞识别，并进行剪切使之破坏，达到保护自身的目的。 没有血缘关系 双胞胎 原理：除了同卵双胞胎外，每个人的DNA不同 范围：亲子鉴定、个体识别 DNA指纹P126：DNA经过①限制酶剪切、 ②电泳、 ③与标记的探针进行核酸分子杂交、④洗涤 、⑤显影检测后，得到的图谱。 （二）法医鉴定 2. 考点梳理 高频命题点05 基因工程的应用 放射自显影即利用放射性可使照像乳胶和软片感光的原理，对标本中放射性分子进行定位的技术。放射性同位素在衰变过程中发射出电离辐射，射线可使照像乳胶感光。乳胶同标本接触后，放射性物质存在的部位溴化银胶体被还原，产生银粒子沉淀，从而显示出放射性物质存在的部位。 （三）农牧业育种 抗虫棉 2. 考点梳理 高频命题点05 基因工程的应用 目的基因： 可专门破坏棉铃虫消化道的Bt毒蛋白基因 （三）农牧业育种 抗虫棉 2. 考点梳理 高频命题点05 基因工程的应用 目的基因： 可专门破坏棉铃虫消化道的Bt毒蛋白基因 2. 考点梳理 高频命题点05 基因工程的应用 （三）农牧业育种 抗病植物 实例：转基因抗病毒甜椒、番木瓜、烟草 来源于某些病毒、真菌等的抗病基因 2. 考点梳理 高频命题点05 基因工程的应用 （三）农牧业育种 抗除草剂植物 降解或抵抗某种除草剂的基因 培育目的： 实例： 相关基因： 喷洒除草剂时，杂草会被杀死而作物不会受到损伤 转基因抗除草剂玉米、大豆、油菜和甜菜等 被除草剂杀死的杂草和 没有被除草剂杀死的玉米 2. 考点梳理 高频命题点05 基因工程的应用 （三）农牧业育种 获得生长快、体型大、性状优良的转基因动物 肠乳糖酶基因 实例： 解决问题： 相关基因： 转基因牛（分泌的乳汁中乳糖的含量大大降低） 有些人由于乳糖酶分泌少，不能完全消化牛奶中的乳糖，食用牛奶后会出现腹泻等不适症状，称之为乳糖不耐受 （四）保护生态环境： 基因工程菌 2. 考点梳理 高频命题点05 基因工程的应用 用___________的方法，使___________得到__________的菌类，一般称为基因工程菌 基因工程 外源基因 高效表达 基因工程构建基因工程菌 工业发酵批量生产 概念： 步骤： 应用： 吸收重金属、降解有毒化合物、分解石油的“超级细菌” （四）保护生态环境： 基因工程菌 2. 考点梳理 高频命题点05 基因工程的应用 1975年美籍印度人查克拉搏特等科学家依据似单胞杆菌对石油中有毒成分具有很强分解力这一特性，把4种能吃浮油的假单胞杆菌的基因拼接起来，合并成一种假单胞菌种，组成了所谓的“超级菌”，它能分解各种石油烃，消除浮油的效率高、速度快，只需几小时就能除掉自然菌种需几年才能消除的原油污染。 能分解石油的“超级吸油菌” 有些微生物具有采矿或分解有毒污染物的宝贵能力，科学家将这些微生物的基因进行改造，获得了拥有珍贵性状并易于培养的转基因工程菌。 2. 考点梳理 高频命题点05 基因工程的应用 应用领域 优点或举例 基因诊断 运用核酸分子杂交、_____等技术进行基因诊断 基因治疗 向有基因缺陷的细胞中引入__________的基因,以 ____________基因的缺陷,达到治疗的目的 基因工程药物 ①转基因植物用于生产__________;②哺乳动物的乳 腺作为____________生产蛋白质类药物;③转基因 ________成为理想的合成蛋白质的分子工厂 正常功能 纠正或补偿 药物蛋白 生物反应器 微生物 转基因动物 可为研究__________提供模型 法医鉴定 运用限制酶剪切、______、______分子杂交等技术 转基因植物 所需时间较短,克服了远缘亲本难以杂交的缺陷 保护生态环境 获得转基因工程菌 疾病机理 电泳 核酸 【例】2024年，全球首例接受经过CRISPR/Cas9基因编辑的猪肾脏移植手术取得成功。为了降低免疫排斥反应，研究者借助CRISPR/Cas9技术对移植的猪肾脏进行了基因编辑（敲除α-Gal基因，过程如图1）。CRISPR/Cas9工具主要由向导RNA（sgRNA）和Cas9蛋白两部分组成，sgRNA可引导Cas9蛋白到特定基因位点进行切割，其机制如图2。下列相关叙述错误的是（　　） A．图1中受体细胞通常选择受精卵，注入受体细胞的常用方法是显微注射法 B．α-Gal基因控制的蛋白质可能是猪的主要组织相容性抗原 C．Cas9蛋白相当于限制酶，能作用于脱氧核糖和碱基之间的磷酸二酯键 D．不同的向导RNA（sgRNA）需要根据目标基因设计不同识别序列 C 【详解】A、受精卵全能性最高，图1中受体细胞通常选择受精卵，注入受体细胞的常用方法是显微注射法，A正确； B、为了降低免疫排斥反应，研究者借助CRISPR/Cas9技术对移植的猪肾脏敲除了α-Gal基因，α-Gal基因控制的蛋白质可能是猪的主要组织相容性抗原，B正确； C、Cas9蛋白相当于限制酶，能作用于脱氧核糖和磷酸之间的磷酸二酯键，C错误； D、sgRNA可引导Cas9蛋白到特定基因位点进行切割，即sgRNA通过与目标DNA碱基互补配对引导Cas9蛋白定位，不同的向导RNA（sgRNA）需要根据目标基因设计不同识别序列，D正确。 【例】RNA干扰(RNAi)指的是将双链RNA(dsRNA)导入细胞后，在Dicer的作用下形成较小的RNA片段，这些片段在进一步解链后与酶形成沉默复合体RISC，从而引起相应mRNA发生降解，进而导致其相应的基因沉默的现象，其作用机理如图所示。下列叙述错误的是（     ）   A．dsRNA分子中大部分磷酸基团都能与两个核糖相连接 B．Dicer作用的化学键与限制酶作用的相同 C．