利用同源重组构建基因表达载体与融合基因、融合蛋白及蛋白质相互作用酵母双杂交系统与免疫共沉淀课件-2025届高三生物学二轮复习

利用同源重组构建基因表达载体与融合基因、融合蛋白及蛋白质相互作用 酵母双杂交系统与免疫共沉淀 突破1　 利用同源重组构建基因表达载体 (2023·江苏卷，22)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有__________，扩增程序中最主要的不同是________。 模板、引物 退火温度 突破1　利用同源重组构建基因表达载体 (2)有关基因序列如图2。引物F2－F、F1－R应在下列选项中选用________。 A.ATGGTG——CAACCA B.TGGTTG——CACCAT C.GACGAG——CTGCAG D.CTGCAG——CTCGTC CD 突破1　利用同源重组构建基因表达载体 (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有___________________________________。 (4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有________。 A.稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落 B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 限制性内切核酸酶、DNA连接酶 ABC 突破1　利用同源重组构建基因表达载体 (5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有________。 (6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是____________________________ ____________________________________________________ _________________。 P3、P4 电泳只能显示扩增片段的大致 长度，不能显示精准的DNA碱基数量。也不能呈现DNA碱 基序列 突破1　利用同源重组构建基因表达载体 角度1　无缝克隆技术 In－Fusion技术，即无缝克隆和组装技术，是一种新型的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA片段的插入。 具体原理是：在载体末端和目的基因两端应具有15～25个同源碱基，而目的基因两端的同源序列往往是通过引物设计实现的，In－Fusion酶能够识别具有相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，DNA连接酶再将两条DNA单链黏合起来。 突破1　利用同源重组构建基因表达载体 命题要点： (1)质粒构建过程：①采用酶切或者PCR扩增方法将载体线性化；②使用设计好的引物进行目的DNA片段的PCR扩增；③反应体系内形成重组质粒。 (2)与传统酶切、酶连相比的优势：①位点选择灵活，在载体任意位置进行基因克隆；②快速简便；③克隆效率高，阳性克隆高达90%以上；④可同时克隆两个或多个DNA片段。 突破1　利用同源重组构建基因表达载体 [例1] (2024·广东佛山调研)纤维素是自然界中分布最广、含量最丰富的一种多糖，水解纤维素的酶系包括内切酶(EG)、外切酶(CBH)和B－葡萄糖苷酶(BGL)。已知酿酒酵母菌不能吸收纤维素，科研人员利用基因工程技术依次将EG基因、CBH基因和BGL基因分多步导入酿酒酵母菌，获取可以直接利用纤维素发酵的酿酒酵母工程菌。 (1)科研人员常用PCR技术获取和扩增EG基因、CBH基因和BGL基因，该过程不需要添加解旋酶，但DNA也能解旋的原因是_____________________________。 若PCR产物中出现了部分非目标序列，可能的原因有_____________________ ____________________________________________________________(答出两点即可)。 高温也可使氢键断裂，双链打开 引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性；复性温度过低，DNA聚合酶的质量不好等 突破1　利用同源重组构建基因表达载体 (2)构建基因表达载体是基因工程的核心步骤，科研人员采用以下两种方法构建含有EG基因的表达载体。 ①双酶切法：如图甲标注了载体、EG基因的限制酶切点、EG基因插入部位及两端的部分序列，已知酿酒酵母菌不能合成尿嘧啶，图中的标记基因为尿嘧啶合成基因。 