专题04 基因工程（河南专用）-【好题汇编】备战2024-2025学年高二生物下学期期末真题分类汇编（福建专用）

专题04 基因工程 一、单选题 1．（23-24高二下·河南周口·期末）利用PCR方法克隆水通道蛋白的基因P。基因P的部分序列如下图，请从①―④中选择扩增P基因的合适引物组合（    ） 5'-GAAGTCCTCT--------------ACGACGAACC-3' 3'-CTTCAGGAGA--------------TGCTGCTTGG-5' ①5'-GAAGTCCTCT-3'②3'-TGCTGCTTGG-5'③3'-CTTCAGGAGA-5'④5'-ACGACGAACC-3' A．①② B．①③ C．②③ D．②④ 2．（23-24高二下·河南开封·期末）将含目的基因的表达载体导入棉花细胞，我国科学家独创的方法是（    ） A．电融合法 B．花粉管通道法 C．农杆菌转化法 D．显微注射法 3．（23-24高二下·河南商丘·期末）“工欲善其事，必先利其器”，基因工程需用到多种工具。下列关于基因工程的基本工具的说法，错误的是（　　） A．限制酶主要从原核生物中分离纯化 B．限制酶将DNA分子水解为脱氧核糖核苷酸 C．被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行人工改造的 D．动植物病毒、噬菌体也可以用作基因工程中的载体 4．（23-24高二下·河南新乡·期末）腈水合酶（N0）是一类可以催化腈类物质转化成相应酰胺类物质的酶，能作为催化剂应用于有机物合成的工艺，但其不耐高温。在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1）。下列叙述错误的是（　　） A．N1与N0的结构不同与氨基酸的种类、数量和排列顺序不同有关 B．插入连接肽后，N0发生了不可逆的蛋白质变性，从而失去活性 C．连接肽的加入可通过改造N0的基因来实现 D．若要检测N1的热稳定性，则可在高温下检测其催化效率 5．（23-24高二下·河南新乡·期末）在植物组织培养过程中导入超氧化物歧化酶（SOD）基因，可培育出能够产生SOD的植物新品种，如图所示。由于SOD具有催化超氧阴离子自由基形成H2O2的能力，因此其可增强植物的抗逆性。下列叙述错误的是（　　）    A．该新品种培育的过程利用了基因工程和细胞工程技术 B．生长素和细胞分裂素的浓度、用量比例会影响②和③ C．SOD基因不需要构建基因表达载体，可直接转入农杆菌中 D．胚状体到新品种植株的过程要先育苗后移栽到土壤中 6．（23-24高二下·河南南阳·期末）通过任何一项技术获得的胚胎，都必须移植给受体才能获得后代。下列有关叙述错误的是（    ） A．胚胎移植前，对受体动物进行同期发情处理，使其与供体生理状态相同 B．转基因动物培育过程中，通过显微注射法将基因表达载体导入受精卵 C．克隆动物培育中，将动物供体细胞注入体外培养到MⅡ期的卵母细胞中 D．试管动物培育中使用的生物技术有体外受精、体外胚胎培养、胚胎移植等 7．（23-24高二下·河南洛阳·期末）棉蚜虫体内有多种寄生蜂的卵。现利用PCR技术对棉蚜虫及其体内寄生蜂种类进行检测，为了一次鉴定出多种目标昆虫，加入同一PCR体系的引物应满足的条件是（    ） ①每对引物扩增的序列对应一种昆虫②每对引物扩增的序列对应多种昆虫③每对引物扩增的产物长度不同④每对引物扩增的产物长度相同⑤所有引物之间不能相互配对⑥所有引物的长度相同 A．①③⑤ B．②④⑥ C．②③⑥ D．①④⑤ 8．（23-24高二下·河南洛阳·期末）四种限制酶的切割位点如图所示，下列相关叙述错误的是（    ） A．限制酶主要是从原核生物中分离纯化而来的 B．DNA连接酶和DNA聚合酶都是催化磷酸二酯键形成的酶 C．SmaI、EcoRV切割后产生的DNA片段之间能用T4DNA连接酶连接 D．EcoRI、PstI切割后产生的DNA片段之间能用E·coliDNA连接酶连接 9．（23-24高二下·河南三门峡·期末）乳酸菌无氧呼吸过程产生的丙酮酸会在LDH酶的催化下产生乳酸，如图所示。由于工业需求，需要利用苯丙酮酸生产①处基团体积更大的苯乳酸。因此科研人员拟改造LDH的结构，使其成为能生产苯乳酸的mLDH。改造思路是改变LDH编码基因的序列，使其编码的蛋白质第52位的酪氨酸替换为亮氨酸，使得活性中心增大，以容纳更大的基团 下列说法错误的是（    ） A．上述改造过程属于蛋白质工程技术，mLDH编码基因原本不存在于自然界中 B．应测定改造所得mLDH生产苯乳酸的能力 C．根据mRNA反推的mLDH编码基因只有一种碱基序列 D．蛋白质工程的操作对象是基因，是在基因水平上进行核苷酸的增减、替换等 10．（23-24高二下·河南三门峡·期末）干扰素是动物体内的一种蛋白质，可以用于治疗病毒感染性疾病和癌症，但在体外保存相当困难。如图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图。据图分析，下列叙述不正确的是（    ） A．图中构建新的干扰素模型的主要依据是预期的蛋白质功能 B．图中各项技术并没有涉及基因工程技术 C．图中改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结构 D．图中新的干扰素基因必须加上启动子和终止子才能表达 11．（23-24高二下·河南濮阳·期末）下列关于基因工程技术的叙述，正确的是（    ） A．基因工程的操作水平属于分子水平，其原理为基因突变 B．PCR中为了实现目的基因DNA的解旋，需要加入解旋酶 C．载体质粒上通常有抗生素抗性基因作为标记基因，以便于重组质粒的筛选 D．构建基因表达载体时，目的基因必须位于启动子和终止子之间才能进行复制 二、解答题 12．（23-24高二下·河南南阳·期末）从健康人的血浆中分离提取的人血清白蛋白（HSA）在临床上需求量很大，具有重要的医用价值。下图是通过基因工程技术获取重组HSA示意图，其中报告基因表达的产物能催化无色物质K呈现蓝色。据图回答下列问题： (1)若要体外获得大量的人血清白蛋白基因，可采用PCR 技术。该技术的前提是要根据一段已知目的基因的 设计引物，PCR的原料是 。 (2)过程①中需将植物细胞与农杆菌混合后共同培养， 旨在让T-DNA 进入植物细胞；除尽农杆菌后，还须转接到含 的培养基上筛选出转化的植物细胞。 (3)为检测HSA基因的表达情况，可提取受体细胞的蛋白质，用 进行抗原一抗体杂交实验。 (4)科学家培养出一种转基因山羊，其膀胱上皮细胞可以合成人血清白蛋白并分泌到尿液中。其培育方法中将重组质粒通过 法导入山羊的受体细胞时，常选用受精卵作为受体细胞的主要原因是 。人血清白蛋白基因能在山羊膀胱上皮细胞中表达的原因是 。 一、单选题 1．（23-24高二下·河南信阳·期末）研究人员用EcoRI和SmaI两种限制酶处理某DNA分子，图1为EcoRI切割该DNA分子后的结果；图2是酶切后的凝胶电泳图谱，其中1号泳道是DNAMarker（标准参照物），2号、3号、4号分别是EcoRI单独处理、SmaI单独处理、两种酶共同处理后的电泳结果。下列相关叙述错误的是（    ） A．据图1可知EcoRI的识别序列为3'—GAATTC—5',切割位点在G和A之间 B．据图2可知琼脂糖凝胶的加样孔在A端，参照1号泳道，可估计样品DNA大小 C．据图2可知该DNA分子可能是含1000个碱基对的环状DNA D．据图2可知该DNA分子中两种限制酶的酶切位点可能各有一个 2．（23-24高二下·河南许昌·期末）下图是“DNA 的粗提取和鉴定”实验中几个重要操作的示意图，下列叙述错误的是（    ） A．实验的操作顺序是③②①④ B．图①的原理是DNA不溶于酒精，而某些蛋白质可溶于酒精 C．图④用到的 NaCl溶液浓度为2mol/L D．图④操作后加入二苯胺试剂充分振荡即可观察到颜色变蓝 3．（23-24高二下·河南南阳·期末）通过转Bt基因技术获得抗虫棉是我国科学家的重大科研成果。下列有关转Bt基因技术的叙述，错误的是（    ） A．可以利用PCR技术获取Bt基因，或从分子水平上检测Bt基因是否转录 B．构建基因表达载体是核心步骤，基因表达载体必须包含启动子、终止子等 C．可以利用农杆菌转化法，将插入T-DNA中的Bt基因转移到棉花细胞染色体上 D．若某抗虫棉仅一条染色体上插入一个Bt基因，则该植株自交后代抗虫个体占1/2 4．（23-24高二下·河南洛阳·期末）苏云金芽孢杆菌中的杀虫晶体蛋白Cry具有杀虫毒性，但Cry蛋白存在杀虫谱窄、毒力有限等问题，制约了其在农业生产中的进一步应用。科学家通过定点突变，将Cry蛋白第168位的组氨酸替换为精氨酸后，Cry蛋白对烟草天蛾的毒性提高了3倍；将Cry蛋白第282位、第283位的丙氨酸和亮氨酸分别替换成甘氨酸和丝氨酸后，Cry蛋白对舞毒蛾的毒性提高了7倍。下列相关叙述不正确的是（    ） A．对Cry蛋白的改造是通过改造编码Cry蛋白的基因来实现的 B．与基因工程相比，蛋白质工程的实现也需要构建基因表达载体 C．蛋白质工程难度较大，主要是蛋白质发挥功能所依赖的高级结构十分复杂 D．如果将第168、282、283位的氨基酸全部替换，Cry蛋白对舞毒蛾的毒性将增加21倍 5．（23-24高二下·河南三门峡·期末）如图是将人的生长激素基因导入细菌B制造“工程菌”的示意图。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。判断下列说法错误的是（    ）    A．将重组质粒导入细菌B常用的方法是Ca+处理法 B．将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的只是导入了质粒A的细菌 C．将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的既有导入普通质粒A的细菌又有导入重组质粒的细菌 D．目的基因成功表达的标志是受体细胞能在含氨苄青霉素的培养基上生长 6．（23-24高二下·河南三门峡·期末）CRISPR/Cas9是一种生物学工具，能够通过“剪切和粘贴”脱氧核糖核酸（DNA）序列的机制来编辑基因组。这套系统源自细菌的防御机制，是一种对任何生物基因组均有效的基因编辑工具。CRISPR-Cas9基因组编辑系统由向导RNA（也叫sgRNA）和Cas9蛋白组成向导RNA识别并结合靶基因DNA，Cas9蛋白切断双链DNA形成两个末端。这两个末端通过“断裂修复”重新连接时通常会有个别碱基对的插入或缺失，从而实现基因敲除，如图所示。CRISPR-Cas9基因组编辑技术有时存在编辑出错而造成脱靶。下列叙述错误的是（    ）    A．对不同目标DNA进行编辑时，使用Cas9蛋白和“不同”的sgRNA进行基因编辑 B．Cas9蛋白相当于限制酶，能作用于脱氧核糖和碱基之间的化学键 C．CRISPR-Cas9基因组编辑系统使细菌获得抵抗噬菌体的能力 D．可能其他DNA序列含有与sgRNA互补配对的序列，造成sgRNA错误结合而脱靶 7．（23-24高二下·河南三门峡·期末）为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（    ） A．①+③ B．③+④ C．③+② D．①+④ 8．（23-24高二下·河南三门峡·期末）如图为形成cDNA过程和PCR扩增过程示意图。据图分析，下列说法不正确的是（    ） A．③④⑤过程分别为变性、复性和延伸阶段 B．催化②⑤过程的酶都是DNA聚合酶，⑤中DNA聚合酶能耐高温 C．①过程需要的是RNA聚合酶 D．④过程需要冷却至50℃左右 9．（23-24高二下·河南三门峡·期末）一种双链DNA分子被三种不同的限制酶切割，切割产物通过电泳分离，用大小已知的DNA片段的电泳结果作为分子量标记（图左边一列）。关于该双链DNA，下列说法错误的是（    ）    A．呈环状结构 B．其NotI切点与EcoRI切点的最大距离为2kb C．有一个NotI和两个EcoRI切点 D．分子质量大小为10kb 10．（23-24高二下·河南三门峡·期末）某学校生物兴趣小组进行DNA的粗提取与鉴定实验，下列相关叙述正确的是（    ） A．预冷的酒精溶液可用来进一步纯化粗提取的DNA B．与鸡血相比，等体积的猪血提取DNA的量较高 C．向菜花组织中加入蒸馏水并搅拌可以释放核DNA D．将白色丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液后加入二苯胺试剂，混匀后呈蓝色 11．（23-24高二下·河南三门峡·期末）研究表明，肌肉萎缩性侧索硬化症（俗称“渐冻症”），是由于基因突变导致神经元合成了某种毒蛋白，从而阻碍了轴突内营养物质的流动；利用诱导多功能干细胞（iPS细胞）分化的前驱细胞，移植给渐冻症实验鼠，能延长其寿命。下列相关描述错误的是（    ） A．诱导多能干细胞和胚胎干细胞全能性都很高，都属于成体干细胞 B．可借助载体将特定基因导入成纤维细胞诱导形成iPS细胞 C．植入神经干细胞，使受损的运动功能得到恢复，可以一定程度改善“渐冻症” D．可通过DNA分子杂交技术，对渐冻症进行基因诊断 12．（23-24高二下·河南南阳·期末）下列关于 PCR 扩增DNA 片段及电泳鉴定的叙述，正确的有（　　） A．PCR 反应中，复性阶段需要DNA 聚合酶连接磷酸二酯键 B．PCR 进行n个循环所需消耗的引物共2ⁿ个 C．电泳时，DNA 分子在凝胶中的迁移速率与DNA 的大小和构象等有关 D．电泳时，将PCR 产物、核酸染料和电泳指示剂混合后注入凝胶加样孔 二、解答题 13．