猜押07 生物技术相关问题（北京专用）-2025年高考生物冲刺抢押秘籍

猜押07 生物技术相关问题 猜押考点 3年真题 考情分析 押题依据 细胞的结构及功能 2024年北京卷第17、19题 2023年北京卷第17、20题 2025年新高考生物新结构体系下，生物技术类题目以综合性的考查学生的思维能力和推理能力为主；以问题为抓手，创新设问方式，搭建思维平台，引导考生思考。 题目更加注重综合性、应用性、创新性，且是综合性比较强，本题分值正常，试题容量一般，部分以选择题呈现，部分以非选择题呈现，对学科核心素养的考查比较深入。 生物技术类的题型要求考生在阅读理解的基础上，依据题目提供的信息，联系所学的知识和方法，实现信息的迁移，达到灵活解题的目的；对这部分内容的考查，多借助图形、情境信息或者生活实际发酵工程，基因工程等内容，且涉及到基因工程部分的内容常与遗传变异等内容综合考查。 难度适中，可以预测2025年新高考大题命题方向将会进行比较综合的考查。 题型1 细胞工程 1．（2025·北京房山·一模）利用植物体细胞杂交技术培养番茄—马铃薯杂种植株，过程如图。下列说法正确的是（    ） A．过程①需要使用胰蛋白酶和果胶酶处理两种细胞 B．过程②可以使用PEG或灭活病毒诱导促使其融合 C．可利用细胞膜表面荧光标记颜色筛选融合原生质体 D．过程④的培养基中需加入植物激素来诱导脱分化和再分化 【答案】C 【分析】分析题图可知，①是表示用酶解法去除细胞壁；②是诱导原生质体融合；③是杂种细胞脱分化形成愈伤组织；④是再分化形成杂种植株。 【详解】A、过程①是去除植物细胞壁获得原生质体的过程。植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，所以应使用纤维素酶和果胶酶处理两种细胞，而胰蛋白酶是用于动物细胞培养中使动物组织分散成单个细胞的酶，不能用于植物细胞，A错误； B、过程②是诱导原生质体融合的过程。诱导植物原生质体融合可使用物理方法（如离心、振动、电激等）和化学方法（如PEG融合法），灭活病毒可用于诱导动物细胞融合，但不能用于诱导植物原生质体融合，B错误； C、由于番茄细胞的原生质体用红色荧光标记，马铃薯细胞的原生质体用绿色荧光标记，所以融合的原生质体表面既有红色荧光又有绿色荧光，可利用细胞膜表面荧光标记颜色筛选融合原生质体，C正确； D、过程④是愈伤组织再分化形成植物体的过程，而脱分化是由植物组织或细胞形成愈伤组织的过程，即过程③。过程④的培养基中需加入植物激素来诱导再分化，而不是诱导脱分化和再分化，D错误。 故选C。 2．（2025·北京房山·一模）中国科学院研究团队利用相关生物学技术，成功培育出世界上首例只有双雌来源的孤雌小鼠和双雄来源的孤雄小鼠，实现了哺乳动物的同性繁殖，实验流程如图所示。下列描述错误的是（    ） A．上述过程培育获得的孤雄小鼠的性染色体组成为XY B．甲囊胚内细胞团均等分割可获得具有相同遗传物质的孤雌小鼠 C．孤雄小鼠的获得利用细胞工程、基因工程、胚胎工程相关技术 D．上述技术为拯救仅存单一性别的濒危哺乳动物提供了可能性 【答案】A 【分析】1、卵细胞激活转化成phFSC，通过基因编辑技术获得具精子细胞核特点的phESC，获得甲，从而得到孤雌小鼠。2、精子激活转化成ahFSC，通过基因编辑技术获得具卵细胞细胞核特点的ahESC，获得乙，从而得到孤雄小鼠。 【详解】A、不考虑致死，孤雄小鼠的染色体来源于两只雄鼠产生的精子，精子的性染色体为X或Y，所以其性染色体可能是XX、XY或YY，A错误； B、利用胚胎分割的方法对甲进行处理得到了多只孤雌小鼠遗传物质一般相同，注意要将甲囊胚内细胞团均等分割，B正确； C、结合题图孤雄小鼠的获得采用了动物细胞培养技术、核移植技术、基因编辑技术等，总之利用了细胞工程、基因工程、胚胎工程相关技术，C正确； D、结合题干该技术可成功培育出世界上首例只有双雌来源的孤雌小鼠和双雄来源的孤雄小鼠，实现了哺乳动物的同性繁殖，未来为拯救仅存单一性别的濒危哺乳动物提供了可能性，有利于相关科学研究发展，D正确。 故选A。 3．（2025·北京朝阳·一模）胚胎干细胞（ES）需接种在单层的饲养层细胞上才能保持未分化状态并增殖。向培养液中添加白血病抑制因子（LIF）可代替饲养层细胞的作用。相关叙述错误的是（    ） A．饲养层细胞增殖时会发生接触抑制 B．饲养层细胞能与ES进行信息交流 C．LIF可影响ES的基因选择性表达 D．LIF的主要作用是为ES提供营养 【答案】D 【分析】哺乳动物的胚胎干细胞简称ES或EK细胞，是由早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞。ES细胞具有胚胎细胞的特性，在形态上，表现为体积小、细胞核大、核仁明显；在功能上，具有发育的全能性，即可以分化为成年动物体内任何一种组织细胞。 【详解】A、饲养层细胞属于动物细胞，增殖时会发生接触抑制，A正确； B、根据题意：胚胎干细胞（ES）需接种在单层的饲养层细胞上才能保持未分化状态并增殖。向培养液中添加白血病抑制因子（LIF）可代替饲养层细胞的作用，可以推测饲养层细胞能与ES进行信息交流，B正确； C、向培养液中添加白血病抑制因子（LIF）可代替饲养层细胞的作用，即让胚胎干细胞（ES）保持未分化状态并增殖，因此LIF可影响ES的基因选择性表达，C正确； D、LIF的主要作用是给ES传递信息，D错误。 故选D。 4．某科研小组欲通过克隆技术实现优质肉牛的快速繁殖，如图为利用体细胞核移植技术克隆优质肉牛的实验流程。下列叙述错误的是（    ） A．获得克隆动物属于无性生殖，原理是已分化动物体细胞的细胞核具有全能性 B．供体细胞培养需在无菌无毒环境中进行，且需添加5%CO2维持培养液的pH C．①为显微操作去核，②为胚胎移植，移植前代孕母牛需进行同期发情处理 D．克隆牛的遗传物质一半来自优质肉牛，一半来自供体母牛，具有二者优良性状 【答案】D 【分析】体细胞核移植技术的应用： （1）畜牧业：可以加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育； （2）保护濒危物种：可望利用体细胞核移植技术增加濒危动物的存活数量； （3）医药卫生：转基因克隆动物可作为生物反应器，生产珍贵医用蛋白；转基因克隆动物细胞、组织和器官可作为异种移植的供体；人的核移植胚胎干细胞经过诱导分化，形成相应的组织、器官后，可用于组织器官的移植； （4）其他领域：研究克隆动物和克隆细胞可使人类深入了解胚胎发育及衰老过程，用克隆动物做疾病模型能使人们更好追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病；存在问题：成功率低，克隆技术的各个环节有待进一步改进，绝大多数克隆动物还存在健康问题，许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大、异常肥胖、发育困难、脏器缺陷、免疫失调等；对克隆动物食品的安全性问题也存有争议。 【详解】A、克隆动物是通过体细胞核移植技术获得，没有经过两性生殖细胞的结合，属于无性生殖。其原理是已分化动物体细胞的细胞核含有该物种生长发育所需的全套遗传物质，具有全能性，A正确； B、供体细胞培养时，为防止杂菌污染，需在无菌无毒环境中进行。添加5%CO2，CO2溶于水形成碳酸，可维持培养液的pH稳定，B正确； C、①是从供体母牛的卵母细胞中去除细胞核，常用显微操作法；②是将发育良好的早期胚胎移植到代孕母牛子宫内，即胚胎移植，移植前代孕母牛需进行同期发情处理，使供体和受体生殖器官的生理变化相同，为胚胎移入受体提供相同的生理环境 ，C正确； D、克隆牛的细胞核遗传物质来自优质肉牛，细胞质遗传物质来自供体母牛的去核卵母细胞，所以克隆牛的性状主要与提供细胞核的优质肉牛相似，而不是遗传物质一半来自优质肉牛，一半来自供体母牛，D错误。 故选D。 5．自养微藻绿色巴夫藻能够产生不饱和脂肪酸EPA和DHA，兼养（既能自养又能异养）微藻四鞭藻只能产生EPA。科研人员利用PEG诱导两种微藻的原生质体融合，经过筛选获得了融合藻株。下列叙述错误的是（    ） A．制备原生质体前需利用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁 B．原生质体融合具有随机性，只考虑两两融合最多有4种细胞 C．PEG融合法可用于诱导植物原生质体融合和动物细胞融合 D．原生质体融合技术有助于打破生殖隔离、实现远缘杂交育种 【答案】B 【分析】植物体细胞杂交是指将植物不同种、属，甚至科间的原生质体通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术。植物细胞具有细胞壁，未脱壁的两个细胞是很难融合的，植物细胞只有在脱去细胞壁成为原生质体后才能融合，所以植物的细胞融合也称为原生质体融合。 【详解】A、微藻为植物，细胞壁的组成为纤维素和果胶，制备原生质体前需利用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，A正确； B、原生质体融合具有随机性，只考虑两两融合最多有3种细胞，即绿色巴夫藻+绿色巴夫藻、四鞭藻+四鞭藻、绿色巴夫藻+四鞭藻，B错误； C、PEG融合法、电刺激法等都可用于诱导植物原生质体融合和动物细胞融合，动物细胞融合还能用灭活的病毒，C正确； D、原生质体融合技术是借助于细胞膜的流动性实现植物细胞的融合，有助于打破生殖隔离、实现远缘杂交育种，D正确。 故选B。 6．体细胞核移植技术在推动我国肉牛遗传育种发展上起到关键作用，下列有关叙述错误的是（    ） A．供体细胞需来自遗传性状优良的个体 B．采用紫外线短时间照射卵母细胞可达到去核的目的 C．利用Ca2+载体或电刺激可激活重构胚 D．选择原肠胚进行胚胎分割可提高胚胎利用率 【答案】D 【分析】动物细胞核移植是指将动物的一个细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。原理是动物细胞核的全能性。 【详解】A、体细胞核移植中，供体细胞的遗传性状决定了克隆个体的主要遗传特征，因此供体细胞需来自优良个体，A正确； B、卵母细胞的去核通常采用显微操作法（物理去除细胞核），此外采用紫外线短时间照射卵母细胞也可达到去核的目的，B正确； C、激活重构胚的常用方法包括电刺激和Ca2+载体，这些方法模拟精子入卵后的激活过程，C正确； D、胚胎分割应选择桑葚胚或囊胚阶段，此时细胞全能性高，分割后成活率高。原肠胚细胞已分化，分割后难以发育为完整个体，因此选择原肠胚无法提高胚胎利用率，D错误。 故选D。 7．PSMA是一种在前列腺癌变细胞中高度表达的蛋白质。CD28是一种细胞表面受体，主要在T细胞的激活和免疫应答中起关键作用。某实验室构建了 PSMA 和CD28的双特异性单克隆抗体，旨在让T细胞定向杀伤前列腺癌变细胞。下列叙述正确的是（　　） A．可让同时产生抗 PSMA 和抗CD28的抗体的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞结合，以获得杂交瘤细胞 B．对杂交瘤细胞进行抗体——抗原检测时，可向培养基中加入PSMA或CD28 C．T细胞定向杀伤前列腺癌变细胞体现了机体的免疫防御功能 D．PSMA的合成是基因选择性表达的一种体现 【答案】D 【分析】单克隆抗体：由单个B淋巴细胞进行无性繁殖形成的细胞系所产生出的化学性质单一、特异性强的抗体。具有特异性强、灵敏度高，并可能大量制备的特点。单克隆抗体的制备过程：首先用特定抗原注射小鼠体内，使其发生免疫，小鼠体内产生具有免疫能力的B淋巴细胞。利用动物细胞融合技术将B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，单克隆抗体制备过程中的两次筛选：第一次筛选：利用特定选择培养基筛选，获得杂交瘤细胞，即AB型细胞（A为B淋巴细胞，B为骨髓瘤细胞），不需要A、B、AA、BB型细胞。第二次筛选：利用多孔板法和抗原-抗体杂交法筛选，获得产生特定抗体的杂交瘤细胞。 【详解】A、一个B淋巴细胞只能产生一种抗体，所以抗PSMA和抗CD28的抗体由不同的B淋巴细胞产生，A错误； B、对杂交瘤细胞进行抗体-抗原检测时，应向多孔板中同时加入放射性标记或荧光标记的PSMA和CD28，检测是否产生双特异性抗体，B错误； C、T细胞定向杀伤前列腺癌变细胞体现了机体的免疫监视功能，C错误； D、PSMA只在前列腺癌变细胞中高度表达，在其他细胞中不表达或低表达，这是基因选择性表达的一种体现，D正确。 故选D。 8．2024年9月25日，我国科学家邓宏魁研究团队在国际上首次报告了利用化学重编程诱导多能干细胞（CiPS）制备的胰岛细胞移植，实现了1型糖尿病的临床功能性治愈。具体治疗过程见下图，下列有关说法错误的是（    ） A．脂肪细胞变为CiPS细胞与CiPS细胞变为胰岛细胞，两者的实质是基因选择性表达 B．脂肪细胞变为CiPS细胞的过程与植物组织培养中的脱分化过程，是类似的 C．上图中的脂肪细胞、CiPS细胞、胰岛细胞的核DNA，是完全相同的 D．该治疗过程说明细胞分化具有可逆性，分化后的细胞在体内可恢复为初始状态 【答案】D 【分析】科学家已尝试采用多种方法来制备iPS细胞，包括借助载体将特定基因导入细胞中，直接将特定蛋白导入细胞中或者用小分子化合物等来诱导形成iPS细胞。iPS细胞最初是由成纤维细胞转化而来的，后来发现已分化的T细胞、B细胞等也能被诱导为iPS细胞。 【详解】A、脂肪细胞变为CiPS 细胞，是关键基因表达的结果，是一种基因选择性表达，而CiPS细胞变为胰岛细胞也是一种基因选择性表达，A正确； B、植物组织培养中的脱分化过程，是使组织细胞恢复全能性，而脂肪细胞变为CiPS细胞的过程也是恢复细胞全能性功能的过程，B正确； C、据图可知，图中的脂肪细胞经诱导变成CiPS细胞，CiPS细胞再分化成胰岛细胞，过程中并没有改变细胞的核DNA，故脂肪细胞、CiPS细胞、胰岛细胞的核DNA都是相同的，C正确； D、分化后的细胞在机体内，由于受细胞间相互作用影响等因素，导致其不能再恢复为初始状态，D错误。 故选D。 9．马铃薯四倍体栽培种（4n=48）易感染青枯病，而马铃薯野生型（2n=24）有青枯病抗性基因，科研人员利用图示操作技术培养了抗病型马铃薯栽培种。下列说法正确的是（　　）    A．制备原生质体时需要用胰蛋白酶将植物细胞分散成单个细胞 B．诱导原生质体融合时可以在无菌水中采用PEG融合法或电融合法 C．可以通过镜检观察染色体数目来初步筛选含青枯病抗病基因的融合原生质体 D．抗病型马铃薯栽培种为异源三倍体植株，因联会紊乱不能形成配子 【答案】C 【分析】体细胞杂交又称体细胞融合，指将两个原生质体不同的体细胞融合成一个体细胞的过程。融合形成的杂种细胞，兼有两个细胞的染色体，而后通过植物组织培养技术将杂种细胞培养成杂种植株，该过程利用的原理是植物细胞的全能性，即植物体细胞杂交的原理是细胞膜的流动性和植物细胞的全能性。 【详解】A、制备原生质体时需要用纤维素酶和果胶酶将植物细胞的细胞壁分解获得原生质体，A错误； B、诱导原生质体融合时可以在一定浓度的溶液中（植物细胞的等渗液或较高渗）采用PEG融合法或电融合法，否则会导致原生质体吸水涨破，B错误； C、根据题意可知，融合原生质体中含有的染色体数目为70，因而可以通过镜检观察染色体数目来初步筛选含青枯病抗病基因的融合原生质体，C正确； D、抗病型马铃薯栽培种为异源六倍体植株，其减数分裂过程中不会发生联会紊乱，D错误。 