突破1　利用同源重组构建基因表达载体 结合图中信息分析，在扩增EG基因时应在引物的________ (填“5′”或“3′”)端添加__________________限制酶的识别序列，设计的引物序列为______________________ ___________________。(从5′端书写，写出前12个碱基序列即可) 5′ BamH Ⅰ、Sac Ⅰ GGATCCGAATCG、 GAGCTCAGCCTA 突破1　利用同源重组构建基因表达载体 ②同源重组法：该操作可通过PCR技术在任一位点实现质粒的线性化，只要将目的基因两端带有与线性化质粒两端同源的DNA序列，在相关酶的作用下即可实现质粒上的同源重组(如图乙所示)。与双酶切法相比，同源重组法构建基因表达载体的突出优点是______________________________________ _____________________。 在相关酶的作用下可以实现载体上任一点与目的基因的重组 突破1　利用同源重组构建基因表达载体 (3)导入上述重组质粒的酿酒酵母菌应在___________的培养基上筛选培养。将筛选得到的菌株接种到液体培养基中培养一段时间，通过检测__________，以确定其发酵效果。 不含尿嘧啶 酒精的含量 突破1　利用同源重组构建基因表达载体 角度2　Cre/LoxP重组酶系统 Cre/LoxP重组酶系统的核心元件： (1)Cre重组酶：由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，具有限制酶特性，能够特异性识别LoxP位点。能介导两个LoxP位点之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。 (2)LoxP序列：来源于P1噬菌体，包括两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的间隔区域，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向，LoxP有不同“亚型”，可以嵌套使用。 突破1　利用同源重组构建基因表达载体 命题要点： (1)同向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列，仅保留一个LoxP。 (2)反向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位。 (3)依赖于Cre基因的表达：在目的基因上游，放置一个带有LoxP位点的终止密码子，可以防止Cre基因缺失时的表达。在Cre基因存在的情况下，终止密码子被切除，基因表达继续进行。 突破1　利用同源重组构建基因表达载体 [例2] Cre/LoxP重组酶系统是对转基因受体细胞DNA上的特定序列进行定点切割和重新连接，从而在基因或染色体水平上对生物基因进行遗传改造的一种技术。请回答下列问题： (1)LoxP具有方向性，结构如图一所示，其中决定方向的序列是________(填序号)。Cre酶能随机识别DNA分子上的两个相同的LoxP序列，并在其中的特定位点切断DNA双链，重新连接切口后，连接时形成的化学键是____________，两个同向LoxP在发挥作用时，机制如图二，则保留图二中片段________(填序号)，就能实现目标基因的敲除。 ② 磷酸二酯键 2 突破1　利用同源重组构建基因表达载体 (2)Cre/LoxP重组酶系统可以调控基因的表达，在目的基因________(填“上游”或“下游”)插入一个带有LoxP位点的编码终止密码子的序列，在Cre酶存在的情况下，目的基因________(填“表达”或“不表达”)。若经Cre酶作用使得2个LoxP位点间的序列发生反转，其原因可能是______________________________。 上游 表达 两个LoxP序列相反 突破1　利用同源重组构建基因表达载体 (3)“脑彩虹”是一项最新的大脑成像技术，通过荧光蛋白“点亮”大脑内的神经元，帮助科学家了解大脑。 ①研究者设计如图所示的DNA片段。已知三种荧光蛋白的氨基酸序列，则可通过________________法获得相关基因，再利用限制酶和____________酶将三种荧光蛋白基因和两种LoxP序列、启动子M与载体连接，形成重组质粒，采用____________法将其导入小鼠的受精卵细胞中，经过筛选、培育，获得转基因小鼠。 人工化学合成 DNA连接 显微注射　 突破1　利用同源重组构建基因表达载体 ②在Cre酶的帮助下，一些荧光蛋白基因可能会被随机“剪掉”，但两个LoxP1或两个LoxP2之间的基因，最多会被Cre酶敲除一次，Cre酶基因在环境中存在化学物质Tam时才能激活表达，因此该小鼠“脑彩虹”的出现可受Tam的调控： a.若无Tam作用时，该小鼠脑组织的色彩为________色，其他组织细胞颜色为________色。 b.若有Tam作用时，该小鼠脑组织会出现“脑彩虹”，请阐述机理：_____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________。 