2026届高三生物一轮复习课件：第53讲 基因编辑技术和各种类型的PCR

2026高考一轮复习 第53讲 基因编辑技术和各种类型的PCR 3 1 2 CRISPR/Cas9基因编辑技术 实时荧光定量PCR技术 大引物PCR技术 实反向PCR技术 重叠延伸PCR技术 巢氏PCR技术 4 5 6 目 录 contents CRISPR/Cas9基因编辑技术 考点1 考点梳理 1、原理 考点1 CRISPR/Cas9基因编辑技术 CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如图)。 1、原理 考点1 CRISPR/Cas9基因编辑技术 sgRNA的功能：与靶向基因(目的基因)上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合（即识别作用）； Cas9蛋白的功能：在特定位点切割DNA。 Cas9切割位点： 磷酸二酯键 2、优点 CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，其明显优点是可将目的基因定点插入所需位点，避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。 考点1 CRISPR/Cas9基因编辑技术 1．研究发现，向导RNA能识别特殊的DNA序列，然后引导Cas9蛋白对DNA双链进行切割。据下图分析，下列叙述正确的是(　　) A．向导RNA和双链DNA含有的含氮碱基不完全相同 B．虚线框内的核苷酸序列彻底水解的产物是8种核苷酸 C．Cas9蛋白不具有降低化学反应活化能的作用 D．合成Cas9蛋白的细胞结构含有磷脂分子和核酸 A 题型剖析 2．猪瘟病毒能与猪细胞膜上的LamR受体蛋白结合，进而侵入细胞引起猪瘟。利用基因编辑技术改变LamR受体蛋白基因，使LamR受体蛋白不能与猪瘟病毒正常结合，但不影响生理功能，从而培育出抗猪瘟病毒猪。基因编辑原理是由一条人为设计的单链向导RNA(sgRNA)引导Cas9蛋白到特定的DNA位点进行切割，从而完成对目的基因的编辑。基因编辑过程如下图所示。下列叙述错误的是(　　) 题型剖析 下列叙述错误的是(　　) A．培育抗猪瘟病毒猪，一般选择受精卵作为基因编辑的受体细胞，这样获得的个体的所有细胞都无法被猪瘟病毒感染 B．Cas9蛋白的功能是准确识别DNA特定序列并进行切割 C．改造后的受体细胞经培养发育到桑葚胚或囊胚时，可将其进行冷冻保存或胚胎移植 D．通过基因编辑技术改造前后的两种LamR基因是等位基因 B 题型剖析 3．CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA(sgRNA)引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如下图所示。回答下列问题： 题型剖析 (1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是_________________。 DNA连接酶　 (2)过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是_________________。 Ca2＋处理法　 (3)过程③～⑤中，sgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是__________________。随后，Cas9蛋白可切割________________________序列。 碱基互补配对原则 目标DNA特定的核苷酸 (4)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1 200 bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是____________________，基因敲除成功的判断依据是_________________。 DNA分子杂交技术　 不出现杂交带 题型剖析 CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是sgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，引导Cas9蛋白切割目标DNA序列，从而将该蛋白酶基因插入基因组DNA中 (5)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入基因组DNA的编辑过程：___________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。 题型剖析 实时荧光定量PCR技术 考点2 考点梳理 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ 引物1 5’ 3’ R Q 荧光基团 淬灭荧光基团 探针 探针完整时，荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收； 1、原理 病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR（qPCR）鉴定。