专题04 基因工程（安徽专用）-【好题汇编】备战2024-2025学年高二生物下学期期末真题分类汇编（安徽专用）

专题04 基因工程 一、单选题 1．（23-24高二下·安徽淮北·期末）丙酮被广泛用作生产塑料的原料和有机溶剂。热乙酸穆尔氏菌能以氢为能源，利用CO2或CO生产乙酸。研究团队去除了该微生物生成乙酸的相关基因，然后导入了其他基因，这样可以抑制乙酸的生成并促进丙酮的合成。下列说法错误的是（    ） A．基因工程成功的原因之一是不同生物的DNA结构不同 B．基因工程中的目的基因可以人工合成并通过PCR进行扩增 C．导入的其他基因需要与启动子等调控组件重组在一起 D．检测该微生物中新的基因是否表达，可进行分子水平的检测 2．（23-24高二下·安徽·期末）下图是通过基因工程获取目的基因hCGβ表达产物人绒毛膜促性腺激素（hCGβ）的过程，hCGβ基因导入AOX1启动子与终止子之间。其中，AOX1为甲醇氧化酶基因的启动子，只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达；甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔。下列说法错误的是（    ）    A．可以通过控制培养液中甲醇作为唯一碳源，来控制hCGβ基因表达 B．hCGβ基因与甲序列形成融合基因，有利于其控制合成的肽链的加工 C．阶段Ⅰ所需酶为限制酶、DNA聚合酶，阶段Ⅲ可通过PCR鉴定重组质粒 D．阶段Ⅳ导入重组质粒后，培养酵母菌所用培养基无须添加氨苄青霉素和组氨酸 3．（23-24高二下·安徽·期末）如图是基因工程培养转基因抗某真菌植物的简易流程，其中多个环节都需要检测与鉴定，下列说法错误的是（    ） A．①可以用PCR获取并用琼脂糖凝胶电泳来鉴定 B．标记基因可用来筛选②中的重组质粒 C．④分子水平上的检测都可以用PCR技术 D．④还需要在个体水平上进行该真菌接种鉴定 4．（22-23高二下·安徽蚌埠·期末）下列关于基因工程和蛋白质工程的说法错误的是（    ） A．基因工程需要在分子水平对基因进行操作 B．蛋白质工程需要在分子水平对基因进行操作 C．基因工程能产生天然不存在的蛋白质 D．蛋白质工程能产生天然不存在的蛋白质 5．（22-23高二下·安徽蚌埠·期末）下列关于基因工程基本工具的描述，错误的是（    ） A．限制酶能识别DNA分子的特定的核苷酸序列具有特异性 B．DNA连接酶可将任意两个DNA分子连接起来不具有特异性 C．限制酶切割产生的DNA片段通常有黏性末端和平末端两种 D．DNA连接酶主要有E．coliDNA连接酶和T₄DNA连接酶两类 6．（21-22高二下·安徽芜湖·期末）下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是（    ） A．DNA对高温的耐受性低于蛋白质 B．DNA溶于酒精，也溶于2mol/L的NaCl溶液 C．猪血取材方便，适宜用于提取和鉴定DNA D．从菜花细胞中提取DNA需先研磨破坏细胞 二、解答题 7．（22-23高二下·安徽蚌埠·期末）干扰素α-1b是基因工程药物，该药物利用大肠杆菌作为受体获得具有抗病毒、抑制肿瘤细胞增生，调节人体免疫功能的作用。下图为干扰素α-1b生产原理示意图。回答下列问题：    (1)逆转录获取干扰素基因后，常用PCR特异性地快速扩增干扰素基因，PCR技术的原理是 。实验人员在PCR反应溶液中加入模板、 Mg2+、4种脱氧核苷酸以及2种 ，PCR的产物常采用 来鉴定。 (2)在构建重组质粒的过程中，常用两种限制酶切割目的基因和质粒，这样做的目的是 。 (3)在利用基因工程技术制备干扰素的过程中，常用大肠杆菌作为受体细胞，研究人员一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种 的生理状态。 8．（23-24高二下·安徽亳州·期末）人体内的t-PA蛋白能高效降解血栓，是心梗和脑血栓的急救药。然而，为心梗患者注射大剂量的t-PA蛋白会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。据此，先对天然的t-PA基因进行序列改造，然后再采取传统的基因工程方法表达该改良基因，可制造出性能优异的t-PA改良蛋白。下图是通过两次PCR操作，运用大引物进行定点突变获取t-PA改良基因和利用质粒pCLYⅡ构建含t-PA改良基因的重组质粒示意图。（注：一次PCR操作可进行多次循环） (1)PCR扩增的第一步是使双链模板DNA变性。DNA中G+C的含量与变性要求的温度有关，DNA中G-C的含量越多，要求的变性温度越高。其原因是 。 (2)在PCR反应中，引物的作用是 。 (3)如果要利用微生物进一步克隆PCR定点诱变产物，其步骤包括： 、 、微生物的筛选和培养，从菌群中获取更多目的基因。为实现质粒和t-PA改良基因的高效连接，选用限制酶XmaⅠ而不选用限制酶SmaⅠ的原因是 。为将t-PA改良基因连接在质粒上，还需要 等酶。 9．（23-24高二下·安徽·期末）理论上，体型越大的动物，其体内细胞数量就会越多，细胞分裂的次数也越多，因此突变的机会理应更高，患癌症的风险也越大，但体积是人类数倍的大象，却不那么容易得癌症。研究发现，大象体内含有多达20份的TP53基因，而人类及其他大部分动物只有1份TP53基因。TP53基因表达的P53蛋白能够修复因复制而出现损伤的核DNA，或在核DNA损伤严重时参与启动细胞凋亡。科研工作者拟将大象的多拷贝TP53基因导入小鼠体内，研究其是否能够使小鼠不易患癌症，相关过程如图1所示。 请回答下列问题： (1)可利用PCR获取大象的多拷贝TP53基因，PCR的原理是 ，PCR反应体系中需要含有缓冲液、模板（目的基因）、4种脱氧核苷酸、引物、 等。应选用图2中的引物 （填图中字母），其扩增产物常采用 法进行鉴定。 (2)若要进行①过程，精子需要 ，卵母细胞需要培养到 期。过程②最常用的一种方法是 。 (3)过程④为胚胎分割，操作时要注意将 （填“a”“b”或“c”）均等分割。过程⑤的实质是 ；进行过程⑤前，对代孕母体应进行的操作为 。 10．（21-22高二下·安徽亳州·期末）早在新冠疫情暴发初期，我国就布局了5条疫苗研发的技术路线，包括了灭活疫苗、腺病毒载体疫苗、重组蛋白疫苗、减毒流感病毒载体疫苗和核酸疫苗。当前我国全民免费接种的主要是灭活疫苗；而科学家陈薇院士团队自主研制腺病毒载体疫苗具有安全、高效、引发的不良反应少的优点。下图所示为科学家陈薇教授团队研制腺病毒载体疫苗的原理。 (1)上图所示②④过程中必须用到的酶有3种，分别是 、 、 。 (2)获取目的S蛋白基因是各种疫苗研制途径需要解决的首要问题，通常采用以下两种方法，一是利用病毒的RNA进行逆转录得到DNA  后，利用PCR技术扩增得到基因S，PCR过程每次循环分为三步，其中温度最低的一步是 ；二是完成病毒S基因测序后，直接人工合成基因S。 (3)为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S，基因工程的基本操作流程中最关键的步骤是 。 一、单选题 1．（23-24高二下·安徽六安·期末）下列关于基因工程基本工具的叙述，正确的是（    ） A．DNA聚合酶能够催化形成磷酸二酯键，是基因工程中的“分子缝合针” B．限制酶切割DNA分子一次可断开2个磷酸二酯键，产生2个游离的磷酸基团 C．有些DNA连接酶既能连接双链DNA片段互补的黏性末端，又能连接双链DNA片段的平末端，从而恢复被限制酶切开的氢键 D．用做分子运输车的质粒有抗生素合成基因，便于重组DNA分子的筛选 2．（23-24高二下·安徽六安·期末）下列关于基因工程的说法正确的是（    ） A．基因表达载体中启动子是DNA聚合酶的结合部位，启动复制过程 B．基因表达载体一般包括目的基因、标记基因、启动子和终止密码子等结构 C．利用PCR技术获取目的基因依据的是DNA半保留复制的原理 D．将目的基因导入植物细胞和动物细胞分别采用花粉管通道法和农杆菌转化法 3．（23-24高二下·安徽亳州·期末）下列有关“DNA粗提取与鉴定”、“PCR扩增”、“琼脂糖凝胶电泳”实验的叙述中，正确的是（　　） A．DNA的粗提取与鉴定实验中可利用DNA在酒精中溶解度较大的特点来提取DNA B．电泳缓冲液配制的琼脂糖溶液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察 C．PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶在复性过程中起作用 D．将提取到的丝状物与二苯胺溶液充分混匀后，溶液变为绿色 4．（23-24高二下·安徽·期末）家禽的饲料中富含谷物，纤维素是谷物的重要成分，但家禽消化道中缺少能降解纤维素的酶，阻碍了家禽对饲料的吸收与利用。研究人员利用转基因技术改造乳酸杆菌，将其添加到饲料中，以提高家禽养殖效率。枯草芽孢杆菌的W基因可编码一种可高效降解纤维素的酶，已知图中W基因转录方向是从左往右。为使乳酸杆菌产生该酶，以图中质粒为载体进行转基因，下列说法不正确的是（    ） 限制酶 BamHⅠ EcoRⅠ MfeⅠ KpnⅠ HindⅢ 识别序列和切割位点（5′→3′） G↓GATTC G↓AATTC C↓AATTG GGTAC↓C A↓AGCTT A．家禽肠道内乳酸杆菌细胞呼吸产生的物质可抑制某些微生物生长 B．限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来，种类繁多且具有专一性 C．在受体细胞中，W基因转录时以乙链为模板，可以边转录边翻译 D．为获得正确表达W基因的重组质粒，应选HindⅢ和EcoRⅠ切割质粒 5．（23-24高二下·安徽·期末）PCR的产物需要通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。下列相关叙述错误的是（    ） A．凝胶的浓度会影响DNA分子的迁移速率 B．凝胶糖溶液需冷却后才能倒入模具进行电泳 C．加样时，每吸取一种试剂后必须更换移液器枪头 D．电泳完成后需要在紫外灯下才能观察到电泳条带 6．（23-24高二下·安徽·期末）T4溶菌酶是一种重要的工业用酶，但在温度较高时易失去活性，科学家研究发现，若将其第3位的异亮氨酸变为半胱氨酸，可在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成一个二硫键，提高T4溶菌酶的耐热性。下列相关叙述错误的是（    ） A．T4溶菌酶是否耐热取决于蛋白质的空间结构 B．提高T4溶菌酶耐热性的过程属于蛋白质工程的范畴 C．引起T4溶菌酶空间结构发生改变的根本原因是氨基酸序列的变化 D．替换T4溶菌酶第3位氨基酸的操作中，直接操作对象是T4溶菌酶基因 7．（23-24高二下·安徽六安·期末）一种天然蛋白t-PA能高效降解因血浆纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药，但是心梗患者注射大剂量的t-PA会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低其诱发出血的副作用。据此，先对天然t-PA基因的碱基序列进行改造，然后再采取传统的基因工程方法表达该改造后的基因，可制造出性能优异的改良t-PA蛋白。下列说法正确的是（    ）    A．蛋白质工程是通过改造现有基因来定向改造蛋白质，以满足人类生产和生活的需求 B．构建重组质粒时可选用限制酶XmaI和NheI切割质粒pCLY11 C．使用T4DNA连接酶不能将t-PA改良基因与质粒pCLY11连接 D．成功导入重组质粒的受体细胞在含有新霉素的培养基上能存活，且呈现白色 8．（23-24高二下·安徽·期末）2024年5月24日，安徽医科大学第一附属医院完成了世界首例活体人的异种肝移植手术，成功将610克的转基因猪肝脏移植到了一位肝癌重症患者身上。本例转基因猪到活体人的异种移植取得成功，开创了转基因猪异种肝移植的先河。下列关于转基因技术说法错误的是（　　） A．选用猪做克隆器官供体是因为其内脏构造、大小与血管分布和人的类似，且体内可导致人类疾病的病毒少 B．该操作的核心步骤是基因表达载体的构建，需要用到限制酶、DNA连接酶两种工具酶 C．调节基因导入的受体细胞取决于需要的器官类型，若需要移植肝脏，则受体细胞为肝细胞 D．若要检测目的基因是否导入了受体细胞，可以利用PCR 等技术进行检测 9．（23-24高二下·安徽黄山·期末）用A和B两种限制酶同时和分别处理同一DNA片段，限制酶对应切点一定能切开。两种酶酶切位点及酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定结果如图1和图2所示。下列叙述错误的是（    ） A．利用限制酶A和B同时处理图1DNA片段，产物中共有6个游离的磷酸基团 B．据图推测图1中X代表的碱基对数为4500bp，Y是限制酶A的酶切位点 C．利用PCR从图1DNA片段中扩增出完整X，至少需要3轮循环 D．据图2可推测在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子碱基对数量有关 10．（23-24高二下·安徽芜湖·期末）干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，重组人干扰素α-1b是我国批准生产的第一个基因工程药物，主要用于治疗慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎等。为了获取干扰素基因，需要的模板和其他材料分别是（    ） ①淋巴细胞的所有DNA②肝细胞的总RNA ③引物④逆转录酶⑤dNTP⑥DNA连接酶⑦RNA酶抑制剂⑧解旋酶⑨耐高温的DNA 聚合酶 A．①；③⑤⑨ B．②；③④⑤⑨ C．①；③⑤⑧⑨ D．②；③④⑤⑥⑦ 11．（23-24高二下·安徽芜湖·期末）透明质酸是一种应用广泛的黏多糖，研究者欲改造枯草芽孢杆菌提高透明质酸的生产产量。透明质酸合成酶基因H上的一段核苷酸序列为“一ATCTCGAGCGGG—”，则对该序列进行剪切的限制酶识别的核苷酸序列最可能为（    ） A．—TCTCGA— B．—CTCGAG— C．—CGAGCG— D．—TCGAGC— 12．（23-24高二下·辽宁鞍山·期末）小麦和水稻是我国主要粮食作物，其中赖氨酸含量很低，科研人员通过以下操作，将辣椒中的含赖氨酸较高的某蛋白基因转入小麦，流程如下图。下列叙述正确的是（    ）    A．逆转录合成DNA的过程需要DNA聚合酶催化 B．通过逆转录获得的cDNA有多种 C．目的基因直接导入小麦就能表达高赖氨酸蛋白 D．T0代转基因植株一定可培育出纯合含高赖氨酸蛋白的植株 13．（22-23高二上·安徽芜湖·期末）下列关于PCR的叙述错误的是（　　） A．用PCR方法扩增目的基因时需要知道基因的部分序列 B．设计的引物序列必须全部能够和模板DNA碱基互补 C．复性温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物 D．第四轮循环产物中含有两种引物的DNA片段所占比例为7/8 14．（22-23高二下·安徽阜阳·期末）下列关于DNA粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定的原理叙述错误的是（    ） A．电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着它所带电荷相反的电极移动的原理 B．利用DNA不溶于酒精，但蛋白质均溶于酒精的原理，可完全分离DNA与蛋白质 C．PCR技术利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合 D．利用在一定温度下DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色的原理对粗提取的DNA进行鉴定 15．（22-23高二下·安徽亳州·期末）甲醇酵母菌是基因工程中常用的受体菌，它可以高效表达外源蛋白，但自身蛋白分泌到培养基的较少。研究人员将人的胶原蛋白基因导入甲醇酵母中并成功表达。下列有关叙述错误的是（　　） A．可以用两种酶切割目的基因和质粒 B．常用显微注射法将胶原蛋白基因导入甲醇酵母中 C．与大肠杆菌相比，甲醇酵母作受体菌所表达出的胶原蛋白与人体产生的胶原蛋白结构更相近 D．与其它酵母菌相比，甲醇酵母作受体菌便于表达出的胶原蛋白的分离与纯化 16．（22-23高二下·安徽黄山·期末）酵母人工染色体（YAC）是由酵母细胞中必需的端粒、着丝粒和复制起始序列等与目的基因和质粒构建成的表达载体。下图表示利用整合有人源抗体IgM基因的YAC，培育能分泌人源抗体的小鼠的三个技术路线图。下列相关叙述正确的是（    ）    A．①②③过程将YAC导入三种受体细胞都只能用显微注射法 B．④过程中获得的融合细胞能表现小鼠和酵母菌的所有遗传特性 C．⑤⑥过程均需涉及胚胎移植，且需对受体小鼠进行免疫检查 D．从YAC—转IgM基因小鼠体内提取的抗体仍需经检测后使用 二、解答题 17．（23-24高二下·安徽芜湖·期末）实验中对DNA进行鉴定时，做如下操作： 试管 序号 A B 1 加2mol/LNaCl溶液5mL 加2mol/LNaCl溶液5mL 2 不加 加入提取的DNA丝状物并搅拌 3 加4mL二苯胺，混匀 加4mL二苯胺，混匀 4 沸水浴5分钟 沸水浴5分钟 实验现象 实验结论 (1)据图，完成表格空白处的实验内容 。 (2)对B试管，完成1、2、3的操作后溶液颜色如何？ 。 (3)在沸水中加热的目的是 ，同时说明DNA对高温有较强的 。 (4)A试管在实验中的作用是 。 (5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与 有关。 18．（23-24高二下·安徽六安·期末）科学家将鱼抗冻蛋白基因转入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高，可以在相对寒冷的环境中生长。质粒上有PstI、SmaI、HindⅢ、Alul四种限制性内切核酸酶切割位点，下图是转基因抗冻番茄培育过程的示意图（amp'为抗氨苄青霉素基因），其中①~④是转基因抗冻番茄培育过程中的相关步骤，甲、乙表示相关结构或细胞。请据图作答： (1)基因工程中常用质粒作为载体，将基因送入受体细胞中。作为运载体的质粒除了必须有复制原点、标记基因之外，通常还需要有 ，图中的标记基因是 ，其主要作用是 。 (2)基因工程中核心步骤是 ，在此过程中，为使目的基因定向插入运载体中，本实验中应该选用限制酶 对鱼抗冻蛋白基因和质粒进行切割。 (3)培育出的番茄植株是否具有抗冻性状，可采用鉴定方法是 。 (4)PCR技术是获取目的基因的主要手段。PCR扩增目的基因时设计引物序列的主要依是 ，若一个该DNA分子在PCR仪经过4次循环，产物中共有 个等长的目的基因片段，PCR产物通常采用 法来鉴定。 (5)研究人员采用了如下图巢式PCR技术获取抗冻蛋白基因，巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应（PCR），使用两对PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物（也称外引物）扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部，也称内引物）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。 相比于常规PCR，巢式PCR获得错误目标产物概率 。 19．（23-24高二下·安徽蚌埠·期末）为加速转基因奶牛的繁育，科学家通过转基因技术将人的生长激素基因导入奶牛体细胞，通过核移植技术和早期胚胎培养技术对此转基因奶牛进行克隆生产，过程如图所示。回答下列问题： (1)现在，常用PCR特异性快速扩增目的基因，PCR反应需要提供DNA模板，2种引物，4种脱氧核苷酸和 酶，该酶活性需要 激活。PCR经过 过程，完成一轮循环。 (2)在基因表达载体构建的过程中，需将目的基因插入到载体的 之间，标记基因的作用是 。 (3)在对含有人生长激素基因的奶牛体细胞进行培养时，细胞增殖的方式是 。奶牛体细胞增殖表现出细胞贴壁的特点，传代培养时需要多次用 酶处理。 (4)形成重组细胞时，应选用 期的卵母细胞。将重组细胞培养成的重构胚移入受体母牛后，该母牛生出的犊牛并不是100%对供体的复制，原因是 。对该奶牛进行克隆的原理是 。 20．（23-24高二下·安徽·期末）PCR定点突变技术是最常用的基因突变技术，通过定点诱变可以在体外改造DNA分子。重叠延伸PCR是发展最早的PCR定点突变技术，操作过程如图1，可通过测序检验定点突变是否成功。现欲将改造后的基因构建重组质粒导入大肠杆菌，质粒结构如图2。请回答有关问题： (1)PCR技术的原理是 ，引物的作用是 。 (2)由图1可知，第1对引物是突变引物FP2和通用引物RP2，第2对引物是通用引物FP1和突变引物RP1，2对引物参与的PCR过程不能在同一反应系统中进行，原因是 。 (3)为筛选出含有目的基因的大肠杆菌，通常采用影印法（使用无菌的绒毡布压在培养基A的菌落上，带出少许菌种，平移并压在培养基B上，结果如图3）。培养基A中添加氨苄青霉素，培养基B中添加四环素，含有重组质粒的菌落是 （填数字），原因是 。 (4)科学家以Rubisco酶的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，利用PCR定点突变技术改造Rubisco酶基因，提高了Rubisco酶对CO2的亲和力，进而提高植物的光合作用速率，以满足人类生产和生活的需求。和传统基因工程相比，该过程最突出的优点是 。 21．（23-24高二下·安徽淮北·期末）随着抗生素需求的增加，利用基因工程从微生物中获得抗生素已成为生产抗生素的一种重要途径。某实验室欲利用大肠杆菌获得抗体，图1表示该抗体基因及部分碱基序列，图2表示质粒及限制酶的切割位点，图3表示不同限制酶的识别序列，其中AmpR、KanR分别为氨苄青霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因。回答下列问题：    (1)限制酶作用于DNA分子的 键，其切割DNA后可产生 和平末端。 (2)将图1中抗体基因与图2中质粒结合的过程称为 ，结合过程中使用的限制酶是 。将目的基因导入受体细胞后，可在培养基中加入 （填“氨苄青霉素”或“卡那霉素”）对目的细胞进行筛选。 22．（23-24高二下·安徽宣城·期末）干扰素是一种广谱抗病毒制剂，下图为通过基因工程生产干扰素的部分操作，图中①②③④表示相关操作过程。回答下列问题： (1)通过提取细胞中的RNA逆转录获得干扰素基因，与细胞中原有的干扰素基因相比，该基因不含 和内含子。 (2)②过程可使用PCR技术大量扩增干扰素基因，PCR技术要在缓冲体系中添加Mg2+、dNTP、两种引物、 、 等。PCR技术的一轮循环要经过三个步骤，其中温度最高的步骤是： （填步骤名称）。PCR的产物通常要用琼脂糖凝胶电泳技术进行鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与 、 等有关。 (3)③过程通常要用不同的限制酶对质粒和干扰素基因进行切割以露出不同的黏性末端，这是为了防止 。 (4)科学家发现，如果将干扰素分子上的第17位半胱氨酸变成丝氨酸，在一定条件下可以延长保存时间。上述对干扰素的改造过程属于 工程的范畴。如利用发酵工程来生产干扰素，发酵结束后可采用适当的提取、分离和 措施来获得干扰素。 23．（23-24高二下·安徽·期末）苹果切开后颜色会加深的现象称为“褐变”，“褐变”是由于多酚氧化酶催化多酚类物质生成棕色色素所致，科研人员用农杆菌转化法培育出了抗褐变转基因苹果。结合下图，回答有关植物转基因和克隆的问题。 (1)农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞基因组中的原因是 。愈伤组织细胞是具有较强的增殖分化能力的薄壁细胞， 技术常用于植物克隆，图中 过程中（填编号）生长素与细胞分裂素的比例应基本相等。 (2)研究应以抑制多酚氧化酶表达的基因作为目的基因，原因是 。研究人员拟用PCR扩增目的基因片段，设计引物时，需要避免引物之间发生 而造成引物失效。已知目的基因的一条链为5’——ATTCCA……CATGCC—3’，设计了一条引物为5’-GGCATG-3’，另一条引物为 （写出6个碱基即可）。 (3)用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞前，需先将构建好的目的基因表达载体导入农杆菌，一般先用Ca2+处理农杆菌细胞使其处于一种 的生理状态。 24．（23-24高二下·安徽阜阳·期末）若要利用某目的基因（如图1）和P1噬菌体载体（如图2）构建重组DNA（如图3），限制性内切核酸酶的酶切位点分别是 BglⅡ（A↓GATCT）、EcoR I （G↓AATTC）和Sau3AI（↓GATC），回答下列问题。 (1)用BglⅡ和Sau3AⅠ分别切割目的基因和P1噬菌体载体，这两种限制酶的识别序列和切割位点均不相同，切出DNA片段的特点是 。 (2)只有用 限制酶切割目的基因和P1噬菌体载体，构建的重组DNA中RNA聚合酶在插入目的基因上的移动方向，只能与图3一致。 (3)若目的基因是来自某单链RNA病毒表面的糖蛋白（GP）基因，则从该病毒基因组中分离出来GP 基因不能直接与质粒载体重组，原因是 。为了判断某人是否感染该病毒，利用探针对疑似患者进行核酸检测，要在短时间内快速生产探针可利用 技术实现。 (4)若该目的基因为利用山羊乳腺生物反应器制备的Hp疫苗基因，则在构建基因表达载体时往往需要 启动子，其目的是 。 25．（23-24高二下·辽宁鞍山·期末）某研究团队将水母细胞中获取的绿色荧光蛋白基因（GFP）插入野生型小鼠Gata3基因一侧，如图甲所示，实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雄鼠1只，让其与野生型雌性小鼠交配获得F1，再让F1中含GFP基因的雌雄鼠相互交配，以获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠F2。为了鉴定交配获得的多只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。回答下列问题。 (1)启动子的作用是 ，Gata3基因的启动子 （能/不能）驱动GFP基因的表达。 (2)插入GFP基因的DNA，转录该基因时的模板链是 链，水母细胞中的GFP基因可以在小鼠细胞中表达出绿色荧光蛋白，原因是 。 (3)PCR扩增中引物的作用是 。用引物1和引物2对亲本雄鼠DNA进行PCR扩增，产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，结果如图乙所示。从DNA结构解释亲本雄鼠产生两个条带的原因 ，用同样的方法对F2中多个个体DNA进行PCR扩增并电泳，在图乙中绘制F2可能出现的所有电泳结果。 26．（23-24高二下·安徽芜湖·期末）某真菌的W基因可编码一种高效降解纤维素的酶，已知图中W基因转录方向为从左往右。为使细菌产生该酶，以图中质粒为载体，进行转基因。 限制酶 BamHI EcoR I Mfe I Kpn I HindⅢ 识别序列和切割位点 G↓GATCC G↓AATTC C↓AATTG GGTAC↓C A↓AGCTT (1)从真菌中获取相应基因后通过PCR技术扩增W基因序列。扩增结果用 检测，检测结果显示有多个条带，试从引物设计的角度分析原因 。 (2)基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。这一步骤应使用限制酶 切割图中质粒，使用限制酶 切割图中含W基因的DNA片段，以获得能正确表达W基因的重组质粒。 (3)W基因转录时应以 链为模板,形成的mRNA的序列为5'---UGAAC-GCUA……(中间序列)…GUCGACUCG---3'。则用于PCR扩增的引物中应有的序列为 。 A．5'--TGAACGCTA…               B．5'--CGAGTCGAC… C．5'--ACTTGCGAT…               D．5'---GCTCAGCTG… 27．（22-23高二上·安徽芜湖·期末）生长激素在治疗激素分泌过少的矮小症方面有积极的作用，为了批量生产生长激素，可以采用转基因技术将控制生长激素合成的基因转移到微生物细胞内。请回答下列相关问题： (1)该技术流程的核心步骤是 。 (2)①获取生长激素基因时可以使用PCR技术扩增，该技术的一个循环中所需温度最低的步骤是 。下表是用于扩增的两种引物序列，请据表回答相关问题： 引物名称 引物序列（5'-3'） 引物1 TTCGATGTTGAGGGTGCTCAT 引物2 TCACACCAGTTGAAAATCCTAATTG 引物1对应的模板链序列（5'-3'）为 。 ②下图为生长激素基因的部分序列，请问引物1和引物2分别对应的位置 。 A．I和Ⅱ  B．Ⅱ和Ⅲ  C．Ⅲ和Ⅳ  D．I和Ⅳ ③假设加入的模板数为a，引物能与模板上唯一基因序列特异性结合，理论上n次循环需要消耗引物2的数量是 。 (3)若目的基因用限制酶切割后形成如图1所示的末端，则切割质粒载体（图2所示）应选择使用的限制酶是 。 28．（22-23高二下·安徽合肥·期末）研究人员利用AFPs抗冻基因和Ti质粒构建重组质粒，选择所需重组质粒转入番茄植株，培育抗冻番茄，主要操作过程如下图。抗冻番茄经低温诱导后可溶性蛋白均比对照明显增加，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳可检测到可溶性蛋白的C区和B区染色加深。已知三种限制酶的识别序列及酶切位点如下表所示。请回答下列问题：    限制酶 BamH I Bgl Ⅱ EcoR I 识别序列及酶切位点 —G↓GATCC —A↓GATCT —G↓AATTC— (1)构建重组质粒时，应选择 、 （酶）分别切割质粒和含AFPs抗冻基因的外源DNA。 (2)培育转基因植物时，常选择Ti质粒作为目的基因载体的原因是 。将导入了表达载体的农杆菌与取自番茄的细胞共同培养，通过农杆菌的 作用就可使目的基因进入番茄细胞，为筛选成功导入抗冻基因的番茄细胞，需在培养基中添加 。通过过程④获得完整的植株，依据的原理是 。与常规的种子繁殖方法相比，利用该技术培育抗冻番茄植株的优点是 。 (3)可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测经低温诱导后抗冻番茄植株中的可溶性蛋白，若 ，则表明AFPs基因已表达出相应的蛋白质；也可采用 进行个体生物学水平的检测。 29．（22-23高二下·安徽六安·期末）PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0.9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题： (1)为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经 过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。 (2)图1为所用载体图谱示意图，在利用PCR扩增phb2基因时，为了使PCR产物能被限制酶切割，以便构建基因表达载体，可以考虑在引物的 （填“3＇”端或“5＇端”）添加限制酶识别序列。而在扩增的phb2基因两端分别引入两种不同限制酶的识别序列是常用方法，对于酶切的phb2基因和载体来说选择两种限制酶切比只用一种限制酶切好的原因是： 。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用 （填“E．coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）。        相关限制酶的识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点 HindⅢ A↓AGCTT TTCGA↑A EcoRⅠ G↓AATTC CTTAA↑G Pvit2 CAG↓CTG GTC↑GAC PstⅠ CTGC↓AG GA↑CGTC KpnⅠ G↓GTACC CCATG↑G BamHⅠ G↓GATCC CCTAG↑G 注：箭头表示切割位点 (3)将符合要求的基因表达载体导入工程菌后，可用 技术检测PHB2蛋白是否合成，通过提取、分离和纯化，从发酵液中获得该蛋白。为防止PHB2蛋白在工程菌细胞中被降解，在发酵过程中应选用 缺陷型工程菌作为受体细胞，且在发酵结束后的纯化过程中应添加蛋白酶抑制剂。 (4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2， 号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。    注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0.2kb的DNA分子条带未出现在图中 30．（22-23高二下·安徽合肥·期末）脑血栓是威胁人类健康的常见疾病，研究发现人体内的t-PA蛋白能高效降解由纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药。通过基因工程技术可以大量制备基因工程药物t-PA。    (1)研究人员采用PCR技术可以获得大量t-PA基因，PCR的原理是 ，此外，除上述外获得t-PA基因的方法还有 （答出1种即可）。 (2)研究表明，为心梗患者注射大量t-PA会诱发颅内出血，其原因在于t-PA与纤维蛋白结合的特异性不高，若将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。据此，先对天然的t-PA基因进行序列改造，然后再采取传统的基因工程方法表达该改造后的基因，可制造出性能优异的改良t-PA蛋白。（注：如图乙表示相关的目的基因、载体及限制酶。pCLY11为质粒，新霉素为抗生素。）请回答下列问题： ①以上制造出性能优异的改良t-PA蛋白的过程被称为 。已知人t-PA基因第84位半胱氨酸的模板链碱基序列为ACA，而丝氨酸的密码子为UCU，因此改造后的基因决定第84位丝氨酸的模板链的碱基序列应设计为 。 ②如图所示，需选用限制酶XmaI和 切开质粒pCLY11，才能与t-PA改良基因高效连接。与单一酶酶切相比，本操作采用的双酶切方法的优点是 。 (3)将连接好的质粒DNA导入大肠杆菌，含t-PA改良基因重组质粒的细胞应具有的性状是________________。 A．新霉素抗性且呈蓝色 B．新霉素敏感且呈蓝色 C．新霉素抗性且呈白色 D．新霉素敏感且呈白色 31．（22-23高二下·安徽亳州·期末）请回答下列关于基因工程的相关问题： (1)在标准的PCR体系中需要加入 和 种引物，引物的作用是 。 (2)构建基因表达载体时，需要用 将目的基因与载体连接，因此需要在目的基因两侧加上酶切位点。PCR完成以后，常采用 来鉴定PCR的产物。 (3)用两种酶切割目的基因和质粒要优于同种酶切割，其优点是 。 (4)若要用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞，应选用下图中的 作为表达载体（图中→代表目的基因，箭头方向代表转录方向；Bar基因是标记基因），原因是 。 A． B．  C．  D．  E.   32．（22-23高二下·安徽亳州·期末）为生产具有特定性能的α-淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中利用PCR克隆了α-淀粉酶基因，利用基因工程大量制备α-淀粉酶，流程如图所示。请回答下列问题：    (1)科研人员利用PCR克隆α-淀粉酶基因时，引物在扩增过程中的作用是 。 (2)构建重组表达载体时，应使用 （酶）“缝合”α-淀粉酶基因和表达载体。若将重组表达载体导入大肠杆菌，则大肠杆菌需经Ca2+处理，使其处于一种能 的生理状态。 (3)筛选分解淀粉能力强的工程菌时，常用 （填“稀释涂布平板法”或“平板划线法”）进行筛选，菌株应接种在以淀粉为 的培养基上，筛选时并不能仅仅以降解圈的大小为观察指标，原因可能是 。 (4)若对工程菌生产的α-淀粉酶进行产品分析，还需要进行的工作有 （答出1点）。 33．（22-23高二下·安徽合肥·期末）新冠疫苗有多种，包括灭活疫苗、腺病毒载体疫苗、重组亚单位疫苗和核酸疫苗等。下图为其中一种疫苗的研发思路，图中①~⑦表示过程，箭头表示 Nco I、Sph I、Nhe I、BamH I的酶切位点（四种酶的识别序列详见表），标记基因 SUC2控制合成蔗糖酶，使 P型酵母菌能利用培养基中的蔗糖生存。 限制酶 Nco I Sph I Nhe I BamH I 识别序列和切割位点 C↓CATGG CCATG↓C G↓GATCC G↓CTAGC (1)图中①过程需要使用逆转录酶先得到 cDNA，再使用 技术扩增得到 S 基因。完成以后，常采用 鉴定扩增产物。 (2)为使③过程顺利进行，需先使用限制酶 和 切割质粒B，选用两种限制酶对新冠病毒的S基因进行切割的目的是 （答出一点即可）。 (3)图中表示筛选的过程是⑤，为达到利用标记基因筛选的目的，普通的 P型酵母菌应该满足的条件是 。 34．（22-23高二下·安徽合肥·期末）研究人员将大麦细胞的LTP1基因导入啤酒酵母菌中，获得的啤酒酵母菌可产生LTP1蛋白，并酿出泡沫更加丰富的啤酒，下图为转基因啤酒酵母的生产过程。回答下列问题：    (1)已知DNA复制时子链的延伸方向是5'→3'，图1中A、B、C、D在不同情况下均可以作为引物，用PCR技术扩增LTP1基因时应该选用 作为引物。 (2) 是实施基因工程的核心。图2中的B为质粒，质粒和LTP1基因结合形成重组质粒C．重组质粒C在受体细胞中能够稳定存在并发挥作用，在LTP1基因的首端必须具有 ，尾端必须具有终止子，还必须含有标记基因和目的基因。 (3)为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合情况，首先采用DNA分子杂交技术检测LTP1基因是否导入成功，需要从转基因啤酒酵母中提取DNA，用 作探针与之杂交。 (4)为检测转基因啤酒酵母是否产生LTP1蛋白，除检测LTP1蛋白是否产生及含量外，还可观察转基因啤酒酵母所酿啤酒的 进行判断，若能检测到LTP1蛋白，但效果差，可能的原因是 ；若经检测确定细胞中无LTP1蛋白，可采用PCR技术检测细胞中的RNA，如果能检测到mRNA，则可能是 ；如果检测后确定细胞中无LTP1蛋白的mRNA，但之前能检测到LTP1基因，则LTP1基因未能正常转录的原因可能是 。 35．（22-23高二下·安徽·期末）tPA是一种临床上用于治疗心脑血栓类疾病的药物，科研人员计划用动物乳腺生物反应器生产tPA，但tPA并不是乳腺蛋白，因此在动物乳腺中的表达水平较低。生长激素（GH）可促进动物细胞增殖和乳腺生长发育及维持泌乳。研究人员通过构建具有GH基因和IPA基因的双转基因小鼠，探究GH能否促进外源目的基因tPA的表达。回答下列问题： (1)为获得转基因小鼠，将tPA基因通过 的方法注入小鼠的 中，将发育成为tPA单转基因个体；同理将tPA基因和GH基因同时注入获得双转基因小鼠，选择性别为 的个体作为后续研究对象。 (2)剪取转基因小鼠的少量尾尖组织，提取基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应体系中需加入特定的引物，引物的作用是 ，扩增的产物再经过 技术来鉴定是否成功。 (3)图1是两种基因表达载体的部分示意图，图中CMV代表 的启动子。利用PCR技术来检测基因整合情况，若小鼠成功整合了tPA基因，则能扩增出多个大小为 bp的DNA片段。图2中的1和2代表转基因小鼠的两种检测结果，出现第 种结果的小鼠为GH/tPA双转基因小鼠。    (4)选取处于泌乳期的GH/tPA双转基因和tPA单转基因小鼠，统计分析两种转基因小鼠乳腺中tPA的表达情况，结果见下表。结果证明了 。 转基因小鼠tPA表达情况分析表 tPA单转基因小鼠 GH/tPA双转基因小鼠 表达水平（μg/mL） 16.3～82.5 112～423 36．（22-23高二下·安徽合肥·期末）神舟十三号乘组航天员在“天空课堂”完成了国际上首例实验：将人体肾上皮细胞诱导成具有多种功能的干细胞，又使其分化成为心肌细胞。通过基因编辑技术将荧光蛋白基因导入心肌细胞，在荧光显微镜下观测记录了在心肌细胞收缩过程中荧光信号的闪烁过程，通过比对心肌细胞在重力条件下和失重条件下的收缩过程可更好地解读失重对人类的影响。 (1)在太空进行哺乳动物心肌细胞培养时，需要给细胞提供的气体环境是 ，培养过程中我们需要定期更换培养液，目的是 （答出1点即可）。 (2)基因编辑技术需要用到的工具酶有 ，将荧光蛋白基因导入心肌细胞通常用 技术。 (3)为了让航天器组装、集成与测试厂房（AIT厂房）免受生物腐蚀，避免地球与其他天体之间出现交叉生物污染，研究者需将对AIT厂房表面环境用随有无菌水的棉签擦拭取样，将采集到的样本加入到1mL无菌磷酸缓冲液中，然后可采用 法对微生物进行分离培养，观察菌落的形态学特征，挑选形态不同的单菌落进一步分离培养，得到单一菌株，再置于 培养基（根据物理性质划分）中，在摇床上进行纯化培养。 37．（22-23高二下·安徽黄山·期末）科学家将Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4基因通过逆转录病毒转入小鼠成纤维细胞中，然后在培养ES细胞的培养基上培养这些细胞。2-3周后，这些细胞显示出ES细胞的形态，具有活跃的分裂能力，它们就是iPS细胞。请回答下列问题。 (1)从病人体内取出某组织，分离得到成纤维细胞，一般需要用 酶处理组织块，分散成单个细胞进行培养，为防止培养过程中细胞代谢产物对细胞造成的危害，应采取的措施是 。 (2)获取目的基因可通过PCR进行，PCR反应体系中加入 离子作为Taq酶的激活剂；PCR产物的检测和鉴定一般采用 方法，其产物可以在波长为300nm的 灯下被检测出来。 (3)如果要了解Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4基因在诱导iPS细胞时，每个基因作用的相对大小，可以依据 原理控制自变量，设计并观察对应实验结果。 / 学科网（北京）股份有限公司 $$ 专题04 基因工程 一、单选题 1．（23-24高二下·安徽淮北·期末）丙酮被广泛用作生产塑料的原料和有机溶剂。热乙酸穆尔氏菌能以氢为能源，利用CO2或CO生产乙酸。研究团队去除了该微生物生成乙酸的相关基因，然后导入了其他基因，这样可以抑制乙酸的生成并促进丙酮的合成。下列说法错误的是（    ） A．基因工程成功的原因之一是不同生物的DNA结构不同 B．基因工程中的目的基因可以人工合成并通过PCR进行扩增 C．导入的其他基因需要与启动子等调控组件重组在一起 D．检测该微生物中新的基因是否表达，可进行分子水平的检测 【答案】A 【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、基因工程成功的原因之一是不同生物的DNA具有相同的双螺旋结构，A错误； B、基因工程中的目的基因获取方式有多种，可以人工合成并通过PCR进行扩增，也可以从基因文库中获取，B正确； C、基因工程中需要目的基因在受体细胞中表达，就要将目的基因与该细胞内特定表达基因的启动子等调控组件重组在一起，C正确； D、检测该微生物中新的基因是否表达，可采用抗原—抗体杂交技术，属于分子水平的检测，D正确。 故选A。 2．（23-24高二下·安徽·期末）下图是通过基因工程获取目的基因hCGβ表达产物人绒毛膜促性腺激素（hCGβ）的过程，hCGβ基因导入AOX1启动子与终止子之间。其中，AOX1为甲醇氧化酶基因的启动子，只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达；甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔。下列说法错误的是（    ）    A．可以通过控制培养液中甲醇作为唯一碳源，来控制hCGβ基因表达 B．hCGβ基因与甲序列形成融合基因，有利于其控制合成的肽链的加工 C．阶段Ⅰ所需酶为限制酶、DNA聚合酶，阶段Ⅲ可通过PCR鉴定重组质粒 D．阶段Ⅳ导入重组质粒后，培养酵母菌所用培养基无须添加氨苄青霉素和组氨酸 【答案】C 【分析】分析题图：图1中Ⅰ为基因表达载体的构建过程，用到限制酶和DNA连接酶；Ⅱ是将重组质粒导入大肠杆菌，目的是大量扩增含有目的基因的重组质粒；Ⅲ是提取并鉴定所需要的重组质粒，Ⅵ是将选择的重组质粒导入组氨酸缺陷型酵母菌内，Ⅴ是筛选符合要求的酵母菌，Ⅵ是分离、提纯目的基因的产物 【详解】A、hCGβ基因导入AOX1启动子与终止子之间，AOX1启动子只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达，因此可以通过控制培养液中甲醇作为唯一碳源，来控制hCGβ基因表达，A正确； B、甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔，hCGβ基因与甲序列形成融合基因，有利于其控制合成的肽链进入内质网进行加工，B正确； C、阶段Ⅰ所需酶为限制酶、DNA连接酶，C错误； D、由于环状质粒中含有组氨酸合成酶基因和氨苄青霉素抗性基因，且筛选重组质粒时大肠杆菌是在含有氨苄青霉素的培养基上培养的，因此为筛选导入重组质粒的酵母菌，培养基中不需要再加入氨苄青霉素，导入重组质粒的酵母菌自身可以合成组氨酸，培养基中不用添加组氨酸，D正确。 故选C。 3．（23-24高二下·安徽·期末）如图是基因工程培养转基因抗某真菌植物的简易流程，其中多个环节都需要检测与鉴定，下列说法错误的是（    ） A．①可以用PCR获取并用琼脂糖凝胶电泳来鉴定 B．标记基因可用来筛选②中的重组质粒 C．④分子水平上的检测都可以用PCR技术 D．④还需要在个体水平上进行该真菌接种鉴定 【答案】C 【分析】检测目的基因是否插入到受体细胞的DNA上、检测目的基因是否转录出了mRNA、检测目的基因是否翻译成蛋白质，这三种检测都是分子水平上的检测。除了分子水平的检测外，有时还需要进行个体生物学水平的鉴定。 【详解】A、PCR可以获取目的基因，琼脂糖凝胶电泳法用来鉴定构象、大小和带电荷不同的DNA，A正确； B、标记基因（如抗性基因）的作用是用来筛选含重组质粒，B正确； C、翻译的产物是蛋白质，不能用PCR检测，C错误； D、是否成功培育了抗某真菌植物，需要在个体水平上接种真菌进行抗性鉴定，D正确。 故选C。 4．（22-23高二下·安徽蚌埠·期末）下列关于基因工程和蛋白质工程的说法错误的是（    ） A．基因工程需要在分子水平对基因进行操作 B．蛋白质工程需要在分子水平对基因进行操作 C．基因工程能产生天然不存在的蛋白质 D．蛋白质工程能产生天然不存在的蛋白质 【答案】C 【分析】蛋白质工程是将控制蛋白质的基因进行修饰改造或合成新的基因，然后运用基因工程合成新的蛋白质。蛋白质工程的过程：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）。蛋白质工程得到的蛋白质一般不是天然存在的蛋白质。 【详解】AB、蛋白质工程本质上属于基因工程的延伸，基因工程和蛋白质工程都需要在分子水平对基因进行操作，AB正确； C、基因工程只能生产自然界中已经存在的蛋白质，C错误； D、蛋白质工程是在深入了解蛋白质分子的结构与功能关系的基础上进行的，它最终要达到的目的是改造现有蛋白质或制造新的蛋白质，满足人类的需求，D正确。 故选C。 5．（22-23高二下·安徽蚌埠·期末）下列关于基因工程基本工具的描述，错误的是（    ） A．限制酶能识别DNA分子的特定的核苷酸序列具有特异性 B．DNA连接酶可将任意两个DNA分子连接起来不具有特异性 C．限制酶切割产生的DNA片段通常有黏性末端和平末端两种 D．DNA连接酶主要有E．coliDNA连接酶和T₄DNA连接酶两类 【答案】B 【分析】限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。 【详解】A、每种限制酶只能识别特定的脱氧核苷酸序列，并在特定位点进行切割，断开磷酸二酯键，具有特异性，A正确； B、DNA连接酶只能连接DNA片段，但不能连接RNA片段，故具有特异性，B错误； C、DNA分子经限制酶切割后产生的DNA片段有黏性末端和平末端两种形式，C正确； D、根据酶的来源不同分为两类：E.coliDNA连接酶、T4DNA连接酶，这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低，D正确。 故选B。 6．（21-22高二下·安徽芜湖·期末）下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是（    ） A．DNA对高温的耐受性低于蛋白质 B．DNA溶于酒精，也溶于2mol/L的NaCl溶液 C．猪血取材方便，适宜用于提取和鉴定DNA D．从菜花细胞中提取DNA需先研磨破坏细胞 【答案】D 【分析】利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，选择适当的盐浓度能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。大多数蛋白质不能忍受60~80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。 【详解】A、DNA在80℃以上变性，蛋白质在60℃以上变性，DNA对高温的耐受性高于蛋白质。A错误； B、DNA不溶于酒精，在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，在2mol/L的NaCl溶液中溶解度较高，B错误； C、猪（哺乳动物）成熟红细胞中不含DNA，不能用于提取和鉴定DNA。C错误； D、菜花细胞有细胞壁保护，通过研磨破坏细胞壁、细胞膜等结构，使DNA释放出来。D正确。 故选D。 二、解答题 7．（22-23高二下·安徽蚌埠·期末）干扰素α-1b是基因工程药物，该药物利用大肠杆菌作为受体获得具有抗病毒、抑制肿瘤细胞增生，调节人体免疫功能的作用。下图为干扰素α-1b生产原理示意图。回答下列问题：    (1)逆转录获取干扰素基因后，常用PCR特异性地快速扩增干扰素基因，PCR技术的原理是 。实验人员在PCR反应溶液中加入模板、 Mg2+、4种脱氧核苷酸以及2种 ，PCR的产物常采用 来鉴定。 (2)在构建重组质粒的过程中，常用两种限制酶切割目的基因和质粒，这样做的目的是 。 (3)在利用基因工程技术制备干扰素的过程中，常用大肠杆菌作为受体细胞，研究人员一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种 的生理状态。 【答案】(1) DNA半保留复制 耐高温的DNA聚合酶 引物 琼脂糖凝胶电泳 (2)防止质粒与目的基因反向连接，以及自身的环化 (3)能吸收周围环境中DNA分子（感受态） 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）PCR是一项体外扩增DNA分子的技术，其原理是DNA半保留复制；实验人员在PCR反应溶液中加入模板、耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）、Mg2+、4种脱氧核苷酸（原料｝和2种引物；PCR的产物常采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。 （2）为防止质粒与目的基因反向连接，以及自身的环化，在构建基因表达载体时，常用两种限制酶切割目的基因和质粒。 （3）利用基因工程技术制备干扰素的过程中，常用大肠杆菌作为受体细胞，研究人员一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子，即处于感受态的细胞。 8．（23-24高二下·安徽亳州·期末）人体内的t-PA蛋白能高效降解血栓，是心梗和脑血栓的急救药。然而，为心梗患者注射大剂量的t-PA蛋白会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。据此，先对天然的t-PA基因进行序列改造，然后再采取传统的基因工程方法表达该改良基因，可制造出性能优异的t-PA改良蛋白。下图是通过两次PCR操作，运用大引物进行定点突变获取t-PA改良基因和利用质粒pCLYⅡ构建含t-PA改良基因的重组质粒示意图。（注：一次PCR操作可进行多次循环） (1)PCR扩增的第一步是使双链模板DNA变性。DNA中G+C的含量与变性要求的温度有关，DNA中G-C的含量越多，要求的变性温度越高。其原因是 。 (2)在PCR反应中，引物的作用是 。 (3)如果要利用微生物进一步克隆PCR定点诱变产物，其步骤包括： 、 、微生物的筛选和培养，从菌群中获取更多目的基因。为实现质粒和t-PA改良基因的高效连接，选用限制酶XmaⅠ而不选用限制酶SmaⅠ的原因是 。为将t-PA改良基因连接在质粒上，还需要 等酶。 【答案】(1)DNA中G+C含量越多，其氢键越多，结构越稳定，变性时所需温度越高 (2)使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 (3) 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 限制酶SmaⅠ切割产生的末端为平末端，无法与t-PA改良基因上的黏性末端连接 BglⅡ、DNA连接酶 【分析】PCR 反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供DNA模板，分别与两条模板链结合的2种引物，4种脱 氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶；同时通过控制温度使 DNA复制在体外反复进行。扩增的过程是：目的基因DNA 受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合；然后以单链 DNA 为模板，在 DNA 聚合酶作用下进行延伸，即将4种脱氧核苷酸加到引物的3'端，如此重复循环多次。由于延伸后得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步。 【详解】（1）DNA分子的热稳定性与碱基对中的氢键数量有关，DNA中G和C之间有三个氢键，A和T之间只有两个氢键，G+C含量越多，其氢键越多，结构越稳定，变性时所需温度越高。 （2）在PCR反应中，引物引物是一小 段能与DNA 母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR 的引物长度通常为20〜30个核苷酸，作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。 （3）如果要利用微生物进一步克隆PCR定点诱变产物，其步骤包括：基因表达载体的构建（这是基因工程的核心步骤）、将目的基因导入受体细胞、微生物的筛选和培养，从菌群中获取更多目的基因。为实现质粒和t-PA改良基因的高效连接，选用限制酶Xma Ⅰ而不选用限制酶Sma Ⅰ的原因是：限制酶Sma Ⅰ切割产生的末端为平末端，限制酶Xma Ⅰ产生的是黏性末端，t-PA改良基因为黏性末端，限制酶Sma Ⅰ切割产生的平末端无法与t-PA改良基因上的黏性末端连接。为将t-PA改良基因连接在质粒上，还需要Bgl Ⅱ、DNA连接酶等酶。 9．（23-24高二下·安徽·期末）理论上，体型越大的动物，其体内细胞数量就会越多，细胞分裂的次数也越多，因此突变的机会理应更高，患癌症的风险也越大，但体积是人类数倍的大象，却不那么容易得癌症。研究发现，大象体内含有多达20份的TP53基因，而人类及其他大部分动物只有1份TP53基因。TP53基因表达的P53蛋白能够修复因复制而出现损伤的核DNA，或在核DNA损伤严重时参与启动细胞凋亡。科研工作者拟将大象的多拷贝TP53基因导入小鼠体内，研究其是否能够使小鼠不易患癌症，相关过程如图1所示。 请回答下列问题： (1)可利用PCR获取大象的多拷贝TP53基因，PCR的原理是 ，PCR反应体系中需要含有缓冲液、模板（目的基因）、4种脱氧核苷酸、引物、 等。应选用图2中的引物 （填图中字母），其扩增产物常采用 法进行鉴定。 (2)若要进行①过程，精子需要 ，卵母细胞需要培养到 期。过程②最常用的一种方法是 。 (3)过程④为胚胎分割，操作时要注意将 （填“a”“b”或“c”）均等分割。过程⑤的实质是 ；进行过程⑤前，对代孕母体应进行的操作为 。 【答案】(1) DNA半保留复制 耐高温的DNA聚合酶 AD 琼脂糖凝胶电泳 (2) 获能 MⅡ 显微注射法 (3) c 早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移 进行同期发情处理 【分析】分析题图：①表示体外受精，②表示将目的基因导入动物受精卵，③表示早期胚胎培养，④表示胚胎分割，⑤表示胚胎移植。a表示滋养层，b表示囊胚腔，c表示内细胞团。 【详解】（1）PCR是是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。PCR反应体系中需要含有缓冲液、模板（目的基因）、4种脱氧核苷酸、引物、耐高温的DNA聚合酶等。引物的作用是使DNA聚合酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸，引物与模板链的3’端结合，由图可知，扩增目的基因应选用图2中的A和D，其扩增产物常采用琼脂糖凝胶电泳法进行鉴定。 （2）①表示体外受精，若要进行①过程，精子需要获能处理，卵母细胞需要培养到MⅡ期。过程②是将目的基因导入动物的受精卵，最常用的一种方法是显微注射法。 （3）过程④为胚胎分割，操作时要注意将内细胞团均等分割。⑤表示胚胎移植，其实质是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移，在进行胚胎移植前，对代孕母体应进行的操作为进行同期发情处理。 10．（21-22高二下·安徽亳州·期末）早在新冠疫情暴发初期，我国就布局了5条疫苗研发的技术路线，包括了灭活疫苗、腺病毒载体疫苗、重组蛋白疫苗、减毒流感病毒载体疫苗和核酸疫苗。当前我国全民免费接种的主要是灭活疫苗；而科学家陈薇院士团队自主研制腺病毒载体疫苗具有安全、高效、引发的不良反应少的优点。下图所示为科学家陈薇教授团队研制腺病毒载体疫苗的原理。 (1)上图所示②④过程中必须用到的酶有3种，分别是 、 、 。 (2)获取目的S蛋白基因是各种疫苗研制途径需要解决的首要问题，通常采用以下两种方法，一是利用病毒的RNA进行逆转录得到DNA  后，利用PCR技术扩增得到基因S，PCR过程每次循环分为三步，其中温度最低的一步是 ；二是完成病毒S基因测序后，直接人工合成基因S。 (3)为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S，基因工程的基本操作流程中最关键的步骤是 。 【答案】(1) 逆转录酶 限制酶 DNA连接酶 (2)复性 (3)基因表达载体的构建 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）据图可知，②表示RNA逆转录形成cDNA，需要逆转录酶；④表示基因表达载体的构建，需要限制酶和DNA连接酶，因此上述过程必须用到的酶是逆转录酶、限制酶、DNA连接酶。 （2）PCR过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链，故其中温度最低的一步是复性。 （3）基因工程的基本操作流程中最关键的步骤是基因表达载体的构建。 一、单选题 1．（23-24高二下·安徽六安·期末）下列关于基因工程基本工具的叙述，正确的是（    ） A．DNA聚合酶能够催化形成磷酸二酯键，是基因工程中的“分子缝合针” B．限制酶切割DNA分子一次可断开2个磷酸二酯键，产生2个游离的磷酸基团 C．有些DNA连接酶既能连接双链DNA片段互补的黏性末端，又能连接双链DNA片段的平末端，从而恢复被限制酶切开的氢键 D．用做分子运输车的质粒有抗生素合成基因，便于重组DNA分子的筛选 【答案】B 【分析】基因工程常用的运载体常用的有质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒，其中质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 【详解】A、基因工程中的“分子缝合针”是DNA连接酶而非DNA聚合酶，A错误； B、限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，即一条链断1个磷酸二酯键，产生1个游离的磷酸基团，所以限制酶切割DNA分子一次可断开2个磷酸二酯键，产生2个游离的磷酸基团，B正确； C、T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，而不是氢键，C错误； D、作为载体的质粒通常采用抗性基因（四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因）作为标记基因，便于成功导入重组DNA分子的受体细胞的筛选，D错误。 故选B。 2．（23-24高二下·安徽六安·期末）下列关于基因工程的说法正确的是（    ） A．基因表达载体中启动子是DNA聚合酶的结合部位，启动复制过程 B．基因表达载体一般包括目的基因、标记基因、启动子和终止密码子等结构 C．利用PCR技术获取目的基因依据的是DNA半保留复制的原理 D．将目的基因导入植物细胞和动物细胞分别采用花粉管通道法和农杆菌转化法 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、基因表达载体中启动子是RNA聚合酶的结合部位，启动转录过程，A错误； B、基因表达载体一般包括目的基因、标记基因、启动子和终止子（而非终止密码子）等结构，密码子存在于mRNA上，B错误； C、PCR是一项体外扩增DNA的技术，利用PCR技术获取目的基因依据的是DNA半保留复制的原理，C正确； D、将目的基因导入植物细胞最常用的方法是农杆菌转化法，也可用花粉管通道法，导入动物细胞的方法是显微注射法，D错误。 故选C。 3．（23-24高二下·安徽亳州·期末）下列有关“DNA粗提取与鉴定”、“PCR扩增”、“琼脂糖凝胶电泳”实验的叙述中，正确的是（　　） A．DNA的粗提取与鉴定实验中可利用DNA在酒精中溶解度较大的特点来提取DNA B．电泳缓冲液配制的琼脂糖溶液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察 C．PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶在复性过程中起作用 D．将提取到的丝状物与二苯胺溶液充分混匀后，溶液变为绿色 【答案】B 【分析】DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精；鉴定DNA时，需要先将DNA溶解在NaCl溶液中，再与二苯胺溶液混合，并在水浴加热条件下呈现蓝色；耐高温的DNA聚合酶在延伸环节时进行子链的合成。 【详解】A、DNA的粗提取与鉴定实验中利用DNA不溶于酒精、但某些蛋白质溶于酒精的原理，可以初步分离DNA与蛋白质，A错误； B、用电泳缓冲液配制的琼脂糖溶液中加入适量的核酸染料，核酸染料能与DNA分子结合，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，B正确； C、PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶在延伸过程中根据碱基互补配对原则来合成新的DNA链，C错误。 D、将提取到的丝状物先溶解于2 mol/L的NaCl溶液，再加入适量二苯胺溶液充分混匀后，需要水浴加热，试管冷却后溶液呈现蓝色，D错误。 故选B。 4．（23-24高二下·安徽·期末）家禽的饲料中富含谷物，纤维素是谷物的重要成分，但家禽消化道中缺少能降解纤维素的酶，阻碍了家禽对饲料的吸收与利用。研究人员利用转基因技术改造乳酸杆菌，将其添加到饲料中，以提高家禽养殖效率。枯草芽孢杆菌的W基因可编码一种可高效降解纤维素的酶，已知图中W基因转录方向是从左往右。为使乳酸杆菌产生该酶，以图中质粒为载体进行转基因，下列说法不正确的是（    ） 限制酶 BamHⅠ EcoRⅠ MfeⅠ KpnⅠ HindⅢ 识别序列和切割位点（5′→3′） G↓GATTC G↓AATTC C↓AATTG GGTAC↓C A↓AGCTT A．家禽肠道内乳酸杆菌细胞呼吸产生的物质可抑制某些微生物生长 B．限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来，种类繁多且具有专一性 C．在受体细胞中，W基因转录时以乙链为模板，可以边转录边翻译 D．为获得正确表达W基因的重组质粒，应选HindⅢ和EcoRⅠ切割质粒 【答案】D 【分析】基因工程是按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品、基因工程过程包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定，基因工程操作中用到的工具有限制酶、DNA连接酶、运载体。 【详解】A、家禽肠道内的乳酸菌可利用葡萄糖通过细胞呼吸产生酸性物质，抑制有害细菌的生长和繁殖，维持肠道的正常功能，A正确； B、限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的，种类繁多，且能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，具有专一性，B正确； C、枯草芽孢杆菌为原核生物，其中的W基因可以边转录边翻译，且根据转录时子链的延伸方向为5'端往3'端方向可知，W基因转录时以乙链为模板，C正确； D、EcoRI在质粒上有两个酶切位点，会将终止子切掉，故均不能选择，MfeⅠ与EcoRⅠ切割后产生的黏性末端相同，故为获得正确表达W基因的重组质粒，应选HindⅢ和MfeⅠ切割质粒，D错误。 故选D。 5．（23-24高二下·安徽·期末）PCR的产物需要通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。下列相关叙述错误的是（    ） A．凝胶的浓度会影响DNA分子的迁移速率 B．凝胶糖溶液需冷却后才能倒入模具进行电泳 C．加样时，每吸取一种试剂后必须更换移液器枪头 D．电泳完成后需要在紫外灯下才能观察到电泳条带 【答案】B 【分析】PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术。 【详解】A、凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等都会影响DNA分子的迁移速率，A正确； B、凝胶糖溶液需在温热条件下倒入模具，冷却后的凝胶糖溶液已经凝固，B错误； C、加样时，每吸取一种试剂后必须更换移液器枪头，C正确； D、电泳完成后需要在紫外灯下才能观察到电泳条带，D正确。 故选B。 6．（23-24高二下·安徽·期末）T4溶菌酶是一种重要的工业用酶，但在温度较高时易失去活性，科学家研究发现，若将其第3位的异亮氨酸变为半胱氨酸，可在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成一个二硫键，提高T4溶菌酶的耐热性。下列相关叙述错误的是（    ） A．T4溶菌酶是否耐热取决于蛋白质的空间结构 B．提高T4溶菌酶耐热性的过程属于蛋白质工程的范畴 C．引起T4溶菌酶空间结构发生改变的根本原因是氨基酸序列的变化 D．替换T4溶菌酶第3位氨基酸的操作中，直接操作对象是T4溶菌酶基因 【答案】C 【分析】蛋白质工程是以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行基因改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要。 【详解】A、蛋白质的结构决定功能，T4溶菌酶是否耐热取决于蛋白质的空间结构，A正确； B、若将T4溶菌酶第3位的异亮氨酸变为半胱氨酸，可在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成一个二硫键，提高T4溶菌酶的耐热性，属于蛋白质工程范畴，B正确； C、引起T4溶菌酶空间结构改变的根本原因是对T4溶菌酶耐热性的相关基因进行了改造，基因碱基序列发生改变，C错误； D、替换T4溶菌酶第3位氨基酸的操作中，属于蛋白质工程，蛋白质工程操作的对象为基因，故直接操作对象是T4溶菌酶基因，D正确。 故选C。 7．（23-24高二下·安徽六安·期末）一种天然蛋白t-PA能高效降解因血浆纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药，但是心梗患者注射大剂量的t-PA会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低其诱发出血的副作用。据此，先对天然t-PA基因的碱基序列进行改造，然后再采取传统的基因工程方法表达该改造后的基因，可制造出性能优异的改良t-PA蛋白。下列说法正确的是（    ）    A．蛋白质工程是通过改造现有基因来定向改造蛋白质，以满足人类生产和生活的需求 B．构建重组质粒时可选用限制酶XmaI和NheI切割质粒pCLY11 C．使用T4DNA连接酶不能将t-PA改良基因与质粒pCLY11连接 D．成功导入重组质粒的受体细胞在含有新霉素的培养基上能存活，且呈现白色 【答案】D 【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 2、蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出的第二代基因工程，因为是对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，所以必须通过基因修饰或基因合成实现。通过蛋白质工程生产出来的蛋白质更加符合人类生产和生活的需要。 【详解】A、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过改造或合成基因，来改造现有的蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求，A错误； B、根据碱基互补配对原则，t-PA基因的左端黏性末端为CCGG-，为XmaI酶切得到，t-PA基因的右端黏性末端为GATC-，为BgIII酶切得到，质粒需要用相同的酶进行酶切以得到与目的基因相同的黏性末端，因此质粒需选用限制酶XmaI和BglII切割质粒pCLY11，B错误； C、T4DNA连接酶能连接黏性末端，还可以连接平末端，使用T4DNA连接酶能将t-PA改良基因与质粒pCLY11连接，C错误； D、t-PA能高效降解因血浆纤维蛋白凝聚而成的血栓，成功转入重组质粒的受体细胞在培养基上会出现具有抗性的白色菌落，D正确； 故选D。 8．（23-24高二下·安徽·期末）2024年5月24日，安徽医科大学第一附属医院完成了世界首例活体人的异种肝移植手术，成功将610克的转基因猪肝脏移植到了一位肝癌重症患者身上。本例转基因猪到活体人的异种移植取得成功，开创了转基因猪异种肝移植的先河。下列关于转基因技术说法错误的是（　　） A．选用猪做克隆器官供体是因为其内脏构造、大小与血管分布和人的类似，且体内可导致人类疾病的病毒少 B．该操作的核心步骤是基因表达载体的构建，需要用到限制酶、DNA连接酶两种工具酶 C．调节基因导入的受体细胞取决于需要的器官类型，若需要移植肝脏，则受体细胞为肝细胞 D．若要检测目的基因是否导入了受体细胞，可以利用PCR 等技术进行检测 【答案】C 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】A、猪的内脏构造、大小、血管分布与人极为相似，而且猪体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒要远远少于灵长类动物，因此选用猪做克隆器官供体，A正确； B、在构建基因表达载体时，首先会用一定的限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段；再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子，B正确； C、将目的基因导入动物细胞，受体细胞一般是受精卵，受精卵具有发育的全能型，肝细胞无法发育为完整的肝脏，因此不会选择肝细胞作为受体细胞，C错误； D、分子水平的检测，可以通过PCR等技术检测受体细胞DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA，D正确； 故选C。 9．（23-24高二下·安徽黄山·期末）用A和B两种限制酶同时和分别处理同一DNA片段，限制酶对应切点一定能切开。两种酶酶切位点及酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定结果如图1和图2所示。下列叙述错误的是（    ） A．利用限制酶A和B同时处理图1DNA片段，产物中共有6个游离的磷酸基团 B．据图推测图1中X代表的碱基对数为4500bp，Y是限制酶A的酶切位点 C．利用PCR从图1DNA片段中扩增出完整X，至少需要3轮循环 D．据图2可推测在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子碱基对数量有关 【答案】A 【分析】限制性核酸内切酶酶切，是一项基于DNA限制性核酸内切酶的基因工程技术，其基本原理是利用限制性核酸内切酶对DNA上特定序列的识别，来确定切割位点并实现切割，从而获得所需的特定序列。 【详解】A、由题可知，图2中三列条带分别对应用A和B两种限制酶同时以及单独使用限制酶A、限制酶B处理DNA片段的酶切产物电泳分离结果，再通过①和②的结果结合图1，分析可知①是单独使用限制酶A处理DNA片段的酶切产物电泳分离结果，②是单独使用限制酶B处理DNA片段的酶切产物电泳分离结果。限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。用A和B两种限制酶同时处理图中同一DNA片段共得到4个DNA片段，即最终得到8个游离的磷酸基团，A错误； B、结合图1和图2中第一列A+B酶同时处理的电泳条带结果分析可知，图1中X代表的碱基对数为4500，根据图2中①电泳分离结果存在3500bp长度的条带可知①是单独使用限制酶A处理DNA片段的酶切产物电泳分离结果，再根据①电泳分离结果存在500bp长度和6000bp长度的条带可知Y是限制酶A的酶切位点，B正确； C、设计引物从图1中完整DNA片段中扩增出完整X，至少需要3次PCR，在第一次 PCR 循环结束后，得到的产物是一条长链（包含完整的 X 以及其两侧的部分序列）和一条短链（只包含引物及 X 一端的部分序列）；第二次循环时，以第一次循环得到的长链和短链为模板，再次进行变性、复性和延伸，得到的产物包括完整的 X 片段、一条与第一次循环得到的长链相同的片段以及其他片段；第三次循环时，以第二次循环得到的各种片段为模板，才可以得到更多的完整 X 片段以及其他产物。