红 无 若有Tam作用时，则启动Cre酶基因的表达，在该酶的作用下，一些荧光蛋白基因可能会被随机“剪掉”，若随机敲除两个LoxP1之间的红色荧光蛋白基因，此时细胞为黄色，敲除两个LoxP2之间的红色和黄色荧光蛋白基因，此时细胞为蓝色，也有可能未成功敲除荧光蛋白基因，此时细胞为红色，这样就会出现不同脑细胞差异表达红色、黄色或蓝色荧光蛋白基因，进而出现“脑彩虹” 突破1　利用同源重组构建基因表达载体 突破2　 融合基因、融合蛋白及蛋白质相互作用 1.(2023·辽宁卷，8)CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起(如图)，使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去(　　) A.CD163基因中编码起始密码子的序列 B.CD163基因中编码终止密码子的序列 C.RFP基因中编码起始密码子的序列 D.RFP基因中编码终止密码子的序列 B 突破2　融合基因、融合蛋白及蛋白质相互作用 2.(2023·浙江6月选考，19)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3－GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。 B 下列叙述正确的是(　　) A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达 B.翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白 C.2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3－GFP基因纯合子 D.若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子 突破2　融合基因、融合蛋白及蛋白质相互作用 1.融合基因与融合蛋白 (1)融合基因：是指将两个或多个基因的编码区首尾相连，置于同一套启动子和终止子内部构成的嵌合基因。 启动子 基因1 基因2 基因3 终止子 (2)融合蛋白：是指融合基因的表达产物。 突破2　融合基因、融合蛋白及蛋白质相互作用 (3)启动子及其类型 启动子是一段具有特殊序列结构的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。主要包括以下三种类型： ①组成型启动子：能够调控基因表达，使其基本恒定在一定程度上，从而使基因在不同部位或组织中的表达水平不存在明显差异。这类启动子一般来自管家基因，可连续不断地启动基因的表达。 ②组织特异性启动子：其调控作用使得基因往往只在某些特定器官或组织中表达，且表现出发育调节的特性。如构建乳腺生物反应器时所用的在乳腺中特异表达的基因的启动子。 ③诱导型启动子：即在某些特定的物理或化学信号刺激后，使目的基因的转录水平有所提高。 突破2　融合基因、融合蛋白及蛋白质相互作用 2.融合基因的种类 (1)目的基因＋报告/标记基因 其主要目的是对目的基因进行示踪，研究其功能及特性。标记基因有绿色荧光蛋白基因(GFP基因)、β－半乳糖苷酶基因(LacZ基因)、β－葡萄糖苷酸酶基因(GUS基因)、虫荧光素酶基因(Luciferasese基因)等。 启动子 目的基因 绿色荧光蛋白基因 终止子 突破2　融合基因、融合蛋白及蛋白质相互作用 (1)报告/标记基因一般连在目的基因的下游，这样才能确信表达了标记基因的受体细胞也表达了目的基因，即受体细胞出现绿色荧光，说明目的基因已经表达。如果报告/标记基因在前，目的基因在后，有可能受体细胞只成功表达报告/标记基因，而未成功表达目的基因。 (2)编码信号肽或单体蛋白序列的基因＋目的基因 其主要目的是利用信号肽或单体序列携带目的基因高效表达，从而提取纯化目的蛋白，为生产或科研所用。 (3)功能基因＋功能基因 分为两类：一是相同功能基因的融合(目的是增强基因的功能，扩大基因的应用范围，例如杀虫基因之间的融合)；二是不同功能基因的融合(为特殊需要而构建，例如将编码大肠杆菌热不稳定性毒素B亚单位基因EtxB与肿瘤抗原基因连接，制成一种融合基因肿瘤疫苗。肿瘤抗原的免疫原性弱，而细菌抗原EtxB的免疫原性强，免疫系统对细菌抗原会产生很强的免疫应答反应，而在反应中被激活的针对细菌抗原的CD4Th免疫细胞可通过链接产生针对肿瘤抗原的体液免疫和细胞免疫，从而高效增强肿瘤疫苗的效力)。 突破2　融合基因、融合蛋白及蛋白质相互作用 [例1] (2024·南通高三质检)OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽(引导合成的蛋白质进入叶绿体)基因连接，构建多基因表达载体(载体中部分序列如下图所示)，利用农杆菌转化法转化水稻，在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列叙述正确的是(　　) A.