故选C。 10．在保护粤东黑猪遗传资源的各项生物技术中，体细胞核移植技术因具有继承亲本性状完整、实验周期短、保种效力强的优点而备受关注，下图为部分操作流程。有关分析错误的是（　　） A．需从卵巢中获取卵母细胞并培养至MⅡ期 B．蛋白酶合成抑制剂可用于激活重构胚 C．重构胚移植前需对杜洛克母猪进行同期发情处理 D．仔猪的遗传物质有少部分来自杜洛克母猪 【答案】D 【分析】动物细胞核移植技术是将动物一个细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，使这个重新组合的细胞发育成新胚胎，继而发育成动物个体的技术。 【详解】A、进行核移植时需用培养至MⅡ期的卵母细胞，此时的卵母细胞的细胞质中有促进细胞核全能性发挥的物质，A正确； B、蛋白酶合成抑制剂可用于激活重构胚，此外钙离子载体、乙醇等也可用于激活重构胚，B正确； C、重构胚移植前需对杜洛克母猪进行同期发情处理，其目的是为了使移入的胚胎在相同生理状态下存活，C正确； D、仔猪的核遗传物质来自粤东黑猪，细胞质遗传物质来自提供卵母细胞的小耳花猪和粤东黑猪，D错误。 故选D。 11．免疫组化（IHC）是通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内的抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，在单克隆抗体制备中有广泛应用。在筛选杂交瘤细胞时，可使用某个针对特定抗体的抗原进行IHC，若杂交瘤细胞产生了目标抗体，则在IHC中可以观察到信号。下列叙述错误的是（    ） A．推测IHC利用了抗体与抗原之间特异性结合的原理 B．单克隆抗体能够准确地识别抗原的细微差异，可用作诊断试剂 C．制备单克隆抗体时，需从分子水平筛选能产生多种抗体的杂交瘤细胞 D．经过IHC筛选后的杂交瘤细胞既能无限增殖，又能分泌目标抗体 【答案】C 【分析】单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。 【详解】A、免疫组化（IHC）是通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内的抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，推测IHC利用了抗体与抗原之间特异性结合的原理，A正确； B、抗体与抗原能特异性结合，单克隆抗体能够准确地识别抗原的细微差异，可用作诊断试剂，B正确； C、制备单克隆抗体时，需从分子水平筛选能产生所需（特定的）抗体的杂交瘤细胞，C错误； D、使用某个针对特定抗体的抗原进行IHC，筛选后的杂交瘤细胞既能无限增殖，又能分泌目标抗体，D正确。 故选C。 12．科研团队为了研究番茄抗虫基因（SIJA2）的功能，进行了相关实验。图1为SUJA2基因过表达番茄（OE）构建的过程，图2为SIJA2基因敲除突变番茄（KO）构建的部分过程。    (1)图1中，为保证过程①获得的SIJA2基因与载体正确连接形成重组质粒，需在SIJA2基因上游添加限制酶 的识别序列；在过程 用钙离子可以提高SLJA2基因导入受体细胞的几率。在过程⑤中需通过调整 （填激素名称）的比例获得SIJA2基因过表达番茄（OE）。 (2)图2中，要准确敲除SLJA2基因，需设计正确的向导RNA（sgRNA），才能准确引导Cas9蛋白切割SLJA2基因。设计sgRNA需要的信息及运用的原理是 。 (3)科研人员将OE、KO以及未处理（WT）三组番茄进行一系列实验，定期测量相关数据，记录于下表：（注：“+”的数目代表程度或数量变化） 组别 SIJA2基因表达量 抗虫性 生长速率 产量 OE +++ +++ +++ ++++ KO - + + + WT + ++ ++ ++ 与WT组相比，实验组OE组和KO组的设置分别采用了自变量控制中 、 （填科学方法）。据表分析SLJA2基因的表达量及性状的变化，可以得出结论： （答2点）。 【答案】(1) BamH I ③ 生长素和细胞分裂素 (2)SlJA2基因的碱基序列、碱基互补配对原则 (3) 加法原理 减法原理 基因的数量影响基因的表达量；一种基因可以控制多种性状 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）分析题图，图1中，过程①获得的SIJA2基因为逆转录。由于目的基因“必须添加在T-DNA区段，并且位于启动子和终止子”之间，不能用NdeⅠ切，因为可把质粒切为两段，不能用XhoⅠ切，因为下游添加相应限制酶后，会把潮霉素抗性基因切掉，若上游为SmaⅠ限制酶，则无法找到下游的限制酶。因此为保证获得的SIJA2基因与载体正确连接形成重组质粒，需在目的基因上游添加限制酶BamH I，下游添加SmaⅠ限制酶；在过程③将重组质粒导入农杆菌，需要用钙离子可以提高SLJA2基因导入受体细胞的几率。在过程⑤再分化中需通过调整生长素和细胞分裂素的比例获得SIJA2基因过表达番茄（OE）。 （2）sgRNA需要与目标基因(SLJA2基因)的特定序列互补配对，以确保精准识别和结合；Cas9蛋白需要在目标序列附近存在PAM序列(通常为NGG)才能进行切割，sgRNA通过碱基互补配对原则识别目标DNA序列，并引导Cas9蛋白在PAM序列上游的特定位置进行双链断裂(DSB)，从而实现对目标基因的敲除。 （3）实验组OE组通过增加SLJA2基因的表达量来观察其功能，采用了自变量控制中加法原理；实验组KO组通过完全抑制SLJA2基因的表达来观察其功能缺失的影响，采用了自变量控制中减法原理；据表分析，SLJA2基因的表达量与抗虫性、生长速率和产量呈正相关：OE组中SLJA2基因表达量最高，抗虫性、生长速率和产量也最高；KO组中SLJA2基因表达缺失，这些性状均显著下降，由此可知基因的数量影响基因的表达量；一种基因可以控制多种性状。 题型2 基因工程 1．（2025·北京房山·一模）高中生物学实验中，有关酒精的使用错误的是（    ） A．在脂肪检测实验中，用酒精溶液洗去多余染液 B．利用无水乙醇对绿叶中的色素进行提取和分离 C．在植物组织培养中，用酒精对外植体进行消毒 D．利用不同物质在酒精溶液中溶解性的差异粗提DNA 【答案】B 【分析】酒精是生物实验常用试剂之一，如检测脂肪实验中需用体积分数为50%的酒精溶液洗去浮色；观察植物细胞有丝分裂实验和低温诱导染色体数目加倍实验中都需用体积分数为95%的酒精对材料进行解离；绿叶中色素的提取和分离实验中需用无水酒精来提取色素；果酒和果醋制作实验中可用体积分数为70%的酒精进行消毒，DNA的粗提取和鉴定中可以体积分数为95%的冷酒精进一步纯化DNA等。 【详解】A、在脂肪检测实验中，染色后需要用50%的酒精溶液洗去浮色，即洗去多余染液。因为苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ染液能将脂肪染成橘黄色或红色，而染液会附着在细胞表面等，不洗去多余染液会干扰后续对脂肪颗粒的观察，A正确； B、在绿叶中色素的提取和分离实验中，利用无水乙醇提取色素，这是因为色素能够溶解在无水乙醇等有机溶剂中；而分离色素使用的是层析液，层析液是由20份石油醚、2份丙酮和1份苯混合而成，不是用酒精进行分离，B错误； C、在植物组织培养中，为防止杂菌污染，需要对外植体进行消毒，常用70%的酒精对外植体进行消毒处理，C正确； D、在DNA粗提取实验中，利用DNA不溶于酒精溶液，而细胞中的某些蛋白质等其他物质能溶于酒精溶液的原理，向含有DNA的滤液中加入冷却的酒精溶液，可以使DNA析出，从而实现对DNA的粗提取，D正确。 故选B。 2．（2025·北京顺义·一模）转基因抗虫棉的Bt蛋白在细胞质积累，可能与内源蛋白相互作用，产生非期望效应。C蛋白能结合纤维素，科研人员将C基因与Bt基因连接构建融合基因（如图）导入棉花细胞。相关叙述正确的是（    ） A．使用DNA聚合酶催化C基因和Bt基因连接 B．选择引物2和4进行PCR以确定基因正确连接 C．可通过花粉管通道法将融合基因导入棉花细胞 D．融合基因表达可促进Bt蛋白在细胞膜定向积累 【答案】C 【分析】基因工程需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定；构建基因表达载体就是要让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使目的基因能够表达和发挥作用，这一步是基因工程的核心工作。 【详解】A、DNA聚合酶的功能是催化DNA链的延伸（如PCR中），而连接两个基因需要的是DNA连接酶（如T4 DNA连接酶），因此使用DNA连接酶催化C基因和Bt基因连接，A错误； B、PCR检测融合基因时，需选择位于两个基因外侧的引物（如C基因上游和Bt基因下游），确保仅当基因正确连接时才能扩增出目标片段，因此选择引物1和4进行PCR才可以确定基因正确连接，B错误； C、花粉管通道法通过将外源DNA直接导入花粉管，利用受精过程将基因整合到胚胎细胞中，因此可通过花粉管通道法将融合基因导入棉花细胞，C正确； D、C蛋白能结合纤维素（主要存在于细胞壁），融合基因表达后，Bt蛋白通过与C蛋白的结合被定向至细胞壁附近，减少细胞质中的积累，从而避免非期望效应，D错误。 故选C。 3．（2025·北京通州·模拟预测）孟德尔说：“任何实验的价值和效用，取决于所使用材料对于实验目的的适合性。”下列实验材料选择不适合的是（　　） A．用洋葱鳞片叶提取和分离叶绿体中色素 B．用洋葱根尖分生区观察细胞的有丝分裂 C．用洋葱鳞片叶表皮观察细胞的质壁分离 D．用洋葱鳞片叶进行DNA的粗提取与鉴定 【答案】A 【分析】洋葱是比较好的实验材料：①洋葱根尖分生区细胞观察植物细胞的有丝分裂；②洋葱鳞片叶外表皮细胞，色素含量较多，用于观察质壁分离和复原；③洋葱的绿叶做叶绿体中色素的提取和分离实验，叶肉细胞做细胞质流动实验。④洋葱的内表皮细胞颜色浅、由单层细胞构成，适合观察DNA、RNA在细胞中的分布状况。 【详解】A、洋葱鳞片叶不含叶绿体，不能用来提取和分离叶绿体中的色素，A错误； B、洋葱根尖分生区细胞分裂旺盛，可以用来观察细胞有丝分裂，B正确； C、洋葱鳞片叶外表皮细胞的液泡为紫色，便于观察细胞的质壁分离和复原现象，C正确； D、洋葱鳞片叶细胞有细胞核且颜色浅，可以用来粗提取DNA，D正确。 故选A。 4．下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（    ） A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会升高 B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C．DNA在不同浓度NaC1溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可用于DNA的鉴定 【答案】A 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理： （1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。 （2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A错误； B、DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可分离DNA，B正确； C、DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确； D、在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，D正确。 故选A。 5．赖氨酸可促进人体发育、增强免疫力，并能提高中枢神经系统的功能。科研人员欲将玉米种子中的某种蛋白酶改造成M酶，M酶通过催化生成赖氨酸的相应代谢过程，从而大大提高玉米种子中赖氨酸的含量，以培育出高赖氨酸含量的玉米新品种。下列有关叙述正确的是（　　） A．赖氨酸是人体的必需氨基酸，M酶中赖氨酸含量高，从而提高了玉米新品种中的赖氨酸含量 B．上述改造属于蛋白质工程，即根据M酶功能设计其分子结构来直接改造M酶的氨基酸序列 C．利用PCR技术可在体外大量扩增M酶基因，再将扩增出的M酶基因直接导入玉米细胞 D．若利用农杆菌转化法导入M酶基因，需将其插入Ti质粒的T-DNA中以整合到玉米的染色体上 【答案】D 【分析】蛋白质工程指以蛋白质的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行基因改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需要。蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。 【详解】A、M酶通过催化生成赖氨酸的相应代谢过程，使玉米新品种的赖氨酸含量提高，M酶中赖氨酸含量不一定高，A错误； B、题述改造属于蛋白质工程，需根据M酶的功能设计分子结构，再改造M酶基因的碱基序列，最终改造M酶的氨基酸序列，B错误； C、利用PCR技术可在体外大量扩增M酶基因，扩增出的M酶基因需要先构建基因表达载体，再导入玉米细胞，C错误； D、在基因工程中，农杆菌转化法是一种常用的将外源基因导入植物细胞的方法。其中，Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，它含有T-DNA区域，这个区域可以整合到植物细胞的染色体上。因此，想将M酶基因导入玉米细胞并整合到其染色体上，就需要将M酶基因插入Ti质粒的T-DNA区域中。这样，当农杆菌感染玉米细胞时，T-DNA（包括其中的M酶基因）就会被整合到玉米细胞的染色体上，D正确。 故选D。 6．（2025·北京房山·一模）肿瘤细胞表面的PD-L1蛋白与T细胞表面的受体蛋白PD-1结合，抑制T细胞的活化和增殖，使得肿瘤细胞开启免疫逃逸。为了达到更好的癌症治疗效果，科研人员对此开展系列研究。 (1)机体能通过 免疫杀伤癌细胞，该过程体现了免疫系统的 功能。 (2)科研人员欲通过基因编辑技术（CRISPR-Cas9）敲除T细胞表面的受体蛋白PD-1基因，以达到治疗癌症的目的。 ①基因编辑CRISPR-Cas9技术系统主要由人工设计的gRNA和Cas9蛋白组成，gRNA可与靶序列特异性结合，Cas9蛋白对靶序列所在DNA进行剪切，gRNA和Cas9蛋白复合体的功能类似于 酶。 ②科研人员设计的gRNA能靶向识别PD-1蛋白基因，与携带Cas9基因的PX330质粒构建gRNA重组质粒。其中PX330质粒部分碱基序列及Bbs1限制酶识别序列如图1所示。 据图1分析，限制酶Bhs1切割后质粒b处黏性末端序列（5’→3’）为 。 (3)研究人员以不同的方式处理黑色素肿瘤小鼠（如图2）。 其中注射物Ⅰ为 ，组6的作用为 。图2结果说明 。 (4)CRISPR-Cas9编辑T细胞为肿瘤治疗提供了新思路，有人说“科学技术是一把双刃剑，应当审慎地使用基因编辑技术。”请你辩证分析基因编辑技术可能带来的影响 。 