C正确； D、电泳凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子大小（DNA分子碱基对数量）和构象等有关，D正确。 故选A。 10．（23-24高二下·安徽芜湖·期末）干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，重组人干扰素α-1b是我国批准生产的第一个基因工程药物，主要用于治疗慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎等。为了获取干扰素基因，需要的模板和其他材料分别是（    ） ①淋巴细胞的所有DNA②肝细胞的总RNA ③引物④逆转录酶⑤dNTP⑥DNA连接酶⑦RNA酶抑制剂⑧解旋酶⑨耐高温的DNA 聚合酶 A．①；③⑤⑨ B．②；③④⑤⑨ C．①；③⑤⑧⑨ D．②；③④⑤⑥⑦ 【答案】A 【分析】PCR技术的条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；PCR的操作过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 【详解】干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，为了获得干扰素基因，一方面可以直接获取，即用①淋巴细胞所有DNA作为模板，③用目的基因两端的已知序列设计的引物、⑤原料和⑨耐高温的DNA聚合酶等；也可选择淋巴细胞的总RNA作为模板逆转录出相应的DNA，而后再加入相应的引物和其他材料进行目的基因的获取，整个过程中不需要解旋酶和RNA酶抑制剂，也不需要DNA连接酶，但干扰素是在淋巴细胞中合成的，肝脏细胞中不能合成。因此A正确。 故选A。 11．（23-24高二下·安徽芜湖·期末）透明质酸是一种应用广泛的黏多糖，研究者欲改造枯草芽孢杆菌提高透明质酸的生产产量。透明质酸合成酶基因H上的一段核苷酸序列为“一ATCTCGAGCGGG—”，则对该序列进行剪切的限制酶识别的核苷酸序列最可能为（    ） A．—TCTCGA— B．—CTCGAG— C．—CGAGCG— D．—TCGAGC— 【答案】B 【分析】切割DNA的工具是限制性核酸内切酶，它们能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 【详解】该核苷酸序列“一ATCTCGAGCGGG—”的互补序列为“-TAGAGCTCGCCC-”,限制酶切割DNA 需两条链都有识别位点（即识别片段两条链序列成倒序），若选—TCTCGA—片段，则另一互补链上（从右到左）应该含有—AGAGCT—，互补链上不存在该序列片段，不能选该片段；若选—CTCGAG—片段，则另一互补链上（从右到左）应该含有—CTCGAG—，互补链上存在该序列片段，能选该片段；若选—CGAGCG—片段，则另一互补链上（从右到左）应该含有—GCTCGC—，互补链上不存在该序列片段，不能选该片段；若选—TCGAGC—片段，则另一互补链上（从右到左）应该含有—AGCTCG—，互补链上不存在该序列片段，不能选该片段，综上分析可知，对该序列进行剪切的限制酶识别的核苷酸序列最可能为—CTCGAG—，ACD不符合题意，B符合题意。 故选B。 12．（23-24高二下·辽宁鞍山·期末）小麦和水稻是我国主要粮食作物，其中赖氨酸含量很低，科研人员通过以下操作，将辣椒中的含赖氨酸较高的某蛋白基因转入小麦，流程如下图。下列叙述正确的是（    ）    A．逆转录合成DNA的过程需要DNA聚合酶催化 B．通过逆转录获得的cDNA有多种 C．目的基因直接导入小麦就能表达高赖氨酸蛋白 D．T0代转基因植株一定可培育出纯合含高赖氨酸蛋白的植株 【答案】B 【分析】1、基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定： 分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术； 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 2、蛋白质过程的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）。 【详解】A、逆转录合成DNA的过程需要逆转录酶来催化，A错误； B、逆转录就是以RNA为模板，在逆转录酶催化作用合成DNA的过程，因此可能会得到多种cDNA，B正确； C、目的基因需要与载体结合构建基因表达载体才能导入小麦细胞，C错误； D、T0代转基因植株不一定能培育出纯合含高赖氨酸蛋白的植株，D错误。 故选B。 13．（22-23高二上·安徽芜湖·期末）下列关于PCR的叙述错误的是（　　） A．用PCR方法扩增目的基因时需要知道基因的部分序列 B．设计的引物序列必须全部能够和模板DNA碱基互补 C．复性温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物 D．第四轮循环产物中含有两种引物的DNA片段所占比例为7/8 【答案】B 【分析】1、PCR原理：在高温的作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 2、PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 【详解】A、用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列，只需要知道一段已知目的基因的核苷酸序列，从而根据这段序列合成引物，A正确； B、设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对而造成引物自连，不需全部能够和模板DNA碱基互补，B错误； C、复性的目的是引物与模板DNA结合，故复性温度过高可能导致引物与模板DNA不能结合，因而使得PCR反应得不到任何扩增产物，C正确； D、DNA复制为半保留复制，DNA复制n次，共形成2n个DNA，其中两个DNA含有母链和子链（含引物A或引物B），（2n-2）个DNA都含有子链（含有引物A和引物B），第四轮循环即DNA复制4次，共形成16个DNA，产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比率为14/16＝7/8，D正确。 故选B。 14．（22-23高二下·安徽阜阳·期末）下列关于DNA粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定的原理叙述错误的是（    ） A．电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着它所带电荷相反的电极移动的原理 B．利用DNA不溶于酒精，但蛋白质均溶于酒精的原理，可完全分离DNA与蛋白质 C．PCR技术利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合 D．利用在一定温度下DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色的原理对粗提取的DNA进行鉴定 【答案】B 【分析】DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。 【详解】A、电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程，由于同性相斥、异性相吸，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动，A正确； B、DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质（而非所有蛋白质）则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离，B错误； C、PCR技术利用了DNA的热变性原理（在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链），通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，C正确； D、在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，故可利用在一定温度下DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色的原理对粗提取的DNA进行鉴定，D正确。 故选B。 15．（22-23高二下·安徽亳州·期末）甲醇酵母菌是基因工程中常用的受体菌，它可以高效表达外源蛋白，但自身蛋白分泌到培养基的较少。研究人员将人的胶原蛋白基因导入甲醇酵母中并成功表达。下列有关叙述错误的是（　　） A．可以用两种酶切割目的基因和质粒 B．常用显微注射法将胶原蛋白基因导入甲醇酵母中 C．与大肠杆菌相比，甲醇酵母作受体菌所表达出的胶原蛋白与人体产生的胶原蛋白结构更相近 D．与其它酵母菌相比，甲醇酵母作受体菌便于表达出的胶原蛋白的分离与纯化 【答案】B 【分析】限制酶识别DNA分子中特定核苷酸序列，在特定的部位将两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒。 【详解】A、用两种酶切割目的基因和质粒，可以防止目的基因的反向连接和质粒的自身环化，保证目的基因与运载体连接的正确性，A正确； B、甲醇酵母属于微生物细胞，常用钙离子处理的方法将目的基因导入微生物细胞，B错误； C、与大肠杆菌做受体相比，甲醇酵母为真核生物，表达出的胶原蛋白可经过内质网和高尔基体的加工，所以与人体产生的胶原蛋白结构更相近，C正确； D、与其他酵母菌相比，甲醇酵母可以高效表达外源蛋白，但自身蛋白分泌到培养基的较少，便于表达出的胶原蛋白的分离与纯化，D正确。 故选B。 16．（22-23高二下·安徽黄山·期末）酵母人工染色体（YAC）是由酵母细胞中必需的端粒、着丝粒和复制起始序列等与目的基因和质粒构建成的表达载体。下图表示利用整合有人源抗体IgM基因的YAC，培育能分泌人源抗体的小鼠的三个技术路线图。下列相关叙述正确的是（    ）    A．①②③过程将YAC导入三种受体细胞都只能用显微注射法 B．④过程中获得的融合细胞能表现小鼠和酵母菌的所有遗传特性 C．⑤⑥过程均需涉及胚胎移植，且需对受体小鼠进行免疫检查 D．从YAC—转IgM基因小鼠体内提取的抗体仍需经检测后使用 【答案】D 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】A、②③将基因表达载体导入小鼠ES细胞或受精卵，采用的方法是显微注射技术；将①基因表达载体导入酵母菌，使用的方法是感受态细胞法，A错误； B、④过程是将小鼠ES细胞与含有人工染色体的酵母菌进行融合，由于融合细胞会进行基因的选择性表达，因此不一定表现出小鼠和酵母菌的所有遗传特性，B错误； C、由于暂时没有全体外胚胎培养技术，因此⑤⑥过程均需涉及胚胎移植，但是由于存在免疫耐受，两者都不需要对受体小鼠进行免疫检查，C错误； D、从YAC—转IgM基因小鼠体内提取的抗体是多种抗体的混合物，仍需经检测后使用，D正确。 故选D。 二、解答题 17．（23-24高二下·安徽芜湖·期末）实验中对DNA进行鉴定时，做如下操作： 试管 序号 A B 1 加2mol/LNaCl溶液5mL 加2mol/LNaCl溶液5mL 2 不加 加入提取的DNA丝状物并搅拌 3 加4mL二苯胺，混匀 加4mL二苯胺，混匀 4 沸水浴5分钟 沸水浴5分钟 实验现象 实验结论 (1)据图，完成表格空白处的实验内容 。 (2)对B试管，完成1、2、3的操作后溶液颜色如何？ 。 (3)在沸水中加热的目的是 ，同时说明DNA对高温有较强的 。 (4)A试管在实验中的作用是 。 (5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与 有关。 【答案】(1)实验现象：A溶液不变蓝色；B溶液逐渐变蓝色 实验结论：DNA在沸水浴的情况下与二苯胺反应呈现蓝色 (2)溶液颜色基本不变（不呈浅蓝色） (3) 加快颜色反应速度 耐受性 (4)对照 (5)加入试管中的DNA（丝状物）的多少 【分析】DNA的析出与鉴定：①将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液，静置2～3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。②取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变蓝。 【详解】（1）A试管没有加入DNA丝状物，只有2mol/L NaCl溶液和二苯胺，在沸水浴条件下不会出现DNA鉴定的特征反应，所以实验现象是溶液不变蓝色；B试管加入了提取的DNA丝状物，DNA在沸水浴条件下与二苯胺反应呈现蓝色，所以实验现象是溶液变蓝色。 实验结论：根据B试管变蓝，A试管不变蓝，可得出DNA在沸水浴条件下遇二苯胺会被染成蓝色，即二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂 。 （2）完成1、2、3操作后，还未进行沸水浴，此时DNA还未与二苯胺发生显色反应，所以溶液颜色无明显变化。 （3）目的：DNA与二苯胺反应需要在沸水浴条件下才能显色，所以沸水中加热的目的是①加快颜色反应速度 。 DNA在沸水浴中能与二苯胺反应且自身结构不被破坏，说明DNA对高温有较强的②耐受性 。 （4）A试管中没有DNA丝状物，其他操作与B试管相同，其作用是作为对照，排除2mol/LNaCl溶液和二苯胺试剂等因素对实验结果的干扰，通过与B试管对比，更能说明是DNA与二苯胺发生了显色反应。 （5）B试管中溶液颜色的变化程度主要与加入试管中的DNA的含量有关，DNA含量越多，颜色反应越明显，溶液颜色越深。 18．（23-24高二下·安徽六安·期末）科学家将鱼抗冻蛋白基因转入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高，可以在相对寒冷的环境中生长。质粒上有PstI、SmaI、HindⅢ、Alul四种限制性内切核酸酶切割位点，下图是转基因抗冻番茄培育过程的示意图（amp'为抗氨苄青霉素基因），其中①~④是转基因抗冻番茄培育过程中的相关步骤，甲、乙表示相关结构或细胞。请据图作答： (1)基因工程中常用质粒作为载体，将基因送入受体细胞中。作为运载体的质粒除了必须有复制原点、标记基因之外，通常还需要有 ，图中的标记基因是 ，其主要作用是 。 (2)基因工程中核心步骤是 ，在此过程中，为使目的基因定向插入运载体中，本实验中应该选用限制酶 对鱼抗冻蛋白基因和质粒进行切割。 (3)培育出的番茄植株是否具有抗冻性状，可采用鉴定方法是 。 (4)PCR技术是获取目的基因的主要手段。PCR扩增目的基因时设计引物序列的主要依是 ，若一个该DNA分子在PCR仪经过4次循环，产物中共有 个等长的目的基因片段，PCR产物通常采用 法来鉴定。 (5)研究人员采用了如下图巢式PCR技术获取抗冻蛋白基因，巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应（PCR），使用两对PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物（也称外引物）扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部，也称内引物）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。 相比于常规PCR，巢式PCR获得错误目标产物概率 。 【答案】(1) 启动子、终止子、限制酶切割位点 抗氨苄青霉素基因 便于筛选含重组DNA分子的受体细胞 (2) 构建基因表达载体 pstI和smaI (3)将转基因抗冻番茄幼苗植株栽培在寒冷环境中，观察植株的生长发育情况 (4) 抗冻基因两端的部分核苷酸序列 8 琼脂糖凝胶电泳 (5)低 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 【详解】（1）基因工程中常用质粒作为载体，将基因送入受体细胞中。作为运载体的质粒除了必须有复制原点、标记基因之外，通常还需要有启动子、终止子、限制酶切割位点，图中的标记基因是抗氨苄青霉素基因（ampr），其主要作用是便于筛选含重组DNA分子的受体细胞。 （2）基因工程中核心步骤是构建基因表达载体，在此过程中，为使目的基因定向插入运载体中，应选择双酶切，结合目的基因两端和质粒上的限制酶分布位置分析可知，本实验中应该选用限制酶pstI和smaI对鱼抗冻蛋白基因和质粒进行切割，这里可以得到两种不同的粘性末端，便于质粒和目的基因的正向连接。 （3）培育出的番茄植株是否具有抗冻性状，可采用鉴定方法是将转基因抗冻番茄幼苗植株栽培在寒冷环境中，观察植株的生长发育情况，该方法属于个体生物学鉴定。 （4）PCR技术是获取目的基因的主要手段。PCR扩增目的基因时设计引物序列的主要依据是抗冻基因两端的部分核苷酸序列进行设计，若一个该DNA分子在PCR仪经过4次循环，经过3次循环后，短链条数目为23×2（单链总数）-2（模板单链）-2×3（与模板单链互补的单链）=8条，3次循环后的短链条在第4次循环时全部作为等长目的基因的模板，故产物中共有8个等长的目的基因片段，PCR产物通常采用琼脂糖凝胶电泳法来鉴定，DNA迁移的速度与其相对分子质量有关。 （5） 巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应（PCR），使用两对PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物（也称外引物）扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部，也称内引物）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。相比于常规PCR，巢式PCR获得错误目标产物概率低，因为第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的基因中同时包含两套引物结合位点的可能性极低，因而巢式PCR大大降低了引物配对特异性不强造成的非特异性扩增，降低了错误目标产物概率。 19．