四个基因转录时都以DNA的同一条单链为模板 B.四个基因都在水稻叶绿体内进行转录、翻译 C.应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞 D.可用抗原—抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达情况 D 突破2　融合基因、融合蛋白及蛋白质相互作用 [例2] (2024·北京海淀区高三上学期期末节选)(2)热纤梭菌中Co和Do蛋白能以高亲和力相互作用，形成复合物。科研人员将Cas9蛋白的N端和C端两个片段分别与Co和Do蛋白融合，构建Cas9(N)－Co复合物和Cas9(C)－Do复合物，这两个复合物在细胞中相遇时，Cas9可恢复全酶活性，科研人员构建图1所示的表达载体，导入受体细胞。 突破2　融合基因、融合蛋白及蛋白质相互作用 启动子1为远红光诱导型启动子，启动子2为持续表达启动子。据此分析，在没有远红光照射时，受体细胞中Cas9(N)、Cas9(C)和Cas9蛋白的存在状态及位置是_____________________________________。 无Cas9(N)和Cas9，Cas9(C)存在于细胞质 与持续表达Cas9全酶相比，上述方法的优势是_____________________________ _____________________________________________________________________。 仅在远红光诱导时才有全酶进入细胞核，可减少Cas9全酶长时间在细胞核中对非目标DNA的切割 突破2　融合基因、融合蛋白及蛋白质相互作用 3.获得融合基因的方法——以重叠延伸PCR技术为例 以融合基因M和基因N为例，步骤是： (1)设计4种引物：引物1和引物4为普通引物。引物2的3′端含有基因M的序列，5′端含有基因N的序列；引物3的3′端含有基因N的序列，5′端含有基因M的序列；引物2和引物3完全互补配对。 (2)PCR扩增：利用引物1和引物2扩增基因M，2轮循环可得到M′型DNA分子；利用引物3和引物4扩增基因N，2轮循环可得到N′型DNA分子。 突破2　融合基因、融合蛋白及蛋白质相互作用 (3)获得融合基因M＋N：将M′型DNA分子和N′型DNA分子放在同一个PCR管里，变性、复性、延伸后，就得到了拼接好的融合基因M＋N。 突破2　融合基因、融合蛋白及蛋白质相互作用 [例3] (2024·江西南昌质检)透明颤菌血红蛋白基因vgb表达产物VHb蛋白能使其在低氧的环境中生长良好。顶头孢霉是好氧型真菌，其发酵产物头孢菌素C有很大的市场需求量，但低氧环境影响其产量，传统发酵生产的增氧成本高。为提高产量科研人员将透明颤菌血红蛋白基因vgb基因和顶头孢霉pcpC启动子进行PCR拼接，并与质粒1构建重组质粒，如下图。 注：hph是潮霉素抗性基因，Vgb基因与hph基因共用终止子。 突破2　融合基因、融合蛋白及蛋白质相互作用 回答下列问题： (1)PCR过程除了需要引物外，还需要的条件有________________________________________________________(写三点)。pcpC启动子是____________识别和结合的部位。 (2)据图所示，重叠延伸PCR拼接时，若启动子启动方向与引物3延伸方向一致，引物2和引物3的5′端需分别添加_______________的酶切位点。拼接形成重组基因的目的是___________________________________________________________ ______________。 DNA模板、四种游离的脱氧 核苷酸、耐高温的DNA聚合酶 RNA聚合酶 XbaⅠ、BamHⅠ 使顶头孢霉在低氧的环境中生长良好，提高其发酵产物头孢 菌素C的产量 突破2　融合基因、融合蛋白及蛋白质相互作用 (3)利用含有____________的选择培养基初步筛选菌种；最后从个体生物学水平上鉴定，若在低氧环境下，检测到头孢菌素C表达量________，则表示转化成功。 潮霉素 增多 突破2　融合基因、融合蛋白及蛋白质相互作用 4.融合蛋白的分离 (1)融合蛋白存在的问题 如果二者翻译成一条多肽链，有可能影响彼此的折叠和空间结构，进而影响彼此的生物学活性；如果二者翻译成一条多肽链，有可能影响彼此的亚细胞定位。目的蛋白不能正确的进入它正常要去的场所，导致不能正常的发挥生物学功能。 