（23-24高二下·河南安阳·期末）绿色荧光蛋白（GFP）是由238个氨基酸组成的单体蛋白，在蓝光诱导下会发光，可用于直接观察细胞中的活动。实验小组以质粒pMUTIN-gfp+为模板扩增gfp+基因，将其与质粒pMV24构建了重组质粒pMV24-gfp+，并在木葡糖酸醋杆菌中进行表达，证明其可作为选择标记用于今后的研究，重组质粒的构建过程如图所示。请回答下列问题： 注：AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，EcoRⅠ、XbaI、PvuⅡ表示三种限制酶。 (1)利用PCR扩增目的基因时，每个循环依次经过 三个阶段，扩增过程中需在缓冲液中添加一定浓度的Mg2+，Mg2+的作用是 。 (2)以质粒pMUTIN-gfp+为模板扩增gfp+基因时，应当在引物的 （填“5′”或“3′”）端添加 两种限制酶的识别序列。用不同的限制酶切割目的基因和载体的原因是 （答出两点）。 (3)重组质粒上的AmpR基因是一种标记基因，其作用是 ，AmpR基因能作为标记基因的前提条件是木葡糖酸醋杆菌中 （填“含有”或“不含”）AmpR基因。若要进一步检测重组质粒是否构建成功，可以用限制酶切割重组质粒，并用 法分离不同的DNA片段。 14．（23-24高二下·河南信阳·期末）易错PCR是利用低保真的TaqDNA聚合酶和改变PCR的反应条件，降低DNA复制的准确性，在新DNA链的合成过程中增加碱基错配率，从而使扩增产物出现较多点突变的一种体外诱导DNA序列变异的方法。研究发现，自然界中的生物体内分离得到的天然酶，在工业生产环境中催化效率往往较低。下图是研究人员利用易错PCR技术对某种天然酶进行改造，获得了高催化效率的酶的流程示意图。回答下列问题： (1)在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是 。 (2)图中步骤②一般要先用Ca2+处理受体菌，使细胞处于 的生理状态。成功导入重组质粒的受体菌不一定能表达出相应的突变酶，原因之一可能是 无法识别和结合突变基因的启动子。 (3)TaqDNA聚合酶的某一区域负责将碱基与模板链正确地互补配对，Mn2+可以降低这一功能；非互补的碱基对由于氢键不易形成，稳定性差，Mg2+可以提高该错配区的稳定性。因此，与普通PCR相比，易错PCR的反应体系中应适当 （填“提高”或“降低”）Mn2+浓度、 （填“提高”或“降低”）Mg2+浓度。 (4)从变异的类型和方向方面分析，通过易错PCR技术改造天然酶基因与通过蛋白质工程改造天然酶基因的相同点是 ;不同点是 。 15．（23-24高二下·河南驻马店·期末）某动物体内含有研究者感兴趣的目的基因，研究者欲将该基因导入大肠杆菌的质粒中保存。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因（AmpR），LacZ基因及一些酶切位点，其结构和简单的操作步骤如下图所示。 请根据以上信息回答下列问题。 (1)可以利用PCR在体外扩增该目的基因的DNA片段，其原理为 ；PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，还需要加入与两条模板链结合的两种引物，引物的作用为 。 (2)进行步骤②时一般选择 （填“同种”或“不同种”）限制酶来切割质粒和含有目的基因的DNA，但该方法处理后构建的目的基因表达载体有时会因 而出现目的基因在受体细胞中不能表达的情况。 (3)进行步骤④时，研究人员需要先用 处理大肠杆菌细胞，再将重组质粒导入大肠杆菌细胞中。 (4)⑤培养基中除了加入大肠杆菌所必需的营养物质外，还需要加入 ，含有重组质粒的大肠杆菌形成的菌落为 色，原因是： 。 (5)在基因工程中使用的载体除质粒外还有 等。 16．（23-24高二下·河南开封·期末）PCR是聚合酶链式反应的缩写，常用于特异性地快速扩增目的基因，应用广泛。回答下列问题。 (1)研究人员将PCR扩增得到的毒物诱导型启动子S（箭头表示转录方向）插入图中载体P区构建表达载体，转入大肠杆菌以获得能够检测水中毒物的大肠杆菌。根据启动子方向以及终止子位置，PCR扩增启动子S时，图中引物I、Ⅱ应分别加入限制酶 的识别序列。 (2)利用PCR方法克隆某蛋白质的基因（部分序列如图）。扩增该基因的合适引物组合是 。通过引物的设计， （填“能”或“不能”）做到选择性扩增DNA片段。 5′——GAAGTC……CGAACC——3′ 3′——CTTCAG……GCTTGG——3′ (3)实时荧光RT-PCR是以提取的RNA为模板，经逆转录获得与之互补的DNA（cDNA）序列，再以cDNA序列为模板进行目的片段的扩增（具体过程如图所示）。利用RT-PCR技术提高检测某些微量RNA病毒的灵敏度，其原因是 。 (4)利用重叠延伸PCR技术改造目的基因的原理如下图所示。进行重叠延伸时，上链和下链在突变位点处的碱基序列互补，能起到引物2、3的作用，因此 （填“需要”或“不需要”）另加引物，即可得到进行PCR3筛选的突变产物。图示过程实现的基因序列改变属于基因突变， （填“有”或“没有”）发生基因重组。 17．（23-24高二下·河南商丘·期末）如图是利用基因工程生产生长激素的流程图，PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ代表相关的限制酶（产生的黏性末端不同），Amp+指氨苄青霉素抗性基因。回答下列问题： (1)对cDNA进行PCR扩增利用了 的原理，除加入引物和模板DNA外，一般还需要加入 ；产物经凝胶电泳后，发现有多条扩增带（其中也包含目的基因片段），在不改变引物、PCR扩增体系和模板量的情况下，可采用 的方法，特异性扩增目的基因片段。 (2)研究人员对扩增出的cDNA片段进行了序列测定，序列信息见下图，推测其最多可以编码 个氨基酸的多肽（终止密码子为UAA/UAG/UGA）。在多肽合成过程中，tRNA“搬运”氨基酸到核糖体上，氨基酸结合部位在tRNA的 端。写出PCR 扩增转录的模板链的引物为 （写出前面的10个碱基序列）。 (3)采用双酶切对目的基因的DNA片段和质粒进行处理，根据图示所采用的限制酶是 。选择两种酶切割的优点是 。 18．（23-24高二下·河南漯河·期末）玉米的祖先——野生玉米，名叫“大刍草”，经过9000多年人工驯化，被改造成现代玉米。我国中科院科学家经过长达10年不懈努力，从野生玉米“大刍草”中，成功找回玉米人工驯化过程中丢失的一个控制高蛋白含量的优良基因THP9，克隆出来并将此高蛋白基因转移到玉米细胞内，获得了转基因高蛋白玉米新品种。某种质粒和含THP9基因的DNA片段如图所示，箭头表示限制酶及其切割位点，表格中为5种限制酶的识别序列及切割位点。回答下列问题： EcoR Ⅰ BamH Ⅰ Kpn Ⅰ Mfe Ⅰ Hind Ⅲ 5'-G↓AATTC-3' 3'-CTTAA↑G-5' 5'-G↓GATCC-3' 3'-CCTAG↑G-5' 5'-G↓GTACC-3' 3'-CCATG↑G-5' 5'-C↓AATTG-3' 3'-GTTAA↑C-5' 5'-A↓AGCTT-3' 3'-TTCGA↑A-5' (1)将THP9基因导入受体细胞前，利用PCR技术进行扩增。PCR技术的原理是 。在PCR扩增仪中要加入缓冲液、 （答出2点）等。若在PCR扩增仪中加入模板DNA分子2个，经过30次循环后，则DNA分子数量将达到 个。 (2)构建基因表达载体时，若科研人员需将THP9基因整合到质粒上，如图，已知图中THP9基因转录方向为从左往右，应使用限制酶 切割如图中质粒，使用限制酶 切割图中含THP9基因的DNA片段，以获得能正确表达THP9基因的重组质粒。 (3)为了鉴别受体细胞中是否含有THP9基因，可用含 （填“氨苄青霉素”、“卡那霉素”、“四环素”或“链霉素”）的培养基进行初步筛选。为了检测转基因技术是否成功，科研 工作者还需进行个体生物学的鉴定，鉴定方法是 。 19．（23-24高二下·河南许昌·期末）野生玉米“大刍草”经过9000多年人工驯化，被改造成现代玉米。我国中科院科学家经过不懈努力，从野生玉米中成功找回玉米人工驯化过程中丢失的一个控制高蛋白含量的优良基因THP9，并将此高蛋白基因转入玉米细胞内，获得了转基因高蛋白玉米新品种。构建基因表达载体时，科研人员需将THP9基因整合到质粒上（如图）。回答下列问题： EcoRⅠ BamHⅠ KpnI Mfe I HindⅢ (1)构建基因表达载体时，为获得能正确表达THP9 基因的重组质粒，应选择限制酶 切割质粒，选择限制酶 切割图中含 THP9基因的 DNA 片段。不能用限制酶 KpnI和 HindⅢ切割质粒和含 THP9基因的 DNA 片段,原因是 。 (2)采用农杆菌转化法将优良基因THP9导入玉米细胞中，在含氨苄青霉素的培养基上培养获得的菌落不一定含有重组质粒，原因是     。 20．（23-24高二下·河南南阳·期末）利用某目的基因（图1，图中黑色部分表示目的基因）和P1噬菌体载体（图2）构建重组DNA（图3），再将其导入大肠杆菌。部分限制酶的识别序列及切割位点如下：BglⅡ（5-A↓GATCT-3'），EcoRⅠ(5'-G↓AATTC-3'）和Sa3A1（5'-↓GATC-3'）回答下列问题： (1)该目的基因以 （填“a”或“b”）链为转录模板。重组DNA中的启动子是 （填“甲”或“乙”）。 (2)限制酶BglⅡ和Sau3AⅠ的切割产物可以相互连接，原因是 ；该连接物能否再被BglⅡ切割？ （填“能”“不能”或“不一定”）。为保证目的基因和质粒正向连接，应用限制酶 切割目的基因和P1噬菌体载体，再用 酶处理，即可得到图3的重组DNA。 (3)为了检测目的基因是否在大肠杆菌中稳定存在，从受体细胞中提取总DNA，可以设计引物 （填图1中的引物编号）进行PCR，理由是 。 21．（23-24高二下·河南·期末）THP9基因是野生玉米中控制高蛋白含量的优良基因，研究者利用基因工程技术将THP9基因转到玉米细胞内，从而获得转基因高蛋白玉米新品种。回答下列问题：    EcoRⅠ BamHⅠ KpnⅠ MfeⅠ HindⅢ 5'-G↓AATTC-3' 3'-CTTAA↑G-5' 5'-G↓GATCC-3' 3'-CCTAG↑G-5' 5'-G↓GTACC-3' 3'-CCATG↑G-5' 5'-C↓AATTG-3' 3'-GTTAA↑C-5' 5'-A↓AGCTT-3' 3'-TTCGA↑A-5' (1)PCR过程中需要添加缓冲液，缓冲液中的 可激活DNA聚合酶。若采用PCR技术对一个THP9基因进行扩增，则第n代复制共需要引物 个，PCR依据的原理是 。 (2)THP9基因游离的磷酸基团侧为 （填“5'”或“3'”）端，已知图中THP9基因转录方向为从左往右，则THP9基因转录时的模板链是 链。 (3)构建基因表达载体时，若科研人员需将THP9基因整合到如图质粒上，应使用限制酶 切割图中质粒，使用限制酶 切割图中含THP9基因的DNA片段，以获得能正确表达THP9基因的重组质粒。 (4)将THP9基因导入农杆菌中，在含氨苄青霉素的培养基上培养获得的菌落不一定含有重组质粒，原因是 。将从新鲜玉米叶片上取下的圆形小片与已成功导入THP9基因的农杆菌共同培养，筛选转化细胞并培育成转基因植株。欲从个体水平检测转基因玉米是否培育成功，实验方法是 。 22．（23-24高二下·河南平顶山·期末）半夏球茎中的半夏蛋白是一种植物凝集素。该蛋白主要包含了半夏胰蛋白酶抑制剂和半夏凝集素，具有凝血和凝集细胞的生物活性，还具有抑菌、抗肿瘤和抗早孕等作用。半夏蛋白能够专一地与甘露糖及其缀合物结合，但不能与半乳糖、岩藻糖、葡萄糖及其聚合糖结合。科学家利用转基因技术使大肠杆菌（对氨苄青霉素敏感）具有产生半夏蛋白的功能。请回答下列问题： (1)在一定温度下，DNA遇 试剂会呈现蓝色，因此该试剂可鉴定DNA。目的基因指的是 的基因。 (2)如图表示科研人员构建重组质粒时用到的质粒和半夏蛋白基因，其中LacZ基因控制合成的酶可以分解无色的X-gal，产生蓝色物质。    ①从半夏体内分离出含半夏蛋白基因的DNA后，利用PCR技术大量扩增半夏蛋白基因，需要知道 ，以便合成引物。据图分析合成引物时，与目的基因左侧、右侧分别配对的引物5′端应添加限制酶 、 的识别序列。常采用 法来鉴定PCR产物。 ②将处理后的大肠杆菌接种到含有氨苄青霉素和X-gal的固体培养基上，若有蓝色菌落出现，则说明 。 23．（23-24高二下·河南濮阳·期末）传统的木薯乙醇发酵工艺所使用的普通酿酒酵母缺乏水解淀粉的酶系，需要经过蒸煮、液化、糖化等工序将木薯中的淀粉水解成葡萄糖后才能用于酵母菌发酵。为了提高制备乙醇的效率，研究者欲通过基因工程获得能够高效表达和分泌淀粉酶的重组酿酒酵母。请回答下列问题： (1)若要利用从细菌中获得的含淀粉酶基因（amy）的DNA片段为模板，则通过PCR技术获得大量amy时，还需要在缓冲液中添加引物、4种脱氧核苷酸、 、镁离子等，需要添加引物的原因是 ；扩增 轮后能得到含目的基因的等长的DNA双链序列。 (2)研究发现，如果amy上特定位置的GTG（位置如图1）突变为ATG，淀粉酶的活性将大大提高。为了通过PCR引入该定点突变，获得高效的淀粉酶，需要如何设计PCR引物？ 。    (3)用限制酶BamHI与SpeI切割含amy的DNA片段和载体pScIKP，然后将amy与载体相连接，构建重组质粒pSc-amy。对pScIKP和目的基因采用双酶切的目的是 。 (4)已知淀粉遇碘变蓝，而葡萄糖遇碘无此现象。为了分离出能够高效表达淀粉酶基因的重组酵母，可使用含 的培养基。