2025届高三生物一轮复习课件 第4讲动物细胞工程

第4讲 　 动物细胞工程 动物细胞培养 考点一 01 PART ONE 考点一 2 一、动物细胞培养 1.概念： 从动物体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后在适当的培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。 原理 地位 对象 目的 细胞增殖（主：有丝分裂） 动物细胞工程的基础 胚胎或幼龄动物的细胞 获得细胞或者细胞产物 一、动物细胞培养 2.培养条件： （1）营养： 合成培养基 + 血清等天然成分 ①无机物：无机盐等 ②有机物：糖类、氨基酸、维生素、血清…… 血清 将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配制而成的培养基。 含人类未知、细胞生长增殖所必需的物质，满足细胞对未知营养成分的需求。蛋白质、氨基酸、未知的促生长因子等 合成培养基 一般用液体培养基，也称为培养液 血清不能灭菌 2.培养条件： （2）无菌、无毒的环境： 无菌 ①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理 ②在无菌环境下进行操作 无毒 定期更换培养液，以便清除代谢物，防止细胞代谢物对细胞自身造成危害 ③添加一定量抗生素（抑制培养液中细菌的生长和繁殖） 一、动物细胞培养 湿热灭菌处理 一、动物细胞培养 2.培养条件： 合成培养基 在培养基中加入一定量的抗生素，从培养基功能的角度分类属于 培养基，用于动物细胞培养的培养基中没有加入凝固剂（如琼脂），从物理性质分类属于 培养基，从化学成分分类属于 培养基 选择 液体 合成 2.培养条件： 温度 pH （3）适宜的温度、pH和渗透压： 哺乳动物多以（36.5±0.5）℃ 多数细胞生存的适宜pH在7.2-7.4 一、动物细胞培养 渗透压 需要考虑的一个重要环境参数（维持细胞正常形态和功能） 2.培养条件： 95%空气 5% CO2 （4）气体环境： 维持培养液的pH 细胞代谢所必需 一、动物细胞培养 培养装置 培养皿或松盖培养瓶置于CO2培养箱，CO2培养箱可定期消毒 95%空气+ 5%CO2 2.培养过程： 一、动物细胞培养 胰蛋白酶 胶原蛋白酶 单个细胞　 培养液 （1）制备细胞悬液： 取动物组织 ①部位：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官 选材原因：这些细胞生命旺盛，分化程度低，分裂能力强，容易培养 2.培养过程： 一、动物细胞培养 ②将组织分散成单个细胞的原因: 从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长和增殖。 ③将组织分散成单个细胞的优点： （1）制备细胞悬液： a.使细胞与培养液充分接触，保证细胞所需营养和氧气的供应，保证细胞内代谢产物的及时排出 b.使得在细胞水平操作的其他技术得以实现。 ④进行动物细胞培养时常用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质，胰蛋白酶的用量和时间需控制好。 2.培养的过程： 一、动物细胞培养 （1）制备细胞悬液： 短时间内细胞________(填“会”或“不会”)被胰蛋白酶消化，原因是_________________________________________________________。 长时间后细胞____(填“会”或“不会”)被胰蛋白酶消化，原因是_________________________________________________________________________________________________________________________ 不会　 细胞表面具有糖蛋白，对细胞具有一定的保护作用 会　 细胞表面糖蛋白的保护作用是有限的；细胞膜的主要成分包括磷脂和蛋白质，长时间处理，细胞膜蛋白质可被胰蛋白酶水解 ⑤进行动物细胞培养时不可用胃蛋白酶 胃蛋白酶作用的适宜pH约为1.5，当pH大于6时，胃蛋白酶就失去活性，多数动物细胞培养的适宜pH为7.2~7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性，所以不能用胃蛋白酶。 2.培养的过程： 一、动物细胞培养 （1）制备细胞悬液： 2.培养的过程： 一、动物细胞培养 （2）动物细胞培养： ①培养对象: a.悬浮（生长）细胞：细胞能够悬浮在培养液中生长増殖 b.贴壁（生长）细胞：细胞需要贴附于某些基质（如培养瓶壁）表面才能增殖（主要类型） 方法：用培养液将细胞制成细胞悬液，再将细胞悬液放入培养皿或培养瓶内，置于适宜环境中培养。 培养瓶或培养皿要求： 内表面光滑、无毒、易于贴附。 2.培养的过程： 一、动物细胞培养 （2）动物细胞培养： ②贴壁细胞的培养现象（特点）: a.细胞贴壁现象：贴壁生长细胞细胞往往贴附在培养瓶的瓶壁上。 b.接触抑制现象：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞通常会停止分裂增殖。 