3.2 DNA片段的扩增及电泳鉴定-【爱上生物课】2024-2025学年高二生物备课通关优质课件（人教版2019选择性必修3）

第1节基因工程的基本操作程序 第三章基因工程 DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.实验原理 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 (1)PCR利用了 原理，通过调节 来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。 (2)PCR扩增DNA片段还利用了 的原理。一次PCR一般要经历 次循环。 DNA的热变性 温度 DNA半保留复制 30 5’- -3’ 3’- -5’ 3’- -5’ 5’- -3’ 5’- -3’ -5’ 5’- 3’- -5’ 5’- -3’ -5’ 5’- 3’- -5’ 3’- -3’ 高温 变性 中温 低温 复性 延伸 1次循环 （一）DNA体外扩增： 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 2.材料用具 (1)用具 ①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增） ②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所） ③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体） ④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头） PCR仪 微量离心管 推动杆 调节旋钮 卸枪头按钮 体积刻度 吸液杆 枪头 （注意：加不同样品时，需要更换枪头） 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 2.材料用具 (2)材料 ①4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。 ②PCR反应体系的配方(见教材)。 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28～33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U 模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL 总体积 50μL 为保证加入反应体系中的各试剂体积的准确性，建议按照加入体积的大小，由大到小依次加入各试剂，即先加入无菌水。为保护酶的活性，一般最后加入DNA聚合酶。 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 3.方法步骤 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 3.方法步骤 (1)DNA片段的扩增 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）。 使DNA充分变性，以利于引物更好地与模板结合。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃，5min 30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后一次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 移液 离心 扩增 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 [思考]1.为什么最后1次变性时间延长？ Taq DNA聚合酶活性会随着循环次数增加而下降。在每一轮循环中，部分片段可能没有完全延伸完，Taq DNA聚合酶就脱落了。最后1次变性时间延长，让这些DNA打开，重新延伸。 2.PCR的产物是什么？ 3.如何鉴定PCR的产物？ DNA片段 琼脂糖凝胶电泳 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 （二）DNA片段电泳鉴定： 1.实验原理 （1）电泳：DNA分子具有_______________，在一定的 ________下，这些基团可以带上正电荷或负 电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷________的电极移动，这个过程就是电泳。 可解离的基团 pH 相反 一般使用的电泳缓冲液pH=8，DNA分子带 ，在电场中DNA便向 泳动。 负电荷 正极 磷酸电离形成的磷酸基团带负电 样品点样孔应靠近 极。 负 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 （2）鉴定方法：PCR的产物一般通过 来鉴定。 琼脂糖来源于红藻的多糖，其主要成分为多聚半乳糖，琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶。 琼脂糖凝胶具有网络结构（孔径），孔径大小与琼脂糖凝胶浓度有关，浓度越高，孔径越 ，能够通过的核酸分子越 。 琼脂糖凝胶电泳 在凝胶中DNA分子的迁移速率与_____________、_________________和______等有关 凝胶的浓度 DNA分子的大小 构象 小 小 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 琼脂糖凝胶浓度（%） 分离DNA分子大小（Kb） 迁移速率 0.6 1～20 慢 快 0.7 0.8～10 0.9 0.5～7 1.2 0.4～6 1.5 0.2～4 2.0 0.1～3 琼脂糖凝胶浓度越大，分离的DNA分子越小，迁移速率越快 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 核酸染色剂 常用的核酸染色剂有EB（溴化乙锭）、GoldView等，EB能插入DNA分子中的碱基对之间，导致EB与DNA结合。嵌入核酸碱基间的EB能吸收300nm波长的紫外光，发出可见荧光。其荧光强度与DNA分子的含量成正比。 1.实验原理 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.实验原理 标准参照物（Marker） DNA Marker是 的片段，在实验时和样本DNA同时进行凝胶电泳，通过对比两者的迁移速率，可以大致估计 。 样本DNA的大小 已知的DNA分子大小 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 2.材料用具 琼脂糖凝胶电泳装置 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 3.方法步骤 制备凝胶 观察鉴定 进行电泳 电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 ①熔化： ②倒模: ③凝固: 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 3.方法步骤 制备凝胶 观察鉴定 进行电泳 将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜 扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（marker）。 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待 前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 ①加液 ②加样 ③电泳 指示剂 ①有颜色，使样品呈现颜色，便于加样。 ②分子量较小，指示样品迁移的速率及方向。 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 3.方法步骤 制备凝胶 观察鉴定 进行电泳 取出凝胶置于 下观察和照相。 紫外灯 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 3.方法步骤 注意： 1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 4.结果分析与评价 （1）.如图所示，该片段大小约为 。 750bp 0次 12次 12次 30次 30次 Marker 根据条带的 及 来评价扩增的结果 （2）.判断成功扩增出DNA片段的依据是什么？ 分布 粗细程度 估计DNA的大小 估计DNA的数量 探究·实践 DNA片段的扩增及电泳鉴定 4.结果分析与评价 （3）.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因？ 未出现扩增条带可能的原因有： ①引物出现质量问题； ②变性时温度 ，变性时间 ，模板DNA链未打开。 ③Taq酶失活； ④Mg2+浓度过 。 出现非特异性扩增带可能的原因有： ①引物特异性不强或容易聚合成二聚体 ②复性时的温度过低，引物随机连接到非目的基因片段 ③DNA聚合酶的浓度过高，即使引物与模板的结合并不完全匹配，酶仍可能催化延伸反应，生成非特异性扩增产物。 ④Mg2+浓度过高 ⑤模板DNA出现污染 低 低 短 一条条带（目的基因片段） 及时训练 1.用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是(　　) A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间 B.3号样品为不含目的基因的载体DNA C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株 D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰 B 3号PCR结果包含250~500bp片段，应包含目的基因 9号PCR结果不包含250~50bp片段，所以不是所需转基因植株 及时训练 2.如图是从酵母菌细胞中获取某植物需要的某种酶基因的流程。结合所学知识及相关信息回答下列问题： (1)图中B过程是________。 (2)为在短时间内大量获得目的基因，可用________扩增的方法，其原理是___________________。 (3)获取目的基因之后，需要进行_____________________，此步骤是基因工程的核心。该步骤得到的结构必须含有____________________________(写出三项)以及目的基因等。 (4)将目的基因导入某双子叶植物细胞，常采用的方法是__________________。其能否在此植物体内稳定遗传的关键是此植物的染色体DNA中是否插入了目的基因，可以用________技术进行检测。 逆转录 PCR DNA半保留复制 基因表达载体的构建 启动子、终止子、标记基因 PCR 农杆菌转化法 感谢观看 Multimedia Cloud Transcode (cloud.baidu.com) Lavf58.20.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 $$