RNAi能特异性关闭相应基因的表达 D．RNAi的实质是基因表达过程中的转录被阻断 D 【详解】A、构成RNA的核糖核苷酸通过磷酸二酯键相连接，大部分磷酸基团都能与两个核糖相连接，A正确； B、限制酶作用于磷酸二酯键，Dicer的作用是切割RNA，也是作用于磷酸二酯键，B正确； C、据图可知RNA干扰的原理是：dsRNA分子与Dicer结合后被切割成小片段，这些小片段在进一步解链后与酶形成沉默复合体RISC，该复合体与相应mRNA结合，引起相应mRNA发生降解，导致相应蛋白质无法合成。综合以上分析，RNAi能特异性关闭相应基因的表达，C正确； D、RNAi实质是某基因相应的mRNA被降解，使基因表达过程中的翻译被阻断，D错误。 【例】基因芯片技术是一种可同时检测不同基因片段的新型检测技术，芯片制作和使用过程如图所示。下列叙述错误的是（     ） A．探针和样品都必须是单链 B．基因芯片上具有多种不同序列的探针 C．探针和样品上都需携带相同的荧光标记 D．洗脱的目的是去除未与探针杂交的样品 【详解】AC、基因芯片是利用核酸分子杂交原理进行基因检测的，因此探针和样品都必须是单链，同时应该在样品上放置荧光标记的探针，从而才能通过是否出现荧光来判定是否有特定序列，A正确，C错误； B、基因芯片的测序原理是杂交测序方法，基因芯片可以放置多种探针，检测多种不同序列，B正确； D、样品和探针的杂交后，需要将未结合的样品去除，避免影响信号检测，D正确。 【例】基因芯片技术是一种可同时检测不同基因片段的新型检测技术，芯片制作和使用过程如图所示。下列叙述错误的是（     ） A．探针和样品都必须是单链 B．基因芯片上具有多种不同序列的探针 C．探针和样品上都需携带相同的荧光标记 D．洗脱的目的是去除未与探针杂交的样品 C 【详解】AC、基因芯片是利用核酸分子杂交原理进行基因检测的，因此探针和样品都必须是单链，同时应该在样品上放置荧光标记的探针，从而才能通过是否出现荧光来判定是否有特定序列，A正确，C错误； B、基因芯片的测序原理是杂交测序方法，基因芯片可以放置多种探针，检测多种不同序列，B正确； D、样品和探针的杂交后，需要将未结合的样品去除，避免影响信号检测，D正确。 【例】将正常基因导入镰状细胞贫血患者体内的造血干细胞内，可实现基因治疗，但其转录的成熟mRNA会因被切割而失效，使用一定剂量的四环素可以减少这种失效，提高基因调控的精准度。下列说法正确的是（    ） A．镰状细胞贫血的根本原因是组成血红蛋白的氨基酸序列发生改变 B．基因治疗改变了患者的基因种类，导入的基因可以遗传给下一代 C．导入基因产生的mRNA上任意三个碱基组成一个密码子 D．一定剂量的四环素通过影响翻译过程调控基因的表达 D 【详解】A、镰状细胞贫血的根本原因是控制血红蛋白合成的基因发生突变，A错误； B、基因治疗只改变患者体内造血干细胞中的基因种类，而生殖细胞中的基因没有发生变化，因此导入的基因不能遗传给下一代，B错误； C、mRNA上3个相邻的碱基决定1个氨基酸，每3个这样的碱基叫作1个密码子，C错误； D、一定剂量的四环素可减少mRNA的失效，使翻译过程正常进行，因此其可通过影响基因的翻译过程调控基因的表达，D正确。 2. 考点梳理 高频命题点06 蛋白质工程 P93是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。 1.基础: 蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系 2.操作方法及对象: 改造或合成基因 3.结果: 改造现有蛋白质或制造一种新的蛋白质 4.目的: 获得满足人类生产和生活的需求的蛋白质 5.与基因工程的关系: 2. 考点梳理 高频命题点06 蛋白质工程 基因工程的现实问题：蛋白质的结构与功能是进化的结果，与特定的物种相适应。 实例：科学家将人体内的抗病毒蛋白β-干扰素（单独存在活性高）cDNA导入大肠杆菌中并进行表达，尽管获得了大量的蛋白质，但多数蛋白质形成了二聚体，总体抗病毒活性只有天然蛋白的10%。 原因：17位半胱氨酸容易与另一个干扰素分子的半胱氨酸形成二硫键 解决方案：替换掉第17位的半胱氨酸 a.直接改造蛋白质 b.改造mRNA c.改造基因 ①蛋白质的高级结构十分复杂，直接改造难度大； ②蛋白质是由基因编码的，改造了基因可以间接改造蛋白质； ③基因可以遗传，蛋白质无法遗传； 项目 蛋白质工程 基因工程 操作对象 操作水平 操作起点 操作流程 结果 实质 联系 基因 基因 DNA分子水平 DNA分子水平 预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新基因→获得所需要的蛋白质 目的基因的筛选与获取→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 可生产自然界没有的蛋白质 只能生产自然界已有的蛋白质 通过改造或合成基因来定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质 将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状 ①都在生物体外对基因进行操作； ②蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程。 预期蛋白质功能 目的基因 2. 