【答案】(1) 细胞 免疫监视 (2) 限制酶/限制性核酸内切酶 G-T-T-T- (3) PX330或空质粒 作为对照，检测基因编辑治疗癌症的效果 淋巴结注射gRNA重组质粒可显著治疗癌症，效果好于肌肉注射和抗体治疗 (4)有利方面：疾病治疗、作物改良、酶的结构改造等…潜在风险：脱靶（误切割）带来的新的未知基因突变或癌变；安全和伦理问题 【分析】基因治疗是把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。大部分基因治疗的临床试验，都是先从病人体内获得某种细胞，进行培养。然后在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩增培养，最后重新输入患者体内，称为体外基因治疗。直接向人体组织细胞中转移基因的治病方法叫体内基因治疗。 【详解】（1）机体杀伤癌细胞依靠细胞免疫过程；免疫系统有三大功能，即免疫防御、免疫自稳和免疫监视，其中监视并清除体内出现的衰老、破损细胞以及癌细胞等异常细胞属于免疫监视功能。 （2）基因编辑CRISPR - Cas9技术中，gRNA与靶序列特异性结合，Cas9蛋白对靶序列所在DNA进行剪切，其功能类似限制酶（限制性核酸内切酶）。 由图1可知，限制酶Bbs1的识别序列是G - G - A - C - T，且切割位点在识别序列的下游，根据DNA单链的5' - 3'方向，切割后质粒5'黏性末端的序列为G - T - T - T - 。 （3）该实验设置了不同处理组，要探究基因编辑治疗癌症的效果，需要有空白对照组，即注射不含gRNA重组质粒的PX330空质粒。 图2中注射物2没有经过基因编辑处理，其作用是作为对照，检测基因编辑治疗癌症的效果。 从图2结果看，淋巴结注射gRNA重组质粒组的肿瘤相对体积明显小于其他组，说明淋巴结注射gRNA重组质粒可显著治疗癌症，效果好于肌肉注射和抗体治疗。 （4）从有利方面考虑，基因编辑技术可以用于疾病治疗，例如对一些遗传疾病进行基因修正；在作物改良上，通过编辑相关基因可以使作物具有更好的抗逆性、更高的产量等；还可以用于酶的结构改造，提高酶的性能等。 从潜在风险方面看，基因编辑过程中可能会出现脱靶（误切割）现象，从而带来新的未知基因突变甚至可能引发癌变；同时也会引发一系列安全和伦理问题，比如对人类生殖细胞进行基因编辑可能改变人类的基因库等。 7．（2025·北京丰台·一模）甘蓝型油菜是我国重要的油料作物之一。黑籽油菜具有耐寒、耐旱、耐盐碱等多种优良性状，黄籽油菜种子含油量（SOC）更高，木质纤维素含量（SLC）更低，二者均可用于甘蓝型油菜的育种。 (1)甘蓝型油菜是油菜（AA，）和甘蓝（CC，）杂交得到的异源四倍体，可通过 形成含有两个 的配子。 (2)目前已克隆的黄籽基因多为隐性基因，限制了甘蓝型油菜黄籽品种的培育。科研人员新发现一株种皮颜色（SCC）为黄色的甘蓝型油菜N，通过杂交实验确认其黄色SCC基因为显性基因，极大加快了甘蓝型油菜黄籽品种的培育进程。 ①从植株N中克隆出基因D。推测D对SCC、SOC和SLC三种性状都有改善作用，为验证此推测，进行如下实验。 实验组1：构建D基因表达载体，导入黑籽油菜中； 实验组2：构建能敲除D基因的表达载体，导入 中； 对照组： 。 ②与对照组相比，实验组2的预期结果为 。 a．SCC变黄  b．SOC升高  c．SLC升高  d．SCC变黑  e．SOC降低  f．SLC降低 (3)甘蓝型油菜种子含油量的部分调控机制如图，D基因在种皮中特异性表达， 苯丙烷、类黄酮生物合成途径， 原花青素和木质纤维素含量，使种皮发生相应变化。    (4)为培育出油量高、且能保持黑籽油菜品系（K）多种优良性状的油菜新品种，请写出杂交育种流程 。 【答案】(1) 减数分裂 染色体组 (2) N 将空质粒分别导入黑籽油菜和N中 cde (3) 抑制 减少 (4)第一步：将黄籽油菜N与黑籽油菜品系K进行杂交，获得F1 第二步：将F1与黑籽油菜品系K回交，从子代中筛选黄籽、含油量高的个体F2 第三步：重复第二步的操作，从子代中筛选黄籽、含油量高的个体F3 第四步：F3自交，从子代中选择稳定遗传的黄籽、高含油量且具有黑籽油菜品系K多种优良性状的油菜新品种 【分析】基因工程技术的基本步骤: (1)目的基因的获取:方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成; (2)基因表达载体的构建:是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等, (3)将目的基因导入受体细胞:根据受体细胞不同，导入的方法也不一样; (4)目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）甘蓝型油菜是异源四倍体（AACC，2n=40），可通过减数分裂形成含有两个染色体组的配子。因为在减数分裂过程中，同源染色体分离，使得染色体数目减半，形成配子时就会含有两个染色体组。 （2）验证D对SCC、SOC和SLC三种性状都有改善作用，实验组1：构建能敲除D基因的表达载体，导入黑籽油菜中。实验组2构建能敲除D基因的表达载体，应该导入种皮颜色（SCC）为黄色的甘蓝型油菜N。 ​对照组：将空质粒分别导入黑籽油菜和N中。设置对照组的目的是为了排除空质粒对实验结果的干扰，以单纯研究D基因对油菜性状的影响。 已知D基因对SCC、SOC和SLC三种性状都有改善作用，即D基因能使SCC变黄、SOC升高、SLC降低。实验组2是敲除D基因，那么会出现与D基因作用相反的结果，即SCC变黑、SOC降低、SLC升高。所以答案选cde。 （3）根据图中的信息，D基因在种皮中特异性表达，抑制苯丙烷、类黄酮生物合成途径，降低原花青素和木质纤维素含量，从而使种皮发生相应变化，最终导致种皮颜色变为黄色，并提高油菜的含油量。 （4）为培育出油量高、且能保持黑籽油菜品系（K）多种优良性状的油菜新品种，杂交育种流程如下：   第一步：将黄籽油菜N与黑籽油菜品系K进行杂交，获得F1； 第二步：将F1与黑籽油菜品系K回交，从子代中筛选黄籽、含油量高的个体F2； 第三步：重复第二步的操作，从子代中筛选黄籽、含油量高的个体F3； 第四步：F3自交，从子代中选择稳定遗传的黄籽、高含油量且具有黑籽油菜品系K多种优良性状的油菜新品种。 8．（2025·北京顺义·一模）学习以下材料，回答（1）～（4）题。 基因编辑技术的变革 CRISPR/Cas9系统是基因编辑技术的常用工具.由Cas9蛋白和人工设计的gRNA构成。gRNA嵌入Cas9的RNA结合区，形成稳定的RNA-蛋白复合体。gRNA可识别目标序列，引导Cas9切断DNA双链。这种情况下，细胞内原有的负责修复DNA切口的酶将“行动”起来，修复断裂的DNA（如图示）。 肝脏合成的蛋白T若发生错误折叠后，会聚集在心脏、神经等组织引发疾病。科学家研发了基于CRISPR/Cas9技术的基因治疗产品，命名为N-2001。该产品包含靶向T基因的gRNA和编码Cas9的mRNA，并由亲肝性脂质体包裹，注射到患者体内，取得一定治疗效果。但gRNA识别的序列短小，可能结合基因组中与目标序列相似的非目标序列，造成脱靶。 Cas9的两个结构域分别负责切割DNA双链中的一条，其中一个结构域失活得到nCas9，只能切割DNA中与gRNA结合的那条链。利用nCas9在目标序列的两条链上产生邻近切口，造成双链断裂，能有效减少脱靶效应。但Cas9和nCas9均是对DNA序列的直接改变，一旦发生错误难以纠正。 若使Cas9的两个结构域同时失活，则获得dCas9，dCas9虽然失去了切割DNA的能力，但仍可在gRNA的引导下定位到特定DNA序列上。以此为基础，我国科研人员通过改造获得“dCas9-Tet1”融合蛋白，将Tet1（去甲基化因子）精确地定位到抑癌基因的启动子区域，激活抑癌基因表达。研究表明，该疗法治疗的肺癌模型小鼠，抑癌基因的表达量显著升高，癌细胞增殖迁移能力均明显降低。dCas9基因编辑技术通过改变特定位点的DNA甲基化修饰，调控基因表达，为相关疾病的治疗提供了新思路。 (1)以含Cas9基因的重组质粒为模板，通过 技术扩增得到含Cas9基因的线性DNA片段，在体外转录出Cas9mRNA。 (2)由文中信息可知，N-2001输入到患者体内后，在无外源模板的情况下，其发挥作用的过程是:脂质体进入肝细胞后降解并释放Cas9mRNA→ → →T基因被Cas9剪切发生 →T蛋白含量降低。 (3)切割DNA双链时，nCas9比Cas9脱靶概率低的原因是 。 (4)DNMT是一种作用于基因启动子区域的DNA甲基化酶，通过研究确定了编码DNMT催化结构域的基因序列。请在N-2001基础上，设计一种基因编辑疗法的产品，实现对肝细胞内T基因表达的抑制 。    【答案】(1)PCR (2) 合成Cas9蛋白 gRNA引导Cas9定位到T基因 突变 (3)nCas9切割双链产生邻近切口，需两种gRNA分别识别目标基因两条链的两段序列 (4)靶向T基因启动子的gRNA+编码dCas9-DNMT融合蛋白的mRNA+亲肝性脂质体 【分析】CRISPR/Cas9系统由Cas9蛋白和人工设计的gRNA构成。在gRNA引导下，gRNA通过碱基互补配对原则特异性结合目的基因序列，然后Cas9与靶序列结合并将DNA双链切断，对真核细胞的基因组进行特异编辑。 【详解】（1）以含Cas9基因的重组质粒为模板，通过PCR技术扩增得到含Cas9基因的线性DNA片段，而后在体外转录出Cas9mRNA，为定向切割DNA做准备。 （2）由文中信息可知，N-2001输入到患者体内后，在无外源模板的情况下，其发挥作用的过程是：脂质体进入肝细胞后降解并释放Cas9mRNA→合成Cas9蛋白→gRNA引导Cas9蛋白定位到T基因→T基因被Cas9剪切发生突变→T蛋白含量降低，进而发生性状改变。 （3）切割DNA双链时，nCas9切割双链产生邻近切口，需两种gRNA分别识别目标基因两条链的两段序列，因此nCas9特异性更强，因而比Cas9脱靶概率低。 （4）DNMT是一种作用于基因启动子区域的DNA甲基化酶，启动子的甲基化会导致基因表达受阻，进而引起T基因编码蛋白质减少，根据该思路设计使T基因的启动子发生甲基化，因此，通过研究确定了编码DNMT催化结构域的基因序列，在N-2001基础上，设计靶向T基因启动子的gRNA+编码dCas9-DNMT融合蛋白的mRNA+亲肝性脂质体，进而实现T基因启动子甲基化。 9．（2025·北京朝阳·一模）番茄的花是两性花，杂交育种时需进行去雄操作.耗时费力且难以避免自交污染。我国研究者利用基因工程技术开发了雄性不育番茄品系，提高了番茄杂交育种的效率。 (1)研究者选择性状优良的WT品系番茄，对在雄蕊中特异性表达的S基因进行编辑，获得S基因中增加一个碱基对的纯合突变体甲。甲花粉不成活。甲与WT杂交，F1育性正常。F1自交，F2中216株育性正常，68株雄性不育。这表明甲的雄性不育性状属于 性状，该性状的遗传遵循分离定律。 (2)为了确认雄性不育是由S基因编辑导致的，研究者使用了一种竞争性等位基因特异性PCR，该PCR体系同时含3种引物和4种探针（如图）。探针的荧光基团与淬灭基团分离时显现荧光。 ①引物3'末端与模板的严格配对对于子链的延伸至关重要。引物I和引物II的3'末端碱基分别是 。该PCR体系从第 个循环开始，复性环节中带有荧光基团的探针与模板链结合，作为引物在延伸环节中掺入子链，使产物显现荧光。 ②用该体系对F2的基因组DNA进行PCR检测，育性不同植株的检测结果为 ，证实雄性不育性状是由S基因编辑导致的。 (3)甲无法自交保种。研究者将控制子叶为紫色的显性基因与WT型的S基因插入Ti质粒的T-DNA中，两基因紧密相邻。用农杆菌转化法导入甲，获得育性恢复的纯合品系乙。请写出用甲和乙为材料，连续生产甲的最简杂交方案。 (4)研究者在野生番茄中发现一个抗病基因，拟用杂交方法将此基因引入到甲、乙品系中。从操作的简便性出发，应将抗病基因先引入甲还是乙？请说明理由。 。 【答案】(1)隐性 (2) G、A 3 雄性不育株PCR产物发绿色荧光.育性正常株1/3发红色荧光，2/3发红、绿荧光 (3)甲与乙杂交获得F1，F1与甲杂交，选出子代中绿色子叶幼苗即为甲。子代中紫色子叶幼苗继续种植以备连续生产甲。 (4)应先引入甲。与甲进行杂交和多代回交不用去雄。 【分析】基因工程四步骤包括：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与表达。分析题图可知，过程①为逆转录，过程②为限制性核酸内切酶切割，过程③为目的基因扩增，过程④为将目的基因导入受体细胞，过程⑤为目的基因的检测鉴定。 【详解】（1）甲花粉不成活。甲与WT杂交，F1育性正常，说明不育为隐性性状。 （2）①引物I和引物II分别与野生型和突变型S型基因结合，相对于野生型的S基因，突变型的S基因中增加一个碱基对A-T，引物与模板链互补配对，且从子链从引物的3'端开始延伸，为了更好地区分突变型和野生型的S基因，因此在引物I和引物II的3'末端碱基分别是G、A；该PCR体系同时含3种引物和4种探针，是一种竞争性等位基因特异性PCR，第1次循环以基因为模板，引物I、引物Ⅲ或引物II、引物Ⅲ扩增突变型S基因，第一轮PCR结束后加入的引物I或II在子链中，第二次PCR引物I、引物Ⅲ或引物II、引物Ⅲ扩增第一次复制得到的突变型S基因，第二轮PCR结束后可以得到引物I、引物Ⅲ或引物II、引物Ⅲ的子链，第三轮PCR开始，引物I或引物II会特异性地与含有引物I或引物II的模板链结合，而带有荧光基团的探针是引物的一部分，因此该PCR体系从第3个循环开始，复性环节中带有荧光基团的探针与模板链结合，作为引物在延伸环节中掺入子链，使产物显现荧光。②F1自交（假设用A表示野生型S基因，a表示突变型S基因），F2中216株育性正常（1/3AA、2/3Aa），68株雄性不育（1/3aa），若雄性不育性状是由S基因编辑导致的，则用该体系对F2的基因组DNA进行PCR检测，雄性不育株（仅含突变型S基因，只能与探针3结合）PCR产物发绿色荧光，育性正常株（均为野生型S基因，只与探针1结合）1/3发红色荧光，2/3发红、绿荧光（含有野生型S基因和突变型S基因，既可以与红色探针结合，也可以与绿色探针结合）。 （3）研究者将控制子叶为紫色的显性基因与WT型的S基因插入Ti质粒的T-DNA中，两基因连锁，用农杆菌转化法导入甲，获得育性恢复的纯合品系乙，甲与乙杂交获得F1，F1与甲杂交，选出子代中绿色子叶幼苗即为甲。子代中紫色子叶幼苗继续种植以备连续生产甲。 （4）甲花粉不成活，应先引入甲，与甲进行杂交和多代回交不用去雄。 10．（2025·北京丰台·一模）高粱是重要的粮食和经济作物。为加速其遗传改良进程，科研人员对载体系统的构建进行了系列研究。 (1)目的基因进入受体细胞，并在受体细胞内维持稳定和 的过程称为转化。已有研究发现，过表达植物发育调节因子（WUS、BBM、GRF、GIF等）可有效提高转化效率。 (2)科研人员欲利用上述四种调节因子加速高粱的遗传改良，构建了图1所示的三种载体，其中LB和RB分别是T-DNA的左右边界，DsRed和NPTⅡ作为 用于筛选转化成功的受体细胞，每个插入单位均需含有 。GIF是GRF的辅助因子，从蛋白质结构和功能角度推测GRF-GIF以融合基因的形式插入的原因是 。    将三种载体分别导入高粱胚中，统计结果如下表。 