专题16 基因工程（广东专用）-【好题汇编】2025年高考生物一模试题分类汇编（广东专用）

专题16 基因工程 考点概览 考点01 重组DNA技术的基本工具 考点02 基因工程的基本操作程序 考点03 基因工程的应用 重组DNA技术的基本工具考点01 1、（2025·广东·一模）在以下实验结果中，能观察到黄色现象的是（    ） A．在豆浆中先后加入双缩脲试剂A液和B液 B．将DNA粗提物加入二苯胺溶液中并水浴加热 C．将酵母菌培养液产生的气体通入溴麝香草酚蓝溶液 D．纸层析法分离菠菜绿叶中的色素，滤纸条自上而下第三条色素带的颜色 基因工程的基本操作程序考点02 1、（广东省揭阳市揭西县2024-2025学年高三第一次调研）利用PCR 获得目的基因后，用限制酶EcoR Ⅰ同时处理目的基因与质粒，拼接后可得到重组基因表达载体，其部分DNA片段如下图所示。下列有关引物的分析正确的是（　　） A．通过PCR获取目的基因时，所选的引物可为引物2和引物3 B．检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时，应选用引物1 和引物4进行PCR C．若设计的引物与模板不完全配对，可适当提高 PCR 复性的温度 D．DNA聚合酶能与引物结合，并从引物的5'端连接脱氧核苷酸 2、（广东省深圳市高级中学高中园2025届 第一次模拟考试）研究者从酵母菌中获取控制细胞色素氧化酶（存在于线粒体）的某一段肽合成的DNA片段，将其与小鼠的二氢叶酸还原酶（只存在于细胞质基质）基因融合。重组基因在酵母菌表达后，在线粒体中发现了二氢叶酸还原酶。该研究的目的是（    ） A．获得融合蛋白 B．研究该段肽的作用 C．引导二氢叶酸还原酶进入线粒体 D．研究重组基因的功能 3、（2025·广东汕头·一模）水杨酸是常见的水体污染物，科学家利用基因工程构建智能工程菌，通过向大肠杆菌体内导入含特殊DNA序列的重组质粒，制备水杨酸生物传感器(下图)，为环境污染治理提供新方法。 回答下列问题： (1)Pc和Ps启动子可被 酶识别并结合后驱动基因的模板链沿3′→5′方向转录出mRNA。分析图上图可知，当环境中存在水杨酸时， 可激活PS启动子，最终使菌体发出红色荧光，据此可判定环境中的水杨酸浓度。 (2)研究人员改造重组质粒，选择激活能力更强的蛋白的基因nahR1替代nahR，实现在相同浓度的水杨酸条件下荧光强度扩大为原来的2倍，提高传感器的灵敏度。该改造过程需要用到的工具酶是 。请提出另一种改造重组质粒以提高传感器灵敏度的思路： 。 (3)水杨酸羟化酶可催化水杨酸转化为龙胆酸，龙胆酸可被细胞利用。若将水杨酸羟化酶基因与mrfp基因连接成融合基因，则工程菌可同时实现对水杨酸的动态检测和清除。现欲通过PCR判定融合基因已准确连接，应选择如图中的引物组合是 。 (4)工程菌治理环境污染具有成本低、动态治理等优点，但菌株本身会造成水源安全隐患。科学家将ccdA、ccdB两个基因插入原有序列中，使水杨酸被耗尽时菌株即启动“自毁”。已知ccdB基因表达毒蛋白可使工程菌致死，ccdA基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，则ccdA、ccdB分别插入下图中的 、 位点。 4、（广东省揭阳市揭西县2024-2025学年高三第一次调研）酵母菌双杂交技术常用于证明两种蛋白质（如蛋白质X和Y） 是否能相互作用，其原理见下图。BD和AD 是构成转录激活因子的两个独立结构域，当二者未结合时，无法激活转录报告基因；将待测蛋白质 X 与 BD 融合，Y与 AD 融合，若蛋白质X和Y互作，则BD 和AD空间上靠近结合，才能激活转录报告基因。柑橘黄化脉明病毒（CYVCV） 可引起柑橘黄脉病，其外壳蛋白（CP） 参与侵染、致病。现利用酵母菌双杂交技术，寻找与CP 蛋白互作的寄主蛋白。 实验步骤如下： (1)构建柑橘染病叶片的cDNA：柑橘幼苗需先 处理，再提取叶片的总RNA，经 得到cDNA。 利用质粒1（见上图）和cDNA，构建含AD 和寄主蛋白融合基因的重组质粒，即寄主蛋白—质粒1。 (2)构建含BD 和CP蛋白融合基因的重组质粒：为了使CP 基因能够正确地插入质粒2（见上图），PCR获取CP 基因所用的两种引物的5'端需分别添加序列 。用相应限制酶切割目的基因和质粒2后，再用 DNA 连接酶缝合，得到CP—质粒2。 (3)将构建成功的寄主蛋白—质粒1 和 CP—质粒2同时转染某一营养缺陷型酵母菌（不能合成组氨酸、色氨酸、亮氨酸和腺嘌呤），再将转染后的酵母菌接种在不同类型的平板上并观察菌落出现情况。 ①若在 的平板上长出菌落，仅能说明两种重组质粒成功转染，但未知 CP与对应寄主蛋白是否互作。 ②若在不含有组氨酸、色氨酸、亮氨酸和腺嘌呤的平板上长出菌落，能证明CP 与对应寄主蛋白互作，可推测出报告基因应含有 基因。 ③仅靠CP蛋白也可能使得 AD 和BD 结合，为了排除这种可能性，应增加一组对照：用 同时转染该营养缺陷型酵母菌。 5、（2025·广东·一模）“杂交水稻之父”袁隆平利用雄性不育野生稻改写了世界水稻育种史，杂交水稻研究团队不断刷新我国水稻产量和品质，举世瞩目。请分析回答： (1)水稻（2n=24）是禾本科植物，在我国有野生种、引进种：杂交种等水稻品种用于农业生产和科学研究，这主要体现了生物多样性的 价值。在育种研究中，对水稻进行基因组测序要测 条染色体中DNA的碱基序列。 (2)安农S-1是我国发现的第一个籼稻（水稻的一个品种）光温敏雄性不育系。该光温敏雄性不育系与9种常规雄性可育系进行正反交，得到的F1均为雄性可育。据此可推出有关该雄性不育基因的两个结论是： 。 (3)另有一个水稻品系，其雄性的育性由一对等位基因M、m控制，基因型为mm的个体表现为雄性不育，能产生正常的雌配子，M基因可使雄性不育个体恢复育性产生可育雄配子。通过转基因技术将M基因与雄配子致死基因A、蓝色素生成基因D一起导入基因型为mm的个体中，并使其插入一条不含m基因的染色体上（D基因的表达产物可使种子呈现蓝色，无D基因的种子呈现白色）。如图： ①图中基因型为mmADM的个体自交时（不考虑突变和互换），子代种子的表型及比例为 ，这种转基因改良品系的显著优点是 。 ②要成功得到转基因个体（mmADM），先要构建基因表达载体。研究人员准备在已插入M基因的运载体（如下图）中再插入A、D融合基因。他们分析发现A、D融合基因拼接处存在XbaI的识别序列，为使基因表达载体中A、D融合基因和M基因都正确表达，应 在A、D融合基因两端添加 两种限制酶的识别序列，并用 两种限制酶对运载体进行酶切。 6、（2025·广东·一模）通过科学选育和种植管理，我国已成为世界上最大的番茄生产国。回答下列问题： (1)番茄花是双性花，野生型番茄成熟时果肉为红色。为探究番茄果肉颜色的遗传机制，科学家利用甲（基因A突变为a，果肉黄色）、乙（基因B突变为b，果肉橙色）两种单基因纯合突变体进行杂交实验，结果如图。则F2中橙色果肉植株的基因型有 ，红色果肉植株中纯合体的比例为 。    (2)番茄的SlMlol基因是参与白粉病（病菌侵染，会严重降低番茄的产量）发生的易感基因。科学家利用CRISPR/Cas9基因组编辑敲除了番茄的SlMlol基因，获得了抗白粉病的新品种。下图示CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理：Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA（sgRNA）引导下切割DNA双链以敲除目标基因。    Ⅰ.过程②中，将重组质粒导入番茄细胞的常用方法是 。 Ⅱ.在设计sgRNA碱基序列时，依据的是 的部分碱基序列。Cas9蛋白切割DNA双链时作用的化学键是 。 Ⅲ.可采用DNA分子杂交技术检测是否成功敲除SlMlol基因，则操作思路及预期结果是 。 7、（2025·广东梅州·一模）苯丙酮尿症是由于患者体内苯丙氨酸代谢途径中的酶发生缺陷，使得苯丙氨酸及其代谢物酮酸在血液和组织中大量累积，进而阻碍脑的发育。研究发现，苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因可在大肠杆菌中表达并降解苯丙氨酸。科学家将PAL基因导入到肠道益生菌Nissle1917大肠杆菌（EcN）中，构建工程菌EcN-PAL，用于治疗苯丙酮尿症。图1为2.7Kb的质粒，其中Ap为氨苄青霉素抗性基因，EcoRⅠ和PvuⅠ两种限制酶的酶切位点与复制原点之间的距离分别为0.6Kb和0.8Kb。图2为含PAL基因的DNA片段。 回答下列问题： (1)PAL是一种胞内酶，据此推测EcN-PAL的细胞膜上应具有 功能的蛋白质与PAL协同工作，完成EcN-PAL的预期作用。 (2)利用PCR技术扩增PAL基因，若该基因编码区其中一条链的序列为5'-AGCCCTCC……GAACCAGC-3'，下列可选用的一对引物是______。 A．5'-CCTCCCCA-3' B．5'-AGCCCTCC-3' C．5'-GCTGGTTC-3' D．5'-GAACCAGC-3' (3)据图分析，选用 酶切割PAL基因和质粒，构建重组表达载体。为确保目的基因正确插入质粒中，使用EcoRⅠ对重组DNA分子完全酶切后，进行凝胶电泳分析。若电泳图谱中出现长度为 Kb的条带，则说明是符合要求的重组质粒。 (4)研究表明EcN菌株不会在人体肠道中定殖，一段时间后会从胃肠道全部清除。据此推测，若服用EcN-PAL治疗苯丙酮尿症，需 （答出一点即可）。 基因工程的应用考点03 1、（2025·广东·一模）我国科学家利用外源抗虫基因——Bt基因成功培育出转基因抗虫棉，能专门破坏棉铃虫等鳞翅目害虫的消化系统，导致其死亡。下列说法正确的是（    ） A．培育抗虫棉的原理是基因突变 B．相对普通棉花而言，抗虫棉是新物种 C．大面积推广种植抗虫棉以后，棉铃虫的基因频率将发生不定向改变 D．在抗虫棉附近种植少量普通棉花，可减缓棉铃虫对抗虫棉的抗性 2、（2025·广东珠海·一模）部分肠道细菌能够分泌外膜囊泡（OMV），OMV能穿越肠道上皮屏障，活化肠黏膜内的免疫细胞。研究人员通过构建ClyA-Ag-mFc融合蛋白基因表达载体（见图），转化大肠杆菌来制备工程菌。下列相关叙述错误的是（    ） A．ClyA表达产物可以将融合蛋白定位到OMV表面 B．Ag表达产物可以激活机体的特异性免疫反应 C．mFc表达产物可以提高T细胞摄取OMV的能力。 D．利用该大肠杆菌可制备预防肿瘤的口服疫苗 3、（2025·广东江门·一模）甲型流感病毒（IAV）是单链RNA病毒，主要利用鸡细胞的ANP32A蛋白进行病毒复制。IAV因传染性强而易导致禽流感疫情的发生，有研究人员使用CRISPR/Cas9技术对鸡的ANP32A基因进行编辑，获得世界首批抗禽流感鸡（GE），过程见图。    (1)在编辑鸡的ANP32A基因时，需加入Cas9蛋白，该蛋白可催化 键水解，剪切特定DNA片段。图中②过程进行细胞培养的培养基中添加了青霉素和链霉素，作用是 。图中③过程筛选得到的GE均为纯合子，与宿主鸡相比，GE具有的特点是 。 (2)由上述过程孵出的基因编辑鸡（GE）与野生型鸡（WT）在生长、外观、行为等方面均无差别。为探究不同感染方式下，GE对IAV的抗感染能力及IAV在鸡群中的传播能力，以GE和WT（均未感染IAV）为实验对象，采用两种感染方式：人工接种（通过鼻内滴注直接接种IAV）和自然接触感染（通过与携带IAV的鸡自然接触感染病毒），步骤及结果如表所示。 分组 A组（GE） B组（GE） C组（WT） D组（WT） 人工接种 接种IAV 不接种 接种IAV 不接种 培养方式 适宜条件下 ？ 培养一周 与A、B组的操作相同 病毒斑块测定 10%个体出现斑块脱落 结果（B1） 100%个体出现斑块脱落 结果（D1） 体内病毒含量测定（PFU/ml） 极少 结果（B2） 很多 结果（D2） 特异性抗体测定 17%个体呈阳性 少或无 100%个体呈阳性 多 注：病毒斑块测定：IAV在鸡的呼吸道中复制会形成斑块。斑块脱落后，斑块中的病毒可进入自身体内，也可在鸡群中传播。 ①据A、C组结果分析，与WT相比，GE体内病毒含量及特异性抗体更少，却可反映出GE有更强的抗感染能力，原因是 。 ②根据上述完整实验还可得出结论：GE和WT均可通过自然接触而感染并传播IAV，但GE的抗感染能力更强、IAV在鸡群中的传播能力更弱，则表2“培养方式”中的“？”应设置为： ；比较实验结果：Bl Dl（填“>”或“<”或“=”）。 (3)对GE的后续跟踪观察中发现：原来无感染的GE后来有部分也会感染IAV，其原因可能是： 。（列出两点即可） (4)尽管对GE的研究已取得了一定可喜成果，要想将GE上市推广前仍需进行安全性方面的评估，例如 。（列出一点即可） 4、（2025·广东深圳·一模）乳糖操纵子是大肠杆菌中一个经典的基因表达调控系统，该系统在生物工程和分子生物学中有广泛应用。如图表示乳糖操纵子调控结构基因表达的过程，回答下列问题： (1)大肠杆菌会优先利用葡萄糖，同时添加葡萄糖和乳糖的培养基培养大肠杆菌，早期大肠杆菌主要是利用 （填“①”或“②”）途径调控结构基因。当培养基中的葡萄糖消耗完，大肠杆菌开始利用乳糖进行自身代谢，此时乳糖作为 为大肠杆菌提供营养，阻遏蛋白主要与 结合，从而调控结构基因表达。 (2)研究人员对传统乳糖操纵子的阻遏蛋白进行分子内的光控化改造，利用蓝光可以改变阻遏蛋白的结构，如图1。用蓝光照射时，GFP基因的表达情况是 。根据该原理，研究人员构建了如图2基因表达载体，除未标出终止子外，该表达载体缺少的结构是 。 (3)为验证阻遏蛋白光控化改造后的调控效果，研究人员用野生型大肠杆菌、IPTG（诱导物）、光控化改造后的大肠杆菌进行验证实验，请完成以下表格中4组实验的设置情况，表格里填“－”和“+”分别表示不处理和处理。 处理 组别 1 2 3 4 野生型大肠杆菌 光控化改造后的大肠杆菌 IPTG 蓝光 (4)为验证阻遏蛋白光控化改造后的空间控制效果，将光控化改造后的大肠杆菌涂布在培养基上，蓝光环境下用三角形遮光板遮挡培养基（如图），适宜温度下培养一段时间后，描述紫外灯下培养基的实验现象 。若用成功转化后的大肠杆菌构建其他形状的荧光图案，需要进行的调控是 。 培养基遮光示意图（黑色区域为退光区） 5、（2025·广东·一模）噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随噬菌体外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白或多肽随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。利用该技术可以获得单克隆抗体（最新技术）。请回答下列问题： (1)传统单克隆抗体的获得需先对小鼠进行 处理，整个过程中涉及的现代科学技术有 。 (2)外源DNA片段含 个游离的磷酸。为了得到大量的外源DNA，可使用PCR技术进行体外扩增，合成引物 （填“需要”或“不需要”）知道整个外源DNA序列。 (3)噬菌体展示技术获得的抗体还可用于定量检测抗原，如双抗体夹心法，具体原理如下图所示： 分析上图可知，固相抗体和酶标抗体均能与抗原结合，这是由于不同抗体可与同一抗原表面的 结合。该检测方法中，酶标抗体的作用是 ，可通过测定产物量来推测抗原量。 (4)试说说噬菌体展示技术可能的局限性： 。 6、（2025届广东省深圳市建文外国语学校两学部一模）抗生素的长期使用易导致病菌产生严重的耐药性。抗菌肽以其快速杀菌活性、低耐药可能性、免疫调节特性和促进伤口愈合的潜力成为最有前景的抗菌药物。研究发现将抗菌肽第52位的脯氨酸（密码子为CCA）替换成苏氨酸（密码子为ACA）可增强抗菌肽的杀菌活性。科研人员利用大引物PCR定点诱变技术对抗菌肽基因进行改造的过程如图所示。回答下列问题： (1)将抗菌肽第52位的脯氨酸换成苏氨酸，需要将mRNA的对应碱基序列中第 位的碱基替换，碱基具体变化为 。基因模板链对应的碱基改变为 。 (2)PCR过程中温度的控制至关重要，若变性时温度偏低则会导致反应效率降低，原因是 。 (3)据图分析，“大引物PCR定点诱变”技术中设计的“诱变引物”应选择________。 A．5'…CCTGTTAT…3' B．5'…CCTGGTAT…3' C．5'…ATACCAGG…3' D．S'…ATAACAGG…3' (4)进行大引物PCR定点诱变获得改良的抗菌肽基因需要进行两次PCR（PCR1和PCR2），产物1最早出现在PCR1的第 轮循环：PCR2的产物除改良的抗菌肽基因外，还有 ；通过PCR3快速扩增时应选用的引物是 。 (5)In-Fusion酶能够识别任何具有15bp相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，实现目的基因和载体的连接。科研人员将载体（320bp）两端连接上与改良的抗菌肽基因（180bp）两端相同的序列（15bp）并利用In-Fusion酶实现两者的连接，如图所示。最终获得的重组DNA分子长度为 。与传统方法相比，这种技术的优点是 （至少写两点）。 7、（2025·广东·一模）番茄的口感品质与葡萄糖和果糖含量正相关。下图甲示番茄体内有机物的合成与分配机理。    回答下列问题： (1)番茄植株光合作用过程中，CO2在叶肉细胞的 （填具体场所）被固定。 (2)据图甲可知细胞壁转化酶的功能是 。实践发现：热胁迫使番茄大幅减产、口感品质低下。对此，检测正常条件及热胁迫处理下番茄果实部位的糖含量，结果如图乙。请结合图甲分析热胁迫导致番茄减产且口感品质变差的原因可能是 。 (3)为探明热胁迫导致番茄减产的机制，并解决这一问题，科研人员设计并开展下列实验。 ①检测发现热胁迫下番茄细胞中LIN5基因表达水平降低，其他基因无明显变化。为验证LIN5基因是热胁迫下影响光合产物分配的关键基因，科研人员敲除LIN5基因获得突变体lin5CR并置于 （填“正常”或“热胁迫”）条件下培养，若出现番茄大幅减产、口感品质低下现象，则假设正确。这种自变量控制方法称为 原理。 ②热响应元件是一种当环境中温度升高时可触发转录的DNA片段，科研人员拟利用其调控LIN5基因表达的水平，从而培育出热胁迫条件下稳产的lin5-de基因修饰植株，则在进行基因工程的核心步骤时要将热响应元件 。 ③利用植物组织培养技术培育lin5-de基因修饰植株过程中，可通过调节培养基中 两种激素的比例来诱导愈伤组织分化。 8、（2025·广东广州·一模）鹅源星状病毒属于RNA病毒，鹅群感染后死亡率高，对鹅类养殖构成巨大威胁。其全基因组结构模式图如图甲所示，ORF2区域编码的纤突蛋白是该病毒的主要抗原性蛋白。研究人员以疑似感染该病毒死亡鹅的组织为样本，通过研磨提取上清液，进而制备单克隆抗体。回答下列问题：    (1)鹅死亡的原因还可能包括感染鹅细小病毒（一种DNA病毒）或感染致病细菌。为确定感染源，研究人员以样本总DNA为模板，在PCR反应体系中通过加入 进行特定片段的扩增并进行相应检测；同时，将样本上清液接种于固体培养基上，在适宜的条件下培养一段时间后，观察并鉴定培养基上是否出现 。 (2)成功分离出鹅源星状病毒后，研究人员提取了该病毒的RNA，并通过 获得该病毒的cDNA作为纤突蛋白基因序列的扩增模板。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，图乙电泳结果中最有可能代表纤突蛋白基因序列的是 （填编号）。    (3)从凝胶中分离得到纤突蛋白基因序列并扩增， ，导入特定受体细胞， 。进行细胞培养后可从中获得纤突蛋白。 (4)研究人员利用纤突蛋白制备获得了纤突蛋白单克隆抗体，该单克隆抗体可应用于 （答两点）。 9、（2025·广东湛江·一模）柑橘树生长过程中易受某种革兰氏阴性菌感染，严重危害柑橘产量。科研人员将M基因转入柑橘中，该基因控制合成的酶可抑制该种革兰氏阴性菌的生长与繁殖。如图是培育转基因柑橘的过程示意图，已知限制酶HindⅢ、BamHⅠ、SalⅠ的识别序列及切割位点分别为5'-A↓AGCTT-3′、5′-G↓GATCC-3′、5-G↓TCGAC-3'。请回答下列问题：    (1)构建的基因表达载体，除了含有目的基因外，还必须含有 （回答2点）等。据图分析，在基因表达载体构建过程中，应使用 对M基因和质粒进行切割，原因是 。 (2)利用PCR技术克隆M基因时，应选择下图中的引物 （填序号），引物的作用是 。    (3)将图中农杆菌先后置于含 的培养基中培养，从而筛选出含重组质粒的农杆菌。为检测转基因柑橘幼苗是否可以抵抗革兰氏阴性菌的感染，在个体生物学水平上，操作方法是 。 (4)图中由柑橘细胞培育成转基因柑橘幼苗采用了 技术，该技术的原理是 ，由柑橘细胞获得愈伤组织的过程称为 。 10、（2025 广东省广州市真光中学高三一测）乳糖操纵子是大肠杆菌中一个经典的基因表达调控系统，该系统在生物工程和分子生物学中有广泛应用。如图表示乳糖操纵子调控结构基因表达的过程，回答下列问题： (1)大肠杆菌会优先利用葡萄糖，同时添加葡萄糖和乳糖的培养基培养大肠杆菌，早期大肠杆菌主要是利用 （填“①”或“②”）途径调控结构基因。当培养基中的葡萄糖消耗完，大肠杆菌开始利用乳糖进行自身代谢，此时乳糖作为 为大肠杆菌提供营养，阻遏蛋白主要与 结合，从而调控结构基因表达。 (2)研究人员对传统乳糖操纵子的阻遏蛋白进行分子内的光控化改造，利用蓝光可以改变阻遏蛋白的结构，如图1。用蓝光照射时，GFP基因的表达情况是 。根据该原理，研究人员构建了如图2基因表达载体，除未标出终止子外，该表达载体缺少的结构是 。 (3)为验证阻遏蛋白光控化改造后的调控效果，研究人员用野生型大肠杆菌、IPTG（诱导物）、光控化改造后的大肠杆菌进行验证实验，请完成以下表格中4组实验的设置情况，表格里填“－”和“+”分别表示不处理和处理。 处理 组别 1 2 3 4 野生型大肠杆菌 光控化改造后的大肠杆菌 IPTG 蓝光 (4)为验证阻遏蛋白光控化改造后的空间控制效果，将光控化改造后的大肠杆菌涂布在培养基上，蓝光环境下用三角形遮光板遮挡培养基（如图），适宜温度下培养一段时间后，描述紫外灯下培养基的实验现象 。若用成功转化后的大肠杆菌构建其他形状的荧光图案，需要进行的调控是 。 培养基遮光示意图（黑色区域为退光区） 11、（广东省深圳市高级中学高中园2025届 第一次模拟考试）在植物基因组中天然存在着一类自私的基因或遗传元件，能够使得自身传递给后代的比例大大提高，被称为基因驱动元件。受天然基因驱动元件的启发，我国研究团队开发了一种名为CAIN的基因驱动系统，如图。 CRISPR/ Cas9能够靶向切割NPG1基因的编辑工具；NPG1表示花粉萌发所必需的基因 回答下列问题： (1)CRISPR/Cas9由人工合成的短链RNA和一种来自细菌的核酸酶Cas9。短链RNA作为“向导”；核酸酶Cas9切割目的DNA，使DNA双链断裂。短链RNA作为“导向”作用的具体原理是 。 (2)CAIN系统基于“毒药—解药”机制，据图分析，通过 的作用在植物花粉中产生毒药效应；再以 作为解药，让花粉正常萌发。图中重新编码后的NPG1需要具备的条件是 ，为实现这一目的，研究人员利用了密码子的 现象对NPGI进行重新编码，最终实现了 的花粉能够正常萌发。 (3)研究人员选用了自交繁殖的拟南芥作为材料，研究结果如下图。 ①若是双剪切，基因驱动工具CAIN系统在人工杂交世代中表现出了显著的高效遗传，理论上后代带有CAIN个体为100%，远高于孟德尔遗传的期望比例 。 ②若是单剪切，如下图所示，则可以产生 种雄配子，理论上后代带有CAIN个体的比例为 。 12、（2025·广东茂名·一模）c-fos是原癌基因的启动子，正常水平下表达水平很低，但是当细胞受到伤害和刺激时（如Na+内流引起的兴奋刺激）能快速启动下游基因的表达。实验小组在c-fos启动子的下游连接绿色荧光蛋白基因（GFP），构建c-fos-GFP重组质粒，并转染富含Na+通道的神经母细胞瘤细胞，再用乌头碱处理细胞，以筛选稳定表达的克隆细胞，其技术流程如下图所示，回答下列问题：    (1)PCR技术可通过设计 从水母细胞中特异性扩增GFP基因，过程①需要选择限制酶 切割含GFP基因的DNA片段，选择该限制酶切割的目的是 （答2点）。 (2)加入乌头碱可用于筛选稳定表达的克隆细胞，推测乌头碱是一种Na+通道 （填“激活剂”或“抑制剂”）。 (3)赤潮是造成海洋生态环境恶化的重要原因之一，其重要危害之一是赤潮生物能产生分泌赤潮毒素，赤潮毒素可特异性结合细胞的Na+通道，阻断Na+的运输。