培养3天后，用碘熏蒸染色，结果如图2所示。若你是研究者，将选择菌落 （填数字）进行扩大培养，原因是 。    24．（23-24高二下·河南新乡·期末）红色荧光蛋白（RFP）常作为检测目的基因是否表达的标记物。研究人员将RFP基因与目的基因（序列如图2所示）构建为融合基因，然后导入靶细胞中使其表达为一条多肽。回答下列问题： (1)通过PCR扩增目的基因时，需要设计一对引物，引物的功能是 。根据图2中目的基因的碱基序列分析，研究人员设计的下列几种引物中可用来扩增目的基因的是 。 ①    ② ③    ④ (2)将融合基因导入受体细胞时，需要构建基因表达载体。构建基因表达载体时需要使用 来切割融合基因和质粒，然后再使用 来连接两者。 (3)据图1分析，该融合基因在受体细胞中翻译时RFP与目的蛋白合成的顺序是 ，因此在连接两个基因时需要去除目的基因序列中决定 的部分和RFP基因序列中决定 的部分，这样翻译出来的才是一条肽链（后两空填“起始密码子”或“终止密码子”）。 (4)将融合基因导入受体细胞后，若动物细胞中出现 ，则说明目的基因成功表达。若需要进一步确定目的基因是否表达出蛋白质，则可用 法进行检测。 三、实验题 25．（23-24高二下·河南洛阳·期末）锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。通过基因工程可对锌吸收缺陷型酵母进行转化。回答下列问题。 (1)在基因工程操作时，若要从该植物体中提取锌转运蛋白的mRNA，常选用幼根而不选用老根作为实验材料，原因是 ；提取RNA时，提取液中需要添加RNA酶抑制剂，其目的是 ；以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是 。 (2)以cDNA为模板，利用PCR扩增并筛选锌转运蛋白基因，为便于锌转运蛋白基因与质粒连接，需在引物的 端加上限制酶识别序列，且常在两条引物上设计加入不同的限制酶识别序列，主要目的是 。 (3)为保证锌转运蛋白基因的表达，可将其插入到酵母菌质粒的 之间。 (4)为鉴定转化酵母是否赋予锌吸收特性，可通过配制含适量Zn2+的（酵母菌）固体培养基、灭菌，分成a、b两半区域，a、b区分别涂布少量缺陷型酵母和转化酵母，已知锌吸收缺陷型酵母菌增殖速度较慢，在适宜条件下培养一段时间后，若 ，则证明有转化成功的酵母。 26．（23-24高二下·河南南阳·期末）某抗膜蛋白治疗性抗体药物研发过程中，需要表达N蛋白胞外段，制备相应的单克隆抗体，增加其对N蛋白胞外段特异性结合的能力。N蛋白胞外段抗原制备的流程如图1所示。回答下列问题： (1)用PCR 技术扩增N蛋白胞外段基因，需要设计一对 ，从而使DNA 聚合酶能从该物质的 （填“3'”或“5'”）端连接脱氧核苷酸。 (2)已知质粒属于非脂溶性的分子，用脂质体将重组慢病毒质粒导入病毒包装细胞，质粒最可能被包在脂质体的 （填“双分子层中”或“两层磷脂分子之间”）。 (3)用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化N蛋白胞外段。制备N蛋白胞外段单克隆抗体的流程如图2所示。 ①制备单克隆抗体的操作中，用N蛋白胞外段多次对小鼠进行免疫，目的是 。常用灭活的仙台病毒诱导B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，灭活病毒发挥作用的原理是 。 ②用选择培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到96孔板，进行 培养。用 技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生N蛋白胞外段抗体，又能大量增殖的单克隆杂交瘤细胞株，经体外扩大培养后提取单克隆抗体。 / 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$ 专题04 基因工程 一、单选题 1．（23-24高二下·河南周口·期末）利用PCR方法克隆水通道蛋白的基因P。基因P的部分序列如下图，请从①―④中选择扩增P基因的合适引物组合（    ） 5'-GAAGTCCTCT--------------ACGACGAACC-3' 3'-CTTCAGGAGA--------------TGCTGCTTGG-5' ①5'-GAAGTCCTCT-3'②3'-TGCTGCTTGG-5'③3'-CTTCAGGAGA-5'④5'-ACGACGAACC-3' A．①② B．①③ C．②③ D．②④ 【答案】A 【分析】利用PCR技术扩增目的基因的原理是DNA复制，PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3＇端通过碱基互补配对结合。 【详解】在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的， PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合，故引物分别为①②，不是③④，A符合题意。 故选A。 2．（23-24高二下·河南开封·期末）将含目的基因的表达载体导入棉花细胞，我国科学家独创的方法是（    ） A．电融合法 B．花粉管通道法 C．农杆菌转化法 D．显微注射法 【答案】B 【分析】将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 【详解】A、电融合法可用于将含目的基因的表达载体导入棉花细胞，但是不是我国独创的，A不符合题意； B、花粉管通道法是我国科学家独创的一种方法，是一种十分简便经济的方法，我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的，B符合题意； C、农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞常用的方法，约80%的转基因植物都是用这种方法获得的，但是不是我国独创的，C不符合题意； D、显微注射技术是将目的基因导入动物细胞的常用方法，D不符合题意。 故选B。 3．（23-24高二下·河南商丘·期末）“工欲善其事，必先利其器”，基因工程需用到多种工具。下列关于基因工程的基本工具的说法，错误的是（　　） A．限制酶主要从原核生物中分离纯化 B．限制酶将DNA分子水解为脱氧核糖核苷酸 C．被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行人工改造的 D．动植物病毒、噬菌体也可以用作基因工程中的载体 【答案】B 【分析】限制酶能够识别DNA中特定的核苷酸序列，切割的部位是核苷酸之间的磷酸二酯键，从而将DNA分子切成两段，出现黏性末端或平末端。 【详解】A、限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，能够识别双链DNA分子中的某种特定的核苷酸序列，A正确； B、限制酶是将DNA分子特定部位的磷酸二酯键断开，产生DNA片段，B错误； C、在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，C正确； D、基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等，D正确。 故选B。 4．（23-24高二下·河南新乡·期末）腈水合酶（N0）是一类可以催化腈类物质转化成相应酰胺类物质的酶，能作为催化剂应用于有机物合成的工艺，但其不耐高温。在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1）。下列叙述错误的是（　　） A．N1与N0的结构不同与氨基酸的种类、数量和排列顺序不同有关 B．插入连接肽后，N0发生了不可逆的蛋白质变性，从而失去活性 C．连接肽的加入可通过改造N0的基因来实现 D．若要检测N1的热稳定性，则可在高温下检测其催化效率 【答案】B 【分析】1、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。 2、蛋白质工程的基本思路：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因，获得所需要的蛋白质。 【详解】A、在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1），因此N1与N0的结构不同与氨基酸的种类、数量和排列顺序不同有关，A正确； B、插入连接肽后，N0并没有发生变性，且依旧有活性，B错误； C、由N0变为N1属于蛋白质工程，可通过改造N0的基因来实现，C正确； D、若要检测N1的热稳定性，则可在高温下检测其催化效率，D正确。 故选B。 5．（23-24高二下·河南新乡·期末）在植物组织培养过程中导入超氧化物歧化酶（SOD）基因，可培育出能够产生SOD的植物新品种，如图所示。由于SOD具有催化超氧阴离子自由基形成H2O2的能力，因此其可增强植物的抗逆性。下列叙述错误的是（　　）    A．该新品种培育的过程利用了基因工程和细胞工程技术 B．生长素和细胞分裂素的浓度、用量比例会影响②和③ C．SOD基因不需要构建基因表达载体，可直接转入农杆菌中 D．胚状体到新品种植株的过程要先育苗后移栽到土壤中 【答案】C 【分析】植物组织培养过程是：离体的植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织，然后再分化生成根、芽，最终形成植物体。植物组织培养依据的原理是植物细胞的全能性。 【详解】A、由题意可知，该育种过程中，①运用了基因工程，②③等过程运用了细胞工程，最后通过植物细胞培育出新品种个体，体现了植物细胞的全能性，A正确； B、②③表示脱分化和再分化过程，脱分化和再分化对生长素和细胞分裂素的浓度、用量比例要求不同，生长素和细胞分裂素的浓度、用量比例会影响脱分化和再分化，B正确； C、SOD基因需要构建基因表达载体后才能转入农杆菌中，利用农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上，C错误； D、胚状体到新品种植株的过程需育苗，并将试管苗移栽到经消毒过的培养基中生活一段时间，等幼苗长壮后再移栽到土壤中，D正确。 故选C。 6．（23-24高二下·河南南阳·期末）通过任何一项技术获得的胚胎，都必须移植给受体才能获得后代。下列有关叙述错误的是（    ） A．胚胎移植前，对受体动物进行同期发情处理，使其与供体生理状态相同 B．转基因动物培育过程中，通过显微注射法将基因表达载体导入受精卵 C．克隆动物培育中，将动物供体细胞注入体外培养到MⅡ期的卵母细胞中 D．试管动物培育中使用的生物技术有体外受精、体外胚胎培养、胚胎移植等 【答案】C 【分析】1、胚胎移植的生理基础：（1）供体与受体相同的生理变化，为供体的胚胎植入受体提供了相同的生理环境；（2）胚胎在早期母体中处于游离状态，这就为胚胎的收集提供了可能；（3）子宫不对外来胚胎发生免疫排斥反应，这为胚胎在受体内的存活提供了可能；（4）胚胎遗传性状不受受体任何影响。 2、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建；（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、胚胎移植前，为使供体与受体相同的生理变化，为供体的胚胎植入受体提供了相同的生理环境，需对受体动物进行同期发情处理，使其与供体生理状态相同，A正确； B、转基因动物培育过程中，转基因动物中的受体细胞是受精卵，因为受精卵的全能性高，通过显微注射法将基因表达载体导入动物受精卵是目前最常用且成功率较高的方法，B正确； C、克隆动物培育中，将动物供体细胞注入体外培养到MⅡ期的去核的卵母细胞中，C错误； D、试管动物技术是指通过人工操作使卵子和精子在体外条件下成熟和受精，并通过培养发育为早期胚胎后，再进行胚胎移植产生后代的技术，这项技术利用了体外受精、体外胚胎培养、胚胎移植等技术，D正确。 选C。 7．（23-24高二下·河南洛阳·期末）棉蚜虫体内有多种寄生蜂的卵。现利用PCR技术对棉蚜虫及其体内寄生蜂种类进行检测，为了一次鉴定出多种目标昆虫，加入同一PCR体系的引物应满足的条件是（    ） ①每对引物扩增的序列对应一种昆虫②每对引物扩增的序列对应多种昆虫③每对引物扩增的产物长度不同④每对引物扩增的产物长度相同⑤所有引物之间不能相互配对⑥所有引物的长度相同 A．①③⑤ B．②④⑥ C．②③⑥ D．①④⑤ 【答案】A 【分析】引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，且引物之间不能发生碱基互补配对。 【详解】要用多对引物一次鉴定出多种生物，那么每种生物要有对应的引物与其DNA特有的碱基序列配对，引物之间不能互补配对，扩增的产物长度要有所不同，以便在电泳时可以区分出不同生物的片段，即①③⑤符合题意，A正确，BCD错误。 故选A。 8．（23-24高二下·河南洛阳·期末）四种限制酶的切割位点如图所示，下列相关叙述错误的是（    ） A．限制酶主要是从原核生物中分离纯化而来的 B．DNA连接酶和DNA聚合酶都是催化磷酸二酯键形成的酶 C．SmaI、EcoRV切割后产生的DNA片段之间能用T4DNA连接酶连接 D．