专题十五 细胞工程和基因工程-【高效备考】备战2025年高考生物二轮复习精品课件

细胞工程和基因工程 专 题 十 五 核心考点 考试频次 考题统计 植物细胞工程 3年27次 （2025 浙江卷）植物组织培养 （2025 浙江卷）植物体细胞杂交技术 （2024 广西卷）植物组织培养技术综合 （2024 江苏卷）植物细胞工程应用 （2024 北京卷）植物体细胞杂交技术 （2024 甘肃卷）植物组织培养技术综合 （2024 安徽卷）植物细胞工程应用 动物细胞工程 3年23次 （2024 福建卷）单克隆抗体的制备 （2024 海南卷）动物细胞融合 （2024 江苏卷）动物细胞培养 （2024 江苏卷）干细胞工程 （2024 重庆卷）克隆技术 胚胎工程 3年11次 （2024 北京卷）胚胎发育 （2024 甘肃卷）胚胎移植技术 （2024 湖北卷）精子和卵子的发生 （2024 湖北卷）胚胎移植 核心考点 考试频次 考题统计 DNA重组技术的工具 3年5次 （2024 贵州卷）DNA重组技术的工具 （2024 江西卷）基因工程与微生物综合 （2024 湖南卷）DNA重组技术的工具与酶 （2023 湖北卷）DNA重组技术的工具与单克隆抗体 基因工程的基本操作程序 3年56次 （2024 广西卷）基因表达载体的构建 （2024 天津卷）将目的基因导入受体细胞 （2024 福建卷）基因工程的基本操作步骤 （2024 重庆卷）基因表达载体的构建 基因工程及应用 3年9次 （2024 江西卷）基因工程应用 （2024 河北卷）基因工程与疫苗 （2024 海南卷）基因工程与制药 考情 分析 近几年高考题对植物细胞工程的考察内容较少，试题难度一般。考察重点为植物组织培养的过程，或是将培养过程与其他技术相结合进行综合考察。针对单克隆抗体，近几年的高考中多是对单克隆抗体的制备过程进行考察，并逐渐拓展到多抗和双抗的制备等。 基因工程部分的命题以非选择题为主，属于高考必考内容。题目内容多，难度往往较大，试题情境新颖，核心素养侧重对科学思维和科学探究的考查。 2025年植物细胞工程可能以植物组织培养或细胞培养为中心，结合其他技术进行综合考查。动物细胞工程很可能继续围绕单克隆抗体这个中心点，拓展免疫学与之相关的前沿内容。 基因工程预计仍是2025高考的热点内容，对能力的要求较高，涉及重组DNA技术、基因工程的基本操作程序等内容，情境大多来自大学教材和论文文献。 4 情境设计 借助双特异性抗体考查了双特异性抗体的制备过程和作用原理，体现了科学思维和科学探究的核心素养。 借助CRISPR/Cas9基因编辑、PCR及应用考查了相关技术的原理和应用，体现了科学思维的核心素养。 备考要点 植物细胞工程综合 动物细胞培养技术 单克隆抗体制备 胚胎工程技术及应用 基因工程的基本工具 基因工程的基本操作程序 蛋白质工程的原理和应用 5 细胞的全能性　 细胞增殖　 细胞膜的流动性　 细胞核的全能性　 获能　 桑葚胚、囊胚 将内细胞团均等分割　 限制酶　 利用PCR获取和扩增　 基因表达载体的构建　 分子水平　 基因 6 重点一 植物细胞工程 1．植物细胞工程的两大技术 变色圈 植物细胞的全能性 植物组织培养技术 植物体细胞杂交技术 原理 过程 原理 过程 外植体 脱分化 愈伤组织 再分化 个体 不需要光 细胞产物的工厂化生产 细胞膜的流动性、植物细胞的全能性 A细胞 B细胞 去壁 去壁 A原生质体 B原生质体 融 合 再生 新壁 杂种 细胞 组织培养 个体 染色体变异 克服了远源杂交不亲和的障碍 7 2．植物组织培养的条件 重点一 植物细胞工程 (1)植物组织培养的关键 ①条件： ②培养基状态： ③体内细胞未表现全能性的原因： 离体，一定营养物质，激素(生长素、细胞分裂素)等。 固体培养基 基因的表达具有选择性。 添加蔗糖的目的是提供碳源营养和调节渗透压 加入的琼脂不能被利用 (2)植物激素的使用 生长素与细胞分裂素的比值 作用效果 高 低 适中 促进根分化、抑制芽形成 促进愈伤组织形成 促进芽分化、抑制根形成 体内细胞未表现全能性的原因：在特定的时间和空间条件下，基因的表达具有选择性。 8 重点一 植物细胞工程 【典例1】(2024·河北唐山高三一模)紫杉醇具有良好的抗癌作用。科研人员用植物外植体获得愈伤组织，然后在液体培养基中进行细胞悬浮培养，以获得更多紫杉醇。下列叙述错误的是(　　) A．诱导愈伤组织需要考虑外植体的取材部位、培养基组成和激素种类等 B．由愈伤组织得到悬浮细胞可以使用纤维素酶和果胶酶进行处理 C．使用液体培养基并振荡有利于细胞获取氧气和营养物质,促进细胞生长 D．利用植物细胞培养技术获得初生代谢物紫杉醇能避免大量破坏野生红豆杉种群 √ 紫杉醇属于次生代谢物 9 重点一 植物细胞工程 3.植物体细胞杂交的关键 (1)酶解法:　　　 (2)融合的方法: (3)杂种细胞的形成标志: (4)培养杂种植株的技术: (5)植物体细胞杂交的结果: (6)杂种植株培育成功的原理: 用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁。　 电融合法、离心法、聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2＋—高pH融合法等。 新细胞壁的形成。 植物组织培养。 细胞具有全能性。 不能利用病毒融合法 没有有性生殖细胞的结合，因此不属于有性生殖，应为无性生殖。 最终经过组织培养形成杂种植株 10 【典例2】(2024·广东梅州高三一模)花椰菜易受黑腐病菌的危害而患黑腐病，野生黑芥具有黑腐病的抗性基因。用一定剂量的紫外线处理黑芥原生质体可使其染色体片段化，并丧失再生能力。利用此原生质体作为部分遗传物质的供体与完整的花椰菜原生质体融合，以获得抗黑腐病杂种植株。流程如下图所示，下列相关叙述错误的是(　　) A．融合成功的杂种细胞中染色体数目可能不同 B．最终获得的抗病植株具有完整的黑芥和花椰菜的遗传信息 C．初步筛选杂种细胞可在过程②后，以融合的活细胞中有叶绿体为标志 D．可将黑腐病菌接种到杂种植株上以鉴定其是否具有抗病性状 重点一 植物细胞工程 √ 利用经紫外线处理的黑芥原生质体作为部分遗传物质的供体与完整的花椰菜原生质体融合，因黑芥原生质体提供部分遗传物质，因此最终获得的抗病植株不具有完整的黑芥遗传信息 11 √ 1．(2024·浙江1月选考)山药在生长过程中易受病毒侵害导致品质和产量下降。采用组织培养技术得到脱毒苗，可恢复其原有的优质高产特性，流程如图。下列操作不可行的是(　　) 外植体→愈伤组织→丛生芽→试管苗 A．选择芽尖作为外植体可减少病毒感染 B．培养基中加入抗生素可降低杂菌的污染 C．将丛生芽切割后进行继代培养可实现快速繁殖 D．提高生长素和细胞分裂素的比值可促进愈伤组织形成丛生芽 真题研析 【最新考情】 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 解析：芽尖等分生组织分裂旺盛，病毒浓度很低甚至无病毒，故选择芽尖作为外植体可减少病毒感染，A不符合题意。 培养基中有大量的营养物质，其容易被杂菌污染，加入抗生素可降低杂菌的污染，B不符合题意。 