接触抑制现象的原因：细胞增殖到相互接触的时候，细胞表面的糖蛋白识别了这种信息，就会使细胞停止继续繁殖。 特例：肿瘤细胞、杂交瘤细胞细胞膜表面糖蛋白等物质显著减少，失去接触抑制，细胞之间的黏着性显著降低，适宜条件下可以无限增殖，可形成多层细胞) 2.培养的过程： 一、动物细胞培养 （2）动物细胞培养： ③影响细胞生长因素: 解除措施：分瓶培养 悬浮生长细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏等因素而分裂受阻。 一般会形成单层细胞 贴壁生长细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累、营养物质缺乏、及接触抑制现象等因素而分裂受阻。 2.培养的过程： 一、动物细胞培养 （2）动物细胞培养： a.原代培养：分瓶前的细胞培养。指动物组织经处理后的初次培养。 b.传代培养：分瓶后的细胞培养。 ④培养阶段: 二、动物细胞培养的过程 ⑤进行培养的过程: a.悬浮生长细胞：细胞悬液 原代培养 制成细胞悬液 分瓶培养 用离心法收集细胞 加培养液 b.贴壁生长细胞：细胞悬液 原代培养 制成细胞悬液 分瓶培养 先用胰蛋白酶等处理，再用离心法收集细胞 加培养液 （2）动物细胞培养： 2.培养的过程： 一、动物细胞培养 （2）动物细胞培养： [易错提醒]　区分原代培养和传代培养的关键是看用胰蛋白酶处理的对象和是否分瓶； 分瓶前，第一次用胰蛋白酶对动物组织进行处理后的培养是原代培养；第二次用胰蛋白酶处理，使细胞从瓶壁上脱离下来，分瓶后的细胞培养为传代培养。 原代培养 传代培养 少数形成细胞株 少数形成细胞系 遗传物质改变 遗传物质有的改变 多数细胞固定在表面生长和分裂 随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖 细胞悬浮液 10代细胞 50代细胞 无限传代 培养危机： 危机1 危机2 遗传物质上来讲： 传代培养过程中部分细胞可能发生细胞转化（即遗传物质改变） 绝大部分细胞凋亡 一、动物细胞培养 植物组织培养和动物细胞培养的比较 项目 植物组织培养 动物细胞培养 原理 细胞全能性、细胞增殖 细胞增殖 培养前 处理 无菌；用机械的方法或胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理，使组织分散成单个细胞 无菌、离体 取材 幼嫩的细胞、组织或器官 胚胎或出生不久的幼龄动物器官或组织 培养基成分 无机盐、蔗糖、维生素、植物激素、琼脂等 糖类、氨基酸、无机盐、微量元素、维生素、血清等 培养基类型 固体 液体 项目 植物组织培养 动物细胞培养 结果 植株或大量细胞 只能获得大量细胞，不能得到生物个体 应用 快速繁殖、作物脱毒、细胞产物的工厂化生产和单倍体育种等 人造皮肤的构建、动物分泌蛋白的规模化生产 相同点 ①都需人工条件下的无菌操作；②都需要适宜的温度、pH等条件；③都进行有丝分裂，都不涉及减数分裂 二、干细胞 1.概念： 3.来源： 是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，与组织、器官的发育、再生和修复密切相关。在一定条件下，干细胞可以分化成其他类型的细胞 存在于 、 和 等多种组织和器官中 早期胚胎 骨髓 脐带血 体积较小，细胞核大，核仁明显。 2.特点： 分布 特点 （作用） 局限性 胚胎干细胞 早期胚胎中 具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。 必须从胚胎中获取 ，涉及伦理问题；因而限制了在医学上的应用。 二、干细胞 4.分类： 动物体内包括胚胎干细胞(ES细胞）和成体干细胞等 培养ES细胞的培养基中加入胰岛素等激素以提高形成率（促进细胞增殖，有利于动物细胞对葡萄糖的摄取） 成体干细胞 分布 特点 （作用） 运用实例 类型 成体组织或器官内 具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织，不具有发育成完整个体的能力 ①造血干细胞（主要骨髓、外周血和脐带血中） ②神经干细胞（神经系统中） ③精原干细胞（睾丸中） 治疗神经组织损伤和神经系统退行性疾病（如帕金森病、阿尔茨海默病等） 治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的造血系统、免疫系统功能障碍等疾病 造血干细胞→ 神经干细胞→ 造血干细胞是发现最早、研究最多的、应用最成熟的实例 二、干细胞 二、干细胞 4.分类： 诱导多能干细胞 概念 获取 方法 优点 通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了类似胚胎干细胞的一种细胞，称为诱导多能干细胞，简称iPS细胞 将特定基因或特定蛋白导入细胞中或者用小分子化合物诱导形成。 运用实例 ①可治疗镰状细胞贫血症 ②在治疗阿尔兹海默病、心血管疾病等领域的研究也取得了新进展 ①诱导过程无须破坏胚胎 ②iPS细胞可以来源于病人自身的体细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应，所以科学家普遍认为ips细胞的应用前景优于胚胎干细胞。 