2.2.2动物细胞融合技术与单克隆抗体课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

1.动物细胞培养的条件?如何营造无菌无毒环境?二氧化碳作用? 2.动物细胞培养的过程? 3.为什么选择幼龄动物组织?由组织制作细胞悬液的方法? 4.培养的细胞分为那两大类?它们生长受抑制的原因?收集细胞的方法? 5.干细胞来自于哪里?造血干细胞来自哪里?iPS细胞如何获得的? 6.植物体细胞杂交技术诱导原生质体融合的方法?原理? 课前记忆(课前3分钟,大声背诵) 原理:细胞膜的流动性、植物细胞的全能性 物理方法:电融合法、离心法 化学方法:聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2+-高pH融合法 高考链接 2 在高考中主要选择题的形式考察“单克隆抗体的制备”, 考察学生对基础知识内容的识记、理解和应用。 3 学情反馈 优秀: 问题: 4 【课程标准】 1.阐明动物细胞核移植一般是将体细胞核移入一个去核的卵母细胞中,并使重组细胞发育成新胚胎,继而发育成动物个体的过程。 2.阐明动物细胞融合是指通过物理、化学或生物学等手段使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。 3.概述细胞融合技术是单克隆抗体制备的重要技术。 【学习目标】 1.通过对动物细胞融合技术的学习,能够说出动物细胞融合技术的原理、方法以及意义。 2.通过对单克隆抗体技术的学习,能够说出单克隆抗体制备过程及应用。 3.通过对动物体细胞核移植的学习,能够说出动物体细胞核移植的过程、应用前景及存在问题。 情境导入 使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞,但其没有特异性,使用时还会攻击健康细胞。科学家发明了一种新药:抗体—药物偶联物(ADC) 优点:位置准确、疗效高、副作用小 抗体-药物偶联物(ADC) 细胞凋亡 ① ADC被细胞吞噬 ② ⑤ ADC 抗体 药物 接头 实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。 如何获得大量这种和肿瘤细胞特异性结合的单一抗体?————单克隆抗体 向动物体内反复注射某种抗原 使动物 产生抗体 从动物血清中 分离所需抗体 有什么方法解决这个问题? 一.动物细胞融合技术 传统抗体制备方法及缺陷 提示: 每个B淋巴细胞只分泌一种特异性的抗体 抗体不纯 缺点:产量低、纯度低、特异性差 有什么方法解决传统抗体制备存在产量低、纯度低、特异性差的问题? 1个B淋巴细胞 B淋巴细胞群 大量单 一抗体 克隆 产生 在体外培养条件下,一个B淋巴细胞是不可能无限增殖的! 米尔斯坦 【英国】 科勒 【德国】 解决 1975年,英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒设计了一个极富创造性的试验方案: 抗体 B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 (单克隆抗体) 一.动物细胞融合技术 1.概念: 使_或_动物细胞结合形成_细胞的技术。 2.结果: 形成的 具有原来两个或多个细胞的 。 3.原理: . 4.诱导融合方法: 两个 多个 一个 杂交细胞 遗传信息 细胞膜具有流动性 5.意义: 突破了 的局限,使 成为可能。 有性杂交 远缘杂交 一.动物细胞融合技术 物理法:电融合法 化学法:聚乙二醇(PEG)融合法 生物法:灭活病毒诱 导法 动物细胞融合特有 6.融合实质及完成的标志: 细胞核的融合 一、动物细胞融合技术 [旁栏思考]19世纪30年代,科学家曾在肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。 病人体内病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。 9 10 01 动物细胞融合技术 灭活病毒诱导细胞融合的原理 灭活:指用物理或化学手段使病毒失去感染能力(不感染细胞), 但是并不破坏病毒的抗原结构(诱导细胞融合)。 病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用,使细胞互相凝聚,细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布,细胞膜打开,细胞发生融合。 【拓展】 二、单克隆抗体及其应用 合作探究:请同学们自主阅读教材P48-49,小组合作思考讨论完成问题。 3.会有几种细胞融合方式?杂交瘤细胞具有什么特点? 1.