EcoRI、PstI切割后产生的DNA片段之间能用E·coliDNA连接酶连接 【答案】D 【分析】限制酶的作用：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 【详解】A、限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的，能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，A正确； B、DNA连接酶主要连接的是两个DNA片段，形成磷酸二酯键，而DNA聚合酶在DNA复制过程中起着关键作用，它能够将单个脱氧核苷酸连接到脱氧核苷酸链上，从而催化形成磷酸二酯键，B正确； C、SmaI、EcoRV两种酶切割后的DNA片段末端类型为平末端，T4DNA连接酶可以连接平末端，C正确； D、EcoRI、PstⅠ两种酶切割后的DNA片段都会产生黏性末端，但产生的黏性末端并不相同，E．coliDNA连接酶可以连接具有相同黏性末端的DNA片段，D错误。 故选D。 9．（23-24高二下·河南三门峡·期末）乳酸菌无氧呼吸过程产生的丙酮酸会在LDH酶的催化下产生乳酸，如图所示。由于工业需求，需要利用苯丙酮酸生产①处基团体积更大的苯乳酸。因此科研人员拟改造LDH的结构，使其成为能生产苯乳酸的mLDH。改造思路是改变LDH编码基因的序列，使其编码的蛋白质第52位的酪氨酸替换为亮氨酸，使得活性中心增大，以容纳更大的基团 下列说法错误的是（    ） A．上述改造过程属于蛋白质工程技术，mLDH编码基因原本不存在于自然界中 B．应测定改造所得mLDH生产苯乳酸的能力 C．根据mRNA反推的mLDH编码基因只有一种碱基序列 D．蛋白质工程的操作对象是基因，是在基因水平上进行核苷酸的增减、替换等 【答案】C 【分析】从蛋白质功能出发，先改造LDH的结构，使其成为能生产苯乳酸的mLDH，再改造LDH编码基因的序列，使其编码的蛋白质第52位的酪氨酸替换为亮氨酸，使得活性中心增大，该方法属于蛋白质工程。 【详解】A、蛋白质工程是根据人类需求修改蛋白结构，反推基因序列，上述改造过程属于蛋白质工程技术，mLDH是新的蛋白质，其编码基因原本不存在于自然界中，A正确； B、合成出mLDH后，还需要测定改造所得mLDH生产苯乳酸的能力，B正确； C、根据密码子简并性，同一蛋白质的氨基酸序列可对应多个mRNA序列，也就有多种可选的DNA序列，C错误； D、蛋白质工程是根据人类需求修改蛋白结构，反推基因序列，最终是在基因水平上进行核苷酸的增减、替换等，其操作对象是基因，D正确。 故选C。 10．（23-24高二下·河南三门峡·期末）干扰素是动物体内的一种蛋白质，可以用于治疗病毒感染性疾病和癌症，但在体外保存相当困难。如图是利用蛋白质工程设计生产干扰素的流程图。据图分析，下列叙述不正确的是（    ） A．图中构建新的干扰素模型的主要依据是预期的蛋白质功能 B．图中各项技术并没有涉及基因工程技术 C．图中改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结构 D．图中新的干扰素基因必须加上启动子和终止子才能表达 【答案】B 【分析】蛋白质工程是将控制蛋白质的基因进行修饰改造或合成新的基因，然后运用基因工程合成新的蛋白质。蛋白质工程的过程：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）。蛋白质工程得到的蛋白质一般不是天然存在的蛋白质。 【详解】A、蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造，因此，构建新的干扰素模型的主要依据是预期的蛋白质的功能，A正确； B、利用蛋白质工程设计保存干扰素的生产流程图中，合成新的干扰素基因后，要构建基因表达载体并将基因表达载体导入受体细胞中，使其在受体细胞中表达，这属于基因工程技术，B错误； C、基因决定蛋白质，因此要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造或合成基因来完成，因此蛋白质工程的实质是对基因进行操作，操作简单，且能遗传给后代，C正确； D、基因结构中的启动子是RNA聚合酶识别和结合部位，有了它才能驱动基因转录，终止子使转录在所需要的地方停下来。因此，新的干扰素基因合成之后，要在受体细胞中表达，在构建基因表达载体时，必须加上启动子和终止子，D正确。 故选B。 11．（23-24高二下·河南濮阳·期末）下列关于基因工程技术的叙述，正确的是（    ） A．基因工程的操作水平属于分子水平，其原理为基因突变 B．PCR中为了实现目的基因DNA的解旋，需要加入解旋酶 C．载体质粒上通常有抗生素抗性基因作为标记基因，以便于重组质粒的筛选 D．构建基因表达载体时，目的基因必须位于启动子和终止子之间才能进行复制 【答案】C 【分析】基因工程的操作步骤：目的基因的获取、构建基因表达载体、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、基因工程的操作对象是基因，属于分子，因此基因工程的操作水平属于分子水平，其原理为基因重组，A错误； B、PCR反应中，目的基因DNA高温变性后解聚为单链，不需要加入解旋酶，B错误； C、用作基因工程载体的质粒上常有特殊的标记基因，如抗生素抗性基因等，便于重组DNA质粒的筛选，C正确； D、启动子与RNA聚合酶结合，驱动目的基因的转录，终止子负责终止目的基因转录，因此构建基因表达载体时，目的基因必须位于启动子和终止子之间才能进行转录，但是目的基因的复制需要复制原点，不需要启动子和终止子，D错误。 故选C。 二、解答题 12．（23-24高二下·河南南阳·期末）从健康人的血浆中分离提取的人血清白蛋白（HSA）在临床上需求量很大，具有重要的医用价值。下图是通过基因工程技术获取重组HSA示意图，其中报告基因表达的产物能催化无色物质K呈现蓝色。据图回答下列问题： (1)若要体外获得大量的人血清白蛋白基因，可采用PCR 技术。该技术的前提是要根据一段已知目的基因的 设计引物，PCR的原料是 。 (2)过程①中需将植物细胞与农杆菌混合后共同培养， 旨在让T-DNA 进入植物细胞；除尽农杆菌后，还须转接到含 的培养基上筛选出转化的植物细胞。 (3)为检测HSA基因的表达情况，可提取受体细胞的蛋白质，用 进行抗原一抗体杂交实验。 (4)科学家培养出一种转基因山羊，其膀胱上皮细胞可以合成人血清白蛋白并分泌到尿液中。其培育方法中将重组质粒通过 法导入山羊的受体细胞时，常选用受精卵作为受体细胞的主要原因是 。人血清白蛋白基因能在山羊膀胱上皮细胞中表达的原因是 。 【答案】(1) 核苷酸序列 脱氧核糖核苷三磷酸（或dNTP） (2)无色物质K (3)抗人血清白蛋白的抗体 (4) 显微注射 受精卵具有发育的全能性 生物界共用一套遗传密码子 【分析】1、基因工程技术的基本步骤是：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 2、利用PCR技术扩增DNA时所需的条件：引物、模板DNA（目的基因）、原料（4种脱氧核糖核苷酸）和耐热性的DNA聚合酶等。 【详解】（1）PCR技术的原理是双链DNA复制，利用PCR技术扩增目的基因时，由于DNA两条链反向平行，DNA聚合酶只能从引物的3'端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA两条链同时扩增，故该技术的前提是要根据一段已知目的基因的核苷酸序列设计引物。PCR是体外对DNA进行复制，其所需的原料是脱氧核糖核苷三磷酸（即dNTP）。 （2）该方法为农杆菌转化法，过程①中需将植物细胞与农杆菌混合后共同培养，旨在通过农杆菌的转化作用，让T-DNA进入植物细胞；由于报告基因表达的产物能催化无色物质K呈现蓝色，所以除尽农杆菌后，还须转接到含无色物质K的培养基上筛选出转化的植物细胞。 （3）为检测HSA基因是否成功表达，可提取受体细胞的蛋白质（相当于抗原，能与特定的抗体结合），用抗人血清白蛋白的抗体进行杂交实验，若呈阳性，则说明HSA基因成功表达。 （4）将重组质粒通过显微注射法导入动物的受体细胞时，常选用受精卵作为受体细胞，主要原因是动物受精卵具有发育的全能性，由于生物界共用一套遗传密码子，所以人血清白蛋白基因能在山羊膀胱上皮细胞中表达出相应的蛋白质。 一、单选题 1．（23-24高二下·河南信阳·期末）研究人员用EcoRI和SmaI两种限制酶处理某DNA分子，图1为EcoRI切割该DNA分子后的结果；图2是酶切后的凝胶电泳图谱，其中1号泳道是DNAMarker（标准参照物），2号、3号、4号分别是EcoRI单独处理、SmaI单独处理、两种酶共同处理后的电泳结果。下列相关叙述错误的是（    ） A．据图1可知EcoRI的识别序列为3'—GAATTC—5',切割位点在G和A之间 B．据图2可知琼脂糖凝胶的加样孔在A端，参照1号泳道，可估计样品DNA大小 C．据图2可知该DNA分子可能是含1000个碱基对的环状DNA D．据图2可知该DNA分子中两种限制酶的酶切位点可能各有一个 【答案】A 【分析】切割DNA 分子的工具是限制性内切核酸酶，又称限制酶。这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。它们能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 【详解】A、图1中DNA双链片段被切割成两段，该片段序列是5′—GAATTC—3'，A错误； B、相对分子质量大小会影响物质在电泳时的迁移速率，DNA片段相对分子质量越大，迁移就越慢，分子量越小，迁移速度越快，据图2可知琼脂糖凝胶的加样孔在A端，B正确； C、2号、3号、分别是EcoRI单独处理、SmaI单独处理后的电泳结果，两个泳道均只出现一个DNA片段，且分子量是1000，说明该DNA分子可能是含1000个碱基对的环状DNA，C正确； D、图2中4号是EcoRI和SmaI两种酶共同处理后的电泳结果，显示800bp和200bp两个条带，说明在该DNA分子中，两种限制酶的酶切位点可能各有一个，D正确。 故选A。 2．（23-24高二下·河南许昌·期末）下图是“DNA 的粗提取和鉴定”实验中几个重要操作的示意图，下列叙述错误的是（    ） A．实验的操作顺序是③②①④ B．图①的原理是DNA不溶于酒精，而某些蛋白质可溶于酒精 C．图④用到的 NaCl溶液浓度为2mol/L D．图④操作后加入二苯胺试剂充分振荡即可观察到颜色变蓝 【答案】D 【分析】DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。 【详解】A、图中“DNA的粗提取和鉴定”的正确的实验操作顺序是③破碎细胞→②获取含DNA的滤液→①DNA析出→④DNA的鉴定，A正确； B、图①的原理是DNA不溶于酒精，而某些蛋白质可溶于酒精，这样可以进一步纯化DNA，B正确； C、图④用到的 NaCl溶液浓度为2mol/L，其目的是溶解DNA，C正确； D、图④操作后加入二苯胺试剂充分振荡，经过沸水浴加热可观察到颜色变蓝，D错误。 故选D。 3．（23-24高二下·河南南阳·期末）通过转Bt基因技术获得抗虫棉是我国科学家的重大科研成果。下列有关转Bt基因技术的叙述，错误的是（    ） A．可以利用PCR技术获取Bt基因，或从分子水平上检测Bt基因是否转录 B．构建基因表达载体是核心步骤，基因表达载体必须包含启动子、终止子等 C．可以利用农杆菌转化法，将插入T-DNA中的Bt基因转移到棉花细胞染色体上 D．若某抗虫棉仅一条染色体上插入一个Bt基因，则该植株自交后代抗虫个体占1/2 【答案】D 【分析】基因工程基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取，②基因表达载体的构建，③将目的基因导入受体细胞，④目的基因的检测与鉴定。其中核心步骤为基因表达载体的构建，其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。 【详解】A、可以利用PCR技术（体外合成DNA）获取Bt基因，或从分子水平上检测Bt基因是否转录，A正确； B、构建基因表达载体是基因工程的核心步骤，基因表达载体包含标记基因、Bt基因、启动子、终止子等，B正确； C、农杆菌细胞中有Ti质粒，Ti质粒上的T-DNA可整合到染色体DNA上，可以利用农杆菌转化法，将插入T-DNA中的Bt基因转移到棉花细胞染色体上，C正确； D、若某抗虫棉仅一条染色体上插入一个Bt基因，该植株的基因型记为AO，则其自交后代基因型及比例为AA:AO:AO=1:2:1，后代中抗虫个体占3/4，D错误。 故选D。 4．（23-24高二下·河南洛阳·期末）苏云金芽孢杆菌中的杀虫晶体蛋白Cry具有杀虫毒性，但Cry蛋白存在杀虫谱窄、毒力有限等问题，制约了其在农业生产中的进一步应用。科学家通过定点突变，将Cry蛋白第168位的组氨酸替换为精氨酸后，Cry蛋白对烟草天蛾的毒性提高了3倍；将Cry蛋白第282位、第283位的丙氨酸和亮氨酸分别替换成甘氨酸和丝氨酸后，Cry蛋白对舞毒蛾的毒性提高了7倍。下列相关叙述不正确的是（    ） A．对Cry蛋白的改造是通过改造编码Cry蛋白的基因来实现的 B．与基因工程相比，蛋白质工程的实现也需要构建基因表达载体 C．蛋白质工程难度较大，主要是蛋白质发挥功能所依赖的高级结构十分复杂 D．