二、干细胞 4.分类： 诱导多能干细胞 过程 取成纤维细胞 转入相关因子 细胞转化为iPS细胞 诱导iPS细胞定向分化为多种组织细胞 移植回病人体内 Ips细胞最初由成纤维细胞转化而来，后来发现已分化的T细胞、B细胞等也能被诱导为ips细胞。 1.若将病人的皮肤成纤维细胞诱导成iPS细胞，再使它转化为需要的细胞，用这些细胞给病人治病，不会产生免疫排斥反应，尝试解释其中的原因。 iPS细胞来源于病人自身的体细胞。 2.利用iPS细胞治疗镰状细胞贫血的过程是首先制备患者的iPS细胞，再将其诱导形成造血干细胞，最终输给患者使其产生健康的血细胞。判断该过程是否能治疗镰状细胞贫血？并阐述理由。 不能。镰状细胞贫血是常染色体单基因隐性遗传病(基因突变)，因为从患者中获取的体细胞的相应基因是突变的，制成iPS细胞相应基因仍是突变的，诱导分化形成的造血干细胞成也是突变的，因此无法通过该过程治疗。 制备iPS细胞时可用健康的基因取代镰状细胞贫血的致病基因，再将其诱导形成造血干细胞，这样可用于治疗小鼠的镰状细胞贫血。 面临的问题 运用展望 存在导致肿瘤发生的风险 干细胞将在再生医学、药物安全性与有效性检测等领域发挥大作用。 胚胎干细胞 成体干细胞 二、干细胞 5.面临的问题和运用展望： 动物细胞融合技术与单克隆抗体 02 PART ONE 考点二 一、动物细胞融合技术 1.概念： 使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。 细胞膜的结构特点即细胞膜具有一定的流动性 2.原理： 物理法：电融合法 化学法：聚乙二醇（PEG) 生物法：灭活病毒诱导法（动物细胞融合特有） 3.诱导方法： 一、动物细胞融合技术 4.结果： 形成具有原来两个或多个细胞的遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。 突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。 5.意义： 研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。 用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。 6.应用： Q.大量制备单一抗体的思路 遗憾的是，在体外培养条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增殖的 每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体 B淋巴细胞群 克隆 单一B淋巴细胞 选择 大量纯度高特异性强的抗体 产生 骨髓瘤细胞能在体外大量增殖 Q.有什么办法能得到既能迅速大量增殖又能产生大量特定抗体的细胞呢？ （但不能产生抗体） 单 克 隆 抗 体 米尔斯坦 【英国】 科勒 【德国】 二、单克隆抗体及其应用 1.单克隆抗体的制备： （1）技术手段： 动物细胞融合和动物细胞培养 （2）制备原理： B淋巴细胞特点：一种B淋巴细胞只分泌　 种特异性抗体，但不能在体外无限增殖。 骨髓瘤细胞特点：能在体外大量增殖，但不能产生抗体。 杂交瘤细胞的特点：由B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合得到，既能大量增殖，又能产生足够数量的特定抗体。 一 ①细胞融合——细胞膜具有一定的流动性 ②动物细胞培养——细胞增殖 有丝分裂、不涉及减数分裂 ③三类细胞特点 多次注射特定的抗原进行免疫 多种B淋巴细胞 从脾中提取 ①为什么要注射特定的抗原？ 为了刺激机体发生免疫应答，从而获得能产生特定抗体的的B淋巴细胞 ②那为什么得的是多种B淋巴细胞呢？ 因为一种B淋巴细胞只能产生一种特定的抗体，小鼠的脾中分离出来的B细胞，还包含了其他抗原激活的B淋巴细胞 二、单克隆抗体及其应用 1.单克隆抗体的制备： （3）制备过程： 骨髓瘤细胞 诱导融合 将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合 能大量增殖， 但不能产生抗体 PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法 培养骨髓瘤细胞 多次注射特定的抗原进行免疫 多种B淋巴细胞 从脾中提取 能产生抗体， 但不能大量增殖 （3）制备过程： 骨髓瘤细胞 诱导融合 将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合 多种B淋巴细胞 多种杂交细胞 ③若只考虑细胞的两两融合，融合形成的细胞有几种？需要的是？ A-A细胞 A-B细胞 B-B细胞 3种 杂交瘤细胞 未融合细胞 一共有5种，AA、BB、AB、A、B,出现不同类型是因为细胞融合不是100%的，且是随机的。 （3）制备过程： 杂交瘤细胞 方法：用特定的选择培养基 (HAT培养基)：在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长 第一次筛选 目的：筛选获得杂交瘤细胞 特点：既能迅速大量增殖，又能产生抗体 原因：诱导融合后得到多种杂交细胞，还有未融合的细胞。 （3）制备过程： 杂交瘤细胞 特点：既能迅速大量增殖，又能产生抗体 第二次筛选 目的：筛选得到能分泌所需特异性抗体的杂交瘤细胞 方法：克隆化培养、抗体检测 抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞 能产生所需抗体的杂交瘤细胞 方法：抗原—抗体杂交 原理：抗原—抗体特异性结合 原因：小鼠生活中受到其他抗原的刺激，经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞。 （3）制备过程： 单克隆抗体 从细胞培养液中提取 从小鼠腹水中提取 注射到小鼠腹腔内 体外培养 体内培养 抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞 能产生所需抗体的杂交瘤细胞 （3）制备过程： 最终目的：获得能与抗原特异性结合的单克隆抗体 体外培养和体内培养的目的：获得大量单克隆抗体 （离心取上清） 项目 腹腔培养 体外培养 优点 缺点 易于控制培养条件（如无需提供无菌环境等），操作简单，成本较低 规模小，产量少 可大规模培养，大量生产 需要人为控制培养条件，成本相对较高 二、单克隆抗体及其应用 1.单克隆抗体的制备： 二、单克隆抗体及其应用 1.单克隆抗体的制备： （4）血清抗体和单克隆抗体区别： ①抗体的概念：抗体是机体受 刺激后产生的、并能与之发生特异性结合的具有免疫功能的 。 ②抗体是由 细胞合成和分泌的，每种这种细胞能产生 抗体。 ③动物免疫反应中产生的抗体有 种 ④为获得单一的抗体， （能/不能）选用特定的浆细胞直接去培养；理由是 。 抗原 蛋白质 浆 多 不能 浆细胞已经高度分化，不能再分裂 一种 二、单克隆抗体及其应用 常规抗体： （传统抗体） （血清抗体) 方法：向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生____，然后从动物____中分离所需抗体 缺点：产量低、纯度低、________。 抗体　 血清　 特异性差　 单克隆抗体： 方法：由________________增殖产生的高度专一的抗体。 优点： 单一杂交瘤细胞　 ①灵敏度高，能准确地识别______的细微差异。 ②特异性强，与特定____发生特异性结合。 ③能大量制备。 抗原　 抗原　 1.单克隆抗体的制备： （4）血清抗体和单克隆抗体区别： 二、单克隆抗体及其应用 2.单克隆抗体的应用： ①作为诊断试剂。如：a.用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成“早早孕诊断试剂盒”。b.利用__________________的单克隆抗体在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。 同位素或荧光标记　 ②可以运载药物。 ADC——“生物导弹”，优点是位置准确、疗效高、副作用小 抗体—药物偶联物(ADC) ：通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。 ③单克隆抗体自身也可用于治疗疾病 细胞凋亡 ADC的作用机制示意图 ① ADC被细胞吞噬（胞吞） ② ⑤ ADC 抗体 药物 接头 ADC组成：单克隆抗体+接头+药物（如细胞毒素） 二、单克隆抗体及其应用 注意：图片中ADC中谁是药物，谁是抗体 2.单克隆抗体的应用： ➊ADC的抗体和药物各具有什么作用？ ADC的抗体和药物具有的作用分别是将药物定向运到靶细胞、治疗。 ➋除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？ 放射性同位素和化学药物等。 ➌ADC在临床应用上的作用机理是什么？ 其作用机理是通过单克隆抗体的靶向作用特异性地识别肿瘤细胞表面抗原，然后利用细胞本身具备的内吞作用使化学药物进入肿瘤细胞体内发生药力，从而达到杀死肿瘤细胞的目的。 二、单克隆抗体及其应用 2.单克隆抗体的应用： [模型新命题点思考] 为研制抗病毒A的单克隆抗体，某同学以小鼠甲为实验材料设计了以下实验流程。 回答下列问题： (1)上述实验前必须给小鼠甲注射病毒A，该处理的目的是______________________________________________________。 (2)写出以小鼠甲的脾脏为材料制备单细胞悬液的主要实验步骤：_________________________________________________________________________________________________________________。 诱导小鼠甲产生能够分泌抗病毒A抗体的B淋巴细胞　 取小鼠甲的脾脏用机械法或用胰蛋白酶处理使其分散成单个细胞，加入培养液制成单细胞悬液　 (3)为了得到能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞，需要进行筛选。图中筛选1所采用的培养基属于________________，使用该培养基进行细胞培养的结果是_______________________。