将初代培养获得的培养物转移到新的培养基上继续进行扩大培养称为继代培养，其又可以分为第二代培养、第三代培养等。大多数植物每隔4～6周进行一次继代培养，每继代培养一次，培养物一般能增殖3～4倍。正因为培养物可以不断继代培养，所以离体繁殖速度比常规方法通常要快数万倍，可实现快速繁殖，C不符合题意。 提高生长素和细胞分裂素的比值可促进愈伤组织形成根，D符合题意。 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 2．(2024·湖北选择考)植物甲抗旱、抗病性强，植物乙分蘖能力强、结实性好。科研人员通过植物体细胞杂交技术培育出兼有甲、乙优良性状的植物丙，过程如下图所示。下列叙述错误的是(　　)  A．过程①中酶处理的时间差异,原因可能是两种亲本的细胞壁结构有差异 B．过程②中常采用灭活的仙台病毒或PEG诱导原生质体融合 C．过程④和⑤的培养基中均需要添加生长素和细胞分裂素 D．可通过分析植物丙的染色体，来鉴定其是否为杂种植株 √ 真题研析 【最新考情】 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 解析：利用纤维素酶和果胶酶去除植物细胞壁时，可能因植物细胞壁结构差异而调整酶处理的时间，A正确； 灭活的仙台病毒是动物细胞融合特有的诱导剂，B错误； 植物组织培养过程中的脱分化(④)和再分化(⑤)过程均需要添加生长素和细胞分裂素，但两过程中两种激素比例不同，C正确； 杂种植物细胞应含有两种生物的染色体，因此可通过分析植物丙的染色体，来鉴定植物丙是否为杂种植株，D正确。  [把脉高考]　该知识点为中低频考点。试题情境常与生活、生产、育种紧密联系，考查教材知识的内涵和外延。 ‹#› 二 轮 专 题 复 习   (1)(2022·辽宁T14)宜选用蓝莓成熟叶片为材料制备外植体。(　　) (2)(2022·浙江1月T7)农作物秸秆的回收利用方式很多，其中之一是将秸秆碎化后作为食用菌的栽培基质。碎化秸秆中纤维所起的作用，相当于植物组织培养中固体培养基的琼脂＋蔗糖。(　　) (3)(2021·江苏T5)植物组织培养过程中，用同一植株体细胞离体培养获得的再生苗不会出现变异。(　　) ×　 √　 ×　 真题研析 【历年考情】 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 (4)(2020·北京T13)为培育具有市场竞争力的无子柑橘，研究者设计如下流程。   过程③需应用植物组织培养技术。(　　) √　 真题研析 【历年考情】 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 (5)(2020·天津T15节选)在诱导形成愈伤组织阶段时通常选择茎尖、幼叶等作为外植体，原因是__________________________________________。 (6)(经典高考题)①植物微型繁殖是植物繁殖的一种途径。与常规的种子繁殖方法相比，这种微型繁殖技术的特点有_________________________ _________________(答出2点即可)。 ②用脱毒苗进行繁殖，可以减少作物感染病毒。为了获得脱毒苗，可以选取植物________进行组织培养。 细胞分化程度低，容易诱导产生愈伤组织　 能保持优良品种的遗传特性、繁殖速度快　 茎尖 真题研析 【历年考情】 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 重点二 动物细胞工程与胚胎工程 1.动物细胞培养 动物胚胎或幼龄动物组织块 原理：细胞增殖 剪碎 胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理 细胞悬液 原代培养 传代培养 胰蛋白酶处理 离心法收集后分瓶培养 其分化程度低、增殖能力强、更易于培养 具有贴壁生长和接触抑制的特点 区分原代培养和传代培养的关键是：是否分瓶培养 19 ①注射特定的抗原 ②培养骨髓瘤细胞 从小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。 B淋巴细胞 多种 诱导融合 ③将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合 PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法 骨髓瘤细胞 ④用特定的选择培养基进行筛选：在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有杂交瘤细胞才能生长。 ⑤克隆化培养和抗体检测：对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。 ⑥注射到小鼠腹腔内或体外培养 ⑦提取单克隆抗体：从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体。 重点二 动物细胞工程与胚胎工程 2.单克隆抗体的制备 20 【拓展】HAT培养基的筛选原理 ①能增殖的细胞合成DNA有两条途径，正常细胞内两种途径都有，若全合成途径被阻断，可以通过补救合成途径合成DNA； ②骨髓瘤细胞不能合成转化酶和激酶，因此只能进行全合成途径； ③全合成途径能被氨基喋呤（A）阻断； ④次黄嘌呤（H）、胸腺嘧啶（T）是补救合成途径的原料； ⑤无增殖能力的细胞在培养基中存活仅5-7天，细胞的多聚体也容易死去； 将诱导融合后的细胞接种于HAT培养基后两周，则细胞生存状况及原因为: B细胞和B-B细胞____________________________________________________ 骨髓瘤细胞和瘤-瘤细胞_______________________________________________ 杂交瘤细胞__________________________________________________________ 死亡；因B细胞属于成熟细胞，无增殖能力； 死亡;本身缺乏补救途径,从头合成途径被氨基蝶呤阻断,无法增殖； 存活；能从B细胞那里获得补救途径，能合成DNA，可大量增殖； 【思考】得到的杂交瘤细胞一定是所需的吗？ 杂交瘤细胞并不纯，因为从脾脏获得的B淋巴细胞不纯(既有未免疫的B淋巴细胞，又有产其他抗体的B淋巴细胞，以及能产所需抗体的B淋巴细胞)，因此要进行第二次筛选； 多孔细胞培养板 【拓展】克隆化培养和抗体检测 ★ 有限稀释法 每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞 侧面模拟图 克隆化培养一段时间 取上清液进行抗体检测 杂交瘤细胞悬液 多孔细胞培养板(克隆化培养) 稀释 加到 抗体检测 选择阳性克隆 稀释 加到 3.动物体细胞克隆技术（核移植技术） 取供体细胞 取卵母细胞 培养到 MⅡ中期 重构胚胎 代孕母牛 生出与供体遗传物质基本相同的个体 重组细胞 供体细胞培养 卵母细胞去核 供体细胞注入去核的卵母细胞 细胞培养 细胞融合 发育 选其作为受体的原因： ①营养丰富；②体积大易操作；③含有激发细胞核全能性表达的物质 [易错提醒] 核移植获得的克隆动物与提供细胞核的亲本性状可能不同的三个原因： (1)克隆动物的遗传物质来自两个亲本。 (2)发育过程中可能发生基因突变或染色体变异。 (3)外界环境可能引起不可遗传的变异。  重点二 动物细胞工程与胚胎工程 24 [易错提醒] 核移植获得的克隆动物与提供细胞核的亲本性状可能不同的三个原因： (1)克隆动物的遗传物质来自两个亲本。 (2)发育过程中可能发生基因突变或染色体变异。 (3)外界环境可能引起不可遗传的变异。  3.动物体细胞克隆技术（核移植技术） 重点二 动物细胞工程与胚胎工程 25 4.准确记忆哺乳动物的早期胚胎发育过程 受精卵 卵裂 分裂方式: 分裂特点: 只分裂，不生长，每个细胞体积逐渐变小，胚胎的总体积并不增加 桑葚胚 卵裂产生的子细胞逐渐形成致密的细胞 团，形似桑葚，每个细胞都属于全能细胞 囊胚 组成: 特点: 原肠胚 幼体 出现内、中、外三个胚层的分化 内细胞团、滋养层、囊胚腔 细胞已分化，内细胞团将发育为胎儿的各种组织 重点二 动物细胞工程与胚胎工程 5.胚胎移植的操作及生理基础 不在原肠胚阶段移植，因为此时分化程度高，移植成功率很低，另外不能直接移植受精卵 (1)操作流程: 供体、受体的选择和处理 发情配种或人工授精 胚胎的收集、检查、培养或保存 胚胎移植 胚胎移植后的检查 遗传性状优良、生产能力强的供体、健康的体质和正常正常繁殖能力的受体 选择 处理 同期发情处理和对供体母畜进行超数排卵 孕激素 促性腺激素 检查 收集 培养 保存 冲卵 直接向受体移植或放入-196℃的液氮中保存 对胚胎进行质量检查，这时胚胎应发育到 桑葚胚或囊胚阶段 检查受体是否妊娠 “胚胎”来自具有优良性状的“自然”胚胎及转基因技术、和移植技术等形成的胚胎。 重点二 动物细胞工程与胚胎工程 27 生理变化 生理环境 游离 免疫排斥反应 生理 组织 遗传特性 5.胚胎移植的操作及生理基础 (2)生理学基础 重点二 动物细胞工程与胚胎工程 6.胚胎分割 材料 实质 发育良好、形态正常的桑葚胚或囊胚 胚胎分割可增加动物后代的数量，其实质是动物的无性繁殖或克隆 成功关键点 对囊胚分割时，注意将内细胞团均等分割否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。对未知性别的胚胎可以取滋养层细胞做DNA分析进行性别鉴定 具有全能性，将来发育成胎儿的各种组织。 重点二 动物细胞工程与胚胎工程 1．(2024·黑吉辽选择考)从小鼠胚胎中分离获取胚胎成纤维细胞进行贴壁培养，在传代后的不同时间点检测细胞数目，结果如图。下列叙述正确的是(　　) A．传代培养时，培养皿需密封防止污染 B．选取①的细胞进行传代培养比②更合理 C．直接用离心法收集细胞进行传代培养 D．细胞增长进入平台期可能与细胞密度过大有关 √ 真题研析 【最新考情】 动物细胞培养需要O2、CO2等气体，培养皿不能密封 原代培养的细胞出现接触抑制现象后，需要分瓶进行传代培养，①的细胞处于增长初期，细胞还未出现接触抑制现象，因此选取②的细胞进行传代培养比①更合理. 由于成纤维细胞贴壁生长，进行传代培养时，需用胰蛋白酶等处理，使其分散成单个细胞后再用离心法收集 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 √ 2．(2024·甘肃选择考)甘加藏羊是甘肃高寒牧区的优良品种，是季节性发情动物，每年产羔一次，每胎一羔，繁殖率较低。为促进畜牧业发展，研究人员通过体外受精、胚胎移植等胚胎工程技术提高藏羊的繁殖率，流程如下图。下列叙述错误的是(　　) A．藏羊甲需用促性腺激素处理使其卵巢卵泡发育和超数排卵 B．藏羊乙的获能精子能与刚采集到的藏羊甲的卵母细胞受精 C．受体藏羊丙需和藏羊甲进行同期发情处理 D．后代丁的遗传物质来源于藏羊甲和藏羊乙 卵母细胞需培育到MⅡ期才能与获能的精子结合形成受精卵 ‹#› 二 轮 专 题 复 习   (1)(2023·湖南T21)研究人员通过肺上皮干细胞诱导生成肺类器官，可自组装或与成熟细胞组装成肺类装配体。肺类装配体培养需要满足适宜的营养、温度、渗透压、pH、无菌、无毒环境、含95%空气和5%CO2的气体环境等基本条件。(　　) (2)(2023·北京T12)研究者制备单克隆抗体用于快速检测甲状旁腺激素(PTH)，制备过程中能筛选分泌多种抗体的单个杂交瘤细胞。(　　) √　 ×　 真题研析 【历年考情】 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 (3)(2023·广东T3)科学家采用体外受精技术获得紫羚羊胚胎，并将其移植到长角羚羊体内，使后者成功妊娠并产仔，该工作有助于恢复濒危紫羚羊的种群数量。此过程不涉及精子获能处理。(　　) (4)(2023·浙江1月T12)胚胎分割技术提高了移植胚胎的成活率。(　　) (5)(2022·湖北T7)某兴趣小组开展小鼠原代神经元培养的研究，结果发现其培养的原代神经元生长缓慢，其原因不可能是血清经过高温处理后加入培养基。(　　) ×　 ×　 ×　 真题研析 【历年考情】 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 (6)(2021·江苏T11)将骨髓瘤细胞和B淋巴细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞。(　　) (7)(2021·浙江1月T18)动物细胞培养过程中用盐酸溶解细胞间物质使细胞分离。(　　) ×　 ×　 真题研析 【历年考情】 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 (8)(2023·湖北T22节选)①添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是_________________________________________ ______________________________________。 ②在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基(如HAT培养基)，该培养基对___________________和_________________________生长具有抑制作用。 ③单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是_____________________________________________________。 使细胞接触处细胞膜的脂类分子发生疏散和重组，从而导致细胞膜相互亲和，促进融合　 未融合的(亲本)细胞　 融合的具有同种核的细胞　 通过抗体检测呈阳性来获得分泌所需抗体的杂交瘤细胞　 真题研析 【历年考情】 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 (9)(2022·全国甲T38节选)①为了实现体外受精需要采集良种公羊的精液，精液保存的方法是________。