突破2　融合基因、融合蛋白及蛋白质相互作用 (2)融合蛋白分离措施 ①使用2A序列：2A序列是一对来源于病毒的短肽(18～25个氨基酸)，通常被称为“自我剪切肽”，能使一条转录产物产生多种蛋白，其原理如图： 突破2　融合基因、融合蛋白及蛋白质相互作用 ②使用“IRES序列”：“IRES”是内部核糖体进入位点序列，能招募核糖体对mRNA进行翻译，使用单个启动子启动多个基因表达时，可以将多个基因通过IRES序列分隔开，一条mRNA就会翻译成多条多肽链，其原理如图： 突破2　融合基因、融合蛋白及蛋白质相互作用 [例4] (2024·江苏南通一模)通常真核细胞翻译的起始必须依赖于mRNA的5′端帽子结构，而内部核糖体进入位点(IRES)则是位于mRNA内部的核糖体识别、结合序列，IRES使翻译可以从mRNA内部开始。人溶菌酶和人乳铁蛋白是人乳中重要的抗菌蛋白，科研人员构建人溶菌酶基因(hLYZ)和人乳铁蛋白基因(hLTF)双基因表达载体，并获得转基因牛胚胎。如图表示双基因表达载体的主要构建过程，请回答下列问题。 限制酶识别序列： BamHⅠ：G↓GATCC NheⅠ：G↓CTAGC XbaⅠ：T↓CTAGA 相关结构： Ori：复制原点 AmpR：氨苄青霉素抗性基因NeoR：新霉素抗性基因 突破2　融合基因、融合蛋白及蛋白质相互作用 (1)IRES的基本组成单位是__________，翻译时核糖体在mRNA移动的方向是________(填“5′→3′”或“3′→5′”)。与两个基因直接连接形成融合基因相比，两个基因之间插入IRES序列的意义是_____________________________________________________________________。 核糖核苷酸 5′→3′ 便于得到两种具有功能的蛋白质(一种mRNA可翻译形成两种蛋白质) 突破2　融合基因、融合蛋白及蛋白质相互作用 (2)为实现hLTF与IRES序列的连接，在PCR扩增基因片段时通常在引物的5′端添加特定的限制酶识别序列，而不在3′端添加的原因是___________________________________ _______________________________。 (3)过程①中，用_________________切割质粒a、b后，再用________(方法)分离，收集质粒a的hLTF片段，与质粒b的大片段连接，获得重组质粒1。 使引物的3′端与模板链严格互补配对， 保证子链的延伸 XbaⅠ和NheⅠ 电泳法 突破2　融合基因、融合蛋白及蛋白质相互作用 (4)过程②中，用BamH Ⅰ分别处理重组质粒1和质粒c，再连接形成的重组质粒不止一种，这是因为______________________________ _____________________________________。 用BamH Ⅰ对重组质粒2进行酶切，获得的DNA片段大小为_______________________。 目的基因与质粒c存在正反连接、目的基因多拷贝与质粒c连接等 3.2 kb和8.2 kb 突破2　融合基因、融合蛋白及蛋白质相互作用 (5)科研人员以包含重组质粒2的脂质体转染乳腺上皮细胞时，在细胞培养液中加入一定浓度的新霉素的主要目的是______________________________________。 选择乳腺上皮细胞作为受体细胞便于检测______________________________________。 便于筛选导入重组质粒2的牛乳腺上皮细胞 hLYZ和hLTF(目的基因)能否表达 突破2　融合基因、融合蛋白及蛋白质相互作用 (6)研究人员试图以转hLYZ与hLTF的奶牛乳腺上皮细胞作为供体细胞，培养转基因克隆胚胎，在此过程中主要涉及的现代生物技术有___________________________________ _____________________________________________________________________(答出两条即可)。 体细胞核移植技术、早期胚胎培养技术(动物细胞培养技术、卵母细胞采集与培养技术) 突破2　融合基因、融合蛋白及蛋白质相互作用 突破3　 酵母双杂交系统与免疫共沉淀 (2022·山东卷，25)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P和FLAG－P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。 (1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是_____________________________________________ _____________，为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的________(填“3′端”或“5′端”)。 能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、 短单链核酸 5′端 突破3　酵母双杂交系统与免疫共沉淀 (2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是____________________________________________________ _____________________________________________________________________。 