图中筛选2含多次筛选，筛选所依据的基本原理是________________________________。 选择培养基　 只有杂交瘤细胞能够生存　 抗原与抗体的反应具有特异性　 (4)若要使能产生抗病毒A的单克隆抗体的杂交瘤细胞大量增殖，可采用的方法有__________________________________________________________ ____________________(答出2点即可)。 将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内增殖；将杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养 √ 考向　单克隆抗体的制备及应用 1．(2024·北京朝阳区高三检测)人绒毛膜促性腺激素 (HCG)是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖 蛋白，制备抗HCG单克隆抗体可用于早孕的诊断。 下面是抗HCG单克隆抗体制备流程示意图。有关分 析错误的是(　　) A．体外培养单个B淋巴细胞也可以获得大量抗HCG的抗体 B．过程③培养后的细胞均能产生特定抗体 C．图中细胞集落a可用于大规模培养，生产抗HCG单克隆抗体 D．图中能产生单克隆抗体的细胞在培养过程中不会出现接触抑制的现象 √ 2．(2024·湖北部分高中联考)一种杂交瘤细胞只能产生一种抗体，抗体由两条相同的重链和两条相同的轻链构成。科研人员通过动物细胞融合技术将两种不同的杂交瘤细胞(A和B)融合形成双杂交瘤细胞AB，双杂交瘤细胞能够悬浮在液体培养基中生长繁殖，产生的双特异性抗体AB如下图所示。下列叙述正确的是(　　)  A．用抗原α和β处理杂交瘤细胞A、B后再 诱导二者融合 B．诱导杂交瘤细胞A、B融合后无需筛选即 可获得双杂交瘤细胞AB C．对培养到一定密度的双杂交瘤细胞进行 传代培养时，需使用胰蛋白酶处理 D．若双特异性抗体应用于肿瘤治疗，则α、β抗原中至少有一种为癌细胞表面抗原 1．制备的单克隆抗体在临床上不能直接用于人体，还需要对抗体进行人源化，即对鼠源单克隆抗体进行改造，使其大部分氨基酸序列为人源序列所替代，该过程的意义是_______________________________。 提示　鼠源单克隆抗体对人而言可能是异种抗原，经人源化后能保留抗体的特异性，降低其异源性 2.请根据以下信息，设计一方法(不考虑机械方法)，从培养液中筛选出杂交瘤细胞，并写出其依据的原理。已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。小鼠骨髓瘤细胞中尽管只有D途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加入聚乙二醇促融，获得杂种细胞。 提示　可向培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞 因为加入氨基嘌呤后，使D合成途径阻断，仅有D合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，但人的淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞可以利用淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖。 3．dMAb技术是一种通过DNA编码产生单克隆抗体的技术，比传统的单克隆抗体制备方法有更多的发展潜力。下图是dMAb技术在埃博拉病毒感染疾病的临床研究中的操作流程。 与传统利用杂交瘤细胞产生单克隆抗体的 技术相比，dMAb技术在抗体的制备上有 何优势？(请列举两点) 提示　①dMAb技术抗体的产生在生物 体内进行，不需要进行细胞体外培养； ②产生抗体的细胞种类不局限于免疫细胞(浆细胞)； ③抗体直接由DNA编码产生，省去抗原刺激免疫细胞、细胞融合和筛选的步骤。 动物体细胞核移植技术和克隆动物 03 PART ONE 考点三 分娩 一、动物细胞核移植技术 稿定PPT 稿定PPT，海量素材持续更新，上千款模板选择总有一款适合你 02 一、动物细胞核移植技术 1.概念： 将动物的一个细胞的细胞核，移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术。 ①供体：动物一个细胞的　　　。 ②受体：去掉核的　　　　。 ③结果：重新组合的细胞发育成　　　，继而发育成动物个体。 ④原理：　　　　　　　　　　　。 细胞核 卵母细胞 新胚胎 动物体细胞核具有全能性 2.生殖方式： 无性生殖 不能丰富生物的多样性，不能促使生物进化,不遵循孟德尔遗传定律。 一、动物细胞核移植技术 3.类型： 胚胎细胞核移植和体细胞核移植　 种类 难易程度 原因 胚胎细胞核移植 体细胞核移植 较容易 较难 分化程度低，全能性易表现 分化程度高，全能性难表现 动物体细胞核移植中，非人灵长类动物的体细胞核移植非常困难的原因： ①供体的细胞核在去核卵母细胞中不能完全恢复其分化前的功能状态，这导致了胚胎发育率低。 ②非人灵长类动物胚胎进行操作的技术尚不完善。 重构胚 早期胚胎 采集牛卵巢中的卵母细胞,在体外培养到MⅡ期 去核的(次级)卵母细胞 供体细胞培养 高产奶牛（供体） 通过显微操作法去核 从供体身体某一部位上取体细胞 将供体细胞注入去核的卵母细胞 通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞 用物理或化学方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程 将胚胎移入受体(代孕)母牛体内 生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛 ①减数分裂II中期（MII)卵母细胞的“核”其实是纺锤体-染色体复合物。 4.过程： 重构胚 早期胚胎 采集牛卵巢中的卵母细胞,在体外培养到MⅡ期 去核的(次级)卵母细胞 供体细胞培养 高产奶牛（供体） 通过显微操作法去核 从供体身体某一部位上取体细胞 将供体细胞注入去核的卵母细胞 通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞 用物理或化学方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程 将胚胎移入受体(代孕)母牛体内 生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛 ②受体细胞选用MⅡ次级卵母细胞的原因： a.其细胞质中含有激发细胞核全能性表达的物质； b.卵母细胞体积大，易操作； c.卵母细胞营养物质丰富。 重构胚 早期胚胎 采集牛卵巢中的卵母细胞,在体外培养到MⅡ期 去核的(次级)卵母细胞 供体细胞培养 高产奶牛（供体） 通过显微操作法去核 从供体身体某一部位上取体细胞 将供体细胞注入去核的卵母细胞 通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞 用物理或化学方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程 将胚胎移入受体(代孕)母牛体内 生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛 ③卵母细胞“去核”的原因： 保证克隆动物的核遗传物质全部来自具有优良性状的供体细胞。 重构胚 早期胚胎 采集牛卵巢中的卵母细胞,在体外培养到MⅡ期 去核的(次级)卵母细胞 供体细胞培养 高产奶牛（供体） 通过显微操作法去核 从供体身体某一部位上取体细胞 将供体细胞注入去核的卵母细胞 通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞 用物理或化学方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程 将胚胎移入受体(代孕)母牛体内 生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛 ④卵母细胞“去核”的方法： 目前动物细胞核移植技术中普遍使用的去核方法是显微操作。也有人采用梯度离心、紫外线短时间照射和化学物质处理等方法。这些方法是在没有穿透卵母细胞透明带的情况下去核或使其中的DNA变性。 　 *去核时，由于MⅡ期卵母细胞核的位置靠近第一极体,故用微型吸管一般会将核和第一极体一并吸出 重构胚 早期胚胎 采集牛卵巢中的卵母细胞,在体外培养到MⅡ期 去核的(次级)卵母细胞 供体细胞培养 高产奶牛（供体） 通过显微操作法去核 从供体身体某一部位上取体细胞 将供体细胞注入去核的卵母细胞 通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞 用物理或化学方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程 将胚胎移入受体(代孕)母牛体内 生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛 ⑤供体——提供细胞核的个体的条件： 　 a.选择有重要利用价值的动物的体细胞。 b.一般选用传代10代以内的细胞，保证正常二倍体核型。 重构胚 早期胚胎 采集牛卵巢中的卵母细胞,在体外培养到MⅡ期 去核的(次级)卵母细胞 供体细胞培养 高产奶牛（供体） 通过显微操作法去核 从供体身体某一部位上取体细胞 将供体细胞注入去核的卵母细胞 通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞 用物理或化学方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程 将胚胎移入受体(代孕)母牛体内 生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛 　 a.对卵母细胞损伤较小； b.保证供体细胞的细胞核不被破坏，操作方便。 ⑥将整个供体细胞注入卵母细胞中的优点： 重构胚 早期胚胎 采集牛卵巢中的卵母细胞,在体外培养到MⅡ期 去核的(次级)卵母细胞 供体细胞培养 高产奶牛（供体） 通过显微操作法去核 从供体身体某一部位上取体细胞 将供体细胞注入去核的卵母细胞 通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞 用物理或化学方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程 将胚胎移入受体(代孕)母牛体内 生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛 　 ⑦激活重构胚的方法及目的是： 用物理或化学方法(如电刺激、Ca2+载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂等)激活重构胚胎，使其完成细胞分裂和发育进程。 重构胚：是指人工重新构建的胚胎，具有发育成完整个体的能力。 重构胚 早期胚胎 采集牛卵巢中的卵母细胞,在体外培养到MⅡ期 去核的(次级)卵母细胞 供体细胞培养 高产奶牛（供体） 通过显微操作法去核 从供体身体某一部位上取体细胞 将供体细胞注入去核的卵母细胞 通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞 用物理或化学方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程 将胚胎移入受体(代孕)母牛体内 生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛 　 ⑧克隆动物的性状与供体不完全相同的原因： a.克隆动物的细胞质遗传物质来自受体卵母细胞的细胞质。 b.生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境等因素的影响。 克隆动物性别、基因型与供体相同 重构胚 早期胚胎 采集牛卵巢中的卵母细胞,在体外培养到MⅡ期 去核的(次级)卵母细胞 供体细胞培养 高产奶牛（供体） 通过显微操作法 去核 从供体身体某一部位上取体细胞 将供体细胞注入去核的卵母细胞 通过电融合法使两细胞融合，供体核进入卵母细胞 用物理或化学方法激活重构胚，使其完成细胞分裂和发育过程 将胚胎移入受体(代孕)母牛体内 生出与供体奶牛遗传物质基本相同的犊牛 动物细胞核移植 动物细胞培养 动物细胞融合 早期胚胎培养 胚胎移植 一、动物细胞核移植技术 5.体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题： （1）应用前景 ①在畜牧生产中加速家畜遗传改良进程、促进优良畜群繁育 a.通过建立转基因体细胞系，再利用体细胞核移植技术培育的转基因克隆动物可以作为生物反应器，生产许多珍贵的医用蛋白； b.在治疗人类疾病时，转基因克隆动物的细胞、组织或器官可以作为异种移植的供体； c.以患者作为供体培育的人核移植胚胎干细胞，经过诱导分化能形成相应的细胞、组织或器官，将它们移植给患者时可以避免免疫排斥反应。 ②在医药卫生领域： 一、动物细胞核移植技术 5.体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题： （1）应用前景 ③在科研领域： a.研究克隆动物可以使人类更深入地了解胚胎发育及衰老过程； b.克隆一批遗传背景相同的动物，可以通过它们之间的对比来分析致病基因； c.克隆特定疾病模型的动物，还能为研究该疾病的致病机制和开发相应的药物提供帮助。 ④在保护濒危物种方面： 该技术有望增加濒危物种的存活数量 一、动物细胞核移植技术 5.体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题： （2）存在的问题 ①体细胞核移植技术成功率非常低 ②核移植的理论研究较为滞后 ③绝大多数克隆动物存在健康问题，许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷。如异常肥胖、免疫失调等 治疗性克隆与iPS细胞治疗 病人 取核 去核卵母细胞 重构胚胎 各种细胞组织或器官 诱导 取出 体细胞 核移植 移植 成纤维细胞 取出 转入相关因子 iPS细胞 各种细胞组织或器官 胚胎干细胞 取出 诱导 移植 治疗性克隆 iPS细胞治疗 细胞发生转化 1．(2021·湖南选择考)M基因编码的M蛋白在动物A的肝细胞中特异性表达。现设计实验，将外源DNA片段F插入M基因的特定位置，再通过核移植、胚胎培养和胚胎移植等技术获得M基因失活的转基因克隆动物A，流程如下图所示。回答下列问题： (1)在构建含有片段F的重组质粒过程中，切割质粒DNA的工具酶是___________________________，这类酶能将特定部位的两个核苷酸之间的_____________断开。 解析：构建基因表达载体时，切割质粒DNA要用到限制酶，限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 限制酶(或限制性内切核酸酶)　 磷酸二酯键　 (2)在无菌、无毒等适宜环境中进行动物A成纤维细胞的原代和传代培养时，需要定期更换培养液，目的是_____________________________________ ___________________________。 