单克隆抗体制备过程中为什么给小鼠注射特定的抗原蛋白? 4.如何大规模进行培养得到大量的单克隆抗体? 2.产生特定抗体的杂交瘤细胞的获得需要几次筛选?各自筛选的方法和目的是什么? 11 动物细胞融合 动物细胞培养 给小鼠注射特定的抗原蛋白 B淋巴细胞(免疫) 骨髓瘤细胞 杂交细胞 杂交瘤细胞 单克隆抗体 能分泌所需抗体 的杂交瘤细胞 第一次筛选 第二次筛选 诱导融合 选择培养基 克隆化培养 抗体检测阳性 体外培养或体内培养(小鼠腹腔内) 总结:两次筛选的原因、方法、目的? 第一次筛选 第二次筛选 (需多次筛选) 原因 诱导融合后得到多种细胞。 B淋巴细胞不止一种,杂交瘤细胞不止一种。 方法 特定的选择培养基 用96孔板克隆化培养和抗体检测阳性 结果 筛选出杂交瘤细胞 筛选出分泌所需抗体的杂交瘤细胞 优点:既能大量繁殖又能产生专一抗体 优点:能准确地识别抗原的细微差异,与特定抗原发生特异性结合,可以大量制备 第一次筛选、第二次筛选有超链接 原理: ②诱导融合后的细胞有几种类型,若仅考虑两两细胞融合呢? ③ 杂交瘤细胞是如何筛选出来的? 2 杂交瘤细胞(多种) 1 3 置于选择性培养基上培养 第一次筛选 融合的细胞 BB B 1 3 2 (B-瘤)杂交瘤细胞 瘤-瘤 瘤 √ 选择培养基只允许杂交瘤细胞生长、增殖,未融合的亲本细胞和融合了同种核的细胞不能生存. 二.单克隆抗体技术 14 02 单克隆抗体及其应用 阳性孔 抗体检测的方法——抗原-抗体杂交法 在单克隆抗体制备过程中,两次筛选的目的和方法是不相同的。 将多种杂交瘤细胞群稀释,约每孔1个细胞进行培养(克隆化培养) 一段时间后,检测各孔上清液中细胞分泌的抗体 上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔 多孔细胞培养板 抗体检测板 分泌抗体能跟特定抗原结合的细胞即为所需杂交瘤细胞 16 知识拓展:第一次筛选获得杂交瘤细胞 ①细胞合成DNA有D和S两条途径,其中D途径能被氨基碟呤阻断。 ②人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径,但不能分裂增殖。 ③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径,没有S途径,但能不断分裂增殖。 筛选出杂交瘤细胞方法? B淋巴细胞及同型融合细胞 不能无限增殖,死亡 骨髓瘤细胞及同型融合细胞 不能无限增殖,死亡 杂交瘤细胞 能无限增殖,生长 培养基中加入氨基碟呤 ①作为诊断试剂 ②运载药物ADC(抗体-药物偶联物) ③作为药物治疗疾病 单克隆抗体的应用 实例1.抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体 实例2.单克隆抗体+同位素(荧光标记) 在特定组织中成像的技术,可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。 新型冠状病毒抗原检测 ②运载药物ADC(抗体-药物偶联物) 19 1. ADC 的抗体和药物各具有什么作用? 2. 除了细胞毒素,还有哪些物质理论上可以作为 ADC 偶联的药物? 3.单克隆抗体诊断试剂盒和 ADC 在临床应用上各具有什么优势? 【合作探究】任务一:单克隆抗体的应用 抗体主要发挥靶向运输作用,即通过特异性结合靶细胞表面的抗原,将连接的药物输送到靶细胞;药物发挥治疗效应,如杀伤靶细胞。 可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗。一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长,理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。 单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应,因此检测的特异性和灵敏度大大提高;生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用,有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒。ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用,因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。 课堂小结 20 给小鼠注射特定的抗原蛋白 B淋巴细胞 (免疫) 骨髓瘤细胞 杂交 细胞 杂交瘤 细胞 单克隆 抗体 能分泌所需抗体 的杂交瘤细胞 第一次 筛选 第二次筛选 诱导融合 选择培养基 克隆化培养,专一抗体检验 体外培养或小鼠腹腔内增殖 特异性强 灵敏度高 可大量制备 既能大量繁殖又能产生专一抗体 动物细胞融合 动物细胞培养 细胞膜的流动性 细胞增殖 21 03 体细胞核移植技术 4.