组别 载体 胚 愈伤组织 存活率（%） 带芽的愈伤组织 再生率（%） 转化效率（%） 1 对照载体 121 56 46.28 8 14.29 6.61 2 WUS+BBM 98 55 56.12 21 38.18 21.43 3 GRF-GIF 96 46 47.92 25 54.35 26.04 ①转化效率的计算公式为 。 ②结果显示WUS+BBM的存活率高而转化效率低，GRF-GIF则相反。对此合理的解释是 。 ③观察3月龄植物生长状况，发现WUS+BBM会造成叶片扭曲、生育能力降低等生长缺陷，而GRF-GIF与对照组相比没有明显差异，说明 。 (3)科研人员欲将CRISPR-Cas9引入上述载体系统，建立一个高效的基因编辑工具。请在图2中补充相关元件 。（CRISPR-Cas9基因编辑技术是通过人工设计的sgRNA来识别目的基因序列，并引导Cas9蛋白有效切割DNA双链，切割后DNA修复会造成基因敲除或敲入等，实现对目标基因的编辑。）    【答案】(1)表达 (2) 标记基因 启动子、终止子 GIF表达产物能改变GRF蛋白的空间结构，增强其提高转化效率的作用 转化效率=（带芽的愈伤组织数量 / 胚的数量）× 100% 外源基因的转化和表达可能会对原有基因的功能造成不同程度的影响 GRF-GIF嵌合蛋白在提高转化效率的同时，不会对植株的正常生长和发育产生明显的负面影响，而WUS+BBM的表达则可能导致植株生长异常 (3)   【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建（核心）；（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）目的基因进入受体细胞，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化，转化不仅仅是目的基因的进入和稳定存在，还包括其在受体细胞内的表达，这样才能实现预期的生物学功能。 （2）据题干信息“DsRed是红色荧光基因，NPTⅡ是新霉素抗性基因”可知，DsRed和NPTⅡ作为标记基因用于筛选转化成功的受体细胞；插入单位需要包含启动子、目的基因（如WUS、BBM、GRF-GIF等）和终止子，以确保基因在受体细胞中的正确表达；已知GIF是GRF的辅助因子，GRF-GIF以融合基因形式插入可以确保GIF表达产物能作用于GRF的表达产物（GRF蛋白），改变GRF蛋白的空间结构，从而提高转化效率； ①据表中数据可知，转化效率的计算公式为（带芽的愈伤组织数量 / 胚的数量）× 100%； ②结果显示WUS+BBM的存活率高而转化效率低，GRF-GIF则相反，说明外源基因的转化和表达可能会对原有基因的功能造成不同程度的影响； ③观察3月龄植物生长状况，发现WUS+BBM会造成叶片扭曲、生育能力降低等生长缺陷，而GRF-GIF与对照组相比没有明显差异，说明GRF-GIF嵌合蛋白在提高转化效率的同时，不会对植株的正常生长和发育产生明显的负面影响，而WUS+BBM的表达则可能导致植株生长异常。 （3）据题干信息可知，基因编辑工具需要特异性的sgRNA序列，Cas9蛋白质基因组成，由（2）中可知，GRF-GIF融合基因能提高转化率，且对植物的生长状况无影响，故可选择该载体系统进行构建CRISPR-Cas9基因编辑工具，相关元件如图所示：  。 11．基因敲除是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。科学家常借助基因敲除技术，使特定的基因功能丧失，从而使部分功能被屏蔽，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。基于同源序列，来源于λ噬菌体的Red系统可通过同源重组的方式实现大肠杆菌等一系列工程菌的基因敲除。 (1)Red同源重组由λ噬菌体的exo、bet、gam3个基因组成，分别编码EXO、BET、GAM3种蛋白质，EXO为双链核酸外切酶，可以结合在双链DNA的末端，从5'向3'降解DNA单链，产生 （选填“3'”或“5'”）黏性末端；BET结合在exo外切产生的末端单链上，促进其与受体细胞内正在复制的靶序列进行同源重组，替换靶基因；GAM蛋白能够抑制受体细胞内核酸外切酶活性，进而 （选填“抑制”或“促进”）受体细胞对外源DNA的降解。 (2)Red同源重组技术要用到质粒pKD46，该质粒含有温度敏感型的复制起点oriR101，在30℃培养时可以正常复制，而高于37℃时会自动丢失；还有由ParaB启动子调控的exo、bet、gam基因，需要L-阿拉伯糖诱导表达。λ-Red系统介导的基因敲除过程如下图所示。      ①首先，要将pKD46导入处于 （某种状态）的大肠杆菌，为使pKD46在细菌内正常复制、Red重组酶正常合成，必须满足 的培养条件。过程I能用含有青霉素的培养基筛选成功导入了pKD46的大肠杆菌，这说明 。 ②然后，用PCR技术扩增卡那霉素抗性基因，PCR引物由两部分组成，靠近5'端的区域为 的序列，靠近3'端的区域与模板DNA互补，将获得的线性DNA片段导入大肠杆菌，通过同源重组将大肠杆菌基因组DNA上的特定靶基因敲除。 ③为筛选出同源重组成功（即靶基因被敲除）的大肠杆菌，过程Ⅱ所用的培养基需加入 ；然后再通过 ，把质粒pKD46除去。 (3)上述操作使得大肠杆菌基因组DNA上的靶基因被卡那霉素抗性基因取代，若想将卡那霉素抗性基因也清除，需要借助于FLP/FRT位点特异性重组系统。FRT是有方向性的，不同方向FRT位点经重组酶FLP作用结果不同，具体如下图所示。因此在PCR扩增卡那霉素抗性基因时需在该基因______。（填字母）    A．左侧引入一个FRT位点 B．右侧引入一个FRT位点 C．两侧引入两个同向的FRT位点 D．两侧引入两个反向的FRT位点 (4)确定靶基因敲除成功且pKD46除去后，再引入温敏型（温度过高时质粒丧失复制能力）质粒pCP20表达重组酶FLP，表达方式是热启动。请说明使用pCP20的优势： 。 【答案】(1) 3' 抑制 (2) 能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 培养温度为30℃(低于 37℃)、培养基中含 L阿拉伯糖 实验用大肠杆菌不含青霉素抗性基因，pKD46质粒含有青霉素抗性基因 与靶基因外侧同源(相同) 卡那霉素 在高于37℃的温度下培养 (3)C (4)当培养温度提高时，质粒pCP20表达重组酶FLP，同时丧失复制能力，这样可以将大肠杆菌中的抗性基因和质粒DCP20同时除去 【分析】基因工程技术的基本步骤： （ 1 ）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法，将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）依题意，EXO可以结合在双链DNA的末端，从5'向3'降解DNA单链，故与降解链互补的未被降解的单链留下3'端，产生3′黏性末端；依题意，核酸外切酶能从5'向3'降解DNA单链，GAM蛋白能够抑制受体细胞内核酸外切酶活性，故GAM蛋白能够抑制受体细胞对外源DNA的降解。 （2）①要将pKD46导入大肠杆菌细胞中，大肠杆菌细胞要处于易吸收外源DNA分子的生理状态这种状态，此时大肠杆菌细胞更易被转化。依题意，由ParaB启动子调控的exo、bet、gam基因，需要L-阿拉伯糖诱导表达；质粒pKD46含有温度敏感型的复制起点oriR101，在 30℃培养时可以正常复制，而高于37℃时会自动丢失。因此，为使导入的pKD46在细菌内正常复制、Red重组酶正常合成，必需满足培养温度为 30℃(低于 37℃)且培养基中含 L-阿拉伯糖的条件。过程I是用含有青霉素的培养基筛选成功导入了pKD46的大肠杆菌，这说明实验用大肠杆菌不含青霉素抗性基因且pKD46质粒含有青霉素抗性基因。 ②据图可知，PCR引物由两部分组成，5'端的部分与靶基因外侧同源，3'端的部分与模板DNA互补。 ③同源重组成功(即靶基因被敲除)的大肠杆菌，其应该被替换上卡那霉素抗性基因，因此应用含卡那霉素的培养基进行筛选；质粒pKD46在高于 37℃时会自动丢失，所以应置于 37℃培养，除去质粒pKD46。 （3）要借助于FLP/FRT 位点特异性重组系统将卡那霉素抗性基因清除，根据图示，可以发现应当在卡那霉素抗性基因两侧引入两个同向的 FRT位点，C正确，ABD错误。 故选C。 （4）由题意可知，使用pCP20的优势为：当培养温度提高时，质粒pCP20表达重组酶FLP，同时丧失复制能力，这样可以将大肠杆菌中的抗性基因和质粒pCP20同时除去。 12．大肠杆菌“蓝白斑筛选实验”的原理为：β-半乳糖苷酶（LacZ基因的表达产物）可将无色的X-Gal分解为蓝色物质，使菌落呈现蓝色；若有外源DNA片段插入载体中，则产生白色菌落，质粒载体如图1所示。回答下列问题：    (1)用于构建重组质粒的载体上含抗氨苄青霉素基因，其可作为 ，作用是 。 (2)将外源DNA质粒连接构建基因表达载体时，还需使用的工具有 ，将构建好的基因表达载体转入大肠杆菌前，需在低温、低浓度的CaCl2溶液中处理大肠杆菌，这样做的目的是 。在上述转化过程中，实际转化效率介于50%～85.7%之间，推测其原因可能与 （答出一点）有关。 (3)进行“蓝白斑筛选实验”时，将转化后的大肠杆菌采用 法接种到添加了 的固体培养基中培养获得单菌落。理论上培养基上生长的菌落都应呈现白色，但实际结果是仍有少量蓝色菌落存在，推测其原因可能是 。 (4)为判断上述推测是否正确，依据LacZ基因两端的序列设计引物，利用PCR技术进行特异性扩增，完成后常用 法来鉴定PCR产物。图2为扩增产物的鉴定结果（LacZ基因长度为1482bp），若推测正确，则图中 （填“1”或“2”）表示目标菌落。 【答案】(1) 标记基因 筛选含目的基因的受体细胞 (2) 限制酶（限制性内切核酸酶）和DNA连接酶 便于吸收外源DNA 插入基因和质粒的浓度、限制酶和DNA连接酶的活性、反应时间、受体菌的状态等 (3) 稀释涂布平板（或平板划线） 氨苄青霉素 质粒发生自连 (4) 琼脂糖凝胶电泳 1 【分析】1、基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（1）启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；（2）终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；（3）标记基因的存在便于目的基因的鉴定和筛选，标记基因可以是多种抗性基因。 2、PCR技术基本反应步骤：变性、复性、延伸。 3、在基因表达载体构建过程中，为了避免目的基因和运载体自身环化以及目的基因与运载体反方向连接，一般用不同的限制酶对目的基因和运载体进行切割，即双酶切割；然后再利用DNA连接酶将两部分末端的序列进行连接。 【详解】（1）载体上的抗氨苄青霉素基因是标记基因，其作用是筛选出含有目的基因的受体细胞。因为含有重组质粒（含抗氨苄青霉素基因）的受体细胞能在含氨苄青霉素的培养基上存活，而不含的则不能，从而实现筛选。 （2）将外源DNA连接构建基因表达载体时，需要限制酶（限制性内切核酸酶）切割外源DNA和载体，再用DNA连接酶连接，所以还需工具是限制酶和DNA连接酶。 用低温、低浓度的CaCl₂溶液处理大肠杆菌，是为了使大肠杆菌成为感受态细胞，便于吸收外源DNA。 转化效率介于50% - 85.7%之间，原因可能与插入基因和质粒的浓度、限制酶和DNA连接酶的活性、反应时间、受体菌的状态等有关，这些因素都可能影响重组质粒的形成和导入过程。 （3）进行蓝白斑筛选实验时，将转化后的大肠杆菌采用稀释涂布平板法或平板划线法接种到添加了氨苄青霉素的固体培养基中，因为载体含抗氨苄青霉素基因，可用于筛选含重组质粒的细菌。理论上含重组质粒（外源DNA插入破坏了LacZ基因）的菌落应呈现白色，但有少量蓝色菌落存在，原因可能是质粒发生了自连，即没有插入外源DNA的质粒自身连接，其LacZ基因完整，能表达β - 半乳糖苷酶，将X - Gal分解为蓝色物质，使菌落呈蓝色。 （4）对PCR产物常用琼脂糖凝胶电泳法来鉴定。因为不同大小的DNA片段在凝胶中迁移速率不同，可据此判断。已知LacZ基因长度为1482bp，若推测正确（即菌落为目标菌落，含插入外源DNA的重组质粒，LacZ基因被破坏），则PCR产物长度应小于1482bp，图中1的条带长度小于2000bp且明显小于2的条带长度（2更接近1482bp），所以图中1表示目标菌落。 13．研究人员在玉米自交品系中偶然发现了一雄性不育突变体ms2020，将其与野生型玉米杂交，F1均表现为雄性可育，F2中雄性可育玉米与雄性不育玉米的比例为3：1。请回答下列问题： (1)据实验结果分析，该雄性不育基因为 （填“显性”或“隐性”）基因。该对相对性状的遗传遵循 定律。 (2)已知玉米的甜度由位于9号染色体上的等位基因D、d控制，非甜对甜为显性。为了确定雄性不育基因是否也在9号染色体上，研究人员设计了如下实验，请将实验过程及预期结果补充完整。 实验过程：让纯合雄性不育非甜玉米与纯合雄性可育甜玉米杂交，F1均为雄性可育非甜玉米； 。 预期结果：若 ，则雄性不育基因在9号染色体上；若 ，则雄性不育基因不在9号染色体上。 (3)研究发现，SSR是DNA分子中的简单重复序列，非同源染色体上的SSR重复单位不同，不同品种中同一种染色体上的SSR重复次数不同，因此常用于染色体特异性标记。研究人员利用玉米2号、5号染色体上特异的SSR进行PCR扩增，亲本野生型雄性可育玉米和雄性不育突变体ms2020及其部分杂交后代的SSR电泳结果如图所示。 由图可知，雄性不育基因最可能位于 号染色体上，依据是 ；推测8号个体出现图示结果的原因可能是 。 【答案】(1) 隐性 分离 (2) 让F1自交，得到F2代 雄性可育非甜玉米与雄性不育甜玉米的比例为3:1 雄性可育非甜玉米与雄性不育甜玉米的比例为9:3:3:1 (3) 5 在5号染色体的SSR电泳结果中，雄性不育突变体ms2020与野生型玉米的SSR标记不同，且杂交后代的SSR标记与雄性不育突变体一致 发生了染色体片段交换 【分析】基因自由组合定律的实质是：位于非同源染色体上的非等位基因的分离或自由组合是互不干扰的；在减数分裂过程中，同源染色体上的等位基因彼此分离的同时，非同源染色体上的非等位基因自由组合。 【详解】（1）雄性不育个体与野生型杂交F1中，所有后代均表现为雄性可育，说明雄性可育是显性性状，雄性不育是隐性性状；F2中雄性可育与雄性不育的比例为3:1，符合孟德尔分离定律中一对等位基因的分离比例，表明该性状由单基因控制。 （2）让纯合雄性不育非甜玉米（基因型为msmsDD）与纯合雄性可育甜玉米（基因型为MsMsdd）杂交，F1代均为雄性可育非甜玉米（基因型为MsmsDd），让F1自交，观察F2代的性状分离情况： 预期结果：若雄性不育基因在9号染色体上，雄性不育基因（ms）与甜度基因（D/d）连锁，F2中雄性可育非甜玉米（Ms_D_）与雄性可育甜玉米（Ms_dd）的比例为3:1；若雄性不育基因不在9号染色体上：雄性不育基因与甜度基因独立分离，F2代中雄性可育非甜玉米（Ms_D_）、雄性可育甜玉米（Ms_dd）、雄性不育非甜玉米（msmsD_）、雄性不育甜玉米（msmsdd）的比例为9:3:3:1。 （3）通过SSR电泳结果分析，5号染色体的SSR标记在雄性不育突变体ms2020与野生型玉米之间存在差异，且杂交后代的SSR标记与雄性不育突变体一致，表明雄性不育基因可能位于5号染色体上；8号个体的SSR电泳结果与预期不符，可能是由于在减数分裂过程中发生了染色体片段交换，导致SSR标记的重新组合。 14．科学研究表明t-PA蛋白能降解血栓，是脑血栓患者的特效药，但其促进血拴溶解的特异性不高，若将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸（密码子是UCU），获得改良的tPA蛋白，其溶解血栓的效率明显提升。图1和图2为改造t-PA蛋白基因及构建表达工体的过程。 (1)在PCR技术中高温变性的目的是 ，图1中重叠延伸时 （填“是”或“否"）需要引物。 (2)t-PA蛋白第84位的半胱氨酸对应的基因模板链碱基序列是ACA，图1中黑点表示突变位点的碱基，若要得到改良t-PA蛋白，则引物b中该位点的碱基是 。 (3)若图1得到的改良t-PA蛋白基因非模板链序列为5'-TGAACGCTA…（中间序列）…GTCGACTCG-3'。为了便于将扩增后的基因和质粒pCLY11成功构建成重组质粒，请写出用于PCR扩增的一对引物的碱基序列 （要求：至少写出10个碱基，并标注5'端），PCR的产物一般通过 来鉴定。 (4)运用乳房生物反应器可以从转基因牛的乳汁中获得t-PA改良蛋白，具体流程如图3。 过程②运用的具体方法为 ；④过程前需取 （填部位）的细胞进行性别鉴定。若改用膀胱生物反应器在尿液中获得t-PA改良蛋白，在构建基因表达载体时，需要添加 的启动子。 【答案】(1) 双链DNA解聚为单链 否 (2)G (3) 5'-CCCGGGTGAA…，5'-CGTAGCCGAG… 琼脂糖凝胶电泳 (4) 显微注射 （囊胚期的）滋养层 仅在膀胱（上皮） 【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）在PCR技术中高温变性的目的是双链DNA解聚为单链，利用了DNA热变性原理；PCR技术开始时需要引物引导DNA聚合酶结合，图1中重叠延伸时不再需要引物； （2）已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸，相应的基因模板链（图中t-PA基因的上链）上的碱基序列是ACA，则半胱氨酸的密码子为UGU，而丝氨酸的密码子是UCU，由此可知，若要将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，则t-PA基因上链第84位发生碱基替换为ACA→AGA，图中显示引物b与t-PA基因的下链互补，故其中相应部位的碱基与上链相同，即该部位的碱基是G； （3） 由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链，因此PCR中需要加入合适的引物来完成子链的延伸，引物需要与模板的3'端结合，故据图可知，PCR1时，需要的引物是引物a和引物b，而延伸后，为扩增完整的序列，需要引物a和d；DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3′端开始延伸DNA链，因此引物的作用是使DNA聚合酶从引物的 3 ′ 端开始连接脱氧核苷酸，结合题干所示，应用Xmal和Nhe1两种限制酶切割，以产生黏性末端，便于把目的基因正确连接到质粒pCLY11上，需在引物5'端添加限制酶识别序列。图1得到的改良t-PA蛋白基因非模板链序列为5'-TGAACGCTA…（中间序列）…GTCGACTCG-3',，结合碱基互补原则用于PCR扩增的一对引物的碱基序列5'-CCCGGGTGAA…，5'-CGTAGCCGAG…； PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 （4）过程②是将目的基因导入受精卵细胞中，常用显微注射法，取早期胚胎的细胞进行性别鉴定一般取囊胚期的滋养层细胞；若改用膀胱生物反应器在尿液中获得t-PA改良蛋白，在构建基因表达载体时，需要添加仅在膀胱（上皮）的启动子，这样可以直接进行转录和翻译表达所需蛋白质，没有额外的其他产物。 15．乳糖酶可被用于水解牛奶中的乳糖来生产低乳糖牛奶。普通乳糖酶热稳定差，在低温条件下才具有水解活性。为了获得高产耐高温乳糖酶的重组枯草杆菌，科研人员将bgaB基因（表达产物是一种乳糖酶）插入含有强启动子P43的质粒pZ01中，构建重组质粒pZ01-bgaB并转化至枯草杆菌中表达，主要技术路线如下图。    回答下列问题： (1)牛奶生产中一般不使用抗生素，低温下生产低乳糖牛奶过程中可能存在 ，使牛奶质量不能得到保障。科研人员在众多产乳糖酶微生物中选择了嗜热脂肪芽孢杆菌为材料获取乳糖酶基因，理由是 。 (2)pZ01上的P43是 识别和结合的部位，可驱动目的基因高效转录出mRNA。P43中含KpnI酶切位点，酶切后将失去其所必须的序列（E序列）；bgaB基因不含限制酶切割位点。据图分析，为保证bgaB基因能与pZ01正确连接并正常表达，在设计扩增bgaB基因的引物时，应在引物1的5'端添加 ；引物2的5'端添加 。 (3)过程①需用到的工具酶是 ，双酶切pZ01后回收 kb（引物5'端添加的序列长度均忽略不计）的DNA片段用于重组质粒的构建。重组质粒中保留卡那霉素抗性基因的目的是 。 【答案】(1) 杂菌污染 啫热菌能在高温中正常生活，从该菌中获取的基因，其表达产物在高温下可能具有较高的活性 (2) RNA聚合酶 限制酶KpnI识别序列和E序列 限制酶BamHⅠ的识别序列 (3) DNA连接酶 6.7 便于筛选出含有重组质粒pZ01-bgaB的受体细胞 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞； （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）低温下生产低乳糖牛奶过程中，由于牛奶生产一般不使用抗生素，所以可能存在杂菌污染的问题，杂菌在牛奶中生长繁殖，会影响牛奶的质量，使牛奶质量不能得到保障；普通乳糖酶热稳定差，在低温条件下才具有水解活性，而科研人员要获得高产耐高温乳糖酶的重组枯草杆菌，啫热菌能在高温中正常生活，从该菌中获取的基因，其表达产物在高温下可能具有较高的活性； （2）由题意可知，pZ01上的P43是强启动子，是RNA聚合酶识别和结合的部位，可驱动目的基因高效转录出mRNA；由图可知，P43中含KpnI酶切位点，酶切后将失去其所必须的序列（E序列），为保证bgaB基因能与pZ01正确连接并正常表达，需要用限制酶KpnI和BamHⅠ进行双酶切。因为bgaB基因不含限制酶切割位点，所以在设计扩增bgaB基因的引物时，应在引物1的5'端添加限制酶KpnI识别序列和E序列，引物2的5'端添加限制酶BamHⅠ的识别序列； （3）过程①是将目的基因和载体连接形成重组质粒，需用到的工具酶是DNA连接酶。从图中可知，pZ01的长度是9kb，bgaB基因的长度是2kb，重组质粒的长度为8.7kb，所以用HindⅢ和BamHⅠ双酶切pZ01后，切去了一部分片段，回收的用于重组质粒构建的DNA片段长度为（8.7-2=）6.7kb（引物5'端添加的序列长度均忽略不计）；重组质粒中保留卡那霉素抗性基因作为标记基因，其目的是便于筛选出含有重组质粒pZ01-bgaB的受体细胞，在含有卡那霉素的培养基中，含有重组质粒pZ01-bgaB（含卡那霉素抗性基因）的受体细胞能够存活，而不含重组质粒的细胞不能存活。 16．研究发现实体肿瘤内部通常是缺氧环境，蓖麻毒紫蛋白(RTA)可作用于核糖体，使蛋白合成受阻，从而引起细胞死亡。TAT是一种短肽，可转导蛋白进入细胞，含有氧依赖性降解区域ODD(多肽)的融合蛋白可以适应低氧条件稳定存在，但在常氧条件下会被蛋白酚降解。科研人员以RTA作为抑制肿瘤细胞增殖的活性分子，利用TAT的作用将融合蛋白转运进入肿瘤细胞，并利用ODD的作用减轻RTA 对正常细胞的毒性,分别构建了含TAT-RTA(660bp)和 TAT-RTA-ODD(870bp)融合基因的表达载体，并成功得到相关融合蛋白。 (1)可通过PCR技术获取TAT-RTA融合基因，前提是根据TAT 和RTA基因设计引物，引物的作用是 。已知RTA基因部分序列如图1(a)所示：TAT 基因编码链序列为5' ATGAGCTACGGCCGTAAAAGAGACGCCAACGTACA 3': 欲得到TAT-RTA 融合基因的结构如图1(b)所示。为顺利构建表达载体，除图示外，还需具有 结构。且需在引物1、2的 端分别加入 酶切位点：要求在RTA 蛋白的前端引入TAT短肽，则引物2的前12个碱基序列为 A．5' GGATCCATGAGC 3'           B．S' GGATCCATCTTC 3' C． 5' GGATCCTACTCG 3'           D．S' CTCGAGATGAGC 3' (2)载体的部分结构如图2所示，His标签由连续的6个组氨酸构成，可用于对重组融合蛋白进行分离纯化。将PCR 得到的TAT-RTA 融合基因和载体双酶切后，再用 酶连接。但在研究时发现融合蛋白中没有 His标签蛋白。据图分析原因很可能是 ，导致 His标签基因对应的mRNA的密码子被错位读取。 (3)科研人员将得到的重组融合蛋白经腹腔给药忠实体肿瘤的小鼠，发现TAT-RTA 和 TAT-RTA-ODD融台蛋白都可以抑制患实体肿瘤小鼠肿瘤体积的增长，但TAT-RTA-ODD 的抑制效果更好，产生该实验结果的原因是 。 【答案】(1) 与模板DNA单链互补配对，并且使Taq酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 复制原点、标记基因 5′ Xbo Ⅰ 、BamH Ⅰ（顺序不能颠倒） A (2) DNA连接 限制酶2识别序列后面的一个碱基A与His标签基因编码链的前两个碱基CA编码一个氨基酸，导致His标签基因对应的mRNA的密码子被错位读取 (3)含有氧依赖性降解区域ODD（多肽）的融合蛋白可以适应肿瘤内部低氧条件稳定存在，从而更好地抑制肿瘤体积增长 【分析】多聚酶链式反应扩增DNA片段：（1）PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4中游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。（2）PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 【详解】（1） PCR中，引物的作用是与模板DNA单链互补配对实现连接，并且使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸；表达载体有利于目的基因的转入和表达，除图示外，还需具有复制原点、标记基因等；据图1可知，TAT-RTA融合基因TAT靠近启动子一侧有BamHⅠ的位点，RTA靠近终止子一侧有XboⅠ的位点，则引物2的 5′端加入BamHⅠ，引物1的5′端加入XboⅠ；TAT基因编码链序列5'ATGAGCTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGA3′，由于其5'端需插入BamHⅠ的识别位点，根据碱基互补配对原则可知，其对应的引物的5'端应包含BamHⅠ的识别序列，故设计为5'GGATCCATGAGC3'，以便BamH Ⅰ切出相应的黏性末端，故选A。 （2）切割后的DNA片段需要用DNA连接酶连接成完整DNA分子；由图2可知， 限制酶2识别序列与His标签序之间多出一个碱基A，这一个碱基A与His标签基因编码链的前两个碱基CA编码一个氨基酸，导致His标签基因对应的mRNA的密码子被错位读取，导致不能正确编码出His标签蛋白。 （3） 由图3可知，较对照组而言，TAT+RTA和TAT+RTA+ODD组的荷瘤小鼠肿瘤体积较小，且TAT+RTA+ODD组的荷瘤小鼠肿瘤体积最小，说明TAT+RTA和TAT+RTA+ODD均能抑制肿瘤体积增大，其中后者抑制效果更显著。产生该实验结果的原因是TAT将融合蛋白转运进入肿瘤细胞，RTA可作用于核糖体，使蛋白合成受阻，从而引起细胞死亡，而ODD可以适应低氧条件稳定存在，实体肿瘤内部通常是缺氧的环境，所以ODD可以在肿瘤细胞中正常发挥作用，更好地抑制肿瘤体积增长，使抗肿瘤效果更加显著。 17．磷脂酸（PA）既是一种结构膜脂，也是植物的一个关键信号分子，为验证盐碱胁迫下植物的PA响应，研究人员构建PA荧光探针：将特异性PA结合蛋白结合域（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFD）基因通过无缝克隆技术连接构建重组DNA，导入拟南芥。DNA无缝连接的原理如图1（a），重组DNA的构建过程如图1（b），P1-P4为引物。 (1)磷脂酸是合成磷脂和三酰甘油等的原料，据此推测细胞中游离的磷脂酸聚集较多的场所是______。 A．线粒体 B．叶绿体 C．高尔基体 D．内质网 (2)关于图1（a）中T5核酸外切酶描述合理的是______。 A．作用部位是磷酸二酯键 B．可使DNA分子形成单链末端 C．可将DNA分子切割为多个片段 D．与限制性内切核酸酶活性中心相同 (3)图1中①处需使用的酶为 （编号选填），②处需使用的酶应为 （编号选填）。 ①RNA聚合酶  ②DNA解旋酶  ③DNA连接酶  ④限制性内切核酸酶  ⑤核酸外切酶 (4)图1（b）中引物P1的碱基序列也会存在于引物 。（编号选填）。 ①P2  ②P3  ③P4 (5)以下是在拟南芥受体细胞组织培养的培养基中所添加的物质，这些物质中不属于营养成分的有 （编号选填）。 ①琼脂  ②生长素  ③硝酸铵（NH4NO3）  ④草铵膦  ⑤甘氨酸  ⑥氯化钙（CaCl2） 绿色荧光蛋白的发色团受到光子辐射后吸收能量从低能级状态跃迁到高能级状态，高能级状态不稳定，再跃迁至低能级状态过程中发出绿色荧光，原理如图2（a）。在等量光子辐射和相同盐碱胁迫下，与仅转入GFD基因的拟南芥相比，转入PABD-GFD融合基因的拟南芥发出的绿色荧光明显增强。（已知PABD不影响GFD的荧光强度） (6)等量光子辐射下，转入PABD-GFD融合基因的拟南芥绿色荧光增强是因为在高能级向低能级状态跃迁过程中释放的能量 （更多/更少）用于非辐射能量的损耗。 (7)若实验结果说明盐碱胁迫下植物PA发生了响应。尝试解释：为什么转入PABD-GFD融合基因的拟南芥经上述处理后，绿色荧光较仅转入GFD基因的拟南芥增强，且随处理时间增加荧光强度会发生如图2变化？ 。 【答案】(1)D (2)AB (3) ③ ③⑤ (4)③ (5)①②④ (6)更少 (7)与仅转入GFD基因的拟南芥相比，转入融合基因的拟南芥表达出的融合蛋白因有PABD可结合PA，改变了分子的结构，使得荧光蛋白的发色团从高能级状态跃迁到低能级状态释放的能量更多转化为辐射能量，荧光增强。随着处理时间增加，更多的融合蛋白结合PA，所以荧光先增强，一段时间后，结合的PA可能被降解或转移，融合蛋白发出的荧光强度下降 【分析】PCR由变性-复性-延伸三个基本反应步骤构成：（1）模板DNA的变性：模板DNA经加热至90℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下一轮反应作准备。