解析：在进行动物细胞培养的过程中，要定期更换培养液，以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。 清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害　 (3)与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率更低，原因是________________________________________。从早期胚胎中分离获得的胚胎干细胞，在形态上表现为_______________________________________ (答出两点即可)，功能上具有_____________________________。 解析：体细胞核移植技术由于动物体细胞分化程度高，表现全能性十分困难，故与胚胎细胞核移植技术相比，体细胞核移植技术的成功率更低。胚胎干细胞具有胚胎细胞的特性，在形态上表现为体积小、细胞核大、核仁明显；在功能上具有发育的全能性，即可以分化成为动物体内任何一种组织细胞。 动物体细胞分化程度高，表现全能性十分困难 体积小、细胞核大、核仁明显(答出两点即可)　 全能性　 (4)鉴定转基因动物：以免疫小鼠的______淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选融合杂交细胞，制备M蛋白的单克隆抗体。简要写出利用此抗体确定克隆动物A中M基因是否失活的实验思路。__________________________ ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。 B　 取该转基因动物的肝组织细胞，提取其蛋白质，加入适量的M蛋白的单克隆抗体，观察有无凝集现象(或有无抗原—抗体特异性结合的现象)，若有则说明M基因没有失活，若无则说明M基因失活 2．(2023·湖北等级考)某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A为抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如下图所示。 回答下列问题： (1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞(含浆细胞)________(填“需要”或“不需要”)通过原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是_______________________ _________________________________________________。 解析：一般认为，已免疫的脾细胞(含浆细胞)中已含足够数量的能产生特异性抗体的B淋巴细胞，不需要通过原代培养扩大细胞数量。聚乙二醇(PEG)分子能改变膜结构，使两细胞接触点处细胞膜的脂类分子发生疏散和重组，通过两细胞接触点处双分子层细胞膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，使细胞融合。 不需要 改变细胞膜结构(，使两细胞接触点处细胞膜的脂类分子发生疏散和重组)　 (2)在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基(如HAT培养基)，该培养基对_____________________和______________________________ 生长具有抑制作用。 解析：淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合后，有些细胞未融合，有些细胞已融合；融合细胞中有的是具有同种核的细胞，有的是具有不同种核的细胞(杂交瘤细胞)。使用选择培养基的目的是筛选出能分泌特定抗体的杂交瘤细胞；在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞的生长受到抑制，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。 未融合的(亲本)细胞 融合的具有同种核的细胞 (3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是_______________________________________________________________。 解析：将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交的目的是从杂交瘤细胞中筛选出能分泌特定抗体的杂交瘤细胞。 筛选出能分泌与该病毒外壳蛋白A特异性结合的抗体的杂交瘤细胞 (4)构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是________。 ④ 解析：在核酸中，一个核苷酸的3′端羟基与另一个核苷酸的5′端磷酸基团发生脱水缩合，形成磷酸二酯键。故④符合题意。 $$