种类: 胚胎细胞核移植: 体细胞核移植: 细胞分化程度低,表现全能性容易 细胞分化程度高,表现全能性十分困难 3.生殖方式: 1.概念: 将动物一个细胞的细胞核,移入去核的卵母细胞中,使这个重新组合的细胞发育成新胚胎,继而发育成动物个体的技术。 用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。 2.原理: 动物细胞核的全能性 无性生殖 难度小 难度大 22 01 体细胞核移植技术 ①供体细胞的细胞核在去核卵母细胞中不能完全恢复其_前的功能状态,这导致了_; 胚胎发育率低 ②对非人灵长类动物_进行操作的技术尚不完善。 胚胎 分化 5.非人灵长类动物体细胞核移植的困难原因 具有许多与人类相似的生物学特征的灵长类动物 2017年我国培育世界上 首例体细胞克隆猴 探究二、动物细胞核移植过程 下图为克隆羊“多莉”的培育过程示意图。请思考回答下列相关问题: 1.核移植时受体应选择什么细胞?为什么? 2.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前,什么时期去核?为什么必须先去掉受体卵母细胞的核? 卵母细胞 体积大、营养多、容易操作; 营养物质丰富,为发育提供充足营养 含有促使细胞核表达全能性的物质 M 中期的卵母细胞;为使核移植的胚胎或动物的核遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞。 探究二、动物细胞核移植过程 3.通过什么方法去核?通过什么方法使两细胞融合? 通过什么手段激活重组胚? 4.用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物,是对体细胞供体动物进行100%的复制吗?为什么? 梯度离心 紫外光短时间照射 化学物质处理 使DNA变性失活,达到去核的目的。 没有刺破卵母细胞膜,对卵母细胞伤害小。 方法:显微操作法 克隆动物遗传物质 细胞核的DNA 来自于供体动物的细胞核 线粒体中的DNA 供体细胞和卵母细胞 生活环境: 性状 可能发生基因突变、染色体变异等可遗传变异 两细胞融合的方法是电融合;用物理或化学方法(如电脉冲、钙离子载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂等)激活重构胚。 探究二、动物细胞核移植过程 5.通过体细胞核移植产生的克隆动物是有性生殖还是无性生殖? 6. 克隆羊的诞生是否证明了动物细胞具有全能性? 7.体细胞核移植技术与诱导iPS细胞相比有什么相似或不同之处? 通过体细胞核移植产生的克隆动物未经过生殖细胞的结合,属无性生殖。不是。 ①获得干细胞过程不同。前者可获得带有核供体细胞遗传物质的胚胎干细胞;诱导iPS细胞需在细胞中表达几个关键基因,将细胞逆转到类似胚胎干细胞的状态。 ②体细胞核移植技术对核供体细胞有较高要求,一般情况下体细胞的分化程度越高,它重编程转化为干细胞的成功率就越低;可诱导成为iPS细胞的细胞来源相对广一些,成纤维细胞、B淋巴细胞、脂肪干细胞等都可以诱导成为iPS细胞。 ③体细胞核移植技术涉及采集卵母细胞、去核、融合等复杂的操作;诱导iPS细胞的技术流程相对简单,可能更适合用于生产实践。 26 01 加速家畜遗传改良进程,促进优良畜群繁育。 1.应用前景 (1)在畜牧生产中 (2)医药卫生领域: A.利用此技术培育的转基因克隆动物,可作为生物反应器生产珍贵的医用蛋白。 B.治疗人类疾病时,转基因克隆动物的细胞、组织或器官,可作为异种移植的供体。 C. 患者的核移植胚胎干细胞经过诱导分化,能形成相应的细胞、组织或器官可用于移植以避免免疫排斥反应。 治疗性克隆 27 01 体细胞核移植技术 ①研究克隆动物可以使人类更深入地了解胚胎发育及衰老过程; ②克隆一批遗传背景相同的动物,可以通过它们之间的对比来分析致病基因; ③克隆特定疾病模型的动物,还能为研究该疾病的致病机制和开发相应的药物提供帮助。 (3)在科研领域: (4)在保护濒危物种方面:该技术有望增加濒危物种的存活数量 28 01 体细胞核移植技术 2、存在的问题 (1)成功率低: 克隆胚胎移植成功率平均不到10% 许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷,如体型过大、异常肥胖、发育困难、脏器缺陷、免疫缺陷等。 需要与发育生物学、细胞生物学和分子遗传学等学科更深层次的理论研究相结合; (3)健康问题: (2)理论研究较为滞后: $$