实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。 考点2 实时荧光定量PCR技术 ‹#› 3’ 5’ 引物2 5’ 3’ R 荧光基团 淬灭荧光基团 探针 Q DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解，荧光基团与淬灭基团分离，发出荧光。 每扩增一次就有一个荧光分子产生。 1、原理 在PCR过程中，与目的基因结合的探针被耐高温的DNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到。 在该反应中TaqDNA聚合酶的作用：①形成子链的磷酸二酯键； ②水解探针，破坏磷酸二酯键。 ‹#› 2、荧光强度与病毒含量的关系 通过实时荧光PCR检测某冠状病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图乙，荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)越小，说明病毒核酸浓度越高。 正相关 ‹#› 1.荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA的含量，其原理是在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成。下列叙述错误的是(　) A．引物与探针均具有特异性，与模板 结合时遵循碱基互补配对原则 B．反应最终的荧光强度与起始状态模 板DNA含量呈负相关 C．耐高温的DNA聚合酶催化DNA合成的方向总是从子链的5′端到3′端 D．若用上述技术检测某基因的转录水平，则需要用到逆转录酶 B 题型剖析 重叠延伸PCR技术 考点3 考点梳理 重叠延伸PCR技术的主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。主要应用：融合基因、定点突变、扩增长片段DNA。 考点3 重叠延伸PCR技术 ‹#› 1、基本原理 ①该过程需要 种引物； ②需要改变的碱基位于引物 和引物 上； ③PCR1的产物AB是引物 和引物 扩增的结果； ④PCR2的产物CD是引物 和引物 扩增的结果； ⑤PCR2中至少 个循环才能获得产物CD； ⑥引物b和引物c之间有什么关系？ 引物b和引物c存在互补配对的片段 ⑦首次获得产物AD需要引物吗？ 不需要，由耐高温的DNA聚合酶延伸 4 a b c d b c 2 ‹#› 1、基本原理 ⑧PCR3中突变产物AD的扩增需要引物 和引物 ； ⑨PCR1和PCR2反应体系中一次复制后共产生 种DNA分子； ⑩过程①的条件为： 先加热至90℃以上变性，再冷却至50℃左右 ⑪AB下链和CD上链结合能得到产物AD吗？ 不能，DNA聚合酶只能将游离的脱氧核苷酸连接在已有链的3'端 (即新链的延伸只能从5'端到3'端）。 3 a d ‹#› 例1(融合基因)：重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术。某实验小组从猪源大肠杆菌中扩增得到了LTB基因和STI基因片段，并用重叠延伸PCR技术构建了LTB-STI融合基因，其过程如图所示，其中目的链L、S都至少需要经过2次循环才能分别得到。下列有关叙述正确的是（ ) A.可在同一个反应体系中进行LTB 基因和STI基因的扩增 B.PCR过程中，第2次循环获得目 的链L时所用的引物为P1 题型剖析 例1(融合基因)：重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术。某实验小组从猪源大肠杆菌中扩增得到了LTB基因和STI基因片段，并用重叠延伸PCR技术构建了LTB-STI融合基因，其过程如图所示，其中目的链L、S都至少需要经过2次循环才能分别得到。下列有关叙述正确的是（ ) A.可在同一个反应体系中进行LTB 基因和STI基因的扩增 B.PCR过程中，第2次循环获得目 的链L时所用的引物为P1 1轮 P1 P2 2轮 P2 P1 链L 5’ 3’ 3’ 5’ 题型剖析 例1(融合基因)：重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术。某实验小组从猪源大肠杆菌中扩增得到了LTB基因和STI基因片段，并用重叠延伸PCR技术构建了LTB-STI融合基因，其过程如图所示，其中目的链L、S都至少需要经过2次循环才能分别得到。下列有关叙述正确的是（ ) C.图中的引物P2与引物P3的碱基 序列均不能互补配对 D.杂交链延伸生成LTB-ST1融合 基因时需要加入引物 B 题型剖析 2、定点突变的方法 例2(定点突变)：水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。注：图中的引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点。 （2）若拟突变位点的碱基对为A-T，则 需要让其突变为 才 能达到目的。引物2的突变位点（突起处) 应设计为 （假设引物为单链DNA)。 