如果将第168、282、283位的氨基酸全部替换，Cry蛋白对舞毒蛾的毒性将增加21倍 【答案】D 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 【详解】A、蛋白质的改造需要从根本上改造基因，因此对Cry蛋白的改造是通过改造编码Cry蛋白的基因来实现的，A正确； B、需要将改造的基因导入受体细胞并表达相关产物，就需要构建基因表达载体因此与基因工程相比，蛋白质工程的实现也需要构建基因表达载体，B正确； C、蛋白质的功能多样性，主要取决于蛋白质中氨基酸种类、数量、排列顺序以及蛋白质的空间结构，因此蛋白质工程难度较大，主要是蛋白质发挥功能所依赖的高级结构十分复杂，C正确； D、如果将第168、282、283位的氨基酸全部替换，Cry蛋白可能会失去原有的功能，D错误。 故选D。 5．（23-24高二下·河南三门峡·期末）如图是将人的生长激素基因导入细菌B制造“工程菌”的示意图。已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因。判断下列说法错误的是（    ）    A．将重组质粒导入细菌B常用的方法是Ca+处理法 B．将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的只是导入了质粒A的细菌 C．将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的既有导入普通质粒A的细菌又有导入重组质粒的细菌 D．目的基因成功表达的标志是受体细胞能在含氨苄青霉素的培养基上生长 【答案】D 【分析】分析题图：图示表示将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的过程。质粒A上含有四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，构建基因表达载体后，破坏了质粒A的四环素抗性基因，但氨苄青霉素抗性基因正常，所以导入重组质粒或普通质粒的大肠杆菌都能抗氨苄青霉素，但导入重组质粒的大肠杆菌不能抗四环素。 【详解】A、将目的基因导入细菌时，常用Ca2+处理细菌，使之处于感受态，从而能够吸收重组质粒，A正确; B、由于抗四环素基因被破坏，所以能在含有四环素的培养基上生长的是导入普通质粒A的细菌，B正确； C、由于抗氨苄青霉素基因未被破坏，所以在含有氨苄青霉素的培养基上能生长的是导入了重组质粒或质粒A的细菌，C正确； D、该实验的目的基因是人的生长激素基因，因此目的基因成功表达的标志是受体细胞能产生人的生长激素，D错误。 故选D。 6．（23-24高二下·河南三门峡·期末）CRISPR/Cas9是一种生物学工具，能够通过“剪切和粘贴”脱氧核糖核酸（DNA）序列的机制来编辑基因组。这套系统源自细菌的防御机制，是一种对任何生物基因组均有效的基因编辑工具。CRISPR-Cas9基因组编辑系统由向导RNA（也叫sgRNA）和Cas9蛋白组成向导RNA识别并结合靶基因DNA，Cas9蛋白切断双链DNA形成两个末端。这两个末端通过“断裂修复”重新连接时通常会有个别碱基对的插入或缺失，从而实现基因敲除，如图所示。CRISPR-Cas9基因组编辑技术有时存在编辑出错而造成脱靶。下列叙述错误的是（    ）    A．对不同目标DNA进行编辑时，使用Cas9蛋白和“不同”的sgRNA进行基因编辑 B．Cas9蛋白相当于限制酶，能作用于脱氧核糖和碱基之间的化学键 C．CRISPR-Cas9基因组编辑系统使细菌获得抵抗噬菌体的能力 D．可能其他DNA序列含有与sgRNA互补配对的序列，造成sgRNA错误结合而脱靶 【答案】B 【分析】由题意可知，CRISPR-Cas9体系是由靶基因的向导RNA和Cas9蛋白构成的复合体。向导RNA在基因组中负责寻找靶基因并与其结合；Cas9蛋白在向导RNA的引导下切割靶基因，使DNA双链断裂产生平末端。在随后DNA自我修复的过程中，容易随机引起一些碱基对的插入或缺失，导致基因功能改变。 【详解】A、Cas9蛋白在向导RNA的引导下切割靶基因，sgRNA具有识别作用，在对不同目标DNA进行编辑时，应使用Cas9蛋白和“不同”的sgRNA结合进而实现对不同基因的编辑，A正确； B、Cas9蛋白识别并切断双链DNA形成两个末端，相当于限制酶，能作用于磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键，B错误； C、噬菌体是通过将自身的DNA注入细菌内，利用细菌内的物质进行自我复制而完成侵染的，而CRISPR−Cas9系统可以定向切割外源DNA，故该系统使细菌获得抵抗噬菌体的能力，C正确； D、CRISRP−Cas9基因编辑技术有时存在编辑出错而造成脱靶，其最可能的原因是其他DNA序列也含有与向导RNA（sgRNA）互补配对的序列，造成向导RNA（sgRNA）错误结合而脱靶，D正确。 故选B。 7．（23-24高二下·河南三门峡·期末）为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（    ） A．①+③ B．③+④ C．③+② D．①+④ 【答案】D 【分析】根据图示中引物的位置可知，引物①扩增的片段含有启动子和HMA3基因，引物③扩增的片段不含启动子，引物②扩增的片段既含有启动子，又含有HMA3基因序列。 【详解】图示中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，可根据PCR产物的片段大小判断是否含有外源HMA3基因序列，应选择的引物组合是①+④，即D正确，ABC错误。 故选D。 8．（23-24高二下·河南三门峡·期末）如图为形成cDNA过程和PCR扩增过程示意图。据图分析，下列说法不正确的是（    ） A．③④⑤过程分别为变性、复性和延伸阶段 B．催化②⑤过程的酶都是DNA聚合酶，⑤中DNA聚合酶能耐高温 C．①过程需要的是RNA聚合酶 D．④过程需要冷却至50℃左右 【答案】C 【分析】分析题图：图示为形成cDNA过程和PCR扩增过程示意图，其中①是由RNA形成单链DNA的过程，为逆转录过程；②是以单链DNA合成双链DNA的过程，是DNA分子复制过程；③④⑤是多聚酶链式反应扩增DNA片段，其中③是变性、④是复性、⑤是延伸阶段。 【详解】A、分析题图可知，③④⑤是多聚酶链式反应扩增DNA片段，其中③是变性、④是复性、⑤是延伸阶段，A正确； B、图中②⑤过程为DNA复制，这两个过程都需要DNA聚合酶的催化，其中⑤过程进行的温度是70~75 ℃，因此催化该过程的DNA聚合酶能耐高温，B正确； C、图中①过程为逆（反）转录，该过程需要逆转录酶（反转录酶）的催化，C错误； D、④为复性过程，需要冷却至50 ℃左右，D正确。 故选C。 9．（23-24高二下·河南三门峡·期末）一种双链DNA分子被三种不同的限制酶切割，切割产物通过电泳分离，用大小已知的DNA片段的电泳结果作为分子量标记（图左边一列）。关于该双链DNA，下列说法错误的是（    ）    A．呈环状结构 B．其NotI切点与EcoRI切点的最大距离为2kb C．有一个NotI和两个EcoRI切点 D．分子质量大小为10kb 【答案】B 【分析】根据题意可知，通过与分子量标记比较可知单用EcoRI处理后产生了4kb和6kb两条带；而利用EcoRI和NotI双酶切时产生了6kb、3kb、1kb三条带，即4kb的片段进一步被NotI酶切为3kb和1kb的片段，因此DNA含有一个NotI酶切位点，因为用NotI处理只产生了一个10kb的条带，所以该分子必须是环状的，长度一定是10kb。 【详解】AD、单用EcoRI处理和利用EcoRI和NotI双酶切时产生的结果不同，说明DNA含有NotI酶切位点，因为用NotI处理只产生了一个10kb的条带，所以该分子必须是环状的，且长度一定是10kb，A正确；D正确； B、用EcoRI处理后产生的4kb的片段，进一步被NotI酶切为3kb和1kb的片段，可以得知NotI切点与EcoRI切点的最短距离为1kb，最大距离为3kb，B错误。 C、因为用NotI处理只产生了一个10kb的条带，说明该环状DNA上含有一个NotI切割位点，单用EcoRI处理后产生了4kb和6kb两条带，说明该环状DNA上含有2个EcoRI切割位点，C正确。 故选B。 10．（23-24高二下·河南三门峡·期末）某学校生物兴趣小组进行DNA的粗提取与鉴定实验，下列相关叙述正确的是（    ） A．预冷的酒精溶液可用来进一步纯化粗提取的DNA B．与鸡血相比，等体积的猪血提取DNA的量较高 C．向菜花组织中加入蒸馏水并搅拌可以释放核DNA D．将白色丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液后加入二苯胺试剂，混匀后呈蓝色 【答案】A 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、在预冷的95%酒精溶液中DNA的溶解度最低，DNA的沉淀量最大，可用来进一步纯化粗提取的DNA，A正确； B、猪为哺乳动物，成熟红细胞不含细胞核和细胞器，而鸡属于鸟类，其红细胞内含有细胞核与各种细胞器，DNA含量较多，B错误； C、菜花细胞有细胞壁，因此向菜花组织中加入蒸馏水并搅拌不会释放核DNA，C错误； D、将白色丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液中，再加入二苯胺试剂，混匀后，在沸水浴条件下，呈蓝色，D错误。 故选A。 11．（23-24高二下·河南三门峡·期末）研究表明，肌肉萎缩性侧索硬化症（俗称“渐冻症”），是由于基因突变导致神经元合成了某种毒蛋白，从而阻碍了轴突内营养物质的流动；利用诱导多功能干细胞（iPS细胞）分化的前驱细胞，移植给渐冻症实验鼠，能延长其寿命。下列相关描述错误的是（    ） A．诱导多能干细胞和胚胎干细胞全能性都很高，都属于成体干细胞 B．可借助载体将特定基因导入成纤维细胞诱导形成iPS细胞 C．植入神经干细胞，使受损的运动功能得到恢复，可以一定程度改善“渐冻症” D．可通过DNA分子杂交技术，对渐冻症进行基因诊断 【答案】A 【分析】诱导多功能干细胞分化成多种细胞是基因选择性表达的结果，细胞核中遗传物质DNA不变，但RNA及蛋白质不完全相同。 【详解】A、诱导多能干细胞属于成体干细胞，胚胎干细胞不属于成体干细胞，A错误； B、基因工程需要借助载体将目的基因导入受体细胞，故可借助载体将特定基因导入成纤维细胞诱导形成iPS细胞，B正确； C、植入神经干细胞，经过分裂分化补充受损的神经元，使受损的运动功能得到恢复，可以一定程度改善“渐冻症”，C正确。 D、由于“渐冻症”是基因发生突变引起的，所以可通过DNA分子杂交技术对渐冻症进行诊断，D正确； 故选A。 12．（23-24高二下·河南南阳·期末）下列关于 PCR 扩增DNA 片段及电泳鉴定的叙述，正确的有（　　） A．PCR 反应中，复性阶段需要DNA 聚合酶连接磷酸二酯键 B．PCR 进行n个循环所需消耗的引物共2ⁿ个 C．电泳时，DNA 分子在凝胶中的迁移速率与DNA 的大小和构象等有关 D．电泳时，将PCR 产物、核酸染料和电泳指示剂混合后注入凝胶加样孔 【答案】C 【分析】1、PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 2、DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 【详解】A、PCR反应中，复性阶段需要耐高温的DNA聚合酶连接磷酸二酯键，A错误； B、PCR第一个循环时需要2个引物，第二个循环需要4个引物，第三个循环需要8个引物，以此类推， 进行n个循环所需消耗的引物共2n+1-2个，B错误； C、PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，DNA分子相对较小迁移速度较快，C正确； D、核酸染料在制备凝胶时加入，将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入分子大小的标准参照物，D错误。 故选C。 二、解答题 13．（23-24高二下·河南安阳·期末）绿色荧光蛋白（GFP）是由238个氨基酸组成的单体蛋白，在蓝光诱导下会发光，可用于直接观察细胞中的活动。实验小组以质粒pMUTIN-gfp+为模板扩增gfp+基因，将其与质粒pMV24构建了重组质粒pMV24-gfp+，并在木葡糖酸醋杆菌中进行表达，证明其可作为选择标记用于今后的研究，重组质粒的构建过程如图所示。请回答下列问题： 注：AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，EcoRⅠ、XbaI、PvuⅡ表示三种限制酶。 (1)利用PCR扩增目的基因时，每个循环依次经过 三个阶段，扩增过程中需在缓冲液中添加一定浓度的Mg2+，Mg2+的作用是 。 (2)以质粒pMUTIN-gfp+为模板扩增gfp+基因时，应当在引物的 （填“5′”或“3′”）端添加 两种限制酶的识别序列。用不同的限制酶切割目的基因和载体的原因是 （答出两点）。 (3)重组质粒上的AmpR基因是一种标记基因，其作用是 ，AmpR基因能作为标记基因的前提条件是木葡糖酸醋杆菌中 （填“含有”或“不含”）AmpR基因。若要进一步检测重组质粒是否构建成功，可以用限制酶切割重组质粒，并用 法分离不同的DNA片段。 【答案】(1) 变性、复性、延伸 激活耐高温的DNA聚合酶 (2) 5′ EcoRI、XbaI 防止目的基因和质粒的自身环化；防止目的基因反向连接到质粒上 (3) 便于重组DNA分子的筛选 不含 琼脂糖凝胶电泳 【分析】基因工程的基本操作程序: 第一步:目的基因的获取; 第二步:基因表达载体的构建(核心)1、目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。