考点梳理 高频命题点06 蛋白质工程 预期功能 预期结构 推测 氨基酸序列（多肽链） 改造或合成 目的基因 转录 mRNA 翻译 折叠 设计 行使 转入受体细胞内 【例】2025年初，科学家设计出了一种能与眼镜蛇毒素结合并使其失效的新型蛋白质，其设计依据主要是眼镜蛇毒素的（     ） A．元素组成和氨基酸种类 B．空间结构和其氨基酸序列 C．基因的碱基种类和序列 D．mRNA的碱基种类和序列 B 【详解】A、蛋白质由C、H、O、N和氨基酸种类组成，但这些信息并不足以确定蛋白质的具体结构和功能。因为即使氨基酸种类相同，不同的排列顺序（即氨基酸序列）也会导致蛋白质结构和功能的巨大差异，A错误； B、蛋白质的功能是由其结构决定的，而结构又由氨基酸序列和空间结构共同决定。因此，如果知道了一个蛋白质的氨基酸序列和空间结构，就可以在一定程度上预测和理解它的功能，因此研究者正是基于新型蛋白质的氨基酸序列和空间结构来设计新型蛋白质的，B正确； C、基因的碱基序列可以编码蛋白质的氨基酸序列，但它本身并不直接决定蛋白质的结构和功能。因为基因的表达还受到许多其他因素的影响，如转录调控、翻译调控等。此外，即使基因序列相同，由于后翻译修饰等因素的存在，也可能导致蛋白质结构和功能的差异，C错误； D、mRNA是基因转录的产物，它可以携带编码蛋白质的氨基酸序列的信息。同样地，mRNA的碱基序列本身并不直接决定蛋白质的结构和功能。它需要通过翻译过程将信息传递给核糖体以合成蛋白质，D错误。 【例】天然胰岛素易形成二聚体或六聚体，皮下注射胰岛素后往往要经历一个逐渐解离为单体的过程，这在一定程度上延缓了疗效。科研人员发现，将胰岛素B28位的脯氨酸替换为天冬氨酸或与B29位的赖氨酸交换位置，可有效抑制胰岛素的聚合，由此研发出的速效胰岛素类似物产品已经在临床上广泛应用。下列叙述正确的是（    ） A．该工程属于蛋白质工程，其生产的蛋白质是自然界已有的蛋白质 B．胰岛素改造的基本思路与天然蛋白质的合成过程相同 C．替换氨基酸时需要用特定的蛋白酶将特定部位的肽键水解 D．胰岛素类似物蛋白想要达到预设的疗效，还需检测其高级结构是否正确 D 3. 真题检测 （2023.06·浙江选考）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。下列叙述正确的是（　　） A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达 B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子 D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 B 【详解】A、分析图中可知，启动子在左侧，GFP基因整合于Gata3基因的右侧，启动子启动转录后，可以使GEP基因转录，Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误； B、因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确； C、整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误； D、用引物1和引物3进行PCR扩增，杂合子和Gata3—GFP基因纯合子都能扩增出相应片段，因此无法区分杂合子和纯合子，D错误。 3. 真题检测 1．下列关于引物F1、F2、R1和R2的叙述，错误的是（      ） A．F1-R1引物可用于特异性地扩增目的片段 B．F1-R2引物不能用于特异性地扩增目的片段 C．F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用 D．R2引物可用于特异性地扩增目的片段 3. 真题 检测 （2024·浙江·高考真题）阅读下列材料，完成下面2小题。疟疾是一种严重危 害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白， 在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者 进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。研究人 员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增 目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为 模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。 2．为了筛查疟原虫感染者，以及区分对氯喹的敏感性。现有6份血样， 处理后进行PCR。产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳结果如图所示。 1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是（     ） A．1号和6号 B．2号和4号 C．3号和5号 D．1号、2号、4号和6号 3. 真题检测 （2024·浙江·高考真题）阅读下列材料，完成下面2小题。疟疾是一种严重危害人类健康的红细胞寄生虫病，可用氯喹治疗。疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。对患者进行抗性筛查，区分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分类治疗。