T-A或C-G（不能写反） A或G ‹#› A/G T/C A/G T/C T/C A/G A/G T/C A/G T/C 1 2 3 4 1 4 原有：天冬酰胺 mRNA:5’AAC/AAU 3’ DNA:3’TTG/TTA 5’ 突变后：赖氨酸 mRNA:5’AAA/AAG 3’ DNA:3’TTT/TTC 5’ DNA1: 3’ 5’ TAA DNA2: 5’ 3’ ATT AA A/G 5’ 3’ 3’ 5’ TT T/C 将G/A变为T/C ‹#› 2、定点突变的方法 要找对目的基因上的拟突变位点，首先应根据变化的氨基酸找出 . 上的碱基变化，再根据碱基互补配对原则，找对 上的碱基变化，同时要标明每条链的5’端和3’端，最后根据拟突变碱基设计突变引物。 原有：天冬酰胺 mRNA:5’AAU 3’ DNA:3’TTA 5’ 突变后：赖氨酸 mRNA:5’AAG 3’ DNA:3’TTC 5’ mRNA DNA A 突变为 C (密码子) ‹#› 2024南昌一模试题（节选） 题型剖析 mRNA: 5’ 3’ ACC UCU GUG 248 249 250 丝氨酸 5’ 3’ ACC GCU GUG 248 249 250 丙氨酸 突变后 DNA1: 3’ 5’ TGG AGA CAC DNA2: 5’ 3’ ACC TCT GTG 3’ 5’ TGG CGA CAC 5’ 3’ ACC GCT GTG 5'-CACAGCGGT-3'或5'-ACCGCTGTG-3’ 原有 TGG GA CAC C 5’ 3’ 3’ 5’ ACC CT GTG G A突变为C,T突变为G 题型剖析 大引物PCR技术 考点4 考点梳理 1、原理 ①该过程共需要 种引物进行 轮PCR； ②第一次PCR的产物是 引物和 引物扩增的结果； ③第一次PCR中至少 个循环才能获得产物； ④第二次PCR以 为模板； ⑤突变上游引物和大引物的关系： 大引物是突变上游引物的互补链 ⑥第二次PCR的产物是 引物和 扩增的结果； 3 2 突变上游 原始DNA分子 2 常规下游 常规上游 大引物(第一轮扩增产物中的一条链) 考点4 大引物PCR技术 ‹#› 1、原理 ⑦第二次PCR中至少 个循环才能获得产物。 ⑧为了使两轮PCR在同一支试管中进行，设计引物时应考虑不同的复性温度，第二次PCR的复性温度应该比第一次PCR ； ⑨PCR扩增的定点诱变产物通常需要连接到载体分子上才能表达出相应的性状，该定点诱变产物需具备________________等结构才能进行转录和翻译。 高 启动子和终止子 2 考点4 大引物PCR技术 ‹#› 例1:抗生素的长期使用易导致病菌产生严重的耐药性。抗菌肽以其快速杀菌活性、低耐药可能性、免疫调节特性和促进伤口愈合的潜力成为最有前景的抗菌药物。研究发现将抗菌肽第52位的脯氨酸(密码子为CCA)替换成苏氨酸(密码子为ACA)可增强抗菌肽的杀菌活性。科研人员利用大引物PCR定点诱变技术对抗菌肽基因进行改造的过程如图所示。回答下列问题： 153(碱基对编号) 题型剖析 (1)将抗菌肽第52位的脯氨酸换成苏氨酸，需要将mRNA的对应碱基序列中第 位的碱基替换，且基因模板链对应的碱基改变为 。 (3)据图分析，“大引物PCR定点诱变”技术中设计的“诱变引物”应选择 。 A. 5’…CCTGTTAT…3’ B. 5’…CCTGGTAT…3’ C. 5’…ATACCAGG…3’ D. 5’…ATAACAGG…3’ 154 G变为T A 52*3=156（154~156） 原有：脯氨酸 mRNA:5’CCA 3’ DNA:3’GGT 5’ 突变后：苏氨酸 mRNA:5’ACA 3’ DNA:3’TGT 5’ 将G变为T 第52位的脯氨酸(密码子为CCA)替换成苏氨酸(密码子为ACA) ‹#› 第52位的脯氨酸(密码子为CCA)替换成苏氨酸(密码子为ACA) 153(碱基对编号) 原有：脯氨酸 mRNA:5’CCA 3’ DNA:3’GGT 5’ 突变后：苏氨酸 mRNA:5’ACA 3’ DNA:3’TGT 5’ 将G变为T 5'CCTGTTAT 3’ 3’ A 5’ ‹#› (4)进行大引物PCR定点诱变获得改良的抗菌肽基因需要进行两次PCR(PCR1和PCR2)，产物1最早出现在PCR1的第 轮循环；PCR2的产物除改良的抗菌肽基因外，还有 ， ；通过PCR3快速扩增时应选用的引物是 。 诱变前的抗菌肽基因、诱变前的抗菌肽基因 3 与改良的抗菌肽基因杂交链 引物1和引物2 153(碱基对编号) 1轮 2轮 3轮 ‹#› 练习：(2024·武汉高三质检)IKK激酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿IKK基因编码区第1183位碱基T突变为C，导致IKK激酶上第395位酪氨酸被组氨酸代替。为研究该患儿发病机制，研究人员利用纯合野生鼠应用大引物PCR定点诱变技术培育出SCID模型小鼠(纯合)，主要过程如图甲、乙所示，分析并回答下列问题： 5’ 5’ 3’ 3’ 题型剖析 (1)在图甲获取突变基因过程中，需要以下3种引物： 则PCR1中使用的引物有________________，PCR2中使用的引物有________________和图中大引物的________(填“①”或“②”)链。 引物A和引物B 引物C 　② 1轮 2轮 C C G C 大引物 +HindⅢ PCR1: 引物A 引物B 引物C ‹#› 反向PCR技术 考点5 考点梳理 1、原理 当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理是用限制酶消化该DNA（形成黏性末端），随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。 