筛选并获得稳定表达的克隆细胞，用于检测水体中赤潮毒素（GTX）的相对含量，其操作流程为： ①向克隆细胞培养液中加入 。 ②检测细胞的荧光强度以确定GTX的相对含量，若 ，则说明水体中的GTX含量越高。 13、（2025届广东省三校高三一模）玉米是我国种植面积最大的农作物，玉米雄性不育系在杂交育种中的作用尤为重要。请回答下列问题： (1)玉米雄性不育系在杂交中常作为 ，杂交得到的子代可获得杂种优势。 (2)雄性不育系常存在着不育性状不稳定、基因污染等问，我国科研工作者为此开展了以下研究。 ①研究发现Z基因在花粉中特异性表达，是导致雄性不育的原因之一。研究者首先利用 法将Z基因导入玉米细胞，最终获得转基因杂合玉米品系Z580El2，然后将其花粉分别授予母本Z58和Z580E12，对花粉管的发育情况进行检测，结果如表1所示。 母本 花粉管长度正常 花粉管长度缩短 比例 Z58 46 54 1:1.17 Z580El2 47 53 1:1.13 表1花粉管发育情况统计结果 ②结果表明，上述花粉管性状的遗传遵循 定律，由于Z基因的表达会 从而可以导致玉米雄性不育。 (3)IPEI是玉米正常形成花粉所必需的基因，研究者获得了其纯合突变品系ipel雄性不育系。为解决其无法通过自交留种的问题，研究者将一个“基因盒子”导入该品系（图1），得到了4个转基因杂合株系P1~P4，然后分别将其花粉授予野生品系wc，结果见表2。    杂交组合 花粉管发育正常：异常 种子无荧光：有荧光 ♀wc×♂P1 1:0 1.05:1 ♀wc×♂P2 1:0 1.02:1 ♀wc×♂P3 1:1.11 1:0 ♀wc×♂P4 1:1.08 1:0 表2花粉管发育和结种情况统计结果 ①由于转入了 基因，四个株系均可以正常产生花粉。 ②以上结果显示 为成功构建的株系。 ③选取构建成功的株系中某植株自交，获得的子代中ipel雄性不育系所占比例为 。 (4)玉米的籽粒颜色由两对独立遗传的等位基因C/c、P/p决定，其中C控制色素的形成，而P控制色素的类型。只有当C和P同时存在时玉米籽粒才表现为紫色，其他组合都表现为非紫色。现有纯合紫色玉米甲（CCPP）、纯合非紫色玉米乙（ccpp）、纯合ipel雄性不育系紫色玉米丙（CCPP）、纯合ipel雄性不育系非紫色玉米丁（ccpp）四种玉米品系。 选取甲和乙杂交得到F1，F1自交后代中性状能稳定遗传的个体占 。若向丙和丁中与籽粒颜色有关基因所在染色体上各导入一个“基因盒子”（不破坏相关基因），以构建成功的丙为母本、丁为父本杂交得到F1，再让F1自交得F2，则F2中粒色的表现型及比例为： 。 试卷第1页，共3页 2 / 2 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$ 专题16 基因工程 考点概览 考点01 重组DNA技术的基本工具 考点02 基因工程的基本操作程序 考点03 基因工程的应用 重组DNA技术的基本工具考点01 1、（2025·广东·一模）在以下实验结果中，能观察到黄色现象的是（    ） A．在豆浆中先后加入双缩脲试剂A液和B液 B．将DNA粗提物加入二苯胺溶液中并水浴加热 C．将酵母菌培养液产生的气体通入溴麝香草酚蓝溶液 D．纸层析法分离菠菜绿叶中的色素，滤纸条自上而下第三条色素带的颜色 【答案】C 【知识点】检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质、探究酵母菌细胞呼吸的方式、绿叶中色素的提取和分离实验、DNA的粗提取及鉴定的方法 【分析】双缩脲试剂用于检验蛋白质，呈紫色；苏丹Ⅲ染液用于检验脂肪，呈橘黄色；斐林试剂可检测还原糖，呈现砖红色。 【详解】A、使用双缩脲试剂鉴定蛋白质时产生紫色反应，A错误； B、将DNA粗提物加入二苯胺溶液中并水浴加热生成蓝色，B错误； C、将酵母菌培养液产生的气体即二氧化碳，通入溴麝香草酚蓝溶液，颜色变化为蓝色→绿色→黄色，C正确； D、纸层析法分离菠菜绿叶中的色素，滤纸条自上而下第三条色素带为叶绿素a，颜色为蓝绿色，D错误。 故选C。 基因工程的基本操作程序考点02 1、（广东省揭阳市揭西县2024-2025学年高三第一次调研）利用PCR 获得目的基因后，用限制酶EcoR Ⅰ同时处理目的基因与质粒，拼接后可得到重组基因表达载体，其部分DNA片段如下图所示。下列有关引物的分析正确的是（　　） A．通过PCR获取目的基因时，所选的引物可为引物2和引物3 B．检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时，应选用引物1 和引物4进行PCR C．若设计的引物与模板不完全配对，可适当提高 PCR 复性的温度 D．DNA聚合酶能与引物结合，并从引物的5'端连接脱氧核苷酸 【答案】A 【知识点】PCR扩增的原理与过程 【分析】1、PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4中游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 2、PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 3、结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加．PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。 【详解】A、引物结合在模板链的3'端，通过PCR获取目的基因时，所选的引物可为引物2和引物3，A正确； B、引物结合在模板链的3'端，检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时，应选用引物2 和引物4进行PCR，B错误； C、若设计的引物与模板不完全配对，可适当降低 PCR 复性的温度，以便引物与模板链结合，C错误； D、DNA聚合酶能与引物结合，并从引物的3'端连接脱氧核苷酸，D错误。 故选A。 2、（广东省深圳市高级中学高中园2025届 第一次模拟考试）研究者从酵母菌中获取控制细胞色素氧化酶（存在于线粒体）的某一段肽合成的DNA片段，将其与小鼠的二氢叶酸还原酶（只存在于细胞质基质）基因融合。重组基因在酵母菌表达后，在线粒体中发现了二氢叶酸还原酶。该研究的目的是（    ） A．获得融合蛋白 B．研究该段肽的作用 C．引导二氢叶酸还原酶进入线粒体 D．研究重组基因的功能 【答案】D 【知识点】基因工程综合、DNA重组技术的基本工具、基因表达载体的构建 【分析】基因是有遗传效应的DNA片段，基因的表达包括转录和翻译两个阶段。染色体是基因的主要载体，核基因在染色体上呈线性排列。 【详解】A、重组基因在酵母菌表达后，在线粒体中发现了二氢叶酸还原酶，该酶不是新融合蛋白，A错误； B、获得的是二氢叶酸还原酶，它由二氢叶酸还原酶基因指导合成，跟段肽没有关联，该研究的目的并不是研究该段肽的作用，B错误； C、该实验没有体现引导二氢叶酸还原酶直接进入线粒体的过程，C错误； D、该实验从酵母菌中获取控制细胞色素氧化酶（存在于线粒体）的某一段肽合成的DNA片段，将其与小鼠的二氢叶酸还原酶（只存在于细胞质基质）基因融合，得到重组基因，重组基因在酵母菌表达后，在线粒体中发现了二氢叶酸还原酶，可以体现基因的表达过程，该研究的目的就是研究重组基因的功能，或者是表达情况，D正确。 故选D。 3、（2025·广东汕头·一模）水杨酸是常见的水体污染物，科学家利用基因工程构建智能工程菌，通过向大肠杆菌体内导入含特殊DNA序列的重组质粒，制备水杨酸生物传感器(下图)，为环境污染治理提供新方法。 回答下列问题： (1)Pc和Ps启动子可被 酶识别并结合后驱动基因的模板链沿3′→5′方向转录出mRNA。分析图上图可知，当环境中存在水杨酸时， 可激活PS启动子，最终使菌体发出红色荧光，据此可判定环境中的水杨酸浓度。 (2)研究人员改造重组质粒，选择激活能力更强的蛋白的基因nahR1替代nahR，实现在相同浓度的水杨酸条件下荧光强度扩大为原来的2倍，提高传感器的灵敏度。该改造过程需要用到的工具酶是 。请提出另一种改造重组质粒以提高传感器灵敏度的思路： 。 (3)水杨酸羟化酶可催化水杨酸转化为龙胆酸，龙胆酸可被细胞利用。若将水杨酸羟化酶基因与mrfp基因连接成融合基因，则工程菌可同时实现对水杨酸的动态检测和清除。现欲通过PCR判定融合基因已准确连接，应选择如图中的引物组合是 。 (4)工程菌治理环境污染具有成本低、动态治理等优点，但菌株本身会造成水源安全隐患。科学家将ccdA、ccdB两个基因插入原有序列中，使水杨酸被耗尽时菌株即启动“自毁”。已知ccdB基因表达毒蛋白可使工程菌致死，ccdA基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，则ccdA、ccdB分别插入下图中的 、 位点。 【答案】(1) RNA聚合酶 水杨酸-调控蛋白复合物 (2) 限制酶和DNA连接酶 ①选择灵敏度更高的启动子替代PS；②在mrfp基因前插入提高表达效率的DNA序列 (3)引物1和3 (4) E(或F) B(或C) 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，所以Pc和Ps启动子可被RNA聚合酶识别并结合后驱动基因的模板链沿3'→5' 方向转录出mRNA。从图中可知，当环境中存在水杨酸时，水杨酸-调控蛋白复合物可激活PS启动子，启动基因表达红色荧光蛋白，最终使菌体发出红色荧光，据此可判定环境中的水杨酸浓度。 （2）基因工程中用到的工具酶有限制性核酸内切酶和DNA连接酶，改造重组质粒，用基nahR1因替代nahR，需要先用限制性核酸内切酶切割质粒和基因，再用 DNA 连接酶将基因连接到质粒上，所以该改造过程需要用到的工具酶是限制性核酸内切酶和 DNA 连接酶。另一种改造重组质粒以提高传感器灵敏度的思路可以是：选择灵敏度更高的启动子替代PS，在mrfp基因前插入提高表达效率的DNA序列，使启动子能更高效地启动下游基因表达，从而提高红色荧光蛋白的表达量，增强荧光强度。 （3）PCR 技术要求引物与模板链的 3' 端互补配对，且 DNA 聚合酶从引物的 3' 端开始延伸子链。要判定水杨酸羟化酶基因与基因连接成的融合基因已准确连接，需要选择能扩增出融合基因的引物组合。引物1 和引物3可以分别与融合基因中水杨酸羟化酶基因的 3' 端和基因的 3' 端互补配对，从而扩增出融合基因，所以应选择的引物组合是引物1和引物3。 （4）ccdA基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，为了保证在水杨酸存在时工程菌正常生存，ccdA应插入在Ps启动子之后，即图中的E（或F）位点，这样在水杨酸存在时，Ps启动子启动，ccdA基因表达抗毒素蛋白；ccdB基因表达毒蛋白可使工程菌致死，当水杨酸被耗尽时，Ps启动子不再启动，此时要让工程菌启动“自亡”，ccdB应插入在Pc启动子控制的区域，所以应插入Pc启动子之后，即图中的B（或C）位点。 4、（广东省揭阳市揭西县2024-2025学年高三第一次调研）酵母菌双杂交技术常用于证明两种蛋白质（如蛋白质X和Y） 是否能相互作用，其原理见下图。BD和AD 是构成转录激活因子的两个独立结构域，当二者未结合时，无法激活转录报告基因；将待测蛋白质 X 与 BD 融合，Y与 AD 融合，若蛋白质X和Y互作，则BD 和AD空间上靠近结合，才能激活转录报告基因。柑橘黄化脉明病毒（CYVCV） 可引起柑橘黄脉病，其外壳蛋白（CP） 参与侵染、致病。现利用酵母菌双杂交技术，寻找与CP 蛋白互作的寄主蛋白。 实验步骤如下： (1)构建柑橘染病叶片的cDNA：柑橘幼苗需先 处理，再提取叶片的总RNA，经 得到cDNA。 利用质粒1（见上图）和cDNA，构建含AD 和寄主蛋白融合基因的重组质粒，即寄主蛋白—质粒1。 (2)构建含BD 和CP蛋白融合基因的重组质粒：为了使CP 基因能够正确地插入质粒2（见上图），PCR获取CP 基因所用的两种引物的5'端需分别添加序列 。