（2）模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至50℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。（3）延伸：DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。 【详解】（1）内质网与脂质代谢有关，磷脂和三酰甘油均属于脂质，故根据题意可推测细胞中游离的磷脂酸聚集较多的场所是内质网，ABC错误，D正确。 故选D。 （2）由图1中的图a可知，T5核酸外切酶使 DNA 1和DNA 2形成了单链末端，且产生了多个游离核苷酸，可见T5核酸外切酶作用部位是磷酸二酯键，可使DNA分子形成单链末端，AB正确，CD错误。 故选AB。 （3）图1中图a中①处是DNA 1和DNA 2单链末端连接，需要③DNA连接酶形成磷酸二酯键，图b中②处为了实现无缝对接需要使用⑤核酸外切酶和 ③DNA连接酶。 （4）图b可知，GFD基因和PABD基因形成融合基因，且GFD基因右侧与PABD基因左侧实现无缝对接，则扩增GFD基因时P4含有部分PABD基因左侧部分序列，而P4扩增后的需要也含有PABD基因，故图1（b）中引物P1的碱基序列也会存在于引物③P4。 （5）培养基中的营养成分包括水、无机盐、碳源、氮源、维生素等，而①琼脂属于凝固剂，②生长素属于植物激素，④草铵膦属于非选择性除草剂能起到筛选作用，①②④不属于营养成分。 （6）图2中图a可知，高能级状态跃迁至低能级状态过程中释放能量中辐射能量导致形成绿色荧光，图2可知等量光子辐射下，转入PABD-GFD融合基因的拟南芥绿色荧光增强，可见在高能级向低能级状态跃迁过程中释放的能量更少用于非辐射能量的损耗。 （7）图2可知，等量光子辐射下，转入PABD-GFD融合基因的拟南芥绿色荧光增强，且适当盐胁迫荧光增强；若实验结果说明盐碱胁迫下植物PA发生了响应，分析可知，与仅转入GFD基因的拟南芥相比，转入融合基因的拟南芥表达出的融合蛋白因有PABD可结合PA，改变了分子的结构，使得荧光蛋白的发色团从高能级状态跃迁到低能级状态释放的能量更多转化为辐射能量，荧光增强。随着处理时间增加，更多的融合蛋白结合PA，所以荧光先增强，一段时间后，结合的PA可能被降解或转移，融合蛋白发出的荧光强度下降。 题型3 发酵工程 1．（2025·北京房山·一模）发酵制作酱油在我国具有悠久的历史。某企业通过发酵制作酱油的流程示意图如下。下列叙述错误的是（    ）    A．大豆中的蛋白质可为菌种生长提供碳源、氮源 B．该过程利用乳酸菌、酵母菌等微生物的有氧呼吸 C．发酵罐和原料需要灭菌，加盐可调味并防止杂菌滋生 D．米曲霉分泌蛋白酶、淀粉酶等利于原料中有机物的分解 【答案】B 【分析】1、酵母菌是兼性厌氧微生物，在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖，把糖分解成二氧化碳和水；在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。 2、由题图信息分析可知，酿造酱油主要利用的是米曲霉，能够产生蛋白酶和脂肪酶，将蛋白质和脂肪分别水解成小分子的肽和氨基酸、甘油和脂肪酸。 【详解】A、大豆中含有丰富的蛋白质，蛋白质由C、H、O、N等元素组成。 在微生物的生长过程中，蛋白质可以被分解利用，其中的碳元素可作为碳源，氮元素可作为氮源，为菌种生长提供所需的物质和能量，A正确； B、乳酸菌是厌氧菌，主要进行无氧呼吸产生乳酸。 而酵母菌在有氧条件下进行有氧呼吸大量繁殖，在无氧条件下进行无氧呼吸产生酒精等。在酱油发酵过程中，乳酸菌进行无氧呼吸参与发酵，不是利用其有氧呼吸，B错误； C、发酵罐和原料灭菌是为了防止杂菌污染，避免杂菌与发酵菌种竞争营养物质等，影响发酵过程。 加盐一方面可以增加酱油的风味，进行调味；另一方面高浓度的盐可以抑制杂菌的生长繁殖，防止杂菌滋生，C正确； D、米曲霉能够分泌蛋白酶、淀粉酶等多种酶。 蛋白酶可以分解原料中的蛋白质为小分子肽和氨基酸，淀粉酶可以分解淀粉为葡萄糖等，有利于原料中有机物的分解，为后续发酵提供更易被利用的营养物质，D正确。 故选B。 2．（2025·北京顺义·一模）大肠杆菌在伊红-亚甲蓝琼脂培养基（EMB）上会形成有金属光泽的深紫色菌落。利用EMB鉴定自制酸奶中的大肠杆菌，相关操作错误的是（    ） A．培养基经湿热灭菌后再倒平板 B．将酸奶样品稀释后涂抹在EMB表面 C．观察菌落颜色进行初步鉴定 D．将使用过的培养基直接丢弃 【答案】D 【分析】在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。虽然各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源（提供碳元素的物质）、氮源（提供氮元素的物质）和无机盐。另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时需将培养基的pH调至酸性，培养细菌时需将pH调至中性或微碱性，培养厌氧微生物时则需要提供无氧的条件。 【详解】A、为防止杂菌污染，微生物培养基配制之后用湿热灭菌法进行灭菌再倒平板，冷却的平板需要倒置，防止对培养基造成污染，且可避免水分过快蒸发，A正确； B、大肠杆菌在伊红-亚甲蓝琼脂培养基（EMB）上会形成有金属光泽的深紫色菌落，将酸奶样品充分稀释后涂抹在EMB表面进行鉴定是否含有大肠杆菌，B正确； C、大肠杆菌在伊红-亚甲蓝琼脂培养基（EMB）上会形成有金属光泽的深紫色菌落，所以可以通过观察菌落的颜色对菌种进行初步鉴定，C正确； D、使用过的培养基应进行灭菌，不应直接丢弃，以免污染环境，D错误。 故选D。 3．（2025·北京顺义·一模）取样调查法强调从总体中抽取样本调查，并根据样本数据推断总体特征。下列研究活动中，没有采用取样调查法的是（    ） A．测定土壤中尿素分解菌的数量 B．研究土壤中小动物类群丰富度 C．调查人群中红绿色盲发病率 D．我国开展的七次全国人口普查 【答案】D 【分析】调查种群密度常用样方法和标记重捕法。 【详解】A、测定土壤中尿素分解菌的数量，由于土壤中细菌数量庞大，难以对所有细菌进行计数，通常采用稀释涂布平板法等取样调查方法，从土壤样本中获取数据来推断总体中尿素分解菌的数量，A不符合题意； B、研究土壤中小动物类群丰富度，因土壤中小动物种类和数量众多，不可能对所有小动物进行全面调查，一般通过取样器取样等方法获取部分样本，进而分析总体的小动物类群丰富度，B不符合题意； C、调查人群中红绿色盲发病率，由于不可能对所有人群逐一检查，常选取一定数量的人群样本进行调查，根据样本中红绿色盲患者的比例来推断整个人群的发病率，C不符合题意； D、我国开展的七次全国人口普查，是对全国所有人口进行全面的调查统计，并非抽取部分样本进行推断，不属于取样调查法，而是普查法，D符合题意。 故选D。 4．（2025·北京丰台·一模）研究者对比了家庭米酒制作与工业化啤酒生产的微生物调控策略。相关叙述正确的是（    ） A．两者均需对原料进行严格灭菌以保证单一菌种的优势 B．两种工艺均需在发酵后期降低温度以加速产物的生成 C．米酒制作中酵母菌的繁殖与产乙醇阶段对氧气的需求不同 D．啤酒生产的主发酵阶段需持续通入无菌空气以促进乙醇合成 【答案】C 【分析】参与果酒制作的微生物是酵母菌，其新陈代谢类型为异养兼性厌氧型。参与果醋制作的微生物是醋酸菌，其新陈代谢类型是异养需氧型。果醋制作的原理：当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的葡萄糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。 【详解】A、家庭米酒制作通常不会对原料严格灭菌，以免杀死菌种，工业化啤酒生产虽会进行高温处理（如糖化阶段），但主要依赖酵母菌的快速繁殖形成优势菌群，而非依赖严格灭菌，A错误； B、米酒制作全程在常温下进行，无需后期降温；啤酒生产的后期降温（如后发酵阶段）是为了抑制微生物活动、促进沉淀或稳定风味，而非加速产物生成，B错误； C、米酒制作中，酵母菌的繁殖阶段需氧气（有氧呼吸），而产乙醇阶段需无氧条件，两者对氧气的需求不同，C正确； D、啤酒主发酵阶段初期通入氧气促进酵母菌增殖，但后期需无氧环境以进行酒精发酵。持续通入空气会抑制乙醇合成，D错误。 故选C。 5．（2025·北京通州·模拟预测）青霉菌处在葡萄糖浓度不足的环境中时，会通过分泌青霉索杀死细菌，以保证自身生存所需的能量供应。关于青霉索的工业化生产过程叙述错误的是（　　） A．青霉素有杀菌作用发酵罐不需灭菌 B．深层通气液体发酵技术可提高产量 C．高产菌株扩大培养后接种到发酵罐中 D．发酵液中的碳源不宜使用葡萄糖 【答案】A 【分析】培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等四类营养物质。配制培养基时除了满足基本的营养条件外，还需满足微生物生长对特殊营养物质、pH、O2的要求。 【详解】A、青霉素只能抑制细菌的生长，不能抑制其他真菌的生长，发酵罐仍需严格灭菌，A错误； B、青霉菌的代谢类型为异养需氧型，可用深层通气液体发酵技术提高产量，B正确； C、选育出的高产青霉素菌株经扩大培养纯化后，才可接种到发酵罐中进行工业化生产，C正确； D、青霉菌处于葡萄糖浓度不足的环境中会通过分泌青霉素杀死细菌；提供相同含量的碳源，葡萄糖溶液单位体积中溶质微粒较多，会导致细胞失水，发酵液中的碳源不宜使用葡萄糖，乳糖是二糖，可被水解为半乳糖和葡萄糖，是青霉菌生长的最佳碳源，可以被青霉菌缓慢利用而维持青霉素分泌的有利条件，D正确。 故选A。 6．甲乙两个生物小组的“酵母菌纯培养”结果如图所示。下列说法正确的是（　　） A．两组平板都分成4个区进行划线 B．甲组操作过程需4次灼烧接种环 C．乙组适合对酵母菌活菌进行计数 D．单菌落大小反映菌种种类差异 【答案】B 【分析】微生物常见的接种的方法： （1）平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。 （2）稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。 【详解】A、由图可知，两组平板都分成3个区进行划线，A错误； B、接种前需对接种环灼烧灭菌一次，每次划线后都灼烧一次，甲组共灼烧4次接种环，B正确； C、活菌计数用稀释涂布平板法，图中为平板划线法，不可计数，C错误； D、单菌落的性状、颜色等特征反映菌种种类差异，D错误。 故选B。 7．（2025·北京·一模）琥珀酸是一种天然有机酸，广泛应用于制药、食品等行业。产琥珀酸放线杆菌（SW）生长的最适pH为7.0，能利用糖类发酵生产琥珀酸，但耐酸能力较弱。 (1)培养SW的培养基包含水、NaCl、K2HPO4、葡萄糖、蛋白胨等成分，其中葡萄糖为SW提供 。 (2)有些微生物进化出由GadC和GadB组成的Gad系统以抵抗酸胁迫。研究人员将编码Gad系统的基因导入SW中，拟获得耐酸性强的重组菌株GSW（如图1）。当外界环境pH降低时，启动Gad系统，运到细胞内的谷氨酸（Glu）转化为γ-氨基丁酸（GABA）运出细胞，此过程 ，同时运出细胞的H+也减少，从而缓解酸胁迫。 (3)研究人员对SW、GSW进行耐酸性实验测定。 ①首先将等量菌液分为两组，分别接种到含或不含 且pH为4.6的液体培养基中培养1.5 h。 ②将上述菌液进行 后，依次分别涂布于pH为7的固体培养基上，37℃培养24 h，图2所示结果说明GSW菌株耐酸能力明显提高。此步骤配制的固体培养基pH为7而非4.6，目的是 。 (4)若要确定GSW菌株是否适用于工业生产，还需检测 。 【答案】(1)碳源 (2)消耗H+ (3) 谷氨酸 梯度稀释 通过最适pH培养获得的菌落检测pH=4.6培养基中菌株的存活率 (4)琥珀酸产量 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）微生物培养中的碳源是为微生物提供碳元素的营养物质，葡萄糖为SW提供碳源。 （2）当外界环境pH降低时，H+增多，启动Gad系统，运到细胞内的谷氨酸（Glu）转化为γ-氨基丁酸（GABA）运出细胞，此过程消耗H+，同时运出细胞的H+也减少，从而缓解细胞外的H+增多。 （3）①对SW、GSW进行耐酸性实验测定，首先将等量菌液分为两组，分别接种到含或不含谷氨酸且pH为4.6的液体培养基中培养1.5 h。②将上述菌液进行梯度稀释，得到稀释度不同的菌液，依次分别涂布于pH为7的固体培养基上；配制的固体培养基pH为7而非4.6，是通过最适pH培养获得的菌落检测pH=4.6培养基中菌株的存活率。 （4）琥珀酸是一种天然有机酸，广泛应用于制药、食品等行业，若要确定GSW菌株是否适用于工业生产，还需检测琥珀酸产量。 8．（2025·北京石景山·一模）铜绿假单胞菌（P菌）易对抗生素产生耐药性，导致现有治疗P菌感染的效果不佳。P菌有两类，其中Pa菌能产生脓毒素S蛋白，杀死不能产生S蛋白的Pb菌。研究者尝试改造S蛋白用于靶向治疗P菌感染，并利用近红外光控制工程菌精准放药。 (1)将Pa菌接种于固体培养基中获得 ，再利用液体培养基进行 ，收集发酵液分离得到S蛋白并分析其结构与功能。 (2)如图1所示，S蛋白的R、U、T功能区可协同将S蛋白特异性转入Pb菌，N能降解Pb菌中DNA。Pa菌能表达Is蛋白与S蛋白形成复合物，保护自身免受S蛋白的毒害。大肠杆菌分泌的抗生素E的功能区C会使核糖体失活，IE可与E形成保护自身的复合物。用 （填酶的名称）构建重组质粒，导入Pa菌中获得工程菌，生产嵌合脓毒素S′蛋白。    用S和S′蛋白分别对Pa菌、Pb菌和大肠杆菌进行抑菌试验，观察抑菌圈出现情况，证实S′蛋白可作为靶向治疗P菌感染的药物。请写出抑菌试验的结果 。 (3)为使工程菌在特定的部位释放S′蛋白，研究者构建图2所示的表达载体。其工作原理为：黑暗条件下，菌体中c-di-GMP浓度低，不能产生裂解蛋白L。近红外光照射激活启动子R， ，进而激活启动子P，合成的Q蛋白 。裂解蛋白L积累到一定量时，工程菌裂解，从而释放S′蛋白。    (4)若要将构建的工程菌用于治疗伤口的P菌感染，在临床应用前，还需要 。 【答案】(1) 单菌落 扩大培养 (2) 限制性内切核酸酶和DNA连接酶 脓毒素类型 培养基接种的菌类型 Pa Pb 大肠杆菌 S – + – S′ + + – (3) 合成的B酶催化c-di-GMP合成，使其浓度升高 解除裂解基因L前的终止子对转录的抑制作用，进而启动裂解基因L表达 (4)确定工程菌的使用剂量、评估疗效等 【分析】基因工程的基本工具：（1）限制酶；（2）DNA连接酶；（3）载体。 基因工程的基本操作程序：（1）目的基因的筛选与获取；（2）基因表达载体的构建；（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）将Pa菌接种于固体培养基中获得单菌落，再利用液体培养基进行扩大培养，收集发酵液分离得到S蛋白并分析其结构与功能。 （2）重组DNA技术用到的工具有限制性核酸内切酶、DNA连接酶、载体，在构建基因表达载体时，需要用到限制性核酸内切酶、DNA连接酶。