在体外受精前要对精子进行获能处理，其原因是_____________________________________________________________。 ②请以保存的囊胚和相应数量的非繁殖期受体母羊为材料进行操作，以获得具有该公羊优良性状的后代。主要的操作步骤是__________________________________________________________。 冷冻保存　 刚排出的精子不能与卵子受精，只有获能后才具备受精能力(合理即可)　 对受体母羊进行同期发情处理，将保存的囊胚进行胚胎移植 真题研析 【历年考情】 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 拓展应用·情境推理 双特异性抗体是指一个抗体分子可以与两个不同抗原或同一抗原的两个不同抗原表位相结合，目前最常利用免疫的B淋巴细胞和杂交瘤细胞杂交技术来制备。长春花是原产于非洲东海岸的野生花卉，其所含的长春碱具有良好的抗肿瘤作用。图1是科研人员通过免疫的B淋巴细胞和杂交瘤细胞杂交技术生产能同时识别癌胚抗原和长春碱的双特异性单克隆抗体的部分过程，图2是某双特异性抗体作用图。 情境：双特异性抗体 拓展应用·情境推理 情境：双特异性抗体 双特异性抗体可同时与癌细胞和免疫细胞特异性结合，它一端与癌细胞结合，一端与T细胞结合，将T细胞拉近癌细胞，大大提高了杀灭癌细胞的效率。CD19是癌细胞表面的抗原蛋白，CD3蛋白受体位于T细胞表面，与抗体结合后，其免疫功能得到激活。下图是研究人员通过杂交瘤细胞技术生产双特异性单克隆抗体的部分过程。回答下列问题。 (1)给小鼠注射CD19蛋白，是为了从小鼠的 脾中分离得到________________________；注 射的抗原A是指____________。 (2)过程②和④所用诱导方法与诱导植物细胞 融合所用方法的不同之处是______________。 过程③培养杂交瘤细胞时需提供的气体条件是 95%空气和5%CO2的混合气体，其中CO2的 主要作用是 。 过程⑤筛选获得的细胞具有的特点是___________________。 免疫的B淋巴细胞　 CD3蛋白 可用灭活的病毒诱导 维持培养液的pH 既能无限增殖，又能产生特异性抗体 (3)与从血清中提取的CD19抗体、抗A抗原的抗体相比，通过双杂交瘤细胞得到双特异性单克隆抗体的优点是_________________________________________________。双特异性单克隆抗体治疗癌症的效果往往优于抗体CD19和A抗体的联合使用，原因是_____________________________________________。 双特异性单克隆抗体可以识别两种抗原 　既不损伤正常细胞，又减少了用药剂量 重点三 基因工程、生物技术的安全性与伦理问题 1．基因工程的操作流程 (1)目的基因的筛选与获取 (2)基因表达载体的构建（核心） (3)将目的基因导入受体细胞 (4)目的基因的检测与鉴定 目的基因的获取 ①人工合成目的基因。 ②利用PCR扩增目的基因 ③从基因文库中获取 [易错提醒] (1)目的基因主要是指编码蛋白质的基因。 (2)在已有mRNA前提下，可通过逆转录法获取目的基因。 (3)当基因较小且序列已知时，可采用化学合成法进行人工合成。 重点三 基因工程、生物技术的安全性与伦理问题 1．基因工程的操作流程 (2)基因表达载体的构建（核心） ① ; ② 。 启动子： RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录。 终止子： 终止转录 目的： 使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代 使目的基因能够表达和发挥作用 组成 标记基因： 目的基因： 复制原点： 鉴别或筛选含有重组DNA分子的受体细胞 目的基因必须插入到 与 之间。 DNA复制的起始位点。 终止子 启动子 重点三 基因工程、生物技术的安全性与伦理问题 [易错提醒] (1)基因工程中的载体与细胞膜上的载体不同。 (2)启动子、终止子 ①启动子(DNA片段)≠起始密码子(位于mRNA上)。 ②终止子(DNA片段)≠终止密码子(位于mRNA上)。 ③目的基因插入位置：启动子与终止子之间。 ④利用乳腺生物反应器生产药物时，应将目的基因与乳腺蛋白基因的启动子连接到一起。 1．基因工程的操作流程 (2)基因表达载体的构建（核心） 重点三 基因工程、生物技术的安全性与伦理问题 重点三 基因工程、生物技术的安全性与伦理问题 1．基因工程的操作流程 (3)将目的基因导入受体细胞 常 用 方 法 将目的基因导入 植物细胞 将目的基因导入 动物细胞 将目的基因导入 微生物细胞 农杆菌转化法: 花粉管通道法: ——显微注射法: ——Ca2+处理法: 【注意】将目的基因导入受体细胞，导入的是含目的基因的重组DNA分子, 而不是直接导入目的基因。 导入受精卵 导入体细胞或受精卵 导入受精卵 导入原核细胞 重点三 基因工程、生物技术的安全性与伦理问题 [易错提醒] 农杆菌转化法中的“两个两次” 1．基因工程的操作流程 (3)将目的基因导入受体细胞 两次拼接 两次导入 第一次拼接 第二次拼接 第一次导入 第二次导入 将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上 插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上(非人工操作) 将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌 含目的基因的T-DNA导入受体细胞(非人工操作) 重点三 基因工程、生物技术的安全性与伦理问题 1．基因工程的操作流程 (4)目的基因的检测与鉴定 类型 检测内容 方法 分子水 平的检测 个体生物学水平的鉴定 受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因 目的基因是否转录出了mRNA PCR等技术 目的基因是否翻译成蛋白质 抗原-抗体杂交技术 个体是否具有相应性状 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 [易错提醒] PCR不仅可用于获取和扩增目的基因，还能用于检测受体细胞中是否含有目的基因或受体细胞中的目的基因是否转录出mRNA。 重点三 基因工程、生物技术的安全性与伦理问题 2．蛋白质工程 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。 预期的蛋白质功能 设计 预期的蛋白质结构 应有的氨基酸序列 推测 改造或合成 转录 翻译 生物功能 行使 DNA mRNA 重点三 基因工程、生物技术的安全性与伦理问题 3．生物技术的安全性与伦理问题 (1)理性看待转基因技术 ①需要以完备的相关科学知识为基础，即清晰地了解转基因技术的原理和操作规程。 ②应看到人们的观点受到许多复杂的政治、经济和文化等因素的影响。 ③要靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。 重点三 基因工程、生物技术的安全性与伦理问题 (2)治疗性克隆与生殖性克隆的关系 项目 类型 治疗性克隆 生殖性克隆 区别 目的 用于医学研究和治疗疾病 用于生育，获得人的复制品 水平 细胞、组织或器官水平 个体水平 联系 都属于无性生殖；产生的新个体或新组织遗传信息相同 3．生物技术的安全性与伦理问题 重点三 基因工程、生物技术的安全性与伦理问题 (3)区分试管婴儿和“设计试管婴儿”   ①“设计试管婴儿”比试管婴儿多出的是过程________。 ②试管婴儿主要解决不孕夫妇的生育问题，“设计试管婴儿”可用于致命血液病等疾病的治疗。 d 3．生物技术的安全性与伦理问题 1．(2024·高考新课标卷)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题。 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 (1)限制酶切割的化学键是____________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是________________________________________________ __________________________________。 解析：限制酶(限制性内切核酸酶)能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。N基因表达需要RNA聚合酶与启动子结合启动转录，还需要终止子终止转录，在题述对应位置插入M1与M2片段，可以防止N基因上游的启动子和下游的终止子在插入B1的基因组时被破坏，保证N基因能在菌株B2中表达。 磷酸二酯键 可以防止N基因上游的启动子和下游的终止子被破坏，保证N基因能在菌株B2中表达　 真题研析 【最新考情】 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 (2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和_______________。 解析：向导RNA中存在碱基A、G、C、U，而B1基因组DNA中存在碱基A、G、C、T，RNA与DNA互补配对时也遵循碱基互补配对原则，可以形成的碱基对有G—C、A—T和U—A。 A—T、U—A 真题研析 【最新考情】 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 (3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是_____________________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是______________________。 解析：根据题意，为验证片段甲是否插入了细菌B1基因组，应该以菌株B2的基因组DNA为模板进行PCR。该模板没有引物P4的结合位置，若用该模板与引物P3和P4进行PCR，则实验结果是无法扩增出目的产物。 菌株B2基因组DNA　 无法扩增出目的产物　 真题研析 【最新考情】 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 (4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是_______________________________________(答出2点即可)。 解析：秸秆焚烧会产生浓烟和二氧化碳等物质，造成环境污染，而利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆，可在一定程度上有效减少环境污染；无火灾隐患，更加安全；此外降解产物中含有大量的葡萄糖，可以作为原料生产燃料乙醇等，实现废物利用。 减少环境污染；实现废物利用(合理即可) 真题研析 【最新考情】 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 2．(2024·河北选择考)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为γ2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得γ2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。回答下列问题： (1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使γ2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为________________________ 启动子。Nos为终止子，其作用为________________。γ2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶________和________对γ2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。 水稻胚乳中特异表达的基因的　 终止转录过程　 Hind Ⅲ　 EcoR Ⅰ 真题研析 【最新考情】 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 解析：根据题意可知，若使γ2HN基因仅在水稻胚乳表达，GtP(启动子)应为水稻胚乳中特异表达的基因的启动子。Nos为终止子，其作用为终止转录过程。GtP内部含有Kpn Ⅰ的酶切位点，用Kpn Ⅰ酶切会破坏启动子，Nos下游含有Sac Ⅰ的酶切位点，用Sac Ⅰ酶切会使重组基因表达载体缺失终止子，故构建基因表达载体时，可选择限制酶Hind Ⅲ和EcoRⅠ对γ2HN基因与载体进行酶切。 真题研析 【最新考情】 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 (2)利用____________方法将γ2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测γ2HN表达情况，可通过PCR技术检测_____________________________，通过________________技术检测是否翻译出γ2HN蛋白。 解析：水稻是单子叶植物，可用农杆菌转化法将γ2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测γ2HN基因表达情况，可用PCR检测γ2HN基因是否转录出mRNA，若要检测γ2HN基因是否翻译出γ2HN蛋白，可用抗原—抗体杂交技术。 