3.2DNA片段的扩增及电泳鉴定 课件 2024—2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

DNA片段的扩增及电泳鉴定 欢迎来到基因工程实验室 1 DNA指纹法在案件侦破中有重要作用，刑侦人员通过案发现场的血液、头发等样品中提取的DNA，与犯罪嫌疑人的DNA进行比较，就有可能为案件的侦破提供有力的证据。 犯罪嫌疑人留在现场的样品一般都是极少量的，刑侦人员要怎样才能得到足够量的DNA呢？ 2 一种体外迅速扩增DNA片段的技术，其本质是在体外模拟细胞内DNA分子复制的过程。 多聚酶链式反应（PCR） 美国　穆里斯（K.B.Mullis） 1993年获诺贝尔化学奖 3 在DNA复制中的作用 参与的组分 打开DNA双链 提供复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 DNA复制需要的基本条件 小资料 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上。 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 4 引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。 引物Ⅰ 引物 Ⅱ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ DNA聚合酶只能从引物的3′ 端开始连接脱氧核苷酸。 DNA的合成方向总是从子链的5 ′端向3 ′端延伸。 复制方向 5 在DNA复制中的作用 参与的组分 打开DNA双链 解旋酶 提供复制的模板 DNA母链 合成子链的原料 4种脱氧核苷酸 催化合成DNA子链 DNA聚合酶 使DNA聚合酶能从引物的 3′端开始连接脱氧核苷酸 引物 思考：体外扩增DNA 如何提供类似环境？ 两种引物（长度通常为20-30个核苷酸） DNA模板 4种脱氧核苷酸 6 在80-1000C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程就称为变性。 当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链，这称为复性。 PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。 7 在DNA复制中的作用 参与的组分 打开DNA双链 解旋酶 提供复制的模板 DNA母链 合成子链的原料 4种脱氧核苷酸 催化合成DNA子链 DNA聚合酶 使DNA聚合酶能从引物的 3′端开始连接脱氧核苷酸 引物 思考：体外扩增DNA 如何提供相似环境？ 两种引物（长度通常为20-30个核苷酸） DNA模板 4种脱氧核苷酸 变性（ 80-100℃ ） 8 美国黄石国家公园中的热泉 中国科学家钱嘉韵 耐高温的Taq DNA聚合酶 9 在DNA复制中的作用 参与的组分 打开DNA双链 解旋酶 提供复制的模板 DNA母链 合成子链的原料 4种脱氧核苷酸 催化合成DNA子链 DNA聚合酶 使DNA聚合酶能从引物的 3′端开始连接脱氧核苷酸 引物 思考：体外扩增DNA 如何提供相似环境？ 两种引物（长度通常为20-30个核苷酸） DNA模板 4种脱氧核苷酸 变性（ 80-100℃ ） Taq聚合酶（耐高温） 10 1、PCR仪 （一）设备及用具 2、微量离心管 一种薄壁塑料管，总容积为0.5mL 3、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体 实质上是能够自动调控温度的仪器 一、PCR的实验操作 11 不同规格的移液器配套使用不同大小的枪头。 每吸取一种试剂后，移液器上的一次性枪头都必须更换。 12 1、将所需仪器和试剂摆放在实验桌上（准备） 2、用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液） 3、盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合） 4、将微量离心管放在离心机上离心约10s（离心） 5、将离心管放入PCR仪中，设置好PCR仪的循环程序（反应） （二）操作步骤 一、PCR的实验操作 13 14 （三）思考讨论 1、DNA的合成是否需要能量？在PCR过程中是什么在提供能量？ 2、判断：复性过程一定是引物与模板DNA结合？ 3、想一想PCR技术在现实生活中有哪些应用？ 15 （三）思考讨论 DNA的合成是否需要能量？在PCR过程中是什么在提供能量？ 答：需要。dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP） 这四种脱氧核糖核苷三磷酸既作为合成原料，又提 供能量。 16 （三）思考讨论 判断：复性过程一定是引物与模板DNA结合？ 答：不一定，复性时引物与DNA模板的结合是 随机的，也存在DNA解开的两条链的结合，但 其概率较低。 原因：模板链一般较长，比引物复杂得多，重新 结合的概率低；引物数量多而模板的数量少。 17 （三）思考讨论 想一想PCR技术在现实生活中有哪些应用？ 答：广泛应用于刑侦破案、基因克隆、 古生物学、遗传病的诊断和DNA测序等方面。 18 （四）结果观察与分析 PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。凝胶中的DNA通过染色可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 一、PCR的实验操作 平板电泳槽、电泳仪 DNA电泳图谱观察仪 19 （一）实验原理 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 二、DNA片段的电泳鉴定 20 （二）材料器具 电泳仪、平板电泳槽、DNA电泳图谱观察仪 琼脂糖凝胶胶板（核酸染料） 二、DNA片段的电泳鉴定 21 （三）实验步骤 二、DNA片段的电泳鉴定 1、琼脂糖凝胶胶板的制备 2、点样孔点样 、电泳 3、紫外检测分析 22 加样注意事项： 二、DNA片段的电泳鉴定 1、用微量移液枪小心加入点样孔内。 2、 注意加样枪的枪头不可刺穿凝胶。 3、每加完一个样品要更换枪头。 23 电泳注意事项： 二、DNA片段的电泳鉴定 1、接通电源，一般红色为正极，黑色为负极，DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负），电压为5 V/cm（长度以两个电极之间的距离计算） 2、根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处停止电泳。 24 （四）思考讨论 1、分析电泳过程中，影响DNA分子迁移速率的因素？ 答：电泳时，DNA分子从琼脂糖凝胶的孔洞中蠕动， 因此相对分子质量越大，受到的阻力越大，迁移速率 越慢。 25 （四）思考讨论 2、电泳过程中，溴酚蓝和核酸染料分别什么作用？ 答：电泳时溴酚蓝是指示剂，指示泳动的位置， 判断是否终止电泳；核酸染料是DNA染色剂，嵌入 DNA分子中，在紫外光下显色。 26 （四）思考讨论 3、观察电泳结果出现了几条带？试分析原因。 27 （五）实验现象 二、DNA片段的电泳鉴定 紫外光 自然光 28 反思与收获: 古人学问无遗力，少壮工夫老始成。 纸上得来终觉浅，绝知此事要躬行。 —— 陆游《冬夜读书示子聿》 29 $$