用相应限制酶切割目的基因和质粒2后，再用 DNA 连接酶缝合，得到CP—质粒2。 (3)将构建成功的寄主蛋白—质粒1 和 CP—质粒2同时转染某一营养缺陷型酵母菌（不能合成组氨酸、色氨酸、亮氨酸和腺嘌呤），再将转染后的酵母菌接种在不同类型的平板上并观察菌落出现情况。 ①若在 的平板上长出菌落，仅能说明两种重组质粒成功转染，但未知 CP与对应寄主蛋白是否互作。 ②若在不含有组氨酸、色氨酸、亮氨酸和腺嘌呤的平板上长出菌落，能证明CP 与对应寄主蛋白互作，可推测出报告基因应含有 基因。 ③仅靠CP蛋白也可能使得 AD 和BD 结合，为了排除这种可能性，应增加一组对照：用 同时转染该营养缺陷型酵母菌。 【答案】(1) 柑橘黄化脉明病毒（CYVCV） 逆转录 (2) 5´-CATATG-3´、5´-CCCGGG-3´ T4 (3) 不含色氨酸或不含亮氨酸 腺嘌呤合成基因、组氨酸合成 CP—质粒2和质粒1 【知识点】DNA重组技术的基本工具、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 【分析】目的基因插入启动子和终止子之间，才能正常转录；T4DNA 连接酶既可以连接黏性末端，也可以连接平末端。 【详解】（1）构建柑橘染病叶片的cDNA：柑橘幼苗需先用柑橘黄化脉明病毒（CYVCV）处理，再提取叶片的总RNA，经逆转录得到cDNA，其中包含与CP 蛋白互作的寄主蛋白基因。 （2）为了使CP 基因能够正确地插入质粒2，应将CP蛋白基因插入BD基因和终止子之间，PCR获取CP 基因所用的两种引物的5'端需分别添加NdeⅠ和SmaⅠ的识别序列和。用相应限制酶切割目的基因和质粒2后，SmaⅠ切割后得到平末端，再用T4DNA 连接酶缝合，得到CP—质粒2。 （3）①若在不含有色氨酸或不含有亮氨酸的平板上长出菌落，仅能说明两种重组质粒成功转染，但未知 CP与对应寄主蛋白是否互作。 ②若在不含有组氨酸、色氨酸、亮氨酸和腺嘌呤的平板上长出菌落，能证明CP 与对应寄主蛋白互作，可推测出报告基因应含有腺嘌呤合成基因、组氨酸合成基因。 ③仅靠CP蛋白也可能使得 AD 和BD 结合，为了排除这种可能性，应增加一组对照：用CP—质粒2和质粒1同时转染该营养缺陷型酵母菌。 5、（2025·广东·一模）“杂交水稻之父”袁隆平利用雄性不育野生稻改写了世界水稻育种史，杂交水稻研究团队不断刷新我国水稻产量和品质，举世瞩目。请分析回答： (1)水稻（2n=24）是禾本科植物，在我国有野生种、引进种：杂交种等水稻品种用于农业生产和科学研究，这主要体现了生物多样性的 价值。在育种研究中，对水稻进行基因组测序要测 条染色体中DNA的碱基序列。 (2)安农S-1是我国发现的第一个籼稻（水稻的一个品种）光温敏雄性不育系。该光温敏雄性不育系与9种常规雄性可育系进行正反交，得到的F1均为雄性可育。据此可推出有关该雄性不育基因的两个结论是： 。 (3)另有一个水稻品系，其雄性的育性由一对等位基因M、m控制，基因型为mm的个体表现为雄性不育，能产生正常的雌配子，M基因可使雄性不育个体恢复育性产生可育雄配子。通过转基因技术将M基因与雄配子致死基因A、蓝色素生成基因D一起导入基因型为mm的个体中，并使其插入一条不含m基因的染色体上（D基因的表达产物可使种子呈现蓝色，无D基因的种子呈现白色）。如图： ①图中基因型为mmADM的个体自交时（不考虑突变和互换），子代种子的表型及比例为 ，这种转基因改良品系的显著优点是 。 ②要成功得到转基因个体（mmADM），先要构建基因表达载体。研究人员准备在已插入M基因的运载体（如下图）中再插入A、D融合基因。他们分析发现A、D融合基因拼接处存在XbaI的识别序列，为使基因表达载体中A、D融合基因和M基因都正确表达，应 在A、D融合基因两端添加 两种限制酶的识别序列，并用 两种限制酶对运载体进行酶切。 【答案】(1) 直接 12 (2)①雄性不育基因位于细胞核中②雄性不育基因是隐性基因 (3) 蓝色和白色≈1：1 根据种子的颜色即可判断育性（或答蓝色用于留种制备新的品系，白色用作制备杂交种时做母本） SpeI、EcoRI XbaI、EcoRI 【知识点】生物多样性及其价值、性状的显、隐性关系及基因型、表现型、等位基因、基因表达载体的构建、分离定律综合问题分析（异常现象分析） 【分析】题图分析：雄性不育个体mm通过转基因技术，得到基因型为mmADM个体，其中含有A基因的可使雄配子致死，含M可使雄性不育个体恢复育性，基因D的表达可使种子呈现蓝色，无基因D的种子呈现白色。 【详解】（1）杂交种等水稻品种用于农业生产和科学研究，体现了生物多样性的直接价值，水稻属于二倍体生物，不含性染色体，所以基因组测序需测定其一个染色体组即12条染色体上的DNA分子上的碱基序列。 （2）依据题干信息，光温敏雄性不育系与9种常规雄性可育系进行正反交，所得的F1均为雄性可育，说明了①雄性不育基因位于细胞核中；②雄性不育基因是隐性基因，雄性可育基因为显性基因。 （3）①依据题干信息可知，A基因为雄配子致死基因，所以当基因型为mmADM的个体自交时，可以产生mADM、m的雌配子，而只能产生m的雄配子，雌雄配子随机结合，就可以产生mmADM和mm的基因型，对应的育性表现为雄性可育、雄性不育。由于D基因的表达产物可使种子呈现蓝色，无D基因的种子呈现白色，所以，子代种子的表型及比例为蓝色和白色≈1：1，这种改良品系的优点是：可以根据种子的颜色来判断育性。 ②依据题干要求，需在已插入M基因的运载体中再插入A、D融合基因，而且使基因表达载体中A、D融合基因和M基因都正确表达。已知A、D融合基因拼接处存在XbaI的识别序列，D基因和M基因的拼接处含有EcoRI的识别序列，且限制酶XbaI和SpeI所产生的黏性末端相同，所以在切割运载体时，运载体是应用限制酶XbaI、EcoRI进行酶切，不可使用限制酶SpeI，因为若使用该酶会破坏M基因。但在A、D融合基因两端应添加SpeI、EcoRI两种限制酶的识别序列，确保其正向连接。 6、（2025·广东·一模）通过科学选育和种植管理，我国已成为世界上最大的番茄生产国。回答下列问题： (1)番茄花是双性花，野生型番茄成熟时果肉为红色。为探究番茄果肉颜色的遗传机制，科学家利用甲（基因A突变为a，果肉黄色）、乙（基因B突变为b，果肉橙色）两种单基因纯合突变体进行杂交实验，结果如图。则F2中橙色果肉植株的基因型有 ，红色果肉植株中纯合体的比例为 。    (2)番茄的SlMlol基因是参与白粉病（病菌侵染，会严重降低番茄的产量）发生的易感基因。科学家利用CRISPR/Cas9基因组编辑敲除了番茄的SlMlol基因，获得了抗白粉病的新品种。下图示CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理：Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA（sgRNA）引导下切割DNA双链以敲除目标基因。    Ⅰ.过程②中，将重组质粒导入番茄细胞的常用方法是 。 Ⅱ.在设计sgRNA碱基序列时，依据的是 的部分碱基序列。Cas9蛋白切割DNA双链时作用的化学键是 。 Ⅲ.可采用DNA分子杂交技术检测是否成功敲除SlMlol基因，则操作思路及预期结果是 。 【答案】(1) AAbb、Aabb、aabb 1/9 (2) 农杆菌转化法 SlMlo1基因 磷酸二酯键 操作思路：从新品种细胞中提取DNA，与SlMlo1基因探针进行杂交。预期结果：没有出现杂交带。 【知识点】基因编辑技术、目的基因的检测与鉴定、将目的基因导入受体细胞、基因自由组合定律的实质和应用 【分析】基因自由组合定律：位于非同源染色体上的非等位基因的分离或组合是互不干扰的；在减数分裂过程中，同源染色体上的等位基因彼此分离的同时，非同源染色体上的非等位基因自由组合。 【详解】（1）由图可知，F2为红色：黄色：橙色≈9:3:4，说明F1基因型为AaBb为红色，由于基因A突变为a，果肉黄色，基因B突变为b，果肉橙色，故红色基因型为A_B_，黄色为aaB_，橙色为A_bb和aabb，甲的基因型为aaBB、乙的基因型为AAbb。则F2中橙色果肉植株的基因型有AAbb、Aabb、aabb，红色果肉植株A_B_=9/16，红色果肉植株中纯合体的比例为1/4×1/4（AABB）÷9/16（A_B_）=1/9。 （2）Ⅰ.过程②中，将重组质粒导入植物细胞的常用方法为农杆菌转化法。 Ⅱ.sgRNA通过与目标基因配对结合起到引导作用，因此在设计sgRNA碱基序列时，依据的是SlMlo1基因的部分碱基序列。核苷酸之间通过磷酸二酯键连接，Cas9蛋白切割DNA双链时作用的化学键是磷酸二酯键。 Ⅲ.用DNA分子杂交技术检测是否成功敲除SlMlol基因，可从新品种细胞中提取DNA，与SlMlo1基因探针进行杂交，根据碱基互补配对原则，若成功敲除，则不会出现杂交带。 7、（2025·广东梅州·一模）苯丙酮尿症是由于患者体内苯丙氨酸代谢途径中的酶发生缺陷，使得苯丙氨酸及其代谢物酮酸在血液和组织中大量累积，进而阻碍脑的发育。研究发现，苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因可在大肠杆菌中表达并降解苯丙氨酸。科学家将PAL基因导入到肠道益生菌Nissle1917大肠杆菌（EcN）中，构建工程菌EcN-PAL，用于治疗苯丙酮尿症。图1为2.7Kb的质粒，其中Ap为氨苄青霉素抗性基因，EcoRⅠ和PvuⅠ两种限制酶的酶切位点与复制原点之间的距离分别为0.6Kb和0.8Kb。图2为含PAL基因的DNA片段。 回答下列问题： (1)PAL是一种胞内酶，据此推测EcN-PAL的细胞膜上应具有 功能的蛋白质与PAL协同工作，完成EcN-PAL的预期作用。 (2)利用PCR技术扩增PAL基因，若该基因编码区其中一条链的序列为5'-AGCCCTCC……GAACCAGC-3'，下列可选用的一对引物是______。 A．5'-CCTCCCCA-3' B．5'-AGCCCTCC-3' C．5'-GCTGGTTC-3' D．5'-GAACCAGC-3' (3)据图分析，选用 酶切割PAL基因和质粒，构建重组表达载体。为确保目的基因正确插入质粒中，使用EcoRⅠ对重组DNA分子完全酶切后，进行凝胶电泳分析。若电泳图谱中出现长度为 Kb的条带，则说明是符合要求的重组质粒。 (4)研究表明EcN菌株不会在人体肠道中定殖，一段时间后会从胃肠道全部清除。据此推测，若服用EcN-PAL治疗苯丙酮尿症，需 （答出一点即可）。 【答案】(1)转运苯丙氨酸 (2)BC (3) PvuI 1.2kb和5.5kb (4)持续服用足够剂量 【知识点】PCR扩增的原理与过程、DNA重组技术的基本工具、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的筛选与获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于重组DNA分子的筛选； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA—PCR技术；②检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术； 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）由于PAL是一种胞内酶，它需要在细胞内发挥作用，而EcN-PAL要完成其预期作用，即降解苯丙氨酸，就需要将苯丙氨酸从细胞外运输到细胞内。因此，EcN-PAL膜上应存在具有转运苯丙氨酸功能的蛋白质，这些蛋白质能与PAL协同工作，确保苯丙氨酸能够顺利进入细胞内并被PAL降解。 （2）PCR技术中，引物是与目的基因两端互补配对的一段短单链DNA，用于引导DNA聚合酶进行DNA的合成。已知该基因编码区其中一条链的序列为5'-AGCCCTCC……GAACCAGC-3' 。引物需要与模板链的3'端互补配对，这样才能保证DNA聚合酶沿着5'到3'的方向进行DNA合成。 A、5'-CCTCCCA - 3' ，与已知序列的部分反向互补，但扩增范围向左，不可作为引物； B、5'-AGCCCTCC - 3' ，与已知序列有部分相同，不能作为引物； C、5'-GCTGGTTC - 3' ，与已知序列的3'端反向互补，可作为引物； D、5'-GAACCA - 3' ，与已知序列有部分相同，不能作为引物。 