研究人员根据pfcrt基因的序列，设计了F1、F2、R1和R2等4种备选引物，用于扩增目的片段，如图甲所示。为选出正确和有效的引物，以疟原虫基因组DNA为模板进行PCR，产物的电泳结果如图乙所示。 1．A、根据图乙结果显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段,说明能够用于特异性扩增目的片段，A正确； B、根据图乙信息可知，F1-R2引物扩增条带为三条，说明其不能用于特异性扩增目的片段，B正确； C、根据图乙信息可知，F1-R1能扩增目的1条带，F2-R1无法扩增目的条带，所以F2为无效引物，没有扩增功能，无法使用，C正确； D、根据图乙显示可知，F1-R1引物只扩增出一条片段，F1-R2引物扩增条带为三条，说明R2引物无法特异性的扩增目的条带，D错误。 故选D。 2．根据题干信息可知，疟原虫pfcrt基因编码的蛋白，在第76位发生了赖氨酸到苏氨酸的改变，从而获得了对氯喹的抗性。根据酶切位点可知，在具有氯喹抗性的基因组没有ApoⅠ酶切位点，而敏感性基因组中具有该酶切位点，因此对6份血样处理后进行PCR，产物用限制酶ApoⅠ消化，酶解产物的电泳出现两条带则为敏感型，只有一条带的为抗性，所以1~6号血样中，来自于氯喹抗性患者的是2号和4号，B正确，ACD错误。 3. 真题检测 [2024·浙江1月选考] 锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并 定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn^2+ 的功能。为研究该植物 2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn^2+相关的生物学功能，在克隆M、N 基 因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。 (1)锌转运蛋白基因M、N 克隆。以该植物____为材料提取并纯化 mRNA，反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR 扩增， PCR 每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体 内________的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA 分子因为 含__________而带负电荷，凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极接口。当 2个PCR 产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间 的距离会______。回收DNA 片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌， 测序验证。 （1）根 解旋酶 磷酸基团 变长 3. 真题检测 (2)重组表达载体构建。分别将含M、N 基因的重组质粒和酵母表达载 体同时进行双酶切处理，然后利用____________连接，将得到的重组 表达载体转化大肠杆菌。用PCR 快速验证重组转化是否成功，此反应 可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是_________________________。 (3)酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基 进行______培养，活化后接种至液体培养基，采用__________以扩大 菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N 基因在受体细胞 中的表达水平，无显著差异。 (2)DNA连接酶 热变性使大肠杆菌细胞破裂, DNA渗漏出来 (3)划线 振荡培养 3. 真题检测 (4)转基因酵母功能鉴定。分别将转化 了M、N 基因的酵母菌株于液体培养基 中培养至OD_600为0.6 ，将菌液用_____ _____法逐级稀释至OD600 为0.06、 0.006和0.0006，然后各取10 μL 菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基 上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为_______________ __________。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+ 能力更强的是____________，依据是____________________________。 注：OD600为波长600 nm 下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空 载体为未插入M或N 基因的表达载体。 (4)梯度稀释 锌吸收缺陷型酵母+空载体 转运蛋白N 转入N基因的这组酵母菌数量多 Lavf58.76.100 Lavf58.76.100 Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.7.67 Lavf57.62.100 $$