农杆菌转化　 γ2HN基因是否转录出了mRNA　 抗原—抗体杂交　 真题研析 【最新考情】 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 (3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，γ2HN纯合体植株的占比为__________。选择纯合体进行后续研究的原因是___________________。 遗传性状稳定 真题研析 【最新考情】 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 (4)制备γ2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的CD8＋T细胞(细胞毒性T细胞)水平，结果如图2所示。据此分析，获得的γ2HN疫苗能够成功激活鸡的________免疫和________免疫。 体液　 细胞　 真题研析 【最新考情】 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 解析：通过体液免疫，机体可产生较多相应抗体，通过细胞免疫，机体可产生较多细胞毒性T细胞。据题图可知，实验组的抗体和CD8＋T细胞(细胞毒性T细胞)均明显高于对照组，因此获得的γ2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。 真题研析 【最新考情】 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 (5)利用水稻作为生物反应器生产γ2HN疫苗的优点是_____________________________。(答出两点即可) 解析：利用水稻作为生物反应器生产γ2HN疫苗，有生产成本低、生物安全性较高、提取和处理目标产物简易等优点。 生产成本低、生物安全性较高 真题研析 【最新考情】 ‹#› 二 轮 专 题 复 习   (1)(2023·全国乙T38)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因翻译。(　　) (2)(2022·山东T25)两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补配对。(　　) (3)(2022·山东T20)通过转基因技术可减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的发酵周期。(　　) ×　 √　 √　 真题研析 【历年考情】 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 (4)(2021·湖北T16)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异条带的产生，可以提高复性的温度。(　　) (5)(2020·天津T11)目的基因是基因工程的关键要素，必须从动物、植物或微生物的基因组文库中直接获取。(　　) √　 ×　 真题研析 【历年考情】 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 (6)(2023·全国甲T38节选)乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题。 ①接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是_______________________________________________。 ②若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。__________________________________________________ _________________________________。 重组乙肝疫苗成分为蛋白质，无法在宿主体内增殖 通过使用相应抗体，利用抗原—抗体杂交技术，检测目的基因是否翻译形成蛋白质　 真题研析 【历年考情】 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 (7)(2022·全国乙T38节选)已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是_________________________________ ______________________________________________________________。 (8)(2022·湖北T22节选)制备转基因植物时，用农杆菌侵染植株叶片外植体，其目的是______________________________________________________。 获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定　 通过农杆菌的转化作用，使目的基因进入植物细胞　 真题研析 【历年考情】 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 (9)(2022·广东T22节选)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是______________________________________________，终止子的作用是___________________________________________。 作为标记基因，筛选含有目的基因的受体细胞　 终止转录，使转录在需要的地方停下来 真题研析 【历年考情】 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 拓展应用·情境推理 情境1：基因编辑技术及其应用 CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如图)。 CRISPR复合体中的sgRNA的主要功能是与靶向基因(目的基因)上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合， 并在特定位点切割DNA。 1．研究发现，向导RNA能识别特殊的DNA序列，然后引导Cas9蛋白对DNA双链进行切割。据下图分析，下列叙述正确的是(　　) A．向导RNA和双链DNA含有的含氮碱基不完全相同 B．虚线框内的核苷酸序列彻底水解的产物是8种核苷酸 C．Cas9蛋白不具有降低化学反应活化能的作用 D．合成Cas9蛋白的细胞结构含有磷脂分子和核酸 √ 彻底水解的产物是磷酸、核糖、脱氧核糖和含氮碱基 Cas9蛋白能对DNA进行切割，说明Cas9蛋白是一种酶，而酶具有降低化学反应活化能的作用 合成Cas9蛋白的细胞结构是核糖体，核糖体含有rRNA，但核糖体没有膜结构，不含磷脂分子 2．猪瘟病毒能与猪细胞膜上的LamR受体蛋白结合，进而侵入细胞引起猪瘟。利用基因编辑技术改变LamR受体蛋白基因，使LamR受体蛋白不能与猪瘟病毒正常结合，但不影响生理功能，从而培育出抗猪瘟病毒猪。