综上所述，可选用的一对引物是BC。 （3）PAL基因的两端只含PvuI限制酶切割位点，且质粒上也有PvuI限制酶切割位点，所以应选用PvuI酶切割PAL基因和质粒构建重组表达载体。经过限制酶切割后，PAL基因两端的黏性末端相同，有可能和质粒正向连接，也可以和质粒反向连接。由于EcoRI在目的基因和质粒上都有酶切位点，为选出正向连接的重组质粒，使用EcoRI对质粒完全酶切后，进行电泳分析。质粒中EcoRI酶切位点与Pvul酶切位点之间的距离为0.2Kb，若是正向连接载体，重组质粒中2个EcoRI酶切点之间的距离是0.2+1.0=1.2Kb ，重组质粒长度为：2.7+4=6.7Kb，故EcoRI酶切后，正向连接载体的情况下，电泳图谱中出现长度为1.2kb和5.5kb两条带。 （4）研究表明EcN菌株不会在人体肠道中定殖，一段时候后会从胃肠道全部清除。据此推测，服用EcN-PAL治疗苯丙酮尿症时需注意持续服用足够剂量以维持治疗效果，因为一旦停止服用，工程菌就会从肠道中清除出去，无法继续发挥降解苯丙氨酸的作用。 基因工程的应用考点03 1、（2025·广东·一模）我国科学家利用外源抗虫基因——Bt基因成功培育出转基因抗虫棉，能专门破坏棉铃虫等鳞翅目害虫的消化系统，导致其死亡。下列说法正确的是（    ） A．培育抗虫棉的原理是基因突变 B．相对普通棉花而言，抗虫棉是新物种 C．大面积推广种植抗虫棉以后，棉铃虫的基因频率将发生不定向改变 D．在抗虫棉附近种植少量普通棉花，可减缓棉铃虫对抗虫棉的抗性 【答案】D 【知识点】基因频率的改变与生物进化、隔离与物种的形成、基因工程的概念及原理、基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用 【分析】1、影响基因频率变化的因素：基因突变、基因重组自然选择等。 2、生物进化的实质是种群基因频率的改变，基因频率改变不一定产生新的物种，生殖隔离是新物种形成的标志。 3、新物种形成的三个环节：隔离、突变和基因重组、自然选择。 【详解】A、培育抗虫棉的原理是基因重组，A错误； B、抗虫棉是新品种，未与普通棉花产生生殖隔离，不属于新物种，B错误； C、大面积推广种植抗虫棉以后，不具抗性的棉铃虫死亡，进而影响棉铃虫种群的基因频率，棉铃虫的基因频率将发定向改变，C错误； D、在抗虫棉附近种植少量普通棉花，可降低环境对棉铃虫选择的强度，减缓棉铃虫对抗虫棉的抗性，D正确。 故选D。 2、（2025·广东珠海·一模）部分肠道细菌能够分泌外膜囊泡（OMV），OMV能穿越肠道上皮屏障，活化肠黏膜内的免疫细胞。研究人员通过构建ClyA-Ag-mFc融合蛋白基因表达载体（见图），转化大肠杆菌来制备工程菌。下列相关叙述错误的是（    ） A．ClyA表达产物可以将融合蛋白定位到OMV表面 B．Ag表达产物可以激活机体的特异性免疫反应 C．mFc表达产物可以提高T细胞摄取OMV的能力。 D．利用该大肠杆菌可制备预防肿瘤的口服疫苗 【答案】C 【知识点】体液免疫、基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用、疫苗 【分析】疫苗是将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用转基因等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。 【详解】A、分析题意可知，ClyA是外膜囊泡上含量较高的特异蛋白，而OMV能穿越肠道上皮屏障活化肠黏膜内丰富的免疫细胞。所以，ClyA基因的作用为表达出细菌溶素A(ClyA)，使OVA和Fc定位至OMV表面，进而融合基因可以被免疫细胞识别，A正确； B、Ag是肿瘤细胞表面特异性抗原基因，Ag表达产物可以激活机体的特异性免疫反应，B正确； C、mFc表达产物能够与树突状细胞表面的特异性受体结合，进而提高树突状细胞（而非T细胞）识别、摄取和传递抗原信息的能力，C错误； D、利用该大肠杆菌可制备预防肿瘤的口服疫苗，属于基因工程在免疫方面的应用，D正确。 故选C。 3、（2025·广东江门·一模）甲型流感病毒（IAV）是单链RNA病毒，主要利用鸡细胞的ANP32A蛋白进行病毒复制。IAV因传染性强而易导致禽流感疫情的发生，有研究人员使用CRISPR/Cas9技术对鸡的ANP32A基因进行编辑，获得世界首批抗禽流感鸡（GE），过程见图。    (1)在编辑鸡的ANP32A基因时，需加入Cas9蛋白，该蛋白可催化 键水解，剪切特定DNA片段。图中②过程进行细胞培养的培养基中添加了青霉素和链霉素，作用是 。图中③过程筛选得到的GE均为纯合子，与宿主鸡相比，GE具有的特点是 。 (2)由上述过程孵出的基因编辑鸡（GE）与野生型鸡（WT）在生长、外观、行为等方面均无差别。为探究不同感染方式下，GE对IAV的抗感染能力及IAV在鸡群中的传播能力，以GE和WT（均未感染IAV）为实验对象，采用两种感染方式：人工接种（通过鼻内滴注直接接种IAV）和自然接触感染（通过与携带IAV的鸡自然接触感染病毒），步骤及结果如表所示。 分组 A组（GE） B组（GE） C组（WT） D组（WT） 人工接种 接种IAV 不接种 接种IAV 不接种 培养方式 适宜条件下 ？ 培养一周 与A、B组的操作相同 病毒斑块测定 10%个体出现斑块脱落 结果（B1） 100%个体出现斑块脱落 结果（D1） 体内病毒含量测定（PFU/ml） 极少 结果（B2） 很多 结果（D2） 特异性抗体测定 17%个体呈阳性 少或无 100%个体呈阳性 多 注：病毒斑块测定：IAV在鸡的呼吸道中复制会形成斑块。斑块脱落后，斑块中的病毒可进入自身体内，也可在鸡群中传播。 ①据A、C组结果分析，与WT相比，GE体内病毒含量及特异性抗体更少，却可反映出GE有更强的抗感染能力，原因是 。 ②根据上述完整实验还可得出结论：GE和WT均可通过自然接触而感染并传播IAV，但GE的抗感染能力更强、IAV在鸡群中的传播能力更弱，则表2“培养方式”中的“？”应设置为： ；比较实验结果：Bl Dl（填“>”或“<”或“=”）。 (3)对GE的后续跟踪观察中发现：原来无感染的GE后来有部分也会感染IAV，其原因可能是： 。（列出两点即可） (4)尽管对GE的研究已取得了一定可喜成果，要想将GE上市推广前仍需进行安全性方面的评估，例如 。（列出一点即可） 【答案】(1) 磷酸二酯 防止杂菌的污染 个体的每个细胞均不含正常ANP32A基因、能稳定遗传 (2) GE体内没有正常的ANP32A蛋白，导致IAV含量过少不足以诱导免疫反应发生 A、B两组混合 ＜ (3)IAV的遗传物质是单链RNA，容易发生变异；GE中还有其它基因发挥作用，未能完全阻断病毒复制、传播途径；饲养环境中的高病毒载量或长时间暴露，导致病毒突破了GE的抗性；部分GE可能存在免疫系统缺陷，无法有效抵抗病毒；突变了的ANP32A 重新突变，合成蛋白 ANP32A (4)抗禽流感鸡对其它生物及环境的影响；抗禽流感鸡经编辑过的基因对人的安全性影响；基因编辑有可能脱靶，存在一定脱靶概率 【知识点】体液免疫、无菌技术、DNA重组技术的基本工具、验证性实验与探究性实验 【分析】1、免疫系统由免疫细胞、免疫器官和免疫活性物质组成。 2、人体免疫包括非特异性免疫和特异性免疫，非特异性免疫包括第一、二道防线，第一道防线由皮肤和黏膜组成，第二道防线由体液中的杀菌物质和吞噬细胞组成；特异性免疫是人体的第三道防线，由免疫器官、免疫细胞借助于血液循环和淋巴循环组成，包括细胞免疫和体液免疫两种方式。 【详解】（1）在编辑鸡的ANP32A基因时，加入Cas9蛋白可以剪切特定的DNA片段，说明Cas9蛋白可以催化磷酸二酯键水解。图中②过程进行细胞培养的培养基中添加了青霉素和链霉素，目的是防止杂菌的污染。结合图示可知，GE是成功导入抗禽流感胚胎细胞的鸡，与宿主鸡相比，GE具有的特点是个体的每个细胞均不含正常ANP32A基因、能稳定遗传。 （2）①IAV在鸡的呼吸道中复制会形成斑块。斑块脱落后，斑块中的病毒可进入自身体内，也可在鸡群中传播。与WT相比，GE体内病毒含量及特异性抗体更少，却可反映出GE有更强的抗感染能力，原因是GE体内没有正常的ANP32A蛋白，导致IAV含量过少不足以诱导免疫反应发生。 ②实验结论是GE和WT均可通过自然接触而感染并传播IAV，但GE的抗感染能力更强、IAV在鸡群中的传播能力更弱，说明培养方式为A、B两组混合；由于GE的抗感染能力更强，因此GE出现斑块脱落的个体比例小，即B1＜D1。 （3）原来无感染的GE后来有部分也会感染IAV，其原因可能是：IAV的遗传物质是单链RNA，容易发生变异；GE中还有其它基因发挥作用，未能完全阻断病毒复制、传播途径；饲养环境中的高病毒载量或长时间暴露，导致病毒突破了GE的抗性；部分GE可能存在免疫系统缺陷，无法有效抵抗病毒；突变了的ANP32A 重新突变，合成蛋白 ANP32A。 （4）将GE上市推广前仍需进行安全性方面的评估，如抗禽流感鸡对其它生物及环境的影响；抗禽流感鸡经编辑过的基因对人的安全性影响等。 4、（2025·广东深圳·一模）乳糖操纵子是大肠杆菌中一个经典的基因表达调控系统，该系统在生物工程和分子生物学中有广泛应用。如图表示乳糖操纵子调控结构基因表达的过程，回答下列问题： (1)大肠杆菌会优先利用葡萄糖，同时添加葡萄糖和乳糖的培养基培养大肠杆菌，早期大肠杆菌主要是利用 （填“①”或“②”）途径调控结构基因。当培养基中的葡萄糖消耗完，大肠杆菌开始利用乳糖进行自身代谢，此时乳糖作为 为大肠杆菌提供营养，阻遏蛋白主要与 结合，从而调控结构基因表达。 (2)研究人员对传统乳糖操纵子的阻遏蛋白进行分子内的光控化改造，利用蓝光可以改变阻遏蛋白的结构，如图1。用蓝光照射时，GFP基因的表达情况是 。根据该原理，研究人员构建了如图2基因表达载体，除未标出终止子外，该表达载体缺少的结构是 。 (3)为验证阻遏蛋白光控化改造后的调控效果，研究人员用野生型大肠杆菌、IPTG（诱导物）、光控化改造后的大肠杆菌进行验证实验，请完成以下表格中4组实验的设置情况，表格里填“－”和“+”分别表示不处理和处理。 处理 组别 1 2 3 4 野生型大肠杆菌 光控化改造后的大肠杆菌 IPTG 蓝光 (4)为验证阻遏蛋白光控化改造后的空间控制效果，将光控化改造后的大肠杆菌涂布在培养基上，蓝光环境下用三角形遮光板遮挡培养基（如图），适宜温度下培养一段时间后，描述紫外灯下培养基的实验现象 。若用成功转化后的大肠杆菌构建其他形状的荧光图案，需要进行的调控是 。 培养基遮光示意图（黑色区域为退光区） 【答案】(1) ① 碳源 诱导物（乳糖、别乳糖） (2) GFP基因不表达 光控化改造后的调节基因（表达光控化改造后的阻遏蛋白的基因） (3) 处理 组别 1 2 3 4 野生型大肠杆菌 光控化改造后的大肠杆菌 IPTG － + － － 蓝光 － － + － (4) 显示三角形的荧光区域 用相应图案的遮光板遮盖培养基并用蓝光照射 【知识点】培养基的成分及其功能、验证性实验与探究性实验、基因工程的操作程序综合 【分析】转录过程中，需要以DNA的一条链为模板合成mRNA；翻译过程中，需要以mRNA为模板，tRNA运送氨基酸，从而合成多肽链，多肽链经盘曲折叠变成具有一定空间结构的蛋白质。 【详解】（1）根据图示，①途径中调节基因表达的阻遏蛋白阻断了乳糖代谢相关基因的表达。大肠杆菌会优先利用葡萄糖，在同时添加葡萄糖和乳糖的培养基中，早期由于有葡萄糖存在，大肠杆菌主要利用①途径调控结构基因，从而抑制结构基因的表达，优先利用葡萄糖。而利用乳糖需要阻遏蛋白失活等一系列过程（即②途径），在葡萄糖存在时会受到一定抑制。所以早期主要是利用①途径调控结构基因。 当葡萄糖消耗完后，乳糖作为碳源为大肠杆菌提供营养。 阻遏蛋白主要与操纵序列（O序列）结合，当阻遏蛋白结合在O序列上时，会阻碍RNA聚合酶与启动子（P序列）结合，从而抑制结构基因的转录。当有乳糖存在时，乳糖的代谢产物别乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白构象改变，从O序列上解离下来，结构基因得以表达。 （2）由图1可知，用蓝光照射时，表达受阻，使GFP基因不表达，一个完整的基因表达载体应包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等。图中除未标出终止子外，还缺少光控化改造后的调节基因（表达光控化改造后的阻遏蛋白的基因）。 （3）对于野生型大肠杆菌，只有在有IPTG诱导时才会大量表达相关基因（因为野生型乳糖操纵子需要IPTG等诱导物解除阻遏蛋白对结构基因的抑制），所以在野生型大肠杆菌对应的IPTG列填“+”，蓝光列填“ - ”。 对于光控化改造后的大肠杆菌，在有蓝光照射时，阻遏蛋白构象改变，结构基因可表达，所以蓝光列填“+”；IPTG对其不是必需的，这里可以不处理，即IPTG列填“ - ”。整理如下：用蓝光照射光控化改造后的大肠杆菌，在蓝光环境下用三角形遮光板遮挡培养基，那么被遮光的部分（三角形内部）没有蓝光照射，阻遏蛋白正常结合操纵序列，结构基因不表达；未被遮光的部分有蓝光照射，阻遏蛋白构象改变，结构基因表达产生荧光蛋白。所以在紫外灯下培养基上会出现三角形亮斑（未遮光处有荧光），周围无荧光的实验现象。 若用成功转化后的大肠杆菌构建其他形状的荧光图案，需要进行的调控是根据所需图案设计相应的遮光装置，通过控制蓝光的照射区域来实现对不同部位大肠杆菌基因表达的调控，从而使大肠杆菌在不同区域按预期表达荧光蛋白形成特定形状。 5、（2025·广东·一模）噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随噬菌体外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白或多肽随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。利用该技术可以获得单克隆抗体（最新技术）。请回答下列问题： (1)传统单克隆抗体的获得需先对小鼠进行 处理，整个过程中涉及的现代科学技术有 。 (2)外源DNA片段含 个游离的磷酸。为了得到大量的外源DNA，可使用PCR技术进行体外扩增，合成引物 （填“需要”或“不需要”）知道整个外源DNA序列。 (3)噬菌体展示技术获得的抗体还可用于定量检测抗原，如双抗体夹心法，具体原理如下图所示： 分析上图可知，固相抗体和酶标抗体均能与抗原结合，这是由于不同抗体可与同一抗原表面的 结合。该检测方法中，酶标抗体的作用是 ，可通过测定产物量来推测抗原量。 (4)试说说噬菌体展示技术可能的局限性： 。 【答案】(1) 注射特定的抗原蛋白（免疫） 动物细胞培养、动物细胞融合 (2) 2 不需要 (3) 不同部位 与待测抗原结合，酶催化检测底物反应 (4)不能展示对噬菌体或宿主细胞有毒的蛋白质，噬菌体的蛋白质无法被内质网和高尔基体等加工 【知识点】噬菌体侵染细菌的实验、PCR扩增的原理与过程、目的基因的检测与鉴定、动物细胞融合与单克隆抗体的制备 【分析】试题分析：本题以图文的形式考查了动物细胞培养、动物细胞融合、单克隆抗体的制备的相关知识，意在考查学生的识图、析图能力及运用所学知识解决问题的能力。噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。 【详解】（1）传统单克隆抗体的获得需先对小鼠进行注射特定的抗原蛋白（免疫）处理，使其产生已免疫的B淋巴细胞；整个过程中涉及的现代科学技术有动物细胞融合（已免疫的B细胞和骨髓瘤细胞融合）、动物细胞培养（体内培养和体外培养）； （2）每个DNA分子的每条单链上各有一个游离的磷酸基团，因此外源DNA片段含2个游离的磷酸。一般情况下，我们需要大量的某一基因的片段时，我们在基因的两端分别设计引物（一段一条），然后在体外，采用PCR的方法，用引物进行体外DNA复制，从而大量合成引物之间的基因。因此不需要知道整个外源DNA序列，只需要设计好引物，其余部分可通过碱基互补配对原则自动完成； （3）抗体与抗原的结合具有特异性，因此不同抗体可与同一抗原表面的不同部位结合。由于抗体具有特异性，因此该检测方法中，酶标抗体的作用是与待测抗原结合，酶催化检测底物反应，可通过测定产物量来推测抗原量； （4）噬菌体展示技术可能的局限性：不能展示对噬菌体或宿主细胞有毒的蛋白质，噬菌体的蛋白质无法被内质网和高尔基体等加工。 6、（2025届广东省深圳市建文外国语学校两学部一模）抗生素的长期使用易导致病菌产生严重的耐药性。抗菌肽以其快速杀菌活性、低耐药可能性、免疫调节特性和促进伤口愈合的潜力成为最有前景的抗菌药物。研究发现将抗菌肽第52位的脯氨酸（密码子为CCA）替换成苏氨酸（密码子为ACA）可增强抗菌肽的杀菌活性。科研人员利用大引物PCR定点诱变技术对抗菌肽基因进行改造的过程如图所示。回答下列问题： (1)将抗菌肽第52位的脯氨酸换成苏氨酸，需要将mRNA的对应碱基序列中第 位的碱基替换，碱基具体变化为 。基因模板链对应的碱基改变为 。 (2)PCR过程中温度的控制至关重要，若变性时温度偏低则会导致反应效率降低，原因是 。 (3)据图分析，“大引物PCR定点诱变”技术中设计的“诱变引物”应选择________。 A．5'…CCTGTTAT…3' B．5'…CCTGGTAT…3' C．5'…ATACCAGG…3' D．S'…ATAACAGG…3' (4)进行大引物PCR定点诱变获得改良的抗菌肽基因需要进行两次PCR（PCR1和PCR2），产物1最早出现在PCR1的第 轮循环：PCR2的产物除改良的抗菌肽基因外，还有 ；通过PCR3快速扩增时应选用的引物是 。 (5)In-Fusion酶能够识别任何具有15bp相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，实现目的基因和载体的连接。科研人员将载体（320bp）两端连接上与改良的抗菌肽基因（180bp）两端相同的序列（15bp）并利用In-Fusion酶实现两者的连接，如图所示。最终获得的重组DNA分子长度为 。与传统方法相比，这种技术的优点是 （至少写两点）。 【答案】(1) 154 C变为A G变为T (2)温度偏低时DNA双链解旋不充分，延伸时模板减少，产生的产物量偏少 (3)A (4) 3 诱变前的抗菌肽基因 引物1和引物2 (5) 500 插入位点不受限制酶识别序列限制；能够实现目的基因在载体任意位点上的插入；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏等 【知识点】遗传信息的转录、遗传信息的翻译、PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建 【分析】关于PCR技术的相关知识： 1、概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。 2、原理：DNA半保留复制。 3、前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。 4、条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。 5、过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 【详解】（1）mRNA上3个相邻的碱基决定一个氨基酸为一个密码子，第51位的氨基酸对应的mRNA上的碱基为51×3=153，脯氨酸密码子为CCA，苏氨酸密码子为ACA，若想将抗菌肽第52位的脯氨酸换成苏氨酸，可将mRNA上154位的碱基替换，碱基具体变化为C变为A。模板链与mRNA碱基互补配对，则基因模板链对应的碱基改变为G变为T。 （2）变性的目的是使双链DNA打开，若变性是温度偏低DNA双链解旋不充分，延伸时模板减少，产生的产物量偏少会导致反应效率降低。 （3）由图可知，模板链方向为3'5'，则诱变引物与转录非模板链碱基互补配对，则诱变引物序列与转录模板链相同，且需将模板连上154位碱基G变为T，则诱变引物序列位5'…CCTGTTAT…3'，A正确，BCD错误。 故选A。 （4）产物1最早出现课在PCR1的第3轮循环：DNA的复制方式位半保留复制，因此PCR2的产物除改良的抗菌肽基因外，还有诱变前的抗菌肽基因。由图可知，通过PCR3扩增时应选引物是引物1和引物2进行扩增。 （5）已知In-Fusion酶能够识别任何具有15bp相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，实现目的基因和载体的连接。因此最终获得的重组DNA分子长度为载体（320bp）+改良的抗菌肽基因（180bp）=500bp。与传统方法相比，这种技术夫人插入位点不受限制酶识别序列限制、能够实现目的基因在载体任意位点上的插入、避免限制酶切割对质粒功能区的破坏等优点。 7、（2025·广东·一模）番茄的口感品质与葡萄糖和果糖含量正相关。下图甲示番茄体内有机物的合成与分配机理。    回答下列问题： (1)番茄植株光合作用过程中，CO2在叶肉细胞的 （填具体场所）被固定。 (2)据图甲可知细胞壁转化酶的功能是 。实践发现：热胁迫使番茄大幅减产、口感品质低下。对此，检测正常条件及热胁迫处理下番茄果实部位的糖含量，结果如图乙。请结合图甲分析热胁迫导致番茄减产且口感品质变差的原因可能是 。 (3)为探明热胁迫导致番茄减产的机制，并解决这一问题，科研人员设计并开展下列实验。 ①检测发现热胁迫下番茄细胞中LIN5基因表达水平降低，其他基因无明显变化。为验证LIN5基因是热胁迫下影响光合产物分配的关键基因，科研人员敲除LIN5基因获得突变体lin5CR并置于 （填“正常”或“热胁迫”）条件下培养，若出现番茄大幅减产、口感品质低下现象，则假设正确。这种自变量控制方法称为 原理。 ②热响应元件是一种当环境中温度升高时可触发转录的DNA片段，科研人员拟利用其调控LIN5基因表达的水平，从而培育出热胁迫条件下稳产的lin5-de基因修饰植株，则在进行基因工程的核心步骤时要将热响应元件 。 ③利用植物组织培养技术培育lin5-de基因修饰植株过程中，可通过调节培养基中 两种激素的比例来诱导愈伤组织分化。 【答案】(1)叶绿体基质 (2) 将蔗糖分解为葡萄糖和果糖 热胁迫抑制细胞壁转化酶发挥作用使蔗糖难以分解为葡萄糖和果糖进入果实 (3) 正常 减法 插入启动子之前 生长素和细胞分裂素 【知识点】植物组织培养技术综合、基因表达载体的构建、影响光合作用的因素、光反应、暗（碳）反应的物质变化和能量变化 【分析】1、光合作用：①光反应场所在叶绿体类囊体薄膜，发生水的光解、ATP和NADPH的生成；②暗反应场所在叶绿体的基质，发生CO2的固定和C3的还原，消耗ATP和NADPH； 2、基因工程的操作步骤： (1)目的基因的获取；方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； (2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤。基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； (3)将目的基因导入受体细胞；根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； (4)目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因：DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA：分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术； 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）在番茄植株光合作用的暗反应阶段，\CO2被固定。暗反应发生在叶绿体基质中，所以CO2在叶肉细胞的叶绿体基质被固定； （2）从图甲可以看出，细胞壁转化酶能将蔗糖分解为葡萄糖和果糖。由图乙可知，热胁迫下果实中蔗糖、葡萄糖和果糖含量都降低。