2、组成:目的基因+启动子+终止子+标记基天。 第三步:将目的基因导入受体细胞，1、转化的概念:是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。将目的基因导入植物细胞:采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。 将目的基因导入动物细胞:最常用的方法是显微注射技术，方法的受体细胞多是受精卵。第四步:目的基因的检测和表达将目的基因导入细菌:感受态细胞法:用钙离子处理细胞使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。 1、首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。2、其次还要检测目的基因是否转录出mRNA,方法是采用分子杂交(DNA-RNA)技术。3、最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原一抗体杂交技术。 【详解】（1）PCR技术扩增目的基因的一次循环要经过变性、复性和延伸三个阶段，扩增过程中需在缓冲液中添加一定浓度的Mg2+，Mg2+的作用是激活耐高温的DNA聚合酶。 （2）gfp+基因的两侧没有相应的限制酶切点，而DNA延伸的方向是5′端→3′端，因此要在5′端添加限制酶的识别序列。限制酶PruⅡ会破坏标记基因，因此应加入限制酶EcoRl和XbuI的识别序列。用不同的限制酶切割目的基因和质粒的原因是防止目的基因和质粒的自身环化，防止目的基因反向连接到质粒上。 （3）根据图示可知，标记基因的作用是筛选含重组质粒的受体细胞，故受体细胞应不含标记基因，不具有相应的抗性；实验室分离DNA片段的方法是琼脂糖凝胶电泳。 14．（23-24高二下·河南信阳·期末）易错PCR是利用低保真的TaqDNA聚合酶和改变PCR的反应条件，降低DNA复制的准确性，在新DNA链的合成过程中增加碱基错配率，从而使扩增产物出现较多点突变的一种体外诱导DNA序列变异的方法。研究发现，自然界中的生物体内分离得到的天然酶，在工业生产环境中催化效率往往较低。下图是研究人员利用易错PCR技术对某种天然酶进行改造，获得了高催化效率的酶的流程示意图。回答下列问题： (1)在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是 。 (2)图中步骤②一般要先用Ca2+处理受体菌，使细胞处于 的生理状态。成功导入重组质粒的受体菌不一定能表达出相应的突变酶，原因之一可能是 无法识别和结合突变基因的启动子。 (3)TaqDNA聚合酶的某一区域负责将碱基与模板链正确地互补配对，Mn2+可以降低这一功能；非互补的碱基对由于氢键不易形成，稳定性差，Mg2+可以提高该错配区的稳定性。因此，与普通PCR相比，易错PCR的反应体系中应适当 （填“提高”或“降低”）Mn2+浓度、 （填“提高”或“降低”）Mg2+浓度。 (4)从变异的类型和方向方面分析，通过易错PCR技术改造天然酶基因与通过蛋白质工程改造天然酶基因的相同点是 ;不同点是 。 【答案】(1)温度升高至90℃以上 (2) 容易接受环境中DNA 若基因突变导致启动子结构改变 (3) 提高 提高 (4) 都是基因突变 易错PCR技术原理是诱发不定向的基因突变，蛋白质工程是特殊条件下的定向基因突变 【分析】PCR技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于TaqDNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过人工合成的引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3′-OH末端，并以此为起始点，沿模板5′→3′方向延伸，合成一条新的DNA互补链。 【详解】（1）在体外利用PCR技术扩增目的基因时，利用DNA高温变性的特点加热至90-95℃，破坏双链之间的氢键，使DNA解链变为单链。 （2）步骤②是将重组质粒导入不同受体菌，由于受体菌用钙离子处理后更容易吸收周围环境中的DNA，因此步骤②是将构建的重组质粒溶于缓冲液中与用Ca2+处理的受体菌混合，在一定温度下完成转化。若基因突变导致启动子结构改变，RNA聚合酶可能无法识别并结合，导致转录无法进行。 （3）TaqDNA聚合酶的某一区域负责将碱基与模板链正确地互补配对，Mn2+可以降低这一功能；非互补的碱基对由于氢键不易形成，稳定性差，Mg2+可以提高该错配区的稳定性。易错PCR需增加错配概率，并使错配区稳定存在，所以两种离子浓度均需要适当提高。 （4）易错PCR技术原理是诱发不定向的基因突变；蛋白质工程中参考推测出的基因序列，对天然酶基因的结构进行定向的改造，属于特殊条件下的定向基因突变。 15．（23-24高二下·河南驻马店·期末）某动物体内含有研究者感兴趣的目的基因，研究者欲将该基因导入大肠杆菌的质粒中保存。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因（AmpR），LacZ基因及一些酶切位点，其结构和简单的操作步骤如下图所示。 请根据以上信息回答下列问题。 (1)可以利用PCR在体外扩增该目的基因的DNA片段，其原理为 ；PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，还需要加入与两条模板链结合的两种引物，引物的作用为 。 (2)进行步骤②时一般选择 （填“同种”或“不同种”）限制酶来切割质粒和含有目的基因的DNA，但该方法处理后构建的目的基因表达载体有时会因 而出现目的基因在受体细胞中不能表达的情况。 (3)进行步骤④时，研究人员需要先用 处理大肠杆菌细胞，再将重组质粒导入大肠杆菌细胞中。 (4)⑤培养基中除了加入大肠杆菌所必需的营养物质外，还需要加入 ，含有重组质粒的大肠杆菌形成的菌落为 色，原因是： 。 (5)在基因工程中使用的载体除质粒外还有 等。 【答案】(1) DNA半保留复制或DNA热变性 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 (2) 同种 目的基因和质粒反向连接 (3)Ca2+ (4) 氨苄青霉素和X-gal 白 目的基因的导入破坏了LacZ基因的结构，使其不能正常表达形成β-半乳糖苷酶，底物X-gal不能被分解而为白色 (5)噬菌体、动植物病毒 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）PCR的原理是DNA半保留复制或DNA热变性。PCR过程一般需要两种引物，引物的作用为使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。 （2）为便于切割后的质粒与目的基因的连接，一般宜选用同种限制酶。由于同种限制酶切割质粒和目的基因后产生相同的黏性末端，使得目的基因可能与质粒发生反向连接而不能在受体细胞中表达。 （3）将重组质粒导入大肠杆菌细胞常用Ca2+处理，使大肠杆菌细胞成为感受态细胞，以便于大肠杆菌细胞吸收外源DNA。 （4）质粒含有氨苄青霉素抗性基因（AmpR），LacZ基因，所以⑤培养基中除了加入大肠杆菌所必需的营养物质外，还需要加入氨苄青霉素和X-gal，由题图可看出，酶切位点位于LacZ基因中，因此重组质粒中的LacZ基因不能表达。根据LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gl产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色；否则菌落为白色，可知含重组质粒的菌落不能产生β-半乳糖苷酶来分解X-gal，故菌落为白色。 （5）在基因工程中使用的载体除质粒外还有噬菌体、动植物病毒。 16．（23-24高二下·河南开封·期末）PCR是聚合酶链式反应的缩写，常用于特异性地快速扩增目的基因，应用广泛。回答下列问题。 (1)研究人员将PCR扩增得到的毒物诱导型启动子S（箭头表示转录方向）插入图中载体P区构建表达载体，转入大肠杆菌以获得能够检测水中毒物的大肠杆菌。根据启动子方向以及终止子位置，PCR扩增启动子S时，图中引物I、Ⅱ应分别加入限制酶 的识别序列。 (2)利用PCR方法克隆某蛋白质的基因（部分序列如图）。扩增该基因的合适引物组合是 。通过引物的设计， （填“能”或“不能”）做到选择性扩增DNA片段。 5′——GAAGTC……CGAACC——3′ 3′——CTTCAG……GCTTGG——3′ (3)实时荧光RT-PCR是以提取的RNA为模板，经逆转录获得与之互补的DNA（cDNA）序列，再以cDNA序列为模板进行目的片段的扩增（具体过程如图所示）。利用RT-PCR技术提高检测某些微量RNA病毒的灵敏度，其原因是 。 (4)利用重叠延伸PCR技术改造目的基因的原理如下图所示。进行重叠延伸时，上链和下链在突变位点处的碱基序列互补，能起到引物2、3的作用，因此 （填“需要”或“不需要”）另加引物，即可得到进行PCR3筛选的突变产物。图示过程实现的基因序列改变属于基因突变， （填“有”或“没有”）发生基因重组。 【答案】(1)XhoI、BamHI (2) 5'—GAAGTC—3'、3'—GCTTGG—5' 能 (3)增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量 (4) 不需要 没有 【分析】PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶；同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。扩增的过程是：目的基因DNA受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合：然后以单链DNA为模板，在DNA聚合酶作用下进行延伸，即将4种脱氧核苷酸加到引物的3'端，如此重复循环多次。 【详解】（1）据图可知，目的基因中存在SmaI和EcoRI两种酶的识别序列，若用这两种酶会破坏目的基因，为防止目的基因和质粒自身环化和反向连接，质粒和目的基因应该用XhoI、BamHI切割。根据启动子方向以及终止子位置，PCR扩增启动子S时，图中引物I、Ⅱ应分别加入XhoI、BamHI的识别序列。 （2）引物的作用是使DNA聚合酶从引物的3'端连接脱氧核苷酸，引物与模板链的3'端结合，因此，扩增该基因的合适引物组合是5'—GAAGTC—3'、3'—GCTTGG—5'。引物是根据目的基因两端的脱氧核苷酸序列设计的，通过引物的设计，能做到选择性扩增DNA片段。 （3）若RNA数量较少时，不容易进行检测，但利用RT-PCR技术可提高检测某些微量RNA病毒的灵敏度，其原因是增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量。 （4）进行重叠延伸时，上链和下链在突变位点处的碱基序列互补，能起到引物2、3的作用，两者互为模板和引物，不需要再另加引物，即可得到进行PCR3筛选的突变产物。该过程发生了基因内部碱基对的替换，属于基因突变，没有发生基因重组。 17．（23-24高二下·河南商丘·期末）如图是利用基因工程生产生长激素的流程图，PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ代表相关的限制酶（产生的黏性末端不同），Amp+指氨苄青霉素抗性基因。回答下列问题： (1)对cDNA进行PCR扩增利用了 的原理，除加入引物和模板DNA外，一般还需要加入 ；产物经凝胶电泳后，发现有多条扩增带（其中也包含目的基因片段），在不改变引物、PCR扩增体系和模板量的情况下，可采用 的方法，特异性扩增目的基因片段。 (2)研究人员对扩增出的cDNA片段进行了序列测定，序列信息见下图，推测其最多可以编码 个氨基酸的多肽（终止密码子为UAA/UAG/UGA）。在多肽合成过程中，tRNA“搬运”氨基酸到核糖体上，氨基酸结合部位在tRNA的 端。写出PCR 扩增转录的模板链的引物为 （写出前面的10个碱基序列）。 (3)采用双酶切对目的基因的DNA片段和质粒进行处理，根据图示所采用的限制酶是 。选择两种酶切割的优点是 。 【答案】(1) DNA半保留复制 耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）、dNTP（缓冲液、Mg2+）等 减少循环次数或者提高退火温度 (2) 89 3' 5'-TCAAGGCATG-3' (3) PstⅠ、EcoRⅠ 形成不同的黏性末端，防止质粒及目的基因自连（自身环化）及目的基因反接（合理即可） 【分析】分析题图：图中①②③是利用反转录法获取目的基因，④是基因表达载体的构建，⑤是核移植。 【详解】（1）利用DNA半保留复制的原理对cDNA进行PCR，PCR体系中需要加入引物和模板DNA、耐高温的DNA聚合酶、dNTP（缓冲液、Mg2+）等。产物经凝胶电泳后，发现有多条扩增带（其中也包含目的基因片段），在不改变引物、PCR扩增体系和模板量的情况下，为了特异性扩增目的基因片段，可通过减少循环次数或者提高退火温度的方式达到目的。 （2）起始密码子是AUG，对应编码链的ATG，终止密码子为UAA/UAG/UGA，对应DNA编码链的TAA、TAG、TGA，则图中编码氨基酸序列的DNA长度为258个碱基对，则可编码258÷3=86个氨基酸。在多肽合成过程中，tRNA“搬运”氨基酸到核糖体上，氨基酸结合部位在tRNA的3'端。根据碱基互补配对原则，模板链和引物反向平行的原则，则PCR扩增转录的模板链的引物为5'-TCAAGGCATG-3'（写出前面的10个碱基序列）。 （3）由于HindⅢ破坏了氨苄青霉素抗性基因，则不能选用，所以只能选择PstI、EcoRI进行双酶切，选择两种酶切割可形成不同的黏性末端，防止质粒及目的基因自连及目的基因反接。 18．（23-24高二下·河南漯河·期末）玉米的祖先——野生玉米，名叫“大刍草”，经过9000多年人工驯化，被改造成现代玉米。我国中科院科学家经过长达10年不懈努力，从野生玉米“大刍草”中，成功找回玉米人工驯化过程中丢失的一个控制高蛋白含量的优良基因THP9，克隆出来并将此高蛋白基因转移到玉米细胞内，获得了转基因高蛋白玉米新品种。某种质粒和含THP9基因的DNA片段如图所示，箭头表示限制酶及其切割位点，表格中为5种限制酶的识别序列及切割位点。回答下列问题： EcoR Ⅰ BamH Ⅰ Kpn Ⅰ Mfe Ⅰ Hind Ⅲ 5'-G↓AATTC-3' 3'-CTTAA↑G-5' 5'-G↓GATCC-3' 3'-CCTAG↑G-5' 5'-G↓GTACC-3' 3'-CCATG↑G-5' 5'-C↓AATTG-3' 3'-GTTAA↑C-5' 5'-A↓AGCTT-3' 3'-TTCGA↑A-5' (1)将THP9基因导入受体细胞前，利用PCR技术进行扩增。PCR技术的原理是 。在PCR扩增仪中要加入缓冲液、 （答出2点）等。若在PCR扩增仪中加入模板DNA分子2个，经过30次循环后，则DNA分子数量将达到 个。 (2)构建基因表达载体时，若科研人员需将THP9基因整合到质粒上，如图，已知图中THP9基因转录方向为从左往右，应使用限制酶 切割如图中质粒，使用限制酶 切割图中含THP9基因的DNA片段，以获得能正确表达THP9基因的重组质粒。 (3)为了鉴别受体细胞中是否含有THP9基因，可用含 （填“氨苄青霉素”、“卡那霉素”、“四环素”或“链霉素”）的培养基进行初步筛选。为了检测转基因技术是否成功，科研 工作者还需进行个体生物学的鉴定，鉴定方法是 。 【答案】(1) DNA半保留复制 引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、目的基因 231 (2) Mfe I、Hind Ⅲ EcoR I、Hind III (3) 氨苄青霉素 将转基因玉米田间种植后收获玉米籽粒，检测其蛋白质含量 【分析】常用PCR特异性地快速扩增目的基因。PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 【详解】（1）PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。在PCR扩增仪中要加入缓冲液、Taq DNA聚合酶（耐高温的DNA聚合酶）、4种脱氧核苷酸、引物、目的基因等，若在PCR扩增仪中加入模板DNA分子2个，经过30次循环后，则DNA分子数量将达到230×2=231个。 （2）图中THP9基因转录方向为从左往右，即启动子位于左端，终止子位于右端，因为该基因右侧只有一个酶切位点，故一定用Hind Ⅲ切割质粒和目的基因，对于质粒来说，不能用EcoR I进行切割（含两个切割位点，切成片段了），不能用BamH I切割（会切断启动子），那么在Hind Ⅲ的左侧只有Mfe I序列，而目的基因不能用该酶切割，与Mfe I能形成相同黏性末端的是EcoR I，故质粒用Mfe I、Hind Ⅲ切割，目的基因用EcoR I、Hind Ⅲ切割。 （3）质粒含有氨苄青霉素抗性基因，为了鉴别受体细胞中是否含有THP9基因，可用含氨苄青霉素的培养基进行初步筛选。为了检测转基因技术是否成功，可进行分子水平、个体水平的检测，个体水平上的检测方法是将转基因玉米田间种植后收获玉米籽粒，检测其蛋白质含量。 19．（23-24高二下·河南许昌·期末）野生玉米“大刍草”经过9000多年人工驯化，被改造成现代玉米。我国中科院科学家经过不懈努力，从野生玉米中成功找回玉米人工驯化过程中丢失的一个控制高蛋白含量的优良基因THP9，并将此高蛋白基因转入玉米细胞内，获得了转基因高蛋白玉米新品种。构建基因表达载体时，科研人员需将THP9基因整合到质粒上（如图）。回答下列问题： EcoRⅠ BamHⅠ KpnI Mfe I HindⅢ (1)构建基因表达载体时，为获得能正确表达THP9 基因的重组质粒，应选择限制酶 切割质粒，选择限制酶 切割图中含 THP9基因的 DNA 片段。不能用限制酶 KpnI和 HindⅢ切割质粒和含 THP9基因的 DNA 片段,原因是 。 (2)采用农杆菌转化法将优良基因THP9导入玉米细胞中，在含氨苄青霉素的培养基上培养获得的菌落不一定含有重组质粒，原因是     。 【答案】(1) MfeI、HindIII EcoRI、HindII 导致目的基因的反向连接，影响目的基因的正常表达 (2)含普通Ti质粒的受体细胞也能正常生长 【分析】DNA重组技术的基本工具：DNA限制酶、DNA连接酶、运载体。 【详解】（1）在构建基因表达载体时，通常采用双酶切法，以防止目的基因反向连接和自身环化，影响目的基因的正常表达。依据题图信息可知，THP9基因应插入启动子和终止子之间，THP9基因右端只有一个限制酶切割位点，即HindⅢ切割位点，结合转录方向，可知该点靠近终止子；质粒上，由于存在两个EcoRⅠ切割位点，经其切割后，质粒会被切割成片段，故不可使用；BamHⅠ会破坏启动子，故也不可使用该酶切割；KpnI切割位点切割后，会导致THP9反向连接，故质粒应用MfeI、HindIII；在质粒上MfeI会破坏目的基因，切MfeI和EcoRⅠ会产生相同的黏性末端，故THP9应采用EcoRI、HindII进行切割。 （2）由于含有重组质粒和普通质粒的农杆菌都能在含氨苄青霉素的培养基上生长，故在含氨苄青霉素的培养基上培养获得的菌落不一定含有重组质粒。 20．（23-24高二下·河南南阳·期末）利用某目的基因（图1，图中黑色部分表示目的基因）和P1噬菌体载体（图2）构建重组DNA（图3），再将其导入大肠杆菌。部分限制酶的识别序列及切割位点如下：BglⅡ（5-A↓GATCT-3'），EcoRⅠ(5'-G↓AATTC-3'）和Sa3A1（5'-↓GATC-3'）回答下列问题： (1)该目的基因以 （填“a”或“b”）链为转录模板。重组DNA中的启动子是 （填“甲”或“乙”）。 (2)限制酶BglⅡ和Sau3AⅠ的切割产物可以相互连接，原因是 ；该连接物能否再被BglⅡ切割？ （填“能”“不能”或“不一定”）。为保证目的基因和质粒正向连接，应用限制酶 切割目的基因和P1噬菌体载体，再用 酶处理，即可得到图3的重组DNA。 (3)为了检测目的基因是否在大肠杆菌中稳定存在，从受体细胞中提取总DNA，可以设计引物 （填图1中的引物编号）进行PCR，理由是 。 【答案】(1) b 乙 (2) 二者切割后产生了相同的黏性末端 不一定 EcoRⅠ和Sau3AⅠ DNA连接 (3) 1和3 选用引物1和3才能扩增出含目的基因的DNA片段 【分析】一种限制酶只能识别一种核苷酸序列且在特定的位点对DNA分子进行切割，切割出的末端有黏性末端和平末端两种，具有相同黏性末端的DNA片段之间可以在DNA连接酶的作用下连接到一起。 【详解】（1）RNA聚合酶沿着模板链的3'端向5'端移动，所以b链为转录模板。根据图3的转录方向可知，乙是启动子。 （2）BglⅡ和Sau3AI的切割产物可以相互连接，原因是二者切割后产生了相同的黏性末端，都是5'-GATC-3'；该连接物中间的碱基序列是GATC，两端不确定，所以不一定能再被BglⅡ切割。只有用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体，才能使目的基因正向插入，否则可能使目的基因和P1噬菌体载体反向连接或自身环化，再用DNA连接酶处理，即可得到图3的重组DNA。 （3）为了检测目的基因是否在大肠杆菌中稳定存在，从受体细胞中提取总DNA，可以设计引物1和3，并进行PCR。根据限制酶EcoRI和Sau3AⅠ的切割位点可知，只有选用引物1和3才能扩增出含目的基因的DNA片段。 21．（23-24高二下·河南·期末）THP9基因是野生玉米中控制高蛋白含量的优良基因，研究者利用基因工程技术将THP9基因转到玉米细胞内，从而获得转基因高蛋白玉米新品种。回答下列问题：    EcoRⅠ BamHⅠ KpnⅠ MfeⅠ HindⅢ 5'-G↓AATTC-3' 3'-CTTAA↑G-5' 5'-G↓GATCC-3' 3'-CCTAG↑G-5' 5'-G↓GTACC-3' 3'-CCATG↑G-5' 5'-C↓AATTG-3' 3'-GTTAA↑C-5' 5'-A↓AGCTT-3' 3'-TTCGA↑A-5' (1)PCR过程中需要添加缓冲液，缓冲液中的 可激活DNA聚合酶。若采用PCR技术对一个THP9基因进行扩增，则第n代复制共需要引物 个，PCR依据的原理是 。 (2)THP9基因游离的磷酸基团侧为 （填“5'”或“3'”）端，已知图中THP9基因转录方向为从左往右，则THP9基因转录时的模板链是 链。 (3)构建基因表达载体时，若科研人员需将THP9基因整合到如图质粒上，应使用限制酶 切割图中质粒，使用限制酶 切割图中含THP9基因的DNA片段，以获得能正确表达THP9基因的重组质粒。 (4)将THP9基因导入农杆菌中，在含氨苄青霉素的培养基上培养获得的菌落不一定含有重组质粒，原因是 。将从新鲜玉米叶片上取下的圆形小片与已成功导入THP9基因的农杆菌共同培养，筛选转化细胞并培育成转基因植株。欲从个体水平检测转基因玉米是否培育成功，实验方法是 。 【答案】(1) Mg2+ 2n DNA半保留复制 (2) 5' 乙 (3) MfeⅠ、HindⅢ EcoRⅠ、HindⅢ (4) 含未重组Ti质粒（或普通Ti质粒）的受体细胞也能正常生长 将转基因玉米在田间种植后收获玉米籽粒，检测其蛋白质含量 【分析】常用PCR特异性地快速扩增目的基因，PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 【详解】（1）PCR的产物是DNA，所以在过程中用到了缓冲液，缓冲液中一般要添加Mg2+用于激活DNA聚合酶。开始THP9基因只有1个，第（n—1）次结束后的基因有2n—1个，每个基因复制1次需要1对引物，第n次循环需要2n—1对引物，即2n个。PCR依据的是DNA半保留复制的原理。 （2）THP9基因游离的磷酸基团侧为5'端，已知图中THP9基因转录方向为从左往右，RNA聚合酶沿着子链的5'端延伸，即图中的乙链是模板链。 （3）图中THP9基因转录方向为从左往右，即启动子位于左端，终止子位于右端，因为该基因右侧只有一个酶切位点，故一定用HindⅢ切割质粒和目的基因，对于质粒来说，不能用EcoRI进行切割（含两个切割位点，会切成片段），不能用BamHⅠ切割（会切断启动子），那么在HindⅢ的左侧只有MfeⅠ序列，而目的基因不能用该酶切割，与MfeI能形成相同黏性末端的是EcoRI，故质粒用MfeI、HindⅢ切割，目的基因用EcoRⅠ、HindⅢ切割。 （4）含有重组质粒和普通质粒的农杆菌都能在含氨苄青霉素的培养基上生长。为了检测转基因技术是否成功，可将转基因玉米在田间种植后收获玉米籽粒，检测其蛋白质含量。 22．（23-24高二下·河南平顶山·期末）半夏球茎中的半夏蛋白是一种植物凝集素。该蛋白主要包含了半夏胰蛋白酶抑制剂和半夏凝集素，具有凝血和凝集细胞的生物活性，还具有抑菌、抗肿瘤和抗早孕等作用。半夏蛋白能够专一地与甘露糖及其缀合物结合，但不能与半乳糖、岩藻糖、葡萄糖及其聚合糖结合。科学家利用转基因技术使大肠杆菌（对氨苄青霉素敏感）具有产生半夏蛋白的功能。请回答下列问题： (1)在一定温度下，DNA遇 试剂会呈现蓝色，因此该试剂可鉴定DNA。目的基因指的是 的基因。 (2)如图表示科研人员构建重组质粒时用到的质粒和半夏蛋白基因，其中LacZ基因控制合成的酶可以分解无色的X-gal，产生蓝色物质。    ①从半夏体内分离出含半夏蛋白基因的DNA后，利用PCR技术大量扩增半夏蛋白基因，需要知道 ，以便合成引物。据图分析合成引物时，与目的基因左侧、右侧分别配对的引物5′端应添加限制酶 、 的识别序列。常采用 法来鉴定PCR产物。 ②将处理后的大肠杆菌接种到含有氨苄青霉素和X-gal的固体培养基上，若有蓝色菌落出现，则说明 。 【答案】(1) 二苯胺 编码蛋白质 (2) 一段核苷酸序列 Xho I Mun I 琼脂糖凝胶电泳 大肠杆菌导入了不带目的基因的质粒 【分析】基因工程的基本操作步骤有：获得目的基因、形成重组DNA分子、将重组DNA分子导入受体细胞、筛选含有目的基因的受体细胞和目的基因的表达。 【详解】（1）鉴定DNA用到的试剂为二苯胺，在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此该试剂可鉴定DNA。目的基因指的是编码蛋白质的基因。 （2）①PCR的前提是已知一段核苷酸序列，以便合成引物。由于目的基因的内部有Sal I和Nhe I的识别序列，所以不能选择这两种限制酶，又因为氨苄青霉素抗性基因的内部有EcoRI的识别序列，所以也不能选择EcoR I，据图分析合成引物时，与目的基因左侧、右侧分别配对的引物5′端应添加限制酶Xho I、Mun I的识别序列。