考点5 反向PCR技术 ‹#› 已知序列 未知序列 未知序列 用EcoRⅠ限制酶切割 已知序列 未知序列 未知序列 自身环化 限制酶 DNA连接酶 ‹#› 1、原理 以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。原理如下图所示。 引物3 引物4 考点5 反向PCR技术 ‹#› 引物1 引物2 引物3 引物4 复制完后 展开成链状 复制完后 展开成链状 引物1 引物2 引物3 引物4 引物1和引物2 继续扩增 大量 引物3和引物4 继续扩增 大量 ‹#› ‹#› 例1：已知基因a的一条单链序列为 5‘—GCAATGCGTAGCCTCT…AACTATGCGCTCATGA­—3′ (虚线处省略了部分核苷酸序列)，则在步骤Ⅲ中 选用的PCR引物是_____。 A．5'—­AACTATGCGCTCATGA­—3′ B．5'—­TTGATACGCGAGTACT­—3′ C．5'­—GCAATGCGTAGCCTCT­—3′ D．5'­—AGAGGCTACGCATTGC—­3′ AD 题型剖析 巢式PCR技术 考点6 考点梳理 1、原理 首先将目标的DNA模板与第一套引物(外引物)结合。第一套引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片段(图中未显示可能的多种产物)。然后使用第二套引物(内引物)对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。 考点6 巢式PCR技术 ‹#› 3轮获得 3轮获得 ‹#› 2、优点 由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片段包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片段。这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。原理如下图所示。 优点：PCR反应的特异性更强 产物特异性更强。 考点6 巢式PCR技术 ‹#› 3．为减少引物与模板之间的非特异性配对，人们对普通PCR进行了改良，发明了巢式PCR，其原理是利用两套引物进行两轮PCR扩增。首先利用第一对引物(外引物)对目的基因所在的DNA进行第一轮扩增(经过15～30次循环)，第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板，利用第二对引物(内引物或巢式引物)结合在第一轮扩增产物内部，经过15～30次循环，获得第二轮扩增片段(即目的基因)，最终第二轮扩增片段短于第一轮，基本过程如下图所示。下列叙述错误的是(　　) A．两对引物的碱基序列不相同， 均应为单链DNA片段 B．使用外引物至少经过3次循环，才能得到图示的第一轮扩增产物 C．若第一轮扩增产生错误片段，则其进入第二轮扩增的概率极低 D．与巢式PCR相比，普通PCR特异性更强，错误率更高 D 题型剖析 4．在利用PCR扩增目的基因时，通常在引物一端添加限制酶识别序列，以便将目的基因连接到载体上。如图所示，TA克隆法可以将PCR产物直接连接到具有3′—T突出末端的载体上，这是因为普通Taq DNA聚合酶具有末端连接酶的活性，可在每个PCR扩增产物的3′端自动添加一个碱基，通常为A，这样扩增产物就可以与有3′—T突出末端的载体连接。高保真Taq DNA聚合酶可切掉PCR扩增过程中产生的错配碱基，保证扩增的准确性。 题型剖析 (1)PCR依据的原理是________________，该技术通常需要2种引物，引物的具体作用是_________________________________________________。 DNA半保留复制　 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 (2)一般情况下，利用PCR扩增目的基因时，通常在引物的________端添加特定限制酶识别序列。基因工程中使用的载体除质粒外，还有________、________________________等。题述构建重组质粒的方法________(填“需要”或“不需要”)限制酶，________ (填“需要”或“不需要”)DNA连接酶，原因是______________________________________________________ ____________________________________________。 5′　 噬菌体　 动植物病毒(顺序可颠倒)　 不需要　 需要　 PCR扩增产物的3′端有一个碱基A，T载体有3′—T突出末端，二者可以在DNA连接酶的作用下直接连接　 题型剖析 (3)高保真Taq DNA聚合酶不会使PCR扩增产物产生A尾，高保真PCR扩增后，如何加工才能进行TA克隆？_________________________________________ ____________________________________________________。 先进行PCR产物回收，将其作为模板，再加入dATP、普通TaqDNA聚合酶等延伸一段时间 题型剖析 加 油！ 学 习 $$