结合图甲分析，原因可能是热胁迫抑制细胞壁转化酶发挥作用使蔗糖难以分解为葡萄糖和果糖进入果实，导致果实中葡萄糖和果糖含量降低，而番茄的口感品质与葡萄糖和果糖含量正相关，同时光合产物向果实运输分配减少，从而导致番茄减产且口感品质变差； （3）①为验证LIN5基因是热胁迫下影响光合产物分配的关键基因，敲除LIN5基因获得突变体lin5CR后应置于正常条件下培养，因为要在正常条件下观察突变体的表现。这种自变量控制方法称为减法原理，即通过去除某一因素（本问中去除LIN5基因）来研究该因素的作用； ②基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。热响应元件是一种当环境中温度升高时可触发转录的DNA片段，要利用其调控LIN5基因表达的水平，在构建基因表达载体时要将热响应元件插入启动子之前，以实现温度升高时热响应元件触发LIN5基因转录； ③在利用植物组织培养技术培育lin5-de基因修饰植株过程中，可通过调节培养基中生长素和细胞分裂素两种激素的比例来诱导愈伤组织分化。当生长素与细胞分裂素比例适中时，促进愈伤组织形成；当生长素与细胞分裂素比例较高时，有利于根的分化；当生长素与细胞分裂素比例较低时，有利于芽的分化。 8、（2025·广东广州·一模）鹅源星状病毒属于RNA病毒，鹅群感染后死亡率高，对鹅类养殖构成巨大威胁。其全基因组结构模式图如图甲所示，ORF2区域编码的纤突蛋白是该病毒的主要抗原性蛋白。研究人员以疑似感染该病毒死亡鹅的组织为样本，通过研磨提取上清液，进而制备单克隆抗体。回答下列问题：    (1)鹅死亡的原因还可能包括感染鹅细小病毒（一种DNA病毒）或感染致病细菌。为确定感染源，研究人员以样本总DNA为模板，在PCR反应体系中通过加入 进行特定片段的扩增并进行相应检测；同时，将样本上清液接种于固体培养基上，在适宜的条件下培养一段时间后，观察并鉴定培养基上是否出现 。 (2)成功分离出鹅源星状病毒后，研究人员提取了该病毒的RNA，并通过 获得该病毒的cDNA作为纤突蛋白基因序列的扩增模板。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，图乙电泳结果中最有可能代表纤突蛋白基因序列的是 （填编号）。    (3)从凝胶中分离得到纤突蛋白基因序列并扩增， ，导入特定受体细胞， 。进行细胞培养后可从中获得纤突蛋白。 (4)研究人员利用纤突蛋白制备获得了纤突蛋白单克隆抗体，该单克隆抗体可应用于 （答两点）。 【答案】(1) 鹅细小病毒DNA引物 致病细菌菌落 (2) 逆（反）转录 B (3) 构建基因表达载体 检测鉴定转基因成功 (4)快速诊断鹅是否感染鹅源星状病毒／治疗鹅源星状病毒的感染（合理即可） 【知识点】PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定、动物细胞融合与单克隆抗体的制备 【分析】单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高，并可能大量制备的特点。 【详解】（1）实验目的是获得鹅细小病毒的DNA，因此PCR扩增时需要加入鹅细小病毒DNA引物，以保证能扩增出鹅细小病毒的DNA。将样本上清液接种于固体培养基上，在适宜的条件下培养一段时间后，观察并鉴定培养基上是否出现致病细菌菌落，以确定是否感染致病菌。 （2）以该病毒的RNA为模板，在逆转录酶的作用下通过逆转录可形成该病毒的cDNA。根据图甲可知，ORF2区域编码的纤突蛋白是该病毒的主要抗原性蛋白，ORF2区域含有的碱基对数为6939－4807=2132，因此图乙电泳结果中最有可能代表纤突蛋白基因序列的是B。 （3）基因工程的操作步骤：目的基因的筛选与获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。因此从凝胶中分离得到纤突蛋白基因序列并扩增，构建基因表达载体，导入特定受体细胞，检测鉴定转基因成功。 （4）抗原和抗体可特异性结合，因此纤突蛋白单克隆抗体可快速诊断鹅是否感染鹅源星状病毒。 9、（2025·广东湛江·一模）柑橘树生长过程中易受某种革兰氏阴性菌感染，严重危害柑橘产量。科研人员将M基因转入柑橘中，该基因控制合成的酶可抑制该种革兰氏阴性菌的生长与繁殖。如图是培育转基因柑橘的过程示意图，已知限制酶HindⅢ、BamHⅠ、SalⅠ的识别序列及切割位点分别为5'-A↓AGCTT-3′、5′-G↓GATCC-3′、5-G↓TCGAC-3'。请回答下列问题：    (1)构建的基因表达载体，除了含有目的基因外，还必须含有 （回答2点）等。据图分析，在基因表达载体构建过程中，应使用 对M基因和质粒进行切割，原因是 。 (2)利用PCR技术克隆M基因时，应选择下图中的引物 （填序号），引物的作用是 。    (3)将图中农杆菌先后置于含 的培养基中培养，从而筛选出含重组质粒的农杆菌。为检测转基因柑橘幼苗是否可以抵抗革兰氏阴性菌的感染，在个体生物学水平上，操作方法是 。 (4)图中由柑橘细胞培育成转基因柑橘幼苗采用了 技术，该技术的原理是 ，由柑橘细胞获得愈伤组织的过程称为 。 【答案】(1) 标记基因、启动子、终止子、复制原点 SalⅠ和HindⅢ 切割后的目的基因完整，和质粒具有相同的黏性末端可以连接且可以防止目的基因和质粒自身环化 (2) 2和3 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 (3) 氨苄青霉素、四环素 对柑橘幼苗接种该种革兰氏阴性菌，观察幼苗生长情况 (4) 植物组织培养 植物细胞的全能性 脱分化 【知识点】植物组织的培养及基本过程、PCR扩增的原理与过程、基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）基因表达载体必须包括目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点等；据图分析，用限制酶BamHⅠ会破坏M基因，因此应使用SalⅠ和HindⅢ对M基因和质粒进行切割；因为目的基因和质粒用的是相同的两种限制酶切割，所以具有相同的黏性末端可以连接在一起构成重组质粒且使用两种限制酶切割可以防止目的基因和载体自身环化。 （2）根据子链延伸方向为5'→3'，引物需要与模版的3'端结合，可判断出扩增M基因应选择引物2和引物3；引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。 （3）用限制酶SalⅠ和HindⅢ对质粒进行切割时，破坏了抗四环素基因，在重组质粒上只有抗氨苄青霉素基因，因此应先将农杆菌置于含氨苄青霉素的培养基中培养，此时导入空质粒和重组质粒的农杆菌均可存活，再将存活的农杆菌接种于含四环素的培养基中，此时导入重组质粒的农杆菌由于没有四环素抗性而死亡，从原来含氨苄青霉素的培养基中原位置可筛选出含重组质粒的农杆菌；在个体生物学水平上，通过对柑橘幼苗接种该种革兰氏阴性菌，观察幼苗生长情况，可以检测转基因柑橘幼苗是否可以抵抗革兰氏阴性菌的感染。 （4）由柑橘细胞培育成转基因柑橘幼苗采用了植物组织培养技术，该技术的原理是植物细胞的全能性，其中由柑橘细胞获得愈伤组织的过程称为脱分化。 10、（2025 广东省广州市真光中学高三一测）乳糖操纵子是大肠杆菌中一个经典的基因表达调控系统，该系统在生物工程和分子生物学中有广泛应用。如图表示乳糖操纵子调控结构基因表达的过程，回答下列问题： (1)大肠杆菌会优先利用葡萄糖，同时添加葡萄糖和乳糖的培养基培养大肠杆菌，早期大肠杆菌主要是利用 （填“①”或“②”）途径调控结构基因。当培养基中的葡萄糖消耗完，大肠杆菌开始利用乳糖进行自身代谢，此时乳糖作为 为大肠杆菌提供营养，阻遏蛋白主要与 结合，从而调控结构基因表达。 (2)研究人员对传统乳糖操纵子的阻遏蛋白进行分子内的光控化改造，利用蓝光可以改变阻遏蛋白的结构，如图1。用蓝光照射时，GFP基因的表达情况是 。根据该原理，研究人员构建了如图2基因表达载体，除未标出终止子外，该表达载体缺少的结构是 。 (3)为验证阻遏蛋白光控化改造后的调控效果，研究人员用野生型大肠杆菌、IPTG（诱导物）、光控化改造后的大肠杆菌进行验证实验，请完成以下表格中4组实验的设置情况，表格里填“－”和“+”分别表示不处理和处理。 处理 组别 1 2 3 4 野生型大肠杆菌 光控化改造后的大肠杆菌 IPTG 蓝光 (4)为验证阻遏蛋白光控化改造后的空间控制效果，将光控化改造后的大肠杆菌涂布在培养基上，蓝光环境下用三角形遮光板遮挡培养基（如图），适宜温度下培养一段时间后，描述紫外灯下培养基的实验现象 。若用成功转化后的大肠杆菌构建其他形状的荧光图案，需要进行的调控是 。 培养基遮光示意图（黑色区域为退光区） 【答案】(1) ① 碳源 诱导物（乳糖、别乳糖） (2) GFP基因不表达 光控化改造后的调节基因（表达光控化改造后的阻遏蛋白的基因） (3) 处理 组别 1 2 3 4 野生型大肠杆菌 光控化改造后的大肠杆菌 IPTG － + － － 蓝光 － － + － (4) 显示三角形的荧光区域 用相应图案的遮光板遮盖培养基并用蓝光照射 【知识点】培养基的成分及其功能、验证性实验与探究性实验、基因工程的操作程序综合 【分析】转录过程中，需要以DNA的一条链为模板合成mRNA；翻译过程中，需要以mRNA为模板，tRNA运送氨基酸，从而合成多肽链，多肽链经盘曲折叠变成具有一定空间结构的蛋白质。 【详解】（1）根据图示，①途径中调节基因表达的阻遏蛋白阻断了乳糖代谢相关基因的表达。大肠杆菌会优先利用葡萄糖，在同时添加葡萄糖和乳糖的培养基中，早期由于有葡萄糖存在，大肠杆菌主要利用①途径调控结构基因，从而抑制结构基因的表达，优先利用葡萄糖。而利用乳糖需要阻遏蛋白失活等一系列过程（即②途径），在葡萄糖存在时会受到一定抑制。所以早期主要是利用①途径调控结构基因。 当葡萄糖消耗完后，乳糖作为碳源为大肠杆菌提供营养。 阻遏蛋白主要与操纵序列（O序列）结合，当阻遏蛋白结合在O序列上时，会阻碍RNA聚合酶与启动子（P序列）结合，从而抑制结构基因的转录。当有乳糖存在时，乳糖的代谢产物别乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白构象改变，从O序列上解离下来，结构基因得以表达。 （2）由图1可知，用蓝光照射时，表达受阻，使GFP基因不表达，一个完整的基因表达载体应包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等。图中除未标出终止子外，还缺少光控化改造后的调节基因（表达光控化改造后的阻遏蛋白的基因）。 （3）对于野生型大肠杆菌，只有在有IPTG诱导时才会大量表达相关基因（因为野生型乳糖操纵子需要IPTG等诱导物解除阻遏蛋白对结构基因的抑制），所以在野生型大肠杆菌对应的IPTG列填“+”，蓝光列填“ - ”。 对于光控化改造后的大肠杆菌，在有蓝光照射时，阻遏蛋白构象改变，结构基因可表达，所以蓝光列填“+”；IPTG对其不是必需的，这里可以不处理，即IPTG列填“ - ”。整理如下：用蓝光照射光控化改造后的大肠杆菌，在蓝光环境下用三角形遮光板遮挡培养基，那么被遮光的部分（三角形内部）没有蓝光照射，阻遏蛋白正常结合操纵序列，结构基因不表达；未被遮光的部分有蓝光照射，阻遏蛋白构象改变，结构基因表达产生荧光蛋白。所以在紫外灯下培养基上会出现三角形亮斑（未遮光处有荧光），周围无荧光的实验现象。 若用成功转化后的大肠杆菌构建其他形状的荧光图案，需要进行的调控是根据所需图案设计相应的遮光装置，通过控制蓝光的照射区域来实现对不同部位大肠杆菌基因表达的调控，从而使大肠杆菌在不同区域按预期表达荧光蛋白形成特定形状。 11、（广东省深圳市高级中学高中园2025届 第一次模拟考试）在植物基因组中天然存在着一类自私的基因或遗传元件，能够使得自身传递给后代的比例大大提高，被称为基因驱动元件。受天然基因驱动元件的启发，我国研究团队开发了一种名为CAIN的基因驱动系统，如图。 CRISPR/ Cas9能够靶向切割NPG1基因的编辑工具；NPG1表示花粉萌发所必需的基因 回答下列问题： (1)CRISPR/Cas9由人工合成的短链RNA和一种来自细菌的核酸酶Cas9。