结合题干信息合可知，Pa菌能产生脓毒素S蛋白，杀死不能产生S蛋白的Pb菌。S蛋白的R、U、T功能区可协同将S蛋白特异性转入Pb菌，N能降解Pb菌中DNA。Pa菌能表达Is蛋白与S蛋白形成复合物，保护自身免受S蛋白的毒害。所以S蛋白处理Pb菌落时会出现抑菌圈，为+，但处理Pa菌落时不会出现抑菌圈，为-。 S′蛋白中含有S蛋白的R、U、T功能区，所以S′蛋白可以特异性转入Pb菌落，S′蛋白的功能区C可以使核糖体失活从而引起细胞死亡，因此Pa和Pb都会被抑制生长出现抑菌圈，这两者均为+。大肠杆菌分泌的抗生素E的功能区C会使核糖体失活，但IE可与E形成保护自身的复合物，所以大肠杆菌由于含有E蛋白可以保护自己，所以不会产生抑菌圈，两种蛋白处理结果均为-。实验结果如图所示：  。 （3）分析题图可知，黑暗条件下，菌体中c-di-GMP浓度低，不能产生裂解蛋白L。近红外光照射激活启动子R，启动子R能驱动基因B表达成B酶，合成的B酶催化GTP合成c-di-GMP，使其浓度升高，进而激活启动子P，合成的Q蛋白解除裂解基因L前的终止子对转录的抑制作用，进而启动裂解基因L表达。裂解蛋白L积累到一定量时，工程菌裂解，从而释放S′蛋白。 （4）若要将构建的工程菌用于治疗伤口的P菌感染，在临床应用前，还需要确定工程菌的使用剂量、评估疗效等。 9．细菌的接合生殖与细菌的质粒F因子有关。有F因子的菌株为雄性，没有的为雌性。F因子携带的基因表达可以使细菌产生仅用于接合生殖的性菌毛，见图1。具有游离F因子的细菌称为F+菌株。部分细菌中F因子可以整合到细菌拟核DNA上，成为Hfr菌株。Hfr菌株的F因子可能从拟核DNA上脱离下来，又变成游离的F因子。这种脱离下来的F因子上携带了部分拟核DNA基因，使菌株成为F＇菌株。不存在F因子的雌性菌株称为F菌株。    (1)雄性菌株与雌性菌株接合时，雄性菌株的性菌毛同雌性菌株紧密连接在一起，然后F因子的一条链被切开，这条链会进入雌性菌株内，在雌性菌株内进行复制，形成一个新的F因子。留在雄性菌株内的F因子单链也会DNA复制成双链。因此，F＇菌株和F菌株接合生殖后，菌株的种类是 。虽然细菌存在接合生殖的方式，但是自然界中雌雄菌株的数量依然保持均衡，结合所学知识，请推测其原因： 。 (2)Hfr菌株在和F-菌株接合时，仅有部分F因子片段和部分拟核DNA片段进入雌性菌株内，因为进入F-菌株的F因子片段不完整，使接合后的F-菌株不具有雄性菌株的特点，既接合后的细菌种类依然是Hfr行菌株和F-菌株。但在这一过程中， 菌株拟核DNA发生了 ，有利于细菌的进化。 (3)细菌利用乳糖的机制如下图所示，当存在乳糖时，乳糖可以和阻遏蛋白结合，导致阻遏蛋白无法和操纵基因结合，启动乳糖利用相关基因的表达。某雌性菌株的调节基因发生突变，导致其表达的阻遏蛋白无法与乳糖结合。若这个菌株与F因子携带了正常调节基因的F＇菌株进行接合生殖，请分析接合后这个菌株能否利用乳糖，并说明原因： 。    【答案】(1) F＇菌株 接合增加雄性菌株数量，但F因子可能造成雄性菌株的物质和能量的浪费，使其存活能力低于雌性菌株，减少了雄性菌株数量（或F因子可以丢失，避免F因子造成的物质和能量浪费，使雄性菌株变成雄性菌株） (2) F- 基因重组 (3)不能利用乳糖。因为菌株中原本存在的突变调节基因依然能产生突变的阻遏蛋白，它与操纵基因结合，抑制乳糖相关基因表达 【分析】接合生殖是由两个亲体细胞互相靠拢，形成接合部位，通过接合部位相互交换一部分核物质后再分开进行分裂生殖的一种方式。 【详解】（1），F＇菌株和F菌株接合生殖后，F＇菌株中的F因子含有部分拟核DNA基因，和F菌株接合生殖后携带了部分拟核DNA基因的F因子，一条链被切开，这条链会进入雌性菌株内，在雌性菌株内进行复制，形成一个新的F因子中还是携带了部分拟核DNA，故菌株的种类是F＇菌株。虽然细菌存在接合生殖的方式，但是自然界中雌雄菌株的数量依然保持均衡，结合所学知识，请推测其原因：接合增加雄性菌株数量，但F因子可能造成雄性菌株的物质和能量的浪费，使其存活能力低于雌性菌株，减少了雄性菌株数量（或F因子可以丢失，避免F因子造成的物质和能量浪费，使雄性菌株变成雄性菌株）。 （2）Hfr菌株在和F-菌株接合时，仅有部分F因子片段和部分拟核DNA片段进入雌性菌株内，但在这一过程中F-菌株拟核DNA发生基因重组，有利于细菌的进化。 （3）若这个菌株与F因子携带了正常调节基因的F＇菌株进行接合生殖，接合后产生的是F＇菌株，原本存在的突变调节基因依然还在，能产生突变的阻遏蛋白，它与操纵基因结合，抑制乳糖相关基因表达，故结合后的F＇菌株不能利用乳糖。 题型4 胚胎工程 1．（2025·北京·一模）我国科研人员成功地将大熊猫皮肤成纤维细胞培养成诱导多能干细胞（iPSC），这些iPSC注入小鼠体内后逐渐形成了一个包括神经、肌肉和上皮组织的团块。下列叙述错误的是（    ） A．动物细胞培养技术是获得iPSC的基础 B．细胞培养基中应含有糖类和动物血清等 C．iPSC注入小鼠体内属于细胞融合技术 D．iPSC可用于心血管等疾病治疗的研究 【答案】C 【分析】胚胎干细胞(ES细胞)具有自我更新及多向分化潜能，为发育学、遗传学、人类疾病的发病机理与替代治疗等研究提供非常宝贵的资源。iPS细胞技术是借助基因导入技术将某些特定因子基因导入动物或人的体细胞，以将其重编程或诱导为ES细胞样的细胞，即iPS细胞。 【详解】A、诱导多能干细胞（iPSC）的获取需通过体外培养成纤维细胞，依赖动物细胞培养技术，A正确； B、动物细胞培养基需提供营养（如糖类），和天然成分（如动物血清），以支持细胞生长，B正确； C、将iPSC注入小鼠体内属于细胞移植技术，而非细胞融合技术，C错误； D、iPSC具有分化潜能，可用于研究治疗因细胞损伤引起的疾病，如心血管疾病，D正确。 故选C。 2．（2025·北京朝阳·一模）mTOR是一种对细胞生长和增殖有调节作用的胞内蛋白激酶。抑制mTOR活性可使小鼠囊胚的内细胞团增殖减慢，进而导致胚胎发育停滞；当mTOR被重新激活时，囊胚恢复正常发育。相关叙述错误的是（    ） A．通过体外受精和胚胎培养技术可获得小鼠囊胚 B．囊胚移植到受体母鼠前要进行受体发情处理 C．移植前用mTOR抑制剂处理囊胚可提高移植成功率 D．该研究可为体外培养胚胎的非冷冻保存提供理论基础 【答案】C 【分析】胚胎移植的基本程序主要包括：（1）对供、受体的选择和处理。选择遗传特性和生产性能优秀的供体，有健康的体质和正常繁殖能力的受体，供体和受体是同一物种。并用激素进行同期发情处理，用促性腺激素对供体母牛做超数排卵处理；（2）配种或人工授精；（3）对胚胎的收集、检查、培养或保存。配种或输精后第7天，用特制的冲卵装置，把供体母牛子宫内的胚胎冲洗出来(也叫冲卵)。对胚胎进行质量检查，此时的胚胎应发育到桑葚胚或囊胚阶段。直接向受体移植或放入-196℃的液氮中保存；（4）对胚胎进行移植；（5）移植后的检查。对受体母牛进行是否妊娠的检查。 【详解】A、可通过体外受精获得受精卵，在通过体外早期培养技术获得囊胚，A正确； B、囊胚移植前需用促性腺激素对受体母鼠进行同期发情处理，B正确； C、mTOR被重新激活时，囊胚恢复正常发育，因此移植前用mTOR抑制剂处理囊胚不可提高移植成功率，C错误； D、该研究可为体外培养胚胎的非冷冻保存提供理论基础，保存胚胎可以适当抑制mTOR活性，D正确。 故选C。 3．甘加藏羊是甘肃高寒牧区的优良品种，是季节性发情动物，每年产羔一次，每胎一羔，繁殖率较低。为促进畜牧业发展，研究人员通过体外受精、胚胎移植等胚胎工程技术提高藏羊的繁殖率，流程如下图。下列叙述错误的是（    ） A．藏羊甲需用促性腺激素处理使其卵巢卵泡发育和超数排卵 B．藏羊乙的获能精子能与刚采集到的藏羊甲的卵母细胞受精 C．受体藏羊丙需和藏羊甲进行同期发情处理 D．后代丁的遗传物质来源于藏羊甲和藏羊乙 【答案】B 【分析】胚胎移植基本程序主要包括：1、对供、受体的选择和处理。2、配种或人工授精。3、对胚胎的收集、检查、培养或保存。4、对胚胎进行移植。5、移植后的检查。 【详解】A、促性腺激素能作用于卵巢，藏羊甲需用促性腺激素处理使其卵巢卵泡发育和超数排卵，A正确； B、从卵巢中刚采集的卵母细胞需培养成熟（减数第二次分裂中期）后才可与获能的精子进行体外受精，B错误； C、在胚胎移植前要对接受胚胎的受体和供体进行同期发情处理，使受体的生理状况相同，因此受体藏羊丙需和藏羊甲进行同期发情处理，C正确； D、后代丁是由藏羊甲的卵细胞和藏羊乙的精子结合形成的受精卵发育而来，因此后代丁的遗传物质来源于藏羊甲和藏羊乙，D正确。 故选B。 4．科学家通过培育小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞，成功获得了“1母亲0父亲”的雌性小鼠，且该雌性小鼠能正常生殖产生后代，有关技术如图所示。下列相关叙述错误的是（　　） A．用雌激素对母鼠进行超数排卵处理可以获得更多的卵母细胞 B．图中过程①②的分裂方式分别为减数分裂和有丝分裂 C．用于过程③的细胞取自孤雌单倍体囊胚中的内细胞团 D．第2阶段的卵子为次级卵母细胞，过程④为减数分裂Ⅱ的部分过程 【答案】A 【分析】分析题图：第1阶段，未减数分裂的卵母细胞经相关酶处理并刺激其进行过程①所示的减数分裂形成卵细胞，体外培养的卵细胞进行过程②所示的有丝分裂和细胞分化形成孤雌单倍体囊胚，从该囊胚中取内细胞团通过过程③体外构建孤雌单倍体胚胎干细胞。第2阶段，孤雌单倍体胚胎干细胞入卵后，形成雄原核的同时，卵子完成减数分裂Ⅱ，排出第二极体，形成雌原核，第2阶段原核形成的图中有两个极体、雌原核和雄原核，说明卵母细胞已完成了减数分裂。 【详解】A、超数排卵是指应用外源的促性腺激素，诱发卵巢排出比自然情况下更多的成熟卵子，因此用促性腺激素对母鼠进行超数排卵处理可以获得更多的卵母细胞，A错误； B、图中过程①分裂的结果形成的是卵细胞，其分裂方式为减数分裂；过程②分裂的结果形成的孤雌单倍体囊胚细胞的染色体数目与卵细胞的相同，其分裂方式为有丝分裂，B正确； C、聚集在胚胎一端的细胞形成内细胞团，将来发育为胎儿的各种组织，沿透明带内壁扩展和排列的细胞称为滋养层细胞，将来发育为胎膜和胎盘，所以过程③体外构建孤雌单倍体胚胎干细胞时，取自孤雌单倍体囊胚中的内细胞团，C正确； D、图中第2阶段，将孤雌单倍体胚胎干细胞注入卵子的过程相当于体外受精，因此第2阶段的卵子为次级卵母细胞，过程④原核形成的图中有两个极体，说明过程④为减数分裂Ⅱ的部分过程，D正确。 故选A。 5．中国空间站在国际上首次实现干细胞在太空早期造血。在太空培养的干细胞呈现出优于地面的生长方式，在微重力环境中干细胞的体外培养更接近于胚胎内干细胞的增殖与分化。下列关于干细胞的叙述，不正确的是（　　） A．造血干细胞只能分化为特定的细胞或组织 B．诱导多能干细胞应用前景优于胚胎干细胞，但临床应用会有导致肿瘤发生的危险 C．可以借助载体将特定基因导入已分化的B细胞或成纤维细胞转化而来 D．干细胞的分化会导致细胞形态结构及遗传物质改变 【答案】D 【分析】干细胞的分类：（1）胚胎干细胞：具有形成完整个体的分化潜能。（2）成体干细胞：具有分化出多种细胞组织的潜能，如神经干细胞可分化为各类神经细胞，造血干细胞可分化为红细胞、白细胞等各类血细胞。 【详解】A、造血干细胞具体组织特异性，造血干细胞只能分化为特定的细胞或组织，A正确； B、诱导多能干细胞的诱导过程中无须破坏胚胎，而且诱导多能干细胞可以来源于病人自身的细胞，将它移植回病人体内后，理论上可以避免免疫排斥反应，诱导多能干细胞应用前景优于胚胎干细胞，但若分化失控可能导致肿瘤，B正确； C、可以通过载体导入特定基因（如Oct4、Sox2等）可使已分化的B细胞或成纤维细胞重编程为多能干细胞，C正确； D、干细胞的分化实质是基因的选择性表达，不会导致遗传物质改变，D错误。 故选D。 6．近年来国内第三代试管婴儿技术快速发展，已被广泛应用于不孕不育夫妇和遗传病患者的生育。如图为培育试管婴儿的两条途径。下列叙述错误的是（　　） A．①过程中精子需要在获能液中获能后才能与成熟的卵细胞受精 B．②过程中需要在培养早期胚胎的培养液中加入血清 C．途径1中，胚胎移植前通常选择囊胚的内细胞团细胞进行基因检测 D．途径1和途径2都要进行胚胎检测，但二者检测的目的不同 【答案】C 【分析】1、试管婴儿是指用人工的方法使精子与卵细胞在体外的试管中结合形成受精卵并进行早期胚胎发育，然后把胚胎移植进母体的子宫内，胚胎和胎儿的发育在子宫中进行，直至发育成熟，分娩产出。可见，“试管婴儿”的生命始于受精卵，受精的部位是试管，其胚胎发育的主要场所是子宫，试管只是初期发育的场所。 2、生殖细胞包括睾丸产生的精子和卵巢产生的卵细胞，含精子的精液进入阴道后，精子缓慢地通过子宫，在输卵管内与卵细胞相遇，有一个精子进入卵细胞，与卵细胞相融合，形成受精卵。 【详解】A、精子获能后才能与成熟的卵细胞受精，可将精子培养在人工配制的获能液中使其获能，A正确； B、②过程为早期胚胎培养，该过程需要在培养液中加入血清，以满足细胞生命活动的需要，B正确； C、胚胎移植前通常选择囊胚的滋养层细胞进行基因检测，C错误； D、途径1和途径2分别是设计试管婴儿技术和试管婴儿技术，试管婴儿技术对胚胎检测的目的是质量检查，而设计试管婴儿技术对胚胎检测的目的是进行遗传学诊断，以获得符合人们要求的胚胎，D正确。 故选C。 7．肉羊良种繁育技术的应用可提高羊的生长速度、肉质以及疾病抵抗力，有效促进品种改良和遗传资源的优化。人工授精技术是肉羊良种繁育中的重要手段。下列叙述正确的是（    ） A．从雌性肉羊的卵巢中采集卵母细胞后应立即进行体外受精 B．冷冻精子在解冻、离心分离后，注入ATP溶液可使精子获能 C．对受体母羊与供体肉羊需要饲喂激素来进行同期发情处理 D．经选择早期胚胎移植产生的后代，其遗传特性与受体不同 【答案】D 【分析】①体外受精的主要步骤：卵母细胞的采用和培养、精子的采集和获能、受精。 ②精子与卵子在体外受精后，应将受精卵移入发育培养基中继续培养，发育培养基的成分：无机盐和有机盐，还需添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养成分，以及血清等物质。 【详解】A、卵巢中采集卵母细胞需培养到MⅡ后进行体外受精，A错误； B、精子在获能液中进行获能处理，B错误； C、激素处理采用注射，不能饲喂，C错误； D、经选择早期胚胎移植产生的后代，遗传物质来自提供精子与卵细胞的个体，其遗传特性与受体不同，D正确。 故选D。 8．某极度濒危的爬行类物种仅余少量雄性个体，科研团队早前已保存其雄性个性的精子，并借助体外受精技术获得胚胎，现欲将该胚胎移植至同种健康雌性体内助其繁衍。下列叙述错误的是（　　） A．从卵巢采集的卵母细胞经获能处理后才可与精子体外受精 B．胚胎分割时需注意对内细胞团均等分割以保障胚胎发育潜能 C．胚胎移植前需对受体雌性进行同期发情处理以营造适宜环境 D．胚胎移植所产子代的遗传特性主要取决于雄性精子和雌性供体的卵细胞 【答案】A 【分析】①体外受精技术主要包括卵母细胞的采集、精子的获取和受精等步骤。采集到的卵母细胞和精子，要分别在体外进行培养成熟和获能处理，然后才能用于体外受精。②胚胎移植的基本程序包括：对供体和受体的选择和处理（同期发情处理，超数排卵处理）、配种或进行人工授精、对胚胎的收集、检查、培养或保存、进行胚胎移植，以及移植后的检查等步骤。