基因编辑原理是由一条人为设计的单链向导RNA(sgRNA)引导Cas9蛋白到特定的DNA位点进行切割，从而完成对目的基因的编辑。基因编辑过程如下图所示。下列叙述错误的是(　　) A．培育抗猪瘟病毒猪，一般选择受精卵作为基因编辑的受体细胞，这样获得的个体的所有细胞都无法被猪瘟病毒感染 B．Cas9蛋白的功能是准确识别DNA特定序列并进行切割 C．改造后的受体细胞经培养发育到桑葚胚或囊胚时，可将其进行冷冻保存或胚胎移植 D．通过基因编辑技术改造前后的两种LamR基因是等位基因 √ 根据基因编辑的原理和题图所示过程，单链向导RNA是通过碱基互补配对原则准确地识别并结合到DNA的特定位点，从而引导Cas9蛋白到达准确位置进行DNA的切割 3．CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA(sgRNA)引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如下图所示。回答下列问题： ‹#› 二 轮 专 题 复 习 (1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是________________________。 解析：基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA连接酶，限制酶负责切割，DNA连接酶负责连接，因此为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的 DNA进行酶切处理，然后将其插入经相同酶切处理过的质粒上，插入时需要的酶是DNA连接酶。 DNA连接酶　 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 (2)过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是_________________。 解析：大肠杆菌是原核生物，属于微生物，将目的基因导入微生物细胞之前需要用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 Ca2＋处理法　 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 (3)过程③～⑤中，sgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是__________________。随后，Cas9蛋白可切割________________________序列。 解析：根据题图可知，在CRISPR/Cas9基因编辑技术中，sgRNA是根据靶基因设计的向导RNA，能引导Cas9蛋白切割与sgRNA配对的目标DNA序列。sgRNA分子与目标DNA进行特异性结合的原因在于sgRNA分子上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序列可以按照碱基互补配对原则实现sgRNA与目标DNA特定序列的特定识别，进而定位；Cas9蛋白在功能上属于限制酶，可切割目标DNA特定的核苷酸序列。 碱基互补配对原则 目标DNA特定的核苷酸 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 (4)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入基因组DNA的编辑过程：___________________________________ _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。 CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是sgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，引导Cas9蛋白切割目标DNA序列，从而将该蛋白酶基因插入基因组DNA中 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 解析：根据题图可知，CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是sgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，引导Cas9蛋白切割目标DNA序列，从而将该蛋白酶基因插入基因组DNA中。 ‹#› 二 轮 专 题 复 习 拓展应用·情境推理 情境2：PCR及其应用 1．实时荧光定量PCR技术检测病毒核酸 病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被耐高温的DNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到(如图甲)，通过实时荧光PCR检测某冠状病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图乙，荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)越小，说明病毒核酸浓度越高。 拓展应用·情境推理 情境2：PCR及其应用 拓展应用·情境推理 2．PCR定点突变——重叠延伸PCR技术 重叠延伸PCR技术的主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。如某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如下图所示。 情境2：PCR及其应用 拓展应用·情境推理 情境2：PCR及其应用 拓展应用·情境推理 3．PCR定点突变——大引物PCR技术 大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。原理如下图所示。 情境2：PCR及其应用 拓展应用·情境推理 情境2：PCR及其应用 拓展应用·情境推理 4．反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列 当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理是用限制酶消化该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。原理如下图所示。 情境2：PCR及其应用 拓展应用·情境推理 情境2：PCR及其应用 拓展应用·情境推理 5．巢式PCR 首先将目标的DNA模板与第一套引物(外引物)结合。第一套引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片段(图中未显示可能的多种产物)。