P基因编码链的第一个碱基与EcoR Ⅰ识别序列的最后两 个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取 突破3　酵母双杂交系统与免疫共沉淀 修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是_________________________________________________________________。 图甲 在引物中的EcoRⅠ识别序列3′端添加1个碱基 突破3　酵母双杂交系统与免疫共沉淀 (3)融合蛋白表达成功后，将FLAG－P、FLAG－P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG－P和FLAG－P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A 的作用是______________________________________________________________； 增强FLAG－P与UBC的结合 突破3　酵母双杂交系统与免疫共沉淀 由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是______________________。 (4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是__________________________________ _______________________________。 参与P与UBC的结合 药物A通过增强P与UBC结合， 促进P降解 突破3　酵母双杂交系统与免疫共沉淀 角度1　酵母双杂交系统 1.酵母菌的转录激活因子含有两个不同的结构域：DNA结合结构域(BD)和DNA转录激活结构域(AD)，这两个结构域可以独立分开，功能互不影响。 2.BD和AD分别单独作用并不能激活转录反应，只有当二者在空间上充分接近时，才呈现完整的转录激活因子活性，使下游基因得到转录，可将两个待研究蛋白(蛋白X与蛋白Y)分别与BD、AD结构域构建质粒来探究其是否具有相互作用，如果X与Y不存在相互作用，则下游基因不会表达；如果X与Y存在相互作用，则下游基因表达。(如图所示) 突破3　酵母双杂交系统与免疫共沉淀 命题要点提醒： (1)一般不将BD－X与AD－Y两融合蛋白构建在同一质粒上，而是将BD－X与AD－Y构建在两个质粒上，然后共转染到同一酵母细胞。 (2)下游常用荧光蛋白基因作为报告基因来验证X与Y是否有相互作用。 突破3　酵母双杂交系统与免疫共沉淀 (3)融合基因的构建： 如想要把两基因(CD163与RFP)融合并成功表达出对应的融合蛋白，要将上游基因即靠近启动子的基因(CD163)中编码终止密码子的序列去除，这样才不会使得在融合蛋白表达过程中翻译完CD163后终止。 突破3　酵母双杂交系统与免疫共沉淀 [例1] 蛋白质甲基化是最广泛的翻译后修饰之一，组蛋白甲基转移酶G9a主要修饰蛋白质中赖氨酸、精氨酸，从而调控基因表达。酵母细胞基因转录因子BD(含赖氨酸)和AD两结构域结合时才能激活转录，两结构域分开时不能激活转录，为了筛选赖氨酸甲基化阅读器(只有甲基化的赖氨酸才能被“阅读器”识别)，研究人员进行了如图1所示实验，其中TRP1、LEU2分别是色氨酸、亮氨酸合成基因，G9a基因表达产物(含G9a)能与BD基因表达产物结合，当赖氨酸甲基化阅读器与G9a、BD复合体相互作用后，BD就可以与AD一起激活报告基因LacZ转录，如图2。请回答下列问题。 突破3　酵母双杂交系统与免疫共沉淀 (1)组蛋白甲基化影响基因表达水平，并可遗传给后代，这种现象________(填“属于”或“不属于”)基因突变，________(填“会”或“不会”)遗传给后代。 (2)为了使“阅读器”基因定向插入载体中，通过PCR技术扩增“阅读器”基因时，需在引物5′端添加______________________________________ 序列。 不属于 会 GAATTC、GGATCC 突破3　酵母双杂交系统与免疫共沉淀 (3)质粒甲、乙导入代谢缺陷型酵母菌时，需用氯化钙(CaCl2)处理酵母菌，其目的是____________________________________________________________________________________。 两培养基中需分别不添加________________才可筛选出导入重组质粒的酵母菌。