短链RNA作为“向导”；核酸酶Cas9切割目的DNA，使DNA双链断裂。短链RNA作为“导向”作用的具体原理是 。 (2)CAIN系统基于“毒药—解药”机制，据图分析，通过 的作用在植物花粉中产生毒药效应；再以 作为解药，让花粉正常萌发。图中重新编码后的NPG1需要具备的条件是 ，为实现这一目的，研究人员利用了密码子的 现象对NPGI进行重新编码，最终实现了 的花粉能够正常萌发。 (3)研究人员选用了自交繁殖的拟南芥作为材料，研究结果如下图。 ①若是双剪切，基因驱动工具CAIN系统在人工杂交世代中表现出了显著的高效遗传，理论上后代带有CAIN个体为100%，远高于孟德尔遗传的期望比例 。 ②若是单剪切，如下图所示，则可以产生 种雄配子，理论上后代带有CAIN个体的比例为 。 【答案】(1)部分序列通过碱基互补配对原则，与目的基因中希望被编辑的DNA序列相结合 (2) CRISPR/Cas9 重新编码的NPG1 使花粉重新萌发且不受CRISPR/Cas9切割 简并性 携带CAIN系统 (3) 50% 3 67%/2/3/66.7% 【知识点】孟德尔两对相对性状的杂交实验、基因自由组合定律的实质和应用、筛选、获取合适的目的基因 【分析】基因工程技术的基本步骤： 1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是钙离子处理法。 4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——PCR检测等技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR检测等技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）短链RNA作为“导向”作用是部分序列通过碱基互补配对原则，与目的基因中希望被编辑的DNA序列相结合。 （2）CRISPR/Cas9是能够靶向切割NPG1基因的编辑工具，NPG1表示花粉萌发所必需的基因，CAIN系统是通过CRISPR/Cas9的作用将NPG1基因切除，从而在植物花粉中产生毒药效应。CAIN系统可以编辑NPG1基因，该基因是花粉形成必需的基因，再将重新编辑的NPG1基因导入到细胞中，重新编辑后的NPG1需要具备的条件是使花粉重新萌发且不受CRISPR/Cas9切割；重新编辑后的NPG1基因功能是一样的，碱基序列上有差异，主要是利用同义编辑，也就是利用密码子的简并性，最后使携带CAIN系统可以形成成熟花粉，即实现了携带CAIN系统的花粉能够正常萌发。 （3）①若是如图中CAIN系统导入到一条染色体上，这样与野生型杂交后代，只有50%个体后代携带CAIN系统； ②若是单剪切则可以产生3种类型花粉，其中有一种不可育（无法形成），带有CAIN系统的花粉是两种，所以后代有该系统的占了2/3，约为67%。 12、（2025·广东茂名·一模）c-fos是原癌基因的启动子，正常水平下表达水平很低，但是当细胞受到伤害和刺激时（如Na+内流引起的兴奋刺激）能快速启动下游基因的表达。实验小组在c-fos启动子的下游连接绿色荧光蛋白基因（GFP），构建c-fos-GFP重组质粒，并转染富含Na+通道的神经母细胞瘤细胞，再用乌头碱处理细胞，以筛选稳定表达的克隆细胞，其技术流程如下图所示，回答下列问题：    (1)PCR技术可通过设计 从水母细胞中特异性扩增GFP基因，过程①需要选择限制酶 切割含GFP基因的DNA片段，选择该限制酶切割的目的是 （答2点）。 (2)加入乌头碱可用于筛选稳定表达的克隆细胞，推测乌头碱是一种Na+通道 （填“激活剂”或“抑制剂”）。 (3)赤潮是造成海洋生态环境恶化的重要原因之一，其重要危害之一是赤潮生物能产生分泌赤潮毒素，赤潮毒素可特异性结合细胞的Na+通道，阻断Na+的运输。筛选并获得稳定表达的克隆细胞，用于检测水体中赤潮毒素（GTX）的相对含量，其操作流程为： ①向克隆细胞培养液中加入 。 ②检测细胞的荧光强度以确定GTX的相对含量，若 ，则说明水体中的GTX含量越高。 【答案】(1) 引物 HindII和XbaI ①确保和质粒产生相同的黏性末端；②用不同限制酶切割防止目的基因和质粒的自身环化 (2)激活剂 (3) 乌头碱和GTX 荧光强度越弱 【知识点】兴奋在神经纤维上的传导、PCR扩增的原理与过程、DNA重组技术的基本工具、基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用 【分析】启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，可以驱动转录。基因表达载体的组成元件目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点等。 【详解】（1）根据图示信息可知，从水母细胞获取GFP的方法是PCR，该技术需要设计两种引物来扩增GFP基因。根据图示信息可知，对质粒HF433是用HindII和XbaI两种限制酶同时进行切割的，为了方便GFP基因与质粒进行连接，应该选择HindII和XbaI两种限制酶切割GFP基因，以利于目的基因和质粒产生协同的黏性末端，另外用两种限制酶切割还可以防止目的基因和质粒的自身环化。 （2）根据题干信息可知，GFP上游为c-fos启动子，当细胞受到伤害和刺激时（如Na+内流引起的兴奋刺激），c-fos启动子能快速启动下游基因的表达，而题目中加入乌头碱可用于筛选稳定表达的克隆细胞，故推测乌头碱是一种钠离子通道激活剂，用乌头碱处理后，钠离子大量内流，会激活GFP的表达。 （3）由上分析可知，用乌头碱处理，有利于钠离子内流，进而激活GFP基因的表达，会呈现较强的绿色荧光。根据“赤潮生物能产生分泌赤潮毒素，赤潮毒素可特异性结合细胞的Na+通道，阻断Na+的运输”可知，克隆细胞在乌头碱的处理下，若用GTX处理，则钠离子的内流会减少，不能有效的激活GFP基因的表达，GTX的含量越高，GFP的表达量越低，绿色荧光会越弱。要检测水体中GTX的相对含量，可以向克隆细胞中加入乌头碱和含GTX的水样，若荧光强度越弱，说明水体中的GTX含量越高。 13、（2025届广东省三校高三一模）玉米是我国种植面积最大的农作物，玉米雄性不育系在杂交育种中的作用尤为重要。请回答下列问题： (1)玉米雄性不育系在杂交中常作为 ，杂交得到的子代可获得杂种优势。 (2)雄性不育系常存在着不育性状不稳定、基因污染等问，我国科研工作者为此开展了以下研究。 ①研究发现Z基因在花粉中特异性表达，是导致雄性不育的原因之一。研究者首先利用 法将Z基因导入玉米细胞，最终获得转基因杂合玉米品系Z580El2，然后将其花粉分别授予母本Z58和Z580E12，对花粉管的发育情况进行检测，结果如表1所示。 母本 花粉管长度正常 花粉管长度缩短 比例 Z58 46 54 1:1.17 Z580El2 47 53 1:1.13 表1花粉管发育情况统计结果 ②结果表明，上述花粉管性状的遗传遵循 定律，由于Z基因的表达会 从而可以导致玉米雄性不育。 (3)IPEI是玉米正常形成花粉所必需的基因，研究者获得了其纯合突变品系ipel雄性不育系。为解决其无法通过自交留种的问题，研究者将一个“基因盒子”导入该品系（图1），得到了4个转基因杂合株系P1~P4，然后分别将其花粉授予野生品系wc，结果见表2。    杂交组合 花粉管发育正常：异常 种子无荧光：有荧光 ♀wc×♂P1 1:0 1.05:1 ♀wc×♂P2 1:0 1.02:1 ♀wc×♂P3 1:1.11 1:0 ♀wc×♂P4 1:1.08 1:0 表2花粉管发育和结种情况统计结果 ①由于转入了 基因，四个株系均可以正常产生花粉。 ②以上结果显示 为成功构建的株系。 ③选取构建成功的株系中某植株自交，获得的子代中ipel雄性不育系所占比例为 。 (4)玉米的籽粒颜色由两对独立遗传的等位基因C/c、P/p决定，其中C控制色素的形成，而P控制色素的类型。只有当C和P同时存在时玉米籽粒才表现为紫色，其他组合都表现为非紫色。现有纯合紫色玉米甲（CCPP）、纯合非紫色玉米乙（ccpp）、纯合ipel雄性不育系紫色玉米丙（CCPP）、纯合ipel雄性不育系非紫色玉米丁（ccpp）四种玉米品系。 选取甲和乙杂交得到F1，F1自交后代中性状能稳定遗传的个体占 。若向丙和丁中与籽粒颜色有关基因所在染色体上各导入一个“基因盒子”（不破坏相关基因），以构建成功的丙为母本、丁为父本杂交得到F1，再让F1自交得F2，则F2中粒色的表现型及比例为： 。 【答案】(1)母本 (2) 农杆菌转化法/花粉管通道法 分离 抑制花粉管的延伸 (3) IPE1 P1、P2 1/2 (4) 1/4 紫色：非紫色=1:1 【知识点】基因自由组合定律的实质和应用 【分析】1.将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可整合到受体细胞的染色体DNA上。动物基因工程中，利用显微注射技术，将目的基因导入动物受精卵。由于动物受精卵具有极高的全能性，便于目的基因的复制和表达。 2.基因分离定律的实质：在杂合体的细胞中，位于一对同源染色体上的等位基因，等位基因会随同源染色体的分开而分离，分别进入两个配子中，独立地随配子遗传给后代。 【详解】（1）雄性不育系不能产生花粉或花粉不育，只能作为母本。 （2）①将外源基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，农杆菌中Ti质粒上的T-DNA可以整合到受体细胞的染色体DNA上，我们国家科学家研发的花粉管通道法也可以将外源基因导入受体细胞。 ②转基因杂合玉米品系Z580E12的花粉管发育情况有两种表型，花粉管长度正常：花粉管长度缩短接近于1:1，则花粉管性状的遗传遵循基因分离定律，雄性不育的原因是花粉管长度缩短，可知Z基因抑制花粉管的延伸无法正常受精，从而导致雄性不育。 （3） ①据题意，IPEI是玉米正常形成花粉所必需的基因，基因盒子中第二个基因是IPEI基因，所以四个株系均可以正常产生花粉。 ②♀wc╳♂P3、♀wc╳♂P4两个组合，花粉管发育正常:异常接近于1:1，则说明P3和P4中的Z基因能够正常发挥作用，种子无荧光:有荧光=1:0，“基因盒子”不会遗传给子代，造成基因污染问题，因此P3和P4为成功构建的株系。 ③选取构建成功的株系中某植株自交，雌性产生的雌配子是ipe1（可育）：ipe1-基因盒（可育）=1：1，雄性产生的雄配子是ipe1（可育）：ipe1-基因盒（不可育）=1：1，由于雄配子ipe1-基因盒不可育，雌、雄配子随机结合后，获得的子代中ipel雄性不育系（ipe1/ipe1-基因盒）所占比例为1×1/2=1/2。 （4） 若向丙和丁中与籽粒颜色有关基因所在的染色体各导入一个基因盒子，对于杂交时将做父本的丁（ccpp）来说，无论这一个基因盒子导入C/c这一条染色体还是P/p这一条染色体，最终都只能产生一种cp的雄配子。 对于杂交时将做母本的丙（CCPP）来说（1）若导入的一个基因盒子在C/c这条染色体上，则丙（CC-基因盒PP）可产生CP，C-基因盒P，两种雌配子，则和构建好的丁杂交出来的F1是CcPp：C-基因盒cPp=1:1,让F1自交产生子代：CcPp自交满足9：3:3;1的变式，即紫色：非紫色=9:7，C-基因盒cPp自交，雄配子有cP,cp两种，雌配子有C-基因盒P，C-基因盒p,cP,cp四种，雌雄配子随机结合，子代紫色：非紫色=3:5，因此F2紫色：非紫色=9+3:7+5=1:1。（2）若导入的一个基因盒子在P/p这条染色体上，则丙（CCPP-基因盒）可产生CP，CP-基因盒，两种雌配子，则和构建好的丁杂交出来的F1是CcPp：CcP-基因盒p=1:1,让F1自交产生子代：CcPp自交满足9：3:3;1的变式，即紫色：非紫色=9:7，CcP-基因盒p自交， 雄配子有Cp,cp两种 ，雌配子有CP-基因盒，Cp,cP-基因盒，cp四种，雌雄配子随机结合，子代紫色：非紫色=3:5,因此F2紫色：非紫色=9+3:7+5=1:1。 综上，F2紫色：非紫色=1:1。 试卷第1页，共3页 2 / 2 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$