然后使用第二套引物(内引物)对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片段包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片段。这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。原理如下图所示。 情境2：PCR及其应用 拓展应用·情境推理 情境2：PCR及其应用 1.荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA的含量，其原理是在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成。下列叙述错误的是(　　) A．引物与探针均具有特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则 B．反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈负相关 C．耐高温的DNA聚合酶催化DNA合成的方向总是从子链的5′端到3′端 D．若用上述技术检测某基因的转录水平，则需要用到逆转录酶 √ 模板DNA含量越高，PCR扩增过程中形成的荧光分子越多，荧光强度越大，即反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关 2.大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，如图表示利用大引物PCR对基因M进行定点诱变。下列说法错误的是(　　) A．第一轮PCR中，至少需要2个循环才能获得相应的大引物 B．第二轮PCR所用的引物是第一轮PCR的产物DNA的两条链 C．扩增的定点诱变产物通常需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译 D．为了使两轮PCR在同一支试管中进行，设计引物时应考虑不同的复性温度 √ 第一轮产物DNA的一条链作第二轮PCR扩增的大引物，第二轮PCR仍需加入的另一种引物是侧翼引物 3．为减少引物与模板之间的非特异性配对，人们对普通PCR进行了改良，发明了巢式PCR，其原理是利用两套引物进行两轮PCR扩增。首先利用第一对引物(外引物)对目的基因所在的DNA进行第一轮扩增(经过15～30次循环)，第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板，利用第二对引物(内引物或巢式引物)结合在第一轮扩增产物内部，经过15～30次循环，获得第二轮扩增片段(即目的基因)，最终第二轮扩增片段短于第一轮，基本过程如下图所示。下列叙述错误的是(　　) A．两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段 B．使用外引物至少经过3次循环，才能得到图示的第一轮扩增产物 C．若第一轮扩增产生错误片段，则其进入第二轮扩增的概率极低 D．与巢式PCR相比，普通PCR特异性更强，错误率更高 √ 巢式PCR中加入的组分与常规PCR相同，都含有模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、四种游离的脱氧核苷酸、缓冲液、Mg2＋等，第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增，从而提高反应的特异性，获得的产物特异性更强 4．在利用PCR扩增目的基因时，通常在引物一端添加限制酶识别序列，以便将目的基因连接到载体上。如图所示，TA克隆法可以将PCR产物直接连接到具有3′—T突出末端的载体上，这是因为普通Taq DNA聚合酶具有末端连接酶的活性，可在每个PCR扩增产物的3′端自动添加一个碱基，通常为A，这样扩增产物就可以与有3′—T突出末端的载体连接。高保真Taq DNA聚合酶可切掉PCR扩增过程中产生的错配碱基，保证扩增的准确性。 (1)PCR依据的原理是________________，该技术通常需要2种引物，引物的具体作用是_________________________________________________。 解析：PCR依据的原理是DNA半保留复制；PCR需要引物，引物的具体作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。 DNA半保留复制　 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 (2)一般情况下，利用PCR扩增目的基因时，通常在引物的________端添加特定限制酶识别序列。基因工程中使用的载体除质粒外，还有________、________________________等。题述构建重组质粒的方法________(填“需要”或“不需要”)限制酶，________ (填“需要”或“不需要”)DNA连接酶，原因是______________________________________________________ ____________________________________________。 5′　 动植物病毒(顺序可颠倒)　 不需要　 需要　 PCR扩增产物的3′端有一个碱基A，T载体有3′—T突出末端，二者可以在DNA连接酶的作用下直接连接　 噬菌体　 解析：PCR扩增目的基因时在3′端开始添加脱氧核苷酸，所以通常在引物的5′端添加特定限制酶识别序列。基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体和动植物病毒等。依据题意，普通Taq DNA聚合酶具有末端连接酶的活性，可在每个PCR扩增产物的3′端自动添加一个碱基，通常为A，这样扩增产物就可以与有3′—T突出末端的载体在DNA连接酶的作用下直接连接，所以利用TA克隆法构建重组质粒不需要限制酶，需要DNA连接酶。 (3)高保真Taq DNA聚合酶不会使PCR扩增产物产生A尾，高保真PCR扩增后，如何加工才能进行TA克隆？__________________________________ ____________________________________________________。 解析：高保真Taq DNA聚合酶不会使PCR产物产生A尾，可利用普通Taq DNA聚合酶添加A尾，同时要添加dATP、缓冲液等，然后在适宜温度下延伸一段时间。 先进行PCR产物回收，将其作为模板，再加入dATP、普通TaqDNA聚合酶等延伸一段时间 胚胎移植的生理学基础 意义 1.同种动物的供、受体排卵后，生殖器官的 __________是相同的 为移入受体的供体胚胎提供了相同的__________ 2.早期胚胎形成后，在一定时间内不会与母体子宫建立组织上的联系，而处于______状态 为胚胎的收集提供了可能 3.受体对外来胚胎基本上不发生 ________________ 为胚胎在受体内存活提供了可能 4.供体胚胎可与受体子宫建立正常的_____和______联系，但其___________不受影响 为移植后的胚胎继续发育提供了营养等方面的保障 $$