（23-24高二下·安徽蚌埠·期末）为加速转基因奶牛的繁育，科学家通过转基因技术将人的生长激素基因导入奶牛体细胞，通过核移植技术和早期胚胎培养技术对此转基因奶牛进行克隆生产，过程如图所示。回答下列问题： (1)现在，常用PCR特异性快速扩增目的基因，PCR反应需要提供DNA模板，2种引物，4种脱氧核苷酸和 酶，该酶活性需要 激活。PCR经过 过程，完成一轮循环。 (2)在基因表达载体构建的过程中，需将目的基因插入到载体的 之间，标记基因的作用是 。 (3)在对含有人生长激素基因的奶牛体细胞进行培养时，细胞增殖的方式是 。奶牛体细胞增殖表现出细胞贴壁的特点，传代培养时需要多次用 酶处理。 (4)形成重组细胞时，应选用 期的卵母细胞。将重组细胞培养成的重构胚移入受体母牛后，该母牛生出的犊牛并不是100%对供体的复制，原因是 。对该奶牛进行克隆的原理是 。 【答案】(1) 耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶） Mg2+ 变性→复性→延伸 (2) 启动子和终止子 便于重组DNA分子的筛选 (3) 有丝分裂 胰蛋白酶 (4) 减数第二次分裂中期 生物的性状受细胞核基因和细胞质基因共同控制（去核的卵母细胞提供了部分质基因） 动物细胞核具有全能性 【分析】PCR反应需要提供的是：DNA模板， 2种引物，4种脱氧核苷酸和TaqDNA聚合酶，反应过程包括变性→复性→延伸。 【详解】（1）PCR反应需要提供的是：DNA模板， 2种引物，4种脱氧核苷酸和TaqDNA聚合酶，且TaqDNA聚合酶需要Mg2+激活，扩增过程中，需将4种脱氧核苷酸依次加到引物的3'端，重复多次。PCR反应过程包括变性→复性→延伸。 （2）基因表达载体构建的过程中，需将目的基因插入到载体的启动子和终止子之间，载体上需要有标记基因，便于重组DNA 分子的筛选。 （3）体细胞的增殖方式为有丝分裂，若对体细胞进行培养的过程中出现接触抑制，则需更换培养基进行传代培养，该过程需要多次用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理。 （4）形成重组细胞时应选用减数第二次分裂中期的卵母细胞，将重组细胞培养成的重构胚移入受体母牛后，该母牛生出的犊牛并不是100%对供体的复制是因为生物的性状受细胞核基因和细胞质基因共同控制，（去核的卵母细胞提供了部分质基因）。克隆的原理是动物细胞核具有全能性。 20．（23-24高二下·安徽·期末）PCR定点突变技术是最常用的基因突变技术，通过定点诱变可以在体外改造DNA分子。重叠延伸PCR是发展最早的PCR定点突变技术，操作过程如图1，可通过测序检验定点突变是否成功。现欲将改造后的基因构建重组质粒导入大肠杆菌，质粒结构如图2。请回答有关问题： (1)PCR技术的原理是 ，引物的作用是 。 (2)由图1可知，第1对引物是突变引物FP2和通用引物RP2，第2对引物是通用引物FP1和突变引物RP1，2对引物参与的PCR过程不能在同一反应系统中进行，原因是 。 (3)为筛选出含有目的基因的大肠杆菌，通常采用影印法（使用无菌的绒毡布压在培养基A的菌落上，带出少许菌种，平移并压在培养基B上，结果如图3）。培养基A中添加氨苄青霉素，培养基B中添加四环素，含有重组质粒的菌落是 （填数字），原因是 。 (4)科学家以Rubisco酶的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，利用PCR定点突变技术改造Rubisco酶基因，提高了Rubisco酶对CO2的亲和力，进而提高植物的光合作用速率，以满足人类生产和生活的需求。和传统基因工程相比，该过程最突出的优点是 。 【答案】(1) DNA半保留复制 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 (2)突变引物FP2和突变引物RP1之间能碱基互补配对，会造成引物形成双链，不能与模板链结合，降低扩增的效率 (3) 4、6 用两种限制酶对质粒进行切割时，会破坏四环素抗性基因，但不会破坏氨苄青霉素抗性基因，因此导入重组质粒的农杆菌能在含有氨苄青霉素的培养基上能生存，但不能在含有四环素培养基上生存 (4)能够更精准、更有针对性地对基因进行改造，以实现特定的功能优化，而不是随机地插入或替换基因 【分析】PCR是利用DNA半保留复制原理的一项在体外合成DNA的技术，PCR反应体系中一般需要两种引物，这两种引物不能碱基互补配对。限制性核酸内切酶能识别特定序列的核苷酸，具有专一性。 【详解】（1）PCR的原理是DNA半保留复制，其中引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。 （2）对于同一DNA片段的不同区段进行扩增时，不同引物的碱基排列顺序不能互补，如果互补，就会造成引物形成双链，不能与模板链结合，降低扩增的效率。 （3）用两种限制酶对质粒进行切割时，会破坏四环素抗性基因但不会破坏氨苄青霉素抗性基因，因此导入重组质粒的菌株能在含有氨苄青霉素的培养基上生存，但不能在含有四环素的培养基上生存，因此制备培养基A时，应添加氨苄青霉素，培养基B添加四环素。采用影印法将培养基A菌落平移并印压在含有四环素抗性基因培养基B上，图中1、2、3、5共四个菌落能生长，说明四个菌落含有四环素抗性基因，表明四环素抗性基因没有被破坏，不含有目的基因，因此含有重组质粒的菌落是4、6。 （4）和传统基因工程相比，利用 PCR 定点突变技术改造 Rubisco 酶基因以提高 Rubisco 酶对 CO₂的亲和力，进而提高植物的光合作用速率，该过程最突出的优点是能够更精准、更有针对性地对基因进行改造，以实现特定的功能优化，而不是随机地插入或替换基因。例如，可以精确地改变 Rubisco 酶基因中的特定碱基对，从而更有效地提高其对 CO₂的亲和力，而传统基因工程往往无法做到如此精确的定点改造。 21．（23-24高二下·安徽淮北·期末）随着抗生素需求的增加，利用基因工程从微生物中获得抗生素已成为生产抗生素的一种重要途径。某实验室欲利用大肠杆菌获得抗体，图1表示该抗体基因及部分碱基序列，图2表示质粒及限制酶的切割位点，图3表示不同限制酶的识别序列，其中AmpR、KanR分别为氨苄青霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因。回答下列问题：    (1)限制酶作用于DNA分子的 键，其切割DNA后可产生 和平末端。 (2)将图1中抗体基因与图2中质粒结合的过程称为 ，结合过程中使用的限制酶是 。将目的基因导入受体细胞后，可在培养基中加入 （填“氨苄青霉素”或“卡那霉素”）对目的细胞进行筛选。 【答案】(1) 磷酸二酯 黏性末端 (2) 基因表达载体的构建 BlgⅡ、NotⅠ 卡那霉素 【分析】1、基因工程的操作工具是DNA连接酶、限制酶和载体。 2、基因工程的操作步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）限制酶作用于DNA分子的磷酸二酯键，切割DNA后可产生黏性末端和平末端，平末端只能用T4DNA连接酶进行连接。 （2）将图1中抗体基因与图2中质粒结合的过程称为基因表达载体的构建，由图可知，抗体基因两侧具有已知的黏性末端，因此需使用限制酶Blg Ⅱ、Not Ⅰ切割质粒，使其具有与抗体基因两侧相同的黏性末端，才能保证目的基因和质粒的正确连接。基因表达载体构建时，会破坏AmpR基因，因此只有kanR可做标记基因，因此需在培养基中加入卡那霉素对目的细胞进行筛选。 22．（23-24高二下·安徽宣城·期末）干扰素是一种广谱抗病毒制剂，下图为通过基因工程生产干扰素的部分操作，图中①②③④表示相关操作过程。回答下列问题： (1)通过提取细胞中的RNA逆转录获得干扰素基因，与细胞中原有的干扰素基因相比，该基因不含 和内含子。 (2)②过程可使用PCR技术大量扩增干扰素基因，PCR技术要在缓冲体系中添加Mg2+、dNTP、两种引物、 、 等。PCR技术的一轮循环要经过三个步骤，其中温度最高的步骤是： （填步骤名称）。PCR的产物通常要用琼脂糖凝胶电泳技术进行鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与 、 等有关。 (3)③过程通常要用不同的限制酶对质粒和干扰素基因进行切割以露出不同的黏性末端，这是为了防止 。 (4)科学家发现，如果将干扰素分子上的第17位半胱氨酸变成丝氨酸，在一定条件下可以延长保存时间。上述对干扰素的改造过程属于 工程的范畴。如利用发酵工程来生产干扰素，发酵结束后可采用适当的提取、分离和 措施来获得干扰素。 【答案】(1)启动子、终止子 (2) 模板 耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶） 变性 凝胶的浓度 DNA分子的大小和构象 (3)质粒和干扰素基因自身环化和干扰素基因反向连接 (4) 蛋白质 纯化 【分析】题图分析，图中过程①②表示获取目的基因，过程③表示基因表达载体的构建，过程④表示将重组质粒导入受体细胞，此后经过目的基因的检测与鉴定进而获得能产生干扰素的酵母菌。 【详解】（1）通过提取细胞中的RNA逆转录获得干扰素基因，与细胞中原有的干扰素基因相比，该基因不含启动子、终止子等非编码序列以及内含子，其中只包含了原来基因中外显子的部分。 （2）②过程可使用PCR技术大量扩增干扰素基因，PCR技术要在缓冲体系中添加Mg2+（能激活DNA聚合酶）、dNTP（合成DNA的原料）、两种引物（使子链在引物的3’开始延伸）、模板和耐高温的DNA聚合酶等。PCR技术的一轮循环要经过三个步骤，即为变性、复性和延伸，其中温度最高的步骤是变性，该步骤中通过高温的作用使碱基对中氢键断裂获得DNA单链。PCR的产物通常要用琼脂糖凝胶电泳技术进行鉴定，在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，进而根据迁移速度的不同加以鉴定。 （3）③过程为目的基因表达载体的构建，该过程中通常要用不同的限制酶对质粒和干扰素基因进行切割以露出不同的黏性末端，这是为了防止质粒和干扰素基因自身环化和干扰素基因反向连接，从而保证目的基因和质粒的正向连接。　 （4）科学家发现，如果将干扰素分子上的第17位半胱氨酸变成丝氨酸，在一定条件下可以延长保存时间。上述对干扰素的改造过程属于蛋白质工程的范畴，但改造过程依然需要通过合成和修饰基因来实现。如利用发酵工程来生产干扰素，发酵结束后由于获得的是代谢产品，因而可采用适当的提取、分离和纯化等措施来获得干扰素。 23．（23-24高二下·安徽·期末）苹果切开后颜色会加深的现象称为“褐变”，“褐变”是由于多酚氧化酶催化多酚类物质生成棕色色素所致，科研人员用农杆菌转化法培育出了抗褐变转基因苹果。结合下图，回答有关植物转基因和克隆的问题。 (1)农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞基因组中的原因是 。愈伤组织细胞是具有较强的增殖分化能力的薄壁细胞， 技术常用于植物克隆，图中 过程中（填编号）生长素与细胞分裂素的比例应基本相等。 (2)研究应以抑制多酚氧化酶表达的基因作为目的基因，原因是 。研究人员拟用PCR扩增目的基因片段，设计引物时，需要避免引物之间发生 而造成引物失效。已知目的基因的一条链为5’——ATTCCA……CATGCC—3’，设计了一条引物为5’-GGCATG-3’，另一条引物为 （写出6个碱基即可）。 (3)用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞前，需先将构建好的目的基因表达载体导入农杆菌，一般先用Ca2+处理农杆菌细胞使其处于一种 的生理状态。 【答案】(1) Ti质粒中的T-DNA 能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起 植物组织培养 ③ (2) 苹果中多酚氧化酶表达量降低，生成的棕色色素物质减少 碱基互补配对 5´-ATTCCA-3´ (3)能吸收周围环境中 DNA 分子 【分析】基因工程常用的转化方法：将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和 花粉管通道法等；将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 显微注射技术，此方法的受体细胞多是受精卵；将目的基因导入微生物细胞：最常用的是大肠杆菌，其转化方法是：先用 Ca2+处理细胞，使其成为 感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。 【详解】（1）农杆菌有Ti质粒，Ti质粒中的T-DNA 能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起，故农杆菌可将外源基因递送到植物细胞基因组中。愈伤组织细胞是具有较强的增殖分化能力的薄壁细胞，植物组织培养技术常用于植物克隆，诱导愈伤组织的形成生长素与细胞分裂素的比例应基本相等，图中过程③为诱导形成愈伤组织。 （2）苹果“褐变”是由于多酚氧化酶催化多酚类物质生成棕色色素所致，研究应以抑制多酚氧化酶表达的基因作为目的基因，是因为苹果中多酚氧化酶表达量降低，生成的棕色色素物质减少。若引物之间能碱基互补配对，引物与模板结合的效率会降低，设计引物时，需要避免引物之间发生碱基互补配对而造成引物失效。引物应根据目的基因的两端的核苷酸序列设计，并且引物应该与目的基因的3'互补配对，已知目的基因的一条链为5’——ATTCCA……CATGCC—3’，另一条链的序列为5’——GGCATG……TGGAAT—3’，设计的另一种引物为5´-ATTCCA-3´。 （3）Ca2+处理农杆菌细胞使其处于一种能吸收周围环境中 DNA 分子。 24．（23-24高二下·安徽阜阳·期末）若要利用某目的基因（如图1）和P1噬菌体载体（如图2）构建重组DNA（如图3），限制性内切核酸酶的酶切位点分别是 BglⅡ（A↓GATCT）、EcoR I （G↓AATTC）和Sau3AI（↓GATC），回答下列问题。 (1)用BglⅡ和Sau3AⅠ分别切割目的基因和P1噬菌体载体，这两种限制酶的识别序列和切割位点均不相同，切出DNA片段的特点是 。 (2)只有用 限制酶切割目的基因和P1噬菌体载体，构建的重组DNA中RNA聚合酶在插入目的基因上的移动方向，只能与图3一致。 (3)若目的基因是来自某单链RNA病毒表面的糖蛋白（GP）基因，则从该病毒基因组中分离出来GP 基因不能直接与质粒载体重组，原因是 。为了判断某人是否感染该病毒，利用探针对疑似患者进行核酸检测，要在短时间内快速生产探针可利用 技术实现。 (4)若该目的基因为利用山羊乳腺生物反应器制备的Hp疫苗基因，则在构建基因表达载体时往往需要 启动子，其目的是 。 【答案】(1)产生相同的黏性末端 (2)EcoRI和Sau3AI (3) 某病毒GP基因为单链RNA，不能直接与质粒DNA相连 PCR (4) 山羊乳腺细胞中特异性表达的基因（乳腺蛋白基因） Hp疫苗基因在乳腺中表达，从而实现山羊的乳汁中提取疫苗 【分析】基因工程的基本操作程序是：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。在构建基因表达载体时，与使用单一限制酶切割相比，使用两种限制酶切割可以减少目的基因及载体的自身环化、使目的基因定向连接到载体上，以增大目的基因正向连接的概率。 【详解】（1）由题意可知：限制酶BglⅡ和Sau3AI的识别序列和切割位点分别为“A↓GATCT”和“↓GATC”，但二者切割DNA片段产生的黏性末端相同，都是GATC。 （2）由题意和题图呈现的信息可知：用BglⅡ和EcoRI切割目的基因会产生两种DNA片段，一种含有目的基因，一种不含目的基因，且有目的基因的片段与载体结合时容易发生反向连接。用Bg1Ⅱ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体，也能产生相同的黏性末端，可能会发生反向连接。只有用EcoRI和Sau3AI限制酶切割目的基因和P1噬菌体载体，产生的黏性末端不同，能防止发生反向连接，这样目的基因插入载体后构建的重组DNA中，RNA聚合酶的移动方向只能与图3一致。 （3）若目的基因是来自某单链RNA病毒表面的糖蛋白（GP）基因，则该GP基因为单链RNA，不能直接与质粒DNA相连，因此从该病毒基因组中分离出来GP 基因不能直接与质粒载体重组。为了判断某人是否感染该病毒，对疑似患者进行核酸检测时，所使用的探针是用放射性同位素等标记目的基因（GP基因）的片段而制成的上。若要在短时间内快速生产探针，可利用PCR技术进行扩增。 （4）若该目的基因为利用山羊乳腺生物反应器制备的Hp疫苗基因，则需要Hp疫苗基因在乳腺中表达，从而实现在转基因山羊的乳汁中提取疫苗，因此在构建基因表达载体时，往往需要山羊乳腺细胞中特异性表达的基因（乳腺蛋白基因）启动子。 25．（23-24高二下·辽宁鞍山·期末）某研究团队将水母细胞中获取的绿色荧光蛋白基因（GFP）插入野生型小鼠Gata3基因一侧，如图甲所示，实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雄鼠1只，让其与野生型雌性小鼠交配获得F1，再让F1中含GFP基因的雌雄鼠相互交配，以获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠F2。为了鉴定交配获得的多只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。回答下列问题。 (1)启动子的作用是 ，Gata3基因的启动子 （能/不能）驱动GFP基因的表达。 (2)插入GFP基因的DNA，转录该基因时的模板链是 链，水母细胞中的GFP基因可以在小鼠细胞中表达出绿色荧光蛋白，原因是 。 (3)PCR扩增中引物的作用是 。用引物1和引物2对亲本雄鼠DNA进行PCR扩增，产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，结果如图乙所示。从DNA结构解释亲本雄鼠产生两个条带的原因 ，用同样的方法对F2中多个个体DNA进行PCR扩增并电泳，在图乙中绘制F2可能出现的所有电泳结果。 