转化后需要在相应的培养基上培养和筛选，选择导入了__________________________________________ (填“融合表达载体”“报告基因载体”或“融合表达载体和报告基因载体”)的酵母细胞。 使酵母菌处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，有利于吸收外源DNA 色氨酸、亮氨酸 融合表达载体和报告基因载体 突破3　酵母双杂交系统与免疫共沉淀 (4)已知LacZ基因表达产物，能将无色化合物X－gal水解成蓝色产物。Y2H和Y187接合生殖、培养时，如需筛选Y3H中含所需的“阅读器”，所需要进行的操作是：_______________________________________________________________________________________________________________。 Y2H和Y187在含有无色化合物X－gal的培养基上完成接合生殖、培养，并在Y3H中挑选蓝色菌落 突破3　酵母双杂交系统与免疫共沉淀 角度2　免疫共沉淀 1.探究蛋白是否有相互作用 (1)加标签：通过构建融合基因完成，A蛋白添加Flag标签，B蛋白添加HA标签。 (2)拉蛋白：使蛋白提取混合物通过含有Flag抗体的介质，这样就可将含有Flag标签的蛋白质筛选出来。 突破3　酵母双杂交系统与免疫共沉淀 (3)共沉淀检测：该沉淀复合物如用A蛋白抗体检测为阳性，如图①，然后在沉淀复合物中添加HA标签的抗体，如果显示阳性，则表明A蛋白和B蛋白有相互作用，如图②，在沉淀复合物中添加B蛋白的抗体，如果显示阳性，则表明A蛋白和B蛋白有相互作用，如图③，如果显示阴性，则表明A蛋白和B蛋白无相互作用，如图④。 突破3　酵母双杂交系统与免疫共沉淀 2.探究蛋白质相互作用的位点 (1)加标签：通过构建融合基因表达载体完成。蛋白A加标签(Flag)和不同长度的蛋白B加标签(HA)。 (2)共转染：将含HA—蛋白B全长基因、HA—蛋白B基因的片段1、HA—蛋白B基因的片段2、HA—蛋白B基因的片段3的4种质粒与含Flag—A融合蛋白质粒分别共转染四组细胞，以单独转染Flag—A质粒的受体细胞作为对照。 突破3　酵母双杂交系统与免疫共沉淀 (3)共沉淀检测：在五组蛋白提取物中分别加入FIag抗体，全部有条带(如Ⅰ)，说明含有Flag—A融合蛋白的质粒成功表达；再选取新的提取物加入HA抗体，②～⑤全部有条带(如 Ⅱ )，说明含有HA—B融合蛋白的质粒成功表达。再利用Flag抗体对上述HA抗体免疫沉淀中的蛋白质进行检测，结果如Ⅲ，全长、片段1检测到了Flag抗体，而片段2和片段3没有检测到Flag抗体，显然蛋白A与蛋白B相互作用的位点在片段1。 突破3　酵母双杂交系统与免疫共沉淀 命题要点提醒： (1)了解免疫共沉淀原理涉及融合蛋白的构建与抗原—抗体杂交。 (2)要将目标蛋白B拆解成若干个部分，针对每一部分蛋白对应的基因构建表达载体。 (3)蛋白质电泳需要添加内参，内参的作用是检测蛋白是否表达，常见内参基因有GAPDH、β－actin、18SrRNA等。 突破3　酵母双杂交系统与免疫共沉淀 [例2] 科研人员在研究甘蔗中糖类代谢时，发现调控蔗糖转移酶基因(SUC2)的两种蛋白质Snf1和Snf2在此发挥重要作用，为了探究两者之间的相互作用，将Snf1基因构建在如图1所示的表达载体上，另将Snf2基因与HA标签序列构建在同一质粒上成为融合基因，绿色荧光蛋白(GFP)与HA标签不会影响蛋白的功能，请回答下列问题： 突破3　酵母双杂交系统与免疫共沉淀 (1)图2为限制酶的识别序列，在图1所示载体含有的限制酶识别位点插入Snf1基因。序列分析发现Snf1基因内部有XbaⅠ的识别序列，为使载体中Snf1基因和绿色荧光蛋白基因正确表达，应在Snf1基因两端分别添加______________两种限制酶的识别序列，将Snf1基因插入载体前，应选用______________两种限制酶对载体酶切。 SpeⅠ、EcoRⅠ XbaⅠ、EcoRⅠ 突破3　酵母双杂交系统与免疫共沉淀 (2)将能够表达融合蛋白的两个质粒共转染到同一细胞中，利用HA抗体对细胞裂解液中的蛋白质进行检测，再利用GFP抗体对上述HA抗体免疫沉淀中的蛋白质进行检测，结果如图3所示，据图判断Snf1蛋白与Snf2蛋白之间的相互作用关系为：_________________________________。 Snf1蛋白与Snf2蛋白具有相互作用 突破3　酵母双杂交系统与免疫共沉淀 (3)为了进一步探究Snf1、Snf2与甘蔗体内糖类含量的关系，对不同甘蔗进行了基因敲除与过表达处理，经实验统计出了不同处理情况下糖类的含量。 图4结果表明：________________________________________________________ ______________________。 敲除Snf1或Snf2，糖类的相对含量降低，过表达Snf1和Snf2，糖类的相对含量增加 突破3　酵母双杂交系统与免疫共沉淀 $$