PCR的产物常采用琼脂糖凝胶电泳法来鉴定。 ②LacZ基因控制合成的酶可以分解无色的X-gal，产生蓝色物质，将处理后的大肠杆菌接种到含有氨苄青霉素和X-gal的固体培养基上，若有蓝色菌落出现，说明该大肠杆菌导入了不带目的基因的质粒。 23．（23-24高二下·河南濮阳·期末）传统的木薯乙醇发酵工艺所使用的普通酿酒酵母缺乏水解淀粉的酶系，需要经过蒸煮、液化、糖化等工序将木薯中的淀粉水解成葡萄糖后才能用于酵母菌发酵。为了提高制备乙醇的效率，研究者欲通过基因工程获得能够高效表达和分泌淀粉酶的重组酿酒酵母。请回答下列问题： (1)若要利用从细菌中获得的含淀粉酶基因（amy）的DNA片段为模板，则通过PCR技术获得大量amy时，还需要在缓冲液中添加引物、4种脱氧核苷酸、 、镁离子等，需要添加引物的原因是 ；扩增 轮后能得到含目的基因的等长的DNA双链序列。 (2)研究发现，如果amy上特定位置的GTG（位置如图1）突变为ATG，淀粉酶的活性将大大提高。为了通过PCR引入该定点突变，获得高效的淀粉酶，需要如何设计PCR引物？ 。    (3)用限制酶BamHI与SpeI切割含amy的DNA片段和载体pScIKP，然后将amy与载体相连接，构建重组质粒pSc-amy。对pScIKP和目的基因采用双酶切的目的是 。 (4)已知淀粉遇碘变蓝，而葡萄糖遇碘无此现象。为了分离出能够高效表达淀粉酶基因的重组酵母，可使用含 的培养基。培养3天后，用碘熏蒸染色，结果如图2所示。若你是研究者，将选择菌落 （填数字）进行扩大培养，原因是 。    【答案】(1) 耐高温的DNA聚合酶 单个脱氧核苷酸只能添加到引物的3'端上 3 (2)将引物1相应位置上的GTG改为ATG (3)防止目的基因和载体pScIKP自身环化，且使目的基因能正向接入载体 (4) 淀粉 1 菌落1的透明圈直径与菌落直径之比最大 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）PCR反应缓冲液中需要加入的物质有模板、引物、4种脱氧核苷酸、镁离子以及耐高温的DNA聚合酶等。需要添加引物的原因是DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能将单个脱氧核苷酸添加到已有核苷酸链的3'端上。据题可知，PCR模板为从细菌中提取的含any的DNA片段，故扩增3轮后才能得到含目的基因的等长的DNA双链序列。 （2）结合图示可以看出，若要通过PCR使amy特定位置的GTG突变为ATG，获得高效的淀粉酶，需要将引物1相应位置上的GTG改为ATG。 （3）对载体pScIKP和目的基因采用双酶切的目的是防止目的基因和载体pScIKP自身环化，且使目的基因能正向接入载体，保证目的基因的正确表达。 （4）普通酿酒酵母不能分解淀粉，为分离出能分泌淀粉酶的重组酵母，可以用含淀粉的培养基培养酵母细胞，并用碘熏蒸染色，碘与淀粉反应呈蓝色，出现透明圈的菌落中酵母菌能分解淀粉，透明圈直径与菌落直径之比最大的说明菌落中酵母菌的分解能力最强。据此可以看出菌落1分解淀粉能力最强，因而可以作为目的菌。 24．（23-24高二下·河南新乡·期末）红色荧光蛋白（RFP）常作为检测目的基因是否表达的标记物。研究人员将RFP基因与目的基因（序列如图2所示）构建为融合基因，然后导入靶细胞中使其表达为一条多肽。回答下列问题： (1)通过PCR扩增目的基因时，需要设计一对引物，引物的功能是 。根据图2中目的基因的碱基序列分析，研究人员设计的下列几种引物中可用来扩增目的基因的是 。 ①    ② ③    ④ (2)将融合基因导入受体细胞时，需要构建基因表达载体。构建基因表达载体时需要使用 来切割融合基因和质粒，然后再使用 来连接两者。 (3)据图1分析，该融合基因在受体细胞中翻译时RFP与目的蛋白合成的顺序是 ，因此在连接两个基因时需要去除目的基因序列中决定 的部分和RFP基因序列中决定 的部分，这样翻译出来的才是一条肽链（后两空填“起始密码子”或“终止密码子”）。 (4)将融合基因导入受体细胞后，若动物细胞中出现 ，则说明目的基因成功表达。若需要进一步确定目的基因是否表达出蛋白质，则可用 法进行检测。 【答案】(1) 与模板链结合，使 DNA 聚合酶从引物的3'端延伸子链 ①和④ (2) 限制酶 DNA连接酶 (3) 先翻译目的基因，再翻译 RFP 终止密码子 起始密码子 (4) 红色荧光 抗原抗体杂交 【分析】基因工程的工具有限制性核酸内切酶、DNA连接酶和载体。基因工程的操作程序包括四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。一个完整的基因表达载体包括目的基因、标记基因、启动子、终止子等。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。终止子相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停下来，它位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段。 【详解】（1）引物的功能是与模板链结合，使 DNA 聚合酶从引物的3'端延伸子链。 引物一般和目的基因的3′ 端相连，根据碱基互补配对原则，选项中与图 2 中目的基因的3′ 端碱基序列互补的是 5′−AGCTAGCA−3′ 和是5′−TGCGCAGT−3′ ，所以可用来扩增目的基因的是①和④。 （2）构建基因表达载体时常用限制酶来切割融合基因和质粒，然后用 DNA 连接酶来连接两者。 （3）由图 1 可知，启动子的作用是启动基因转录的，因此该融合基因在受体细胞中翻译时先翻译目的基因，再翻译 RFP。 要使翻译出来的是一条肽链，需要去除目的基因序列中决定终止密码子的部分和 RFP 基因序列中决定起始密码子的部分。 （4）将融合基因导入受体细胞后，若动物细胞中出现红色荧光，则说明红色荧光蛋白（RFP）基因表达，进而说明目的基因成功表达，进一步确定目的基因是否表达出蛋白质则可用抗原抗体杂交法进行检测。 三、实验题 25．（23-24高二下·河南洛阳·期末）锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。通过基因工程可对锌吸收缺陷型酵母进行转化。回答下列问题。 (1)在基因工程操作时，若要从该植物体中提取锌转运蛋白的mRNA，常选用幼根而不选用老根作为实验材料，原因是 ；提取RNA时，提取液中需要添加RNA酶抑制剂，其目的是 ；以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是 。 (2)以cDNA为模板，利用PCR扩增并筛选锌转运蛋白基因，为便于锌转运蛋白基因与质粒连接，需在引物的 端加上限制酶识别序列，且常在两条引物上设计加入不同的限制酶识别序列，主要目的是 。 (3)为保证锌转运蛋白基因的表达，可将其插入到酵母菌质粒的 之间。 (4)为鉴定转化酵母是否赋予锌吸收特性，可通过配制含适量Zn2+的（酵母菌）固体培养基、灭菌，分成a、b两半区域，a、b区分别涂布少量缺陷型酵母和转化酵母，已知锌吸收缺陷型酵母菌增殖速度较慢，在适宜条件下培养一段时间后，若 ，则证明有转化成功的酵母。 【答案】(1) 幼根组织细胞易破碎 防止RNA降解 在逆转录酶的作用下,以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则合成cDNA (2) 5′ 使DNA片段能定向插入表达载体,防止目的基因自身环化 (3)启动子与终止子 (4)b区有些菌落明显大于a区的菌落 【分析】基因工程的基本操作程序：（1）目的基因的筛选与获取；（2）基因表达载体的构建；（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）在基因工程操作中，选择幼根作为实验材料提取锌转运蛋白的mRNA，是因为幼根代谢旺盛，细胞分裂快，锌转运蛋白基因转录旺盛，mRNA含量高，同时相比老根，幼根组织细胞易破碎；在该基因工程操作中，目的是提取锌转运蛋白的mRNA，而在提取液中添加RNA酶抑制剂，可防止被RNA降解；若要以mRNA为材料可以获得cDNA，可以在逆转录酶的作用下,以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则合成cDNA。 （2）PCR过程中，由于DNA子链是从引物的3’端延伸，因此在设计引物时，只能在两条引物的5’端加上限制性酶切位点。两种引物含不同的限制性酶识别序列，主要目的是为了使DNA片段能定向插入表达载体，同时防止构建基因表达载体时出现目的基因自身环化、质粒的自身环化或目的基因的反向连接。 （3）要将锌转运蛋白基因插入到质粒的启动子和终止子之间，才能保证锌转运蛋白基因的表达。 （4）配置含适量Zn2+的（酵母菌）固体培养基、灭菌，分成a、b两半区域，a区接种涂布少量的缺陷型酵母，b区接种涂布少量的转化酵母，由于锌吸收缺陷型酵母增殖较慢，转化成功的酵母赋予了锌吸收特性后增殖较快，在适宜的条件下培养一段时间后，若b区有些菌落明显大于a区的菌落，则证明有转化成功的酵母。 26．（23-24高二下·河南南阳·期末）某抗膜蛋白治疗性抗体药物研发过程中，需要表达N蛋白胞外段，制备相应的单克隆抗体，增加其对N蛋白胞外段特异性结合的能力。N蛋白胞外段抗原制备的流程如图1所示。回答下列问题： (1)用PCR 技术扩增N蛋白胞外段基因，需要设计一对 ，从而使DNA 聚合酶能从该物质的 （填“3'”或“5'”）端连接脱氧核苷酸。 (2)已知质粒属于非脂溶性的分子，用脂质体将重组慢病毒质粒导入病毒包装细胞，质粒最可能被包在脂质体的 （填“双分子层中”或“两层磷脂分子之间”）。 (3)用慢病毒感染海拉细胞进而表达并分离、纯化N蛋白胞外段。制备N蛋白胞外段单克隆抗体的流程如图2所示。 ①制备单克隆抗体的操作中，用N蛋白胞外段多次对小鼠进行免疫，目的是 。常用灭活的仙台病毒诱导B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，灭活病毒发挥作用的原理是 。 ②用选择培养基对融合后的细胞进行筛选，获得杂交瘤细胞，将其接种到96孔板，进行 培养。用 技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生N蛋白胞外段抗体，又能大量增殖的单克隆杂交瘤细胞株，经体外扩大培养后提取单克隆抗体。 【答案】(1) 引物 3' (2)双分子层中 (3) 使小鼠产生免疫反应，从而产生能产生特定抗体的B淋巴细胞 病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用 ，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合 克隆化 抗原-抗体杂交 【分析】单克隆抗体制备流程：（1）对小鼠注射特定的抗原使小鼠产生免疫反应；（2）从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；（3）将小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，再用特定的选择培养基进行筛选；（4）在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂种细胞才能生长；（5）对上述杂交瘤细胞还需进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选就可获得足量的能分泌所需抗体的细胞；（6）最后，将杂交瘤细胞在体外条件下做大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖。这样从细胞培养液或小鼠腹水中，就可以提取出大量的单克隆抗体。 【详解】（1）用PCR 技术扩增N蛋白胞外段基因，需要设计一对引物，从而使DNA 聚合酶能从该物质的3'端连接脱氧核苷酸。用PCR 技术扩增目的基因的过程中除了需要引物，还需要有模板、耐高温的DNA聚合酶及脱氧核苷酸等。 （2）脂质体由磷脂双分子层组成，磷脂分子的头部具有亲水性，尾部具有疏水性，质粒属于非脂溶性的分子，故质粒最可能被包在脂质体的双分子层中。 （3）制备单克隆抗体的操作中，用N蛋白胞外段多次对小鼠进行免疫，目的是使小鼠产生免疫反应，从而产生能产生特定抗体的B淋巴细胞。诱导B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合的方法有灭活的仙台病毒诱导法等，灭活病毒发挥作用的原理是：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用 ，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合；用选择培养基对融合后的细胞进行第一次筛选，获得杂交瘤细胞需进行第二次筛选，将其接种到96孔板，进行克隆化培养，用抗原-抗体杂交技术检测每孔中的抗体，筛选既能产生N蛋白胞外段抗体，又能大量增殖的单克隆杂交瘤细胞株，最后，将杂交瘤细胞在体外条件下做大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖。这样从细胞培养液或小鼠腹水中，就可以提取出大量的单克隆抗体。 / 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$