【答案】(1) RNA聚合酶结合与识别的位点，驱动转录 能 (2) b 他们都遵循中心法则，共用一套密码子 (3) 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 雄性亲本是杂合子，小片段条带扩增的是非编码区和Gata3编码区部分序列，大片段条带扩增的是非编码区、GFP编码区、Gata3  编码区的部分序列 【分析】PCR技术是聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 【详解】（1）启动子是RNA 聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA 序列，它含有RNA 聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游,启动子本身不被转录，因此启动子的作用是RNA聚合酶结合与识别的位点，驱动转录；分析图中可知，启动子在编码区的左侧，GFP基因整合在Gata3基因的右侧，启动子启动转录后，可以在Gata3基因转录后，使GFP基因转录，Gata3基因的启动子也能驱动GFP基因的表达； （2）GFP基因转录时RNA聚合将沿5'端延伸，因此插入GFP基因的DNA，转录该基因时的模板链是b链，水母细胞中的GFP基因可以在小鼠细胞中表达出绿色荧光蛋白，原因是他们都遵循中心法则，共用一套密码子； （3）PCR扩增中引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸；从DNA结构解释亲本雄鼠产生两个条带的原因雄性亲本是杂合子，小片段条带扩增的是非编码区和Gata3编码区部分序列，大片段条带扩增的是非编码区、GFP编码区、Gata3 编码区的部分序列。用同样的方法对F2中多个个体DNA进行PCR扩增并电泳，F2可能出现的所有电泳结果为： 26．（23-24高二下·安徽芜湖·期末）某真菌的W基因可编码一种高效降解纤维素的酶，已知图中W基因转录方向为从左往右。为使细菌产生该酶，以图中质粒为载体，进行转基因。 限制酶 BamHI EcoR I Mfe I Kpn I HindⅢ 识别序列和切割位点 G↓GATCC G↓AATTC C↓AATTG GGTAC↓C A↓AGCTT (1)从真菌中获取相应基因后通过PCR技术扩增W基因序列。扩增结果用 检测，检测结果显示有多个条带，试从引物设计的角度分析原因 。 (2)基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。这一步骤应使用限制酶 切割图中质粒，使用限制酶 切割图中含W基因的DNA片段，以获得能正确表达W基因的重组质粒。 (3)W基因转录时应以 链为模板,形成的mRNA的序列为5'---UGAAC-GCUA……(中间序列)…GUCGACUCG---3'。则用于PCR扩增的引物中应有的序列为 。 A．5'--TGAACGCTA…               B．5'--CGAGTCGAC… C．5'--ACTTGCGAT…               D．5'---GCTCAGCTG… 【答案】(1) 电泳 引物特异性不高，在模板上有非特异结合位点 (2) MfeI、HindⅢ EcoRI、HindⅢ (3) 乙链 AB 【分析】一个基因表达载体的组成，除目的基因、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位。有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。 【详解】（1）扩增完成后,可以通过电泳分析来检测PCR产物；检测结果显示有多个条带，从引物设计的角度分析可能的原因是引物特异性不高，在模板上有非特异结合位点； （2）根据题图信息“图中W基因转录方向是从左往右”、“质粒启动子到终止子方向为顺时针”，故重组质粒的启动子应在W基因左侧，终止子应在W基因右侧，W基因右侧只能用HindⅢ切割，W基因左侧有BamHI、KpnI、EcoRI三种酶切位点，结合质粒情况及切割位点识别序列，应使用限制酶MfeI、HindⅢ切割图中质粒，使用限制酶EcoRI（切割出的黏性末端与MfeI相同）、HindⅢ切割图中含W基因的DNA片段，以获得能正确表达W基因的重组质粒，因为限制酶MfeI和限制酶EcoRI切割露出相同的黏性末端； （3）W基因转录方向是从左向右，mRNA链的合成方向为5'→3'，与乙链从左向右3'→5'互补，故W基因转录的模板链是乙链；引物与模板链的3'端结合，mRNA也与模板链结合，因此左引物与mRNA序列相似，不同的是引物是一段DNA，因此将mRNA中的U替换成T即是引物序列，即5'-UGAAC-CCUA…（中间序列）…GUCCACUCG-3'→5'-TGAAC-CCTA…（中间序列）…GTCCACTCG-3'，与A相同。右引物为5'--CGAGTCGAC…，故选AB。 27．（22-23高二上·安徽芜湖·期末）生长激素在治疗激素分泌过少的矮小症方面有积极的作用，为了批量生产生长激素，可以采用转基因技术将控制生长激素合成的基因转移到微生物细胞内。请回答下列相关问题： (1)该技术流程的核心步骤是 。 (2)①获取生长激素基因时可以使用PCR技术扩增，该技术的一个循环中所需温度最低的步骤是 。下表是用于扩增的两种引物序列，请据表回答相关问题： 引物名称 引物序列（5'-3'） 引物1 TTCGATGTTGAGGGTGCTCAT 引物2 TCACACCAGTTGAAAATCCTAATTG 引物1对应的模板链序列（5'-3'）为 。 ②下图为生长激素基因的部分序列，请问引物1和引物2分别对应的位置 。 A．I和Ⅱ  B．Ⅱ和Ⅲ  C．Ⅲ和Ⅳ  D．I和Ⅳ ③假设加入的模板数为a，引物能与模板上唯一基因序列特异性结合，理论上n次循环需要消耗引物2的数量是 。 (3)若目的基因用限制酶切割后形成如图1所示的末端，则切割质粒载体（图2所示）应选择使用的限制酶是 。 【答案】(1)基因表达载体的构建 (2) 复性（退火） 5'-ATGAGCACCCTCAACATCGAA-3' B a（2n-1） (3)KpnⅠ和XmaⅠ 【分析】1、基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。 2、PCR技术：①概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术；②原理：DNA复制；③条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；④方式：以指数的方式扩增，即约2n；⑤过程：高温变性、低温复性、中温延伸。 【详解】（1）基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。 （2）①PCR的过程为：高温变性、低温复性、中温延伸，因此一个循环中所需温度最低的步骤是复性。引物1的碱基序列为（5'-3'）TTCGATGTTGAGGGTGCTCAT，根据碱基互补配对可得到模板的碱基序列，且DNA分子是由两条反向平行的脱氧核苷酸链连接而成，因此引物1对应的模板链序列为5'-ATGAGCACCCTCAACATCGAA-3'。 ②子链延伸的方向是从5'端到3'端，引物应选择Ⅱ和Ⅲ ，即B正确，ACD错误。 故选B。 ③每合成一个新的DNA需要一个引物2，因此若加入的模板数为a，n次循环新合成的DNA分子数为a（2n-1）。则需要消耗引物2的数量是a（2n-1）。 （3）若想目的基因和质粒连接成重组质粒，两者需要相同的黏性末端，目的基因的黏性末端已知，根据各限制酶识别序列，可判断用限制酶KpnⅠ和XmaⅠ切割后的质粒和与目的基因相连。 28．（22-23高二下·安徽合肥·期末）研究人员利用AFPs抗冻基因和Ti质粒构建重组质粒，选择所需重组质粒转入番茄植株，培育抗冻番茄，主要操作过程如下图。抗冻番茄经低温诱导后可溶性蛋白均比对照明显增加，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳可检测到可溶性蛋白的C区和B区染色加深。已知三种限制酶的识别序列及酶切位点如下表所示。请回答下列问题：    限制酶 BamH I Bgl Ⅱ EcoR I 识别序列及酶切位点 —G↓GATCC —A↓GATCT —G↓AATTC— (1)构建重组质粒时，应选择 、 （酶）分别切割质粒和含AFPs抗冻基因的外源DNA。 (2)培育转基因植物时，常选择Ti质粒作为目的基因载体的原因是 。将导入了表达载体的农杆菌与取自番茄的细胞共同培养，通过农杆菌的 作用就可使目的基因进入番茄细胞，为筛选成功导入抗冻基因的番茄细胞，需在培养基中添加 。通过过程④获得完整的植株，依据的原理是 。与常规的种子繁殖方法相比，利用该技术培育抗冻番茄植株的优点是 。 (3)可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测经低温诱导后抗冻番茄植株中的可溶性蛋白，若 ，则表明AFPs基因已表达出相应的蛋白质；也可采用 进行个体生物学水平的检测。 【答案】(1) BamHⅠ BamHⅠ和BglⅡ (2) 农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上T-DNA及其携带的外源基因转移到被侵染的细胞中，并将其整合到该细胞的染色体DNA上 转化 四环素 （植物）细胞的全能性 不仅可以高效、快速地实现种苗的大量繁殖，还可以保持抗冻番茄的遗传特性 (3) 可溶性蛋白的C区和B区染色加深 低温处理并观察番茄植株的抗冻情况 【分析】农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。 【详解】（1）根据表格信息，BamHⅠ和BglⅡ切割AFPs抗冻基因DNA后产生的黏性末端相同，结合图示可知，构建重组质粒时，可选择BamHⅠ切割质粒，选择BamHⅠ和BglⅡ切割含AFPs抗冻基因的外源DNA。 （2）培育转基因植物时，常选择Ti质粒作为目的基因载体的原因是：农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上T-DNA及其携带的外源基因转移到被侵染的细胞中，并将其整合到该细胞的染色体DNA上；通过农杆菌的转化作用就可使目的基因进入番茄细胞； 四环素抗性基因位于T-DNA上，Ti质粒上的T-DNA可转移到被侵染的细胞中，因此可通过在培养基中添加四环素来筛选成功导入抗冻基因的番茄细胞。 通过植物组织培养技术将细胞培养成完整的植株，依据的原理是植物细胞的全能性；利用植物组织培养技术培育植株的优点是不仅可以高效、快速地实现种苗的大量繁殖，还可以保持抗冻番茄的遗传特性。 （3）根据题干信息分析，抗冻番茄经低温诱导后可溶性蛋白均比对照明显增加，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳可检测到，若可溶性蛋白的C区和B区染色加深，则表明AFPs基因已表达出相应的蛋白质；也可采用低温处理并观察番茄植株的抗冻情况进行个体生物学水平的检测。 29．（22-23高二下·安徽六安·期末）PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0.9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题： (1)为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经 过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。 (2)图1为所用载体图谱示意图，在利用PCR扩增phb2基因时，为了使PCR产物能被限制酶切割，以便构建基因表达载体，可以考虑在引物的 （填“3＇”端或“5＇端”）添加限制酶识别序列。而在扩增的phb2基因两端分别引入两种不同限制酶的识别序列是常用方法，对于酶切的phb2基因和载体来说选择两种限制酶切比只用一种限制酶切好的原因是： 。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用 （填“E．coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）。        相关限制酶的识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点 HindⅢ A↓AGCTT TTCGA↑A EcoRⅠ G↓AATTC CTTAA↑G Pvit2 CAG↓CTG GTC↑GAC PstⅠ CTGC↓AG GA↑CGTC KpnⅠ G↓GTACC CCATG↑G BamHⅠ G↓GATCC CCTAG↑G 注：箭头表示切割位点 (3)将符合要求的基因表达载体导入工程菌后，可用 技术检测PHB2蛋白是否合成，通过提取、分离和纯化，从发酵液中获得该蛋白。为防止PHB2蛋白在工程菌细胞中被降解，在发酵过程中应选用 缺陷型工程菌作为受体细胞，且在发酵结束后的纯化过程中应添加蛋白酶抑制剂。 (4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2， 号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。    注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0.2kb的DNA分子条带未出现在图中 【答案】(1)逆转录 (2) 5'端 可以防止目的基因和质粒的自身环化，也可以防止目的基因和质粒的反向连接 T4DNA连接酶 (3) 抗原-抗体杂交 蛋白酶 (4)3 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）利用RNA获得cDNA的过程称为逆转录（或反转录）。 （2）进行PCR扩增目的基因时，引物需要与模板的3'端结合，故需在引物的5'端添加限制酶识别序列。可以防止目的基因和质粒的自身环化，也可以防止目的基因和质粒的反向连接，故在扩增的phb2基因两端分别引入两种不同限制酶的识别序列是常用方法，对于酶切的phb2基因和载体来说选择两种限制酶切比只用一种限制酶切好。根据Pvit2的酶切序列，切出了平末端，所以构建基因表达载体时，应该用T4DNA连接酶连接质粒和目的基因。 （3）将表达载体导入工程菌后，PHB2蛋白是否合成可用抗原-抗体杂交技术检测，从发酵液中获得该蛋白的方法提取、分离和纯化；为防止PHB2蛋白在工程菌细胞中被降解，在发酵过程中应选用不能合成蛋白酶（蛋白酶缺陷型）工程菌作为受体细胞，且在发酵结束后的纯化过程中应添加蛋白酶的抑制剂。 （4）由于这些菌落都可以生长在含有氨苄青霉素的培养基中，因此都含有质粒，重组质粒包含了目的基因和质粒，如果用EcoRⅠ和PvitⅡ两种酶切割重组质粒电泳后将获得含有质粒和目的基因两条条带，由于phb2基因大小为0.9kb，所以对应电泳图是菌落3。 30．（22-23高二下·安徽合肥·期末）脑血栓是威胁人类健康的常见疾病，研究发现人体内的t-PA蛋白能高效降解由纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药。通过基因工程技术可以大量制备基因工程药物t-PA。    (1)研究人员采用PCR技术可以获得大量t-PA基因，PCR的原理是 ，此外，除上述外获得t-PA基因的方法还有 （答出1种即可）。 (2)研究表明，为心梗患者注射大量t-PA会诱发颅内出血，其原因在于t-PA与纤维蛋白结合的特异性不高，若将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。据此，先对天然的t-PA基因进行序列改造，然后再采取传统的基因工程方法表达该改造后的基因，可制造出性能优异的改良t-PA蛋白。（注：如图乙表示相关的目的基因、载体及限制酶。pCLY11为质粒，新霉素为抗生素。）请回答下列问题： ①以上制造出性能优异的改良t-PA蛋白的过程被称为 。已知人t-PA基因第84位半胱氨酸的模板链碱基序列为ACA，而丝氨酸的密码子为UCU，因此改造后的基因决定第84位丝氨酸的模板链的碱基序列应设计为 。 ②如图所示，需选用限制酶XmaI和 切开质粒pCLY11，才能与t-PA改良基因高效连接。与单一酶酶切相比，本操作采用的双酶切方法的优点是 。 (3)将连接好的质粒DNA导入大肠杆菌，含t-PA改良基因重组质粒的细胞应具有的性状是________________。 A．新霉素抗性且呈蓝色 B．新霉素敏感且呈蓝色 C．新霉素抗性且呈白色 D．新霉素敏感且呈白色 【答案】(1) DNA半保留复制 人工合成（或从基因文库中获取） (2) 蛋白质工程 AGA BglⅡ 防止载体和目的基因自身环化以及目的基因和质粒反向连接 (3)C 【分析】1、目的基因的获取可以从基因文库中提取，可以使用PCR进行扩增获得。对于基因比较小，核苷酸序列已知，也可以直接使用DNA合成仪直接人工合成。 2、PCR技术的步骤：①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解旋为单链；②温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；③当温度上升到72℃左右时，溶液中的脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 【详解】（1）PCR是指体外合成DNA的技术，其原理是DNA半保留复制。对于基因比较小，核苷酸序列已知，也可以直接使用DNA合成仪（化学方法）直接人工合成，此外还可从基因文库中直接获取。 （2）①天然的t-PA基因控制t-PA蛋白的合成，改良t-PA蛋白需要对天然的t-PA基因序列进行改造，然后用改造的基因作为目的基因让其表达，从而实现对天然蛋白质的改造，题中合成性能优异的改良t-PA蛋白的过程称为蛋白质工程，已知人t-PA基因第84位半胱氨酸的模板链碱基序列为ACA，而丝氨酸的密码子为UCU，根据碱基互补配对原则可推测，改造后的基因决定第84位丝氨酸的模板链的碱基序列应设计为AGA。 ②目的基因两端的黏性末端图中已经给出，观察各限制酶的识别序列可知，限制酶XmaⅠ和BglⅡ切割产生的黏性末端能与目的基因的黏性末端碱基互补，要想把目的基因与质粒pCLY11 （运载体） 拼接起来，需要得到相同的黏性末端，因此质粒pCLY11（运载体）也需要限制酶XmaⅠ和BglⅡ切割；这里用两种不同的限制酶切割质粒是为了使其呈现两种不同的黏性末端分别与目的基因的两个黏性末端连接，这样可以保证目的基因和质粒的正向连接，同时也可避免目的基因和质粒的自身环化。 （3）结合图示可知，限制酶XmaⅠ和BglⅡ会破坏质粒pCLY11上的mlacZ，但不会破坏neor（新霉素抗性基因），导入重组质粒的大肠杆菌具有新霉素抗性，但由于mlacZ基因被破坏，因而菌落呈现白色，故选C。 31．（22-23高二下·安徽亳州·期末）请回答下列关于基因工程的相关问题： (1)在标准的PCR体系中需要加入 和 种引物，引物的作用是 。 (2)构建基因表达载体时，需要用 将目的基因与载体连接，因此需要在目的基因两侧加上酶切位点。PCR完成以后，常采用 来鉴定PCR的产物。 (3)用两种酶切割目的基因和质粒要优于同种酶切割，其优点是 。 (4)若要用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞，应选用下图中的 作为表达载体（图中→代表目的基因，箭头方向代表转录方向；Bar基因是标记基因），原因是 。 A． B．  C．  D．  E.   【答案】(1) 模板、原料、酶 2 使Taq酶（热稳定DNA聚合酶）能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 (2) DNA连接酶 琼脂糖凝胶电泳 (3)可以保证目的基因和质粒的正向连接，同时避免目的基因、质粒发生自连成环 (4) D 表达载体需要具备启动子、终止子和标记基因等元件，且需将目的基因正确插到T-DNA的启动子和终止子之间 【分析】基因工程的基本步骤是：获取目的基因、构建基因表达载体、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）PCR技术的原理是DNA双链复制，故PCR反应体系需满足DNA复制所需条件，包括模板、原料、酶以及2种引物。两种引物分别与解旋后的DNA的两条链配对结合，使Taq酶（热稳定DNA聚合酶）能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸形成子链。 （2）构建基因表达载体时，需要用DNA连接酶将切割后的目的基因与载体连接。常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 （3）若用一种酶进行切割，目的基因和质粒均含相同黏性末端，可能会发生目的基因反向连接，也可能发生目的基因、质粒自连成环现象，因此与一种酶相比，用两种酶切割目的基因和质粒的优点是可以保证目的基因和质粒的正向连接，同时避免目的基因、质粒发生自连成环。 （4）基因表达载体除了含有目的基因外，还需要具备启动子、终止子和标记基因等元件，且需将目的基因正确插到T-DNA的启动子和终止子之间，才能利用T-DNA的可转移特性将目的基因整合到宿主细胞染色体DNA上，且能在受体细胞中稳定存在和表达，则若要用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞，应选用图中的D作为表达载体，D正确。 故选D。 32．（22-23高二下·安徽亳州·期末）为生产具有特定性能的α-淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中利用PCR克隆了α-淀粉酶基因，利用基因工程大量制备α-淀粉酶，流程如图所示。请回答下列问题：    (1)科研人员利用PCR克隆α-淀粉酶基因时，引物在扩增过程中的作用是 。 (2)构建重组表达载体时，应使用 （酶）“缝合”α-淀粉酶基因和表达载体。若将重组表达载体导入大肠杆菌，则大肠杆菌需经Ca2+处理，使其处于一种能 的生理状态。 (3)筛选分解淀粉能力强的工程菌时，常用 （填“稀释涂布平板法”或“平板划线法”）进行筛选，菌株应接种在以淀粉为 的培养基上，筛选时并不能仅仅以降解圈的大小为观察指标，原因可能是 。 (4)若对工程菌生产的α-淀粉酶进行产品分析，还需要进行的工作有 （答出1点）。 【答案】(1)与模板链结合，使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 (2) T4DNA连接酶 吸收周围环境中DNA分子 (3) 稀释涂布平板法 唯一碳源 菌体繁殖力不同，菌落中菌体的数量存在差异，形成的菌落大小不同 (4)某些基本特性重新确定：如酶能耐受的温度（或pH）范围、催化反应的最适温度（或pH）；酶活力大小的测定；建立规模化生产时该酶的技术体系、评估生产成本等 【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）PCR过程中，引物的作用是与模板链结合，使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。 （2）由图中α-淀粉酶基因的结构可以看出，左侧是平末端，右侧是黏性末端，因此需要用T4DNA连接酶“缝合”α-淀粉酶基因和表达载体。进行目的基因导入时，Ca2+处理的大肠杆菌应处于一种吸收周围环境中DNA分子的生理状态，即感受态。 （3）筛选目的菌株时，常用稀释涂布平板法完成，此时培养基应该以淀粉为唯一碳源，由于菌体繁殖力不同，使菌落中菌体的数量存在差异，形成的菌落大小不同，因此筛选时，不能直接以降解圈的大小为观察指标。 （4）由于使用的是海洋细菌中的α-淀粉酶，与某些动物（或细菌）自身产生的α-淀粉酶有所区别，因此，需要对某些基本特性重新确定：如酶能耐受的温度（或pH）范围、催化反应的最适温度（或pH）；酶活力大小的测定；建立规模化生产时该酶的技术体系、评估生产成本等。 33．（22-23高二下·安徽合肥·期末）新冠疫苗有多种，包括灭活疫苗、腺病毒载体疫苗、重组亚单位疫苗和核酸疫苗等。下图为其中一种疫苗的研发思路，图中①~⑦表示过程，箭头表示 Nco I、Sph I、Nhe I、BamH I的酶切位点（四种酶的识别序列详见表），标记基因 SUC2控制合成蔗糖酶，使 P型酵母菌能利用培养基中的蔗糖生存。 限制酶 Nco I Sph I Nhe I BamH I 识别序列和切割位点 C↓CATGG CCATG↓C G↓GATCC G↓CTAGC (1)图中①过程需要使用逆转录酶先得到 cDNA，再使用 技术扩增得到 S 基因。完成以后，常采用 鉴定扩增产物。 (2)为使③过程顺利进行，需先使用限制酶 和 切割质粒B，选用两种限制酶对新冠病毒的S基因进行切割的目的是 （答出一点即可）。 (3)图中表示筛选的过程是⑤，为达到利用标记基因筛选的目的，普通的 P型酵母菌应该满足的条件是 。 【答案】(1) PCR 琼脂糖凝胶电泳 (2) NcoⅠ NheⅠ 防止S基因自身环化（防止载体自身环化、防止S基因与载体反向连接） (3)不能合成蔗糖酶，无法利用培养基中的蔗糖生存 【分析】分析题图：图中①为逆转录过程，②表示用限制酶切割获得目的基因，③表示构建基因表达载体，④表示将目的基因导入受体细胞，⑤表示筛选获得含有重组质粒的P型酵母菌，⑥表示目的基因的表达，⑦表示制备获得疫苗。 【详解】（1）①是以RNA为模板合成DNA的逆转录过程，该过程需要逆转录酶的催化，再使用PCR技术扩增得到S基因；PCR的扩增产物通常用琼脂糖凝胶电泳技术进行鉴定。 （2）据C分子的两端的碱基序列及黏性末端（-GATC－和－CATG）可知，③过程需要用限制酶NcoI、NheI切割质粒B；若用一种限制酶切割，得到的目的基因或运载体的两端的黏性末端相同，用DNA连接酶连接时可出现S基因自身环化以及S基因与运载体反向连接的现象，所以常选用两种限制酶对新冠病毒的S基因进行切割，目的是防止S基因与运载体自身环化、防止S基因与运载体反向连接、保证S基因与运载体正确连接。 （3）图中的标记基因是SUc2，标记基因SUC2控制合成蔗糖酶，使P型酵母菌能利用培养基中的蔗糖生存，因此筛选时应使用以蔗糖为唯一碳源的培养基，图中表示筛选的过程是⑤（筛选含重组质粒的P型酵母菌），为达到利用标记基因筛选的目的，普通的 P型酵母菌应该满足的条件是不能合成蔗糖酶，无法利用培养基中的蔗糖生存。 34．（22-23高二下·安徽合肥·期末）研究人员将大麦细胞的LTP1基因导入啤酒酵母菌中，获得的啤酒酵母菌可产生LTP1蛋白，并酿出泡沫更加丰富的啤酒，下图为转基因啤酒酵母的生产过程。回答下列问题：    (1)已知DNA复制时子链的延伸方向是5'→3'，图1中A、B、C、D在不同情况下均可以作为引物，用PCR技术扩增LTP1基因时应该选用 作为引物。 (2) 是实施基因工程的核心。图2中的B为质粒，质粒和LTP1基因结合形成重组质粒C．重组质粒C在受体细胞中能够稳定存在并发挥作用，在LTP1基因的首端必须具有 ，尾端必须具有终止子，还必须含有标记基因和目的基因。 (3)为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合情况，首先采用DNA分子杂交技术检测LTP1基因是否导入成功，需要从转基因啤酒酵母中提取DNA，用 作探针与之杂交。 (4)为检测转基因啤酒酵母是否产生LTP1蛋白，除检测LTP1蛋白是否产生及含量外，还可观察转基因啤酒酵母所酿啤酒的 进行判断，若能检测到LTP1蛋白，但效果差，可能的原因是 ；若经检测确定细胞中无LTP1蛋白，可采用PCR技术检测细胞中的RNA，如果能检测到mRNA，则可能是 ；如果检测后确定细胞中无LTP1蛋白的mRNA，但之前能检测到LTP1基因，则LTP1基因未能正常转录的原因可能是 。 【答案】(1)B、C (2) 构建基因表达载体 启动子 (3)(放射性同位素)标记的目的基因(LTP1基因) (4) 泡沫丰富程度 LTP1基因表达效率低，合成的LTP1蛋白少 (LTP1基因)未能正常翻译 LTP1基因反向插入质粒DNA分子中 【分析】分析题图：图示表示将使啤酒产生丰富泡沫的LTP1基因植入啤酒酵母菌中，使其产生LTP1蛋白，酿出泡沫丰富的啤酒的过程。图中A为获取目的基因的过程；B为质粒；C为基因表达载体。 【详解】（1）引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对，必须先知道该段DNA的碱基序列。DNA复制时子链的延伸方向是5'→3'，则应选择B，C引物，其子链的延伸方向是LTP1基因。 （2）基因工程的核心是构建基因表达载体，在LTP1基因的首端必须具有启动子，尾端必须具有终止子，还必须含有标记基因和目的基因。 （3）用DNA分子杂交技术检测目的基因是否导入时，须用放射性同位素标记的目的基因（LTP1基因）单链作探针进行杂交。 （4）如导入LTP1基因成功，则可产生LTP1蛋白，并酿出泡沫丰富的啤酒；若能检测到LTPI蛋白，但效果差，则可能是LTP1基因表达效率低，合成的LTP1蛋白少；若经检测确定细胞中无LTP1蛋白，采用PCR技术能检测到细胞中的mRNA，则可能是LTP1基因未能正常翻译；如果检测细胞中无LTP1蛋白的mRNA，但之前能检测到LTP1基因，则LTP1基因未能正常转录的原因可能是LTP1基因反向插入质粒DNA分子中，或RNA聚合酶无法识别启动子。 35．（22-23高二下·安徽·期末）tPA是一种临床上用于治疗心脑血栓类疾病的药物，科研人员计划用动物乳腺生物反应器生产tPA，但tPA并不是乳腺蛋白，因此在动物乳腺中的表达水平较低。生长激素（GH）可促进动物细胞增殖和乳腺生长发育及维持泌乳。研究人员通过构建具有GH基因和IPA基因的双转基因小鼠，探究GH能否促进外源目的基因tPA的表达。回答下列问题： (1)为获得转基因小鼠，将tPA基因通过 的方法注入小鼠的 中，将发育成为tPA单转基因个体；同理将tPA基因和GH基因同时注入获得双转基因小鼠，选择性别为 的个体作为后续研究对象。 (2)剪取转基因小鼠的少量尾尖组织，提取基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应体系中需加入特定的引物，引物的作用是 ，扩增的产物再经过 技术来鉴定是否成功。 (3)图1是两种基因表达载体的部分示意图，图中CMV代表 的启动子。利用PCR技术来检测基因整合情况，若小鼠成功整合了tPA基因，则能扩增出多个大小为 bp的DNA片段。图2中的1和2代表转基因小鼠的两种检测结果，出现第 种结果的小鼠为GH/tPA双转基因小鼠。    (4)选取处于泌乳期的GH/tPA双转基因和tPA单转基因小鼠，统计分析两种转基因小鼠乳腺中tPA的表达情况，结果见下表。结果证明了 。 转基因小鼠tPA表达情况分析表 tPA单转基因小鼠 GH/tPA双转基因小鼠 表达水平（μg/mL） 16.3～82.5 112～423 【答案】(1) 显微注射 受精卵 雌性 (2) 使耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）从引物3'端开始连接脱氧核苷酸 琼脂糖凝胶电泳 (3) 乳腺中特异表达的基因 560 2 (4)生长激素（GH）能够促进tPA的表达 【分析】PCR技术的原理为在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3'端延伸DNA链。 【详解】（1）将目的基因导入动物细胞的方法是显微注射法。由于受精卵具有全能性，所以应选取受精卵作为受体细胞。科研人员计划用动物乳腺生物反应器生产tPA，但tPA并不是乳腺蛋白，因此在动物乳腺中的表达水平较低，雌性的个体中乳腺较发达，故将tPA基因和GH基因同时注入获得双转基因小鼠，选择性别为雌性的个体作为后续研究对象。 （2）剪取转基因小鼠的少量尾尖组织，提取基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应体系中需加入特定的引物，引物的作用是使耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）从引物3'端开始连接脱氧核苷酸，扩增的产物再经过琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定。 （3）因为tPA并不是乳腺蛋白，为了让雌性小鼠的乳汁中有tPA，所以图1中CMV代表乳腺中特异表达的基因的启动子。应用引物3和4进行PCR检测tPA基因整合情况，若整合tPA基因则扩增出4434-3874=560bp大小的DNA片段，GH基因扩增后能得到5181-4512=669bp大小的DNA片段，则tPA单转基因小鼠电泳鉴定具有560bp一个条带，而GH/tPA双转基因小鼠电泳鉴定具有560bp/669bp两个条带。图2中的1和2代表转基因小鼠的两种检测结果，出现第2种结果的小鼠为GH/tPA双转基因小鼠。 （4）据表可知，tPA单转基因小鼠的tPA表达量显著低于GH/tPA双转基因小鼠，因此结果证明了GH能促进外源目的基因tPA的表达。 36．（22-23高二下·安徽合肥·期末）神舟十三号乘组航天员在“天空课堂”完成了国际上首例实验：将人体肾上皮细胞诱导成具有多种功能的干细胞，又使其分化成为心肌细胞。通过基因编辑技术将荧光蛋白基因导入心肌细胞，在荧光显微镜下观测记录了在心肌细胞收缩过程中荧光信号的闪烁过程，通过比对心肌细胞在重力条件下和失重条件下的收缩过程可更好地解读失重对人类的影响。 (1)在太空进行哺乳动物心肌细胞培养时，需要给细胞提供的气体环境是 ，培养过程中我们需要定期更换培养液，目的是 （答出1点即可）。 (2)基因编辑技术需要用到的工具酶有 ，将荧光蛋白基因导入心肌细胞通常用 技术。 (3)为了让航天器组装、集成与测试厂房（AIT厂房）免受生物腐蚀，避免地球与其他天体之间出现交叉生物污染，研究者需将对AIT厂房表面环境用随有无菌水的棉签擦拭取样，将采集到的样本加入到1mL无菌磷酸缓冲液中，然后可采用 法对微生物进行分离培养，观察菌落的形态学特征，挑选形态不同的单菌落进一步分离培养，得到单一菌株，再置于 培养基（根据物理性质划分）中，在摇床上进行纯化培养。 【答案】(1) 95%空气和5%CO2 清除代谢产物，防止代谢产物积累，对细胞自身造成危害（为细胞提供充足的营养） (2) 限制酶和DNA连接酶 显微注射 (3) 稀释涂布平板 液体 【分析】动物细胞培养条件： （1）无菌、无毒的环境：①消毒、灭菌②添加一定量的抗生素③定期更换培养液，以清除代谢废物。 （2）营养物质：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，还需加入血清、血浆等天然物质。 （3）温度和pH：哺乳动物多以36.5℃为宜，最适pH为7.2-7.4。 （4）气体环境：95%空气（细胞代谢必需的）和5%的CO2（维持培养液的pH。） 【详解】（1）动物细胞培养需要给细胞提供的气体环境是95%空气和5%CO2，95%空气是细胞代谢必需的，5%的CO2能维持培养液的pH。为清除代谢产物，防止代谢产物积累，对细胞自身造成危害，培养过程中需要定期更换培养液。 （2）基因编辑技术需要用到限制酶和DNA连接酶，限制酶能够切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，DNA连接酶能将目的基因和质粒连接成重组质粒。将目的基因导入动物细胞，最常用的方法是显微注射技术。 （3）对微生物进行分离、纯化可用平板划线法或稀释涂布平板法。培养基根据物理性质划分为固体培养基和液体培养基，将单一菌置于液体培养基中，在摇床上进行纯化培养。 37．（22-23高二下·安徽黄山·期末）科学家将Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4基因通过逆转录病毒转入小鼠成纤维细胞中，然后在培养ES细胞的培养基上培养这些细胞。2-3周后，这些细胞显示出ES细胞的形态，具有活跃的分裂能力，它们就是iPS细胞。请回答下列问题。 (1)从病人体内取出某组织，分离得到成纤维细胞，一般需要用 酶处理组织块，分散成单个细胞进行培养，为防止培养过程中细胞代谢产物对细胞造成的危害，应采取的措施是 。 (2)获取目的基因可通过PCR进行，PCR反应体系中加入 离子作为Taq酶的激活剂；PCR产物的检测和鉴定一般采用 方法，其产物可以在波长为300nm的 灯下被检测出来。 (3)如果要了解Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4基因在诱导iPS细胞时，每个基因作用的相对大小，可以依据 原理控制自变量，设计并观察对应实验结果。 【答案】(1) 胰蛋白酶（胶原蛋白酶） 定期更换培养液 (2) Mg2+ 琼脂糖凝胶电 紫外 (3)减法 【分析】动物细胞培养条件： （1）无菌、无毒的环境：①消毒、灭菌②添加一定量的抗生素③定期更换培养液，以清除代谢废物。 （2）营养物质：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，还需加入血清、血浆等天然物质。 （3）温度和pH：哺乳动物多以36.5℃为宜，最适pH为7.2-7.4。 （4）气体环境：95%空气和5%的CO2。 【详解】（1）将动物组织处理为单细胞通常用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理；动物细胞培养所需的气体条件是95%空气和5%的CO2。在细胞培养过程中，需要定期更换培养液这样可以保证细胞培养对营养物质的需求，同时还能避免代谢废物对细胞造成的危害。 （2）PCR反应体系中加入Mg2+作为Taq酶的激活剂，从而有利于PCR过程的正常进行，PCR产物的检测和鉴定一般采用琼脂糖凝胶电泳 方法进行鉴定，其产物可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，通过与标准DNA进行比对得到鉴定结果。 （3）如果要了解Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4基因在诱导iPS细胞时，每个基因作用的相对大小，可用减法原理在导入基因时：依次去掉某个特定的基因，只导入其他3个基因到小鼠成纤维细胞中，通过与转入4个基因的小鼠成纤维细胞的诱导情况进行比较，来推测缺失的基因对诱导iPS细胞的影响，进而判断每个基因作用的相对大小。 / 学科网（北京）股份有限公司 $$