③在囊胚阶段进行胚胎分割时，要注意将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。 【详解】A、采集的精液中的精子没有受精能力，体外受精前需要对精子进行获能处理，从卵巢采集的卵母细胞需进行培养至成熟，但不需要进行获能处理，A错误； B、胚胎分割时需注意对内细胞团均等分割以保障胚胎发育潜能，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育，B正确； C、为保证胚胎移植前后所处生理环境一致，应对受体雌性进行同期发情处理，以营造适宜环境，C正确； D、借助体外受精技术获得的胚胎，其细胞中的遗传物质主要来自雄性精子和雌性供体的卵细胞，因此胚胎移植所产子代的遗传特性主要取决于雄性精子和雌性供体的卵细胞，D正确。 故选A。 9．中国科学家将可表达绿色荧光蛋白的供体猴的胚胎干细胞注射至与其遗传信息不同的猴胚胎中，形成嵌合胚胎，得到嵌合体猴。下列叙述正确的是（    ） A．实验过程所需的胚胎干细胞可取自囊胚中的滋养层细胞 B．体外培养嵌合胚胎需在含有95%O₂和5%CO₂的气体环境中 C．胚胎干细胞与受体胚胎细胞同步分化是因为遗传物质发生了融合 D．检测绿色荧光细胞的分布及比例可反映实验猴的嵌合程度 【答案】D 【分析】胚胎干细胞简称ES或EK细胞，来源于早期胚胎或原始性腺（即囊胚期的内细胞团）。特点：具有胚胎细胞的特性，体积较小，细胞核大，核仁明显；在功能上，具有发育的全能性，可分化为成年动物任何一种组织细胞。另一方面，在体外培养条件下，ES细胞可不断增殖而不发生分化，可进行冷冻保存，也可以进行某些遗传改造。 【详解】A、胚胎干细胞可取自囊胚中的内细胞团，滋养层细胞将来发育成胎膜和胎盘，A错误； B、体外培养动物细胞需在含有95%空气和5% CO2的气体环境中，空气中的O2为细胞呼吸所需要，CO2可维持培养液的pH，B错误； C、胚胎干细胞与受体胚胎细胞融合后，遗传物质并没有发生融合，只是两种细胞共同发育，C错误； D、因为供体猴的胚胎干细胞可表达绿色荧光蛋白，所以检测绿色荧光细胞的分布及比例可反映实验猴的嵌合程度，D正确。 故选D。 10．下列有关动物细胞培养和胚胎发育的叙述，正确的是（    ） A．动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植 B．体外培养的大多数细胞能够悬浮在培养液中生长 C．卵裂期胚胎中细胞数目和有机物总量在不断增加 D．桑葚胚从透明带中伸展出来的过程称为“孵化” 【答案】A 【分析】1、受精过程为：顶体反应→穿越放射冠→穿越透明带（透明带反应）→卵细胞膜反应（卵黄膜封闭作用）→卵子完成减数第二次分裂并释放第二极体→雌雄原核的形成、核膜消失，雌、雄原核融合形成合子→第一次卵裂开始； 2、胚胎发育过程： （1）卵裂期：细胞进行有丝分裂，数量增加，胚胎总体积不增加； （2）桑葚胚：32个细胞左右的胚胎（之前所有细胞都能发育成完整胚胎的潜能属全能细胞）； （3）囊胚：细胞开始分化，其中个体较大的细胞叫内细胞团将来发育成胎儿的各种组织；而滋养层细胞将来发育成胎膜和胎盘；胚胎内部逐渐出现囊胚腔（注：囊胚的扩大会导致透明带的破裂，胚胎伸展出来，这一过程叫孵化）； （4）原肠胚：内细胞团表层形成外胚层，下方细胞形成内胚层，由内胚层包围的囊腔叫原肠腔。（细胞分化在胚胎期达到最大限度）。 【详解】A、动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难，而胚胎细胞分化程度低，全能性容易表达，所以动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植，A正确； B、体外培养的大多数细胞需要贴附在某些基质表面才能生长增殖，称为贴壁生长，而不是悬浮在培养液中生长，B错误； C、卵裂期胚胎中细胞数目不断增加，但胚胎总体积基本不变或略有减小，由于细胞呼吸不断消耗有机物，所以有机物总量在不断减少，C错误； D、囊胚从透明带中伸展出来的过程称为“孵化”，而不是桑葚胚，D错误。 故选A。 1 / 1 学科网（北京）股份有限公司 $$ 猜押07 生物技术相关问题 猜押考点 3年真题 考情分析 押题依据 细胞的结构及功能 2024年北京卷第17、19题 2023年北京卷第17、20题 2025年新高考生物新结构体系下，生物技术类题目以综合性的考查学生的思维能力和推理能力为主；以问题为抓手，创新设问方式，搭建思维平台，引导考生思考。 题目更加注重综合性、应用性、创新性，且是综合性比较强，本题分值正常，试题容量一般，部分以选择题呈现，部分以非选择题呈现，对学科核心素养的考查比较深入。 生物技术类的题型要求考生在阅读理解的基础上，依据题目提供的信息，联系所学的知识和方法，实现信息的迁移，达到灵活解题的目的；对这部分内容的考查，多借助图形、情境信息或者生活实际发酵工程，基因工程等内容，且涉及到基因工程部分的内容常与遗传变异等内容综合考查。 难度适中，可以预测2025年新高考大题命题方向将会进行比较综合的考查。 题型1 细胞工程 1．（2025·北京房山·一模）利用植物体细胞杂交技术培养番茄—马铃薯杂种植株，过程如图。下列说法正确的是（    ） A．过程①需要使用胰蛋白酶和果胶酶处理两种细胞 B．过程②可以使用PEG或灭活病毒诱导促使其融合 C．可利用细胞膜表面荧光标记颜色筛选融合原生质体 D．过程④的培养基中需加入植物激素来诱导脱分化和再分化 2．（2025·北京房山·一模）中国科学院研究团队利用相关生物学技术，成功培育出世界上首例只有双雌来源的孤雌小鼠和双雄来源的孤雄小鼠，实现了哺乳动物的同性繁殖，实验流程如图所示。下列描述错误的是（    ） A．上述过程培育获得的孤雄小鼠的性染色体组成为XY B．甲囊胚内细胞团均等分割可获得具有相同遗传物质的孤雌小鼠 C．孤雄小鼠的获得利用细胞工程、基因工程、胚胎工程相关技术 D．上述技术为拯救仅存单一性别的濒危哺乳动物提供了可能性 3．（2025·北京朝阳·一模）胚胎干细胞（ES）需接种在单层的饲养层细胞上才能保持未分化状态并增殖。向培养液中添加白血病抑制因子（LIF）可代替饲养层细胞的作用。相关叙述错误的是（    ） A．饲养层细胞增殖时会发生接触抑制 B．饲养层细胞能与ES进行信息交流 C．LIF可影响ES的基因选择性表达 D．LIF的主要作用是为ES提供营养 4．某科研小组欲通过克隆技术实现优质肉牛的快速繁殖，如图为利用体细胞核移植技术克隆优质肉牛的实验流程。下列叙述错误的是（    ） A．获得克隆动物属于无性生殖，原理是已分化动物体细胞的细胞核具有全能性 B．供体细胞培养需在无菌无毒环境中进行，且需添加5%CO2维持培养液的pH C．①为显微操作去核，②为胚胎移植，移植前代孕母牛需进行同期发情处理 D．克隆牛的遗传物质一半来自优质肉牛，一半来自供体母牛，具有二者优良性状 5．自养微藻绿色巴夫藻能够产生不饱和脂肪酸EPA和DHA，兼养（既能自养又能异养）微藻四鞭藻只能产生EPA。科研人员利用PEG诱导两种微藻的原生质体融合，经过筛选获得了融合藻株。下列叙述错误的是（    ） A．制备原生质体前需利用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁 B．原生质体融合具有随机性，只考虑两两融合最多有4种细胞 C．PEG融合法可用于诱导植物原生质体融合和动物细胞融合 D．原生质体融合技术有助于打破生殖隔离、实现远缘杂交育种 6．体细胞核移植技术在推动我国肉牛遗传育种发展上起到关键作用，下列有关叙述错误的是（    ） A．供体细胞需来自遗传性状优良的个体 B．采用紫外线短时间照射卵母细胞可达到去核的目的 C．利用Ca2+载体或电刺激可激活重构胚 D．选择原肠胚进行胚胎分割可提高胚胎利用率 7． PSMA是一种在前列腺癌变细胞中高度表达的蛋白质。CD28是一种细胞表面受体，主要在T细胞的激活和免疫应答中起关键作用。某实验室构建了 PSMA 和CD28的双特异性单克隆抗体，旨在让T细胞定向杀伤前列腺癌变细胞。下列叙述正确的是（　　） A．可让同时产生抗 PSMA 和抗CD28的抗体的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞结合，以获得杂交瘤细胞 B．对杂交瘤细胞进行抗体——抗原检测时，可向培养基中加入PSMA或CD28 C．T细胞定向杀伤前列腺癌变细胞体现了机体的免疫防御功能 D．PSMA的合成是基因选择性表达的一种体现 8． 2024年9月25日，我国科学家邓宏魁研究团队在国际上首次报告了利用化学重编程诱导多能干细胞（CiPS）制备的胰岛细胞移植，实现了1型糖尿病的临床功能性治愈。具体治疗过程见下图，下列有关说法错误的是（    ） A．脂肪细胞变为CiPS细胞与CiPS细胞变为胰岛细胞，两者的实质是基因选择性表达 B．脂肪细胞变为CiPS细胞的过程与植物组织培养中的脱分化过程，是类似的 C．上图中的脂肪细胞、CiPS细胞、胰岛细胞的核DNA，是完全相同的 D．该治疗过程说明细胞分化具有可逆性，分化后的细胞在体内可恢复为初始状态 9．马铃薯四倍体栽培种（4n=48）易感染青枯病，而马铃薯野生型（2n=24）有青枯病抗性基因，科研人员利用图示操作技术培养了抗病型马铃薯栽培种。下列说法正确的是（　　）    A．制备原生质体时需要用胰蛋白酶将植物细胞分散成单个细胞 B．诱导原生质体融合时可以在无菌水中采用PEG融合法或电融合法 C．可以通过镜检观察染色体数目来初步筛选含青枯病抗病基因的融合原生质体 D．抗病型马铃薯栽培种为异源三倍体植株，因联会紊乱不能形成配子 10．在保护粤东黑猪遗传资源的各项生物技术中，体细胞核移植技术因具有继承亲本性状完整、实验周期短、保种效力强的优点而备受关注，下图为部分操作流程。有关分析错误的是（　　） A．需从卵巢中获取卵母细胞并培养至MⅡ期 B．蛋白酶合成抑制剂可用于激活重构胚 C．重构胚移植前需对杜洛克母猪进行同期发情处理 D．仔猪的遗传物质有少部分来自杜洛克母猪 11．免疫组化（IHC）是通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内的抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，在单克隆抗体制备中有广泛应用。在筛选杂交瘤细胞时，可使用某个针对特定抗体的抗原进行IHC，若杂交瘤细胞产生了目标抗体，则在IHC中可以观察到信号。下列叙述错误的是（    ） A．推测IHC利用了抗体与抗原之间特异性结合的原理 B．单克隆抗体能够准确地识别抗原的细微差异，可用作诊断试剂 C．制备单克隆抗体时，需从分子水平筛选能产生多种抗体的杂交瘤细胞 D．经过IHC筛选后的杂交瘤细胞既能无限增殖，又能分泌目标抗体 12．科研团队为了研究番茄抗虫基因（SIJA2）的功能，进行了相关实验。图1为SUJA2基因过表达番茄（OE）构建的过程，图2为SIJA2基因敲除突变番茄（KO）构建的部分过程。    (1)图1中，为保证过程①获得的SIJA2基因与载体正确连接形成重组质粒，需在SIJA2基因上游添加限制酶 的识别序列；在过程 用钙离子可以提高SLJA2基因导入受体细胞的几率。在过程⑤中需通过调整 （填激素名称）的比例获得SIJA2基因过表达番茄（OE）。 (2)图2中，要准确敲除SLJA2基因，需设计正确的向导RNA（sgRNA），才能准确引导Cas9蛋白切割SLJA2基因。设计sgRNA需要的信息及运用的原理是 。 (3)科研人员将OE、KO以及未处理（WT）三组番茄进行一系列实验，定期测量相关数据，记录于下表：（注：“+”的数目代表程度或数量变化） 组别 SIJA2基因表达量 抗虫性 生长速率 产量 OE +++ +++ +++ ++++ KO - + + + WT + ++ ++ ++ 与WT组相比，实验组OE组和KO组的设置分别采用了自变量控制中 、 （填科学方法）。据表分析SLJA2基因的表达量及性状的变化，可以得出结论： （答2点）。 题型2 基因工程 1．（2025·北京房山·一模）高中生物学实验中，有关酒精的使用错误的是（    ） A．在脂肪检测实验中，用酒精溶液洗去多余染液 B．利用无水乙醇对绿叶中的色素进行提取和分离 C．在植物组织培养中，用酒精对外植体进行消毒 D．利用不同物质在酒精溶液中溶解性的差异粗提DNA 2．（2025·北京顺义·一模）转基因抗虫棉的Bt蛋白在细胞质积累，可能与内源蛋白相互作用，产生非期望效应。C蛋白能结合纤维素，科研人员将C基因与Bt基因连接构建融合基因（如图）导入棉花细胞。相关叙述正确的是（    ） A．使用DNA聚合酶催化C基因和Bt基因连接 B．选择引物2和4进行PCR以确定基因正确连接 C．可通过花粉管通道法将融合基因导入棉花细胞 D．融合基因表达可促进Bt蛋白在细胞膜定向积累 3．（2025·北京通州·模拟预测）孟德尔说：“任何实验的价值和效用，取决于所使用材料对于实验目的的适合性。”下列实验材料选择不适合的是（　　） A．用洋葱鳞片叶提取和分离叶绿体中色素 B．用洋葱根尖分生区观察细胞的有丝分裂 C．用洋葱鳞片叶表皮观察细胞的质壁分离 D．用洋葱鳞片叶进行DNA的粗提取与鉴定 4．下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（    ） A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会升高 B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA C．DNA在不同浓度NaC1溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物 D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可用于DNA的鉴定 5．赖氨酸可促进人体发育、增强免疫力，并能提高中枢神经系统的功能。科研人员欲将玉米种子中的某种蛋白酶改造成M酶，M酶通过催化生成赖氨酸的相应代谢过程，从而大大提高玉米种子中赖氨酸的含量，以培育出高赖氨酸含量的玉米新品种。下列有关叙述正确的是（　　） A．赖氨酸是人体的必需氨基酸，M酶中赖氨酸含量高，从而提高了玉米新品种中的赖氨酸含量 B．上述改造属于蛋白质工程，即根据M酶功能设计其分子结构来直接改造M酶的氨基酸序列 C．利用PCR技术可在体外大量扩增M酶基因，再将扩增出的M酶基因直接导入玉米细胞 D．若利用农杆菌转化法导入M酶基因，需将其插入Ti质粒的T-DNA中以整合到玉米的染色体上 6．（2025·北京房山·一模）肿瘤细胞表面的PD-L1蛋白与T细胞表面的受体蛋白PD-1结合，抑制T细胞的活化和增殖，使得肿瘤细胞开启免疫逃逸。为了达到更好的癌症治疗效果，科研人员对此开展系列研究。 (1)机体能通过 免疫杀伤癌细胞，该过程体现了免疫系统的 功能。 (2)科研人员欲通过基因编辑技术（CRISPR-Cas9）敲除T细胞表面的受体蛋白PD-1基因，以达到治疗癌症的目的。 ①基因编辑CRISPR-Cas9技术系统主要由人工设计的gRNA和Cas9蛋白组成，gRNA可与靶序列特异性结合，Cas9蛋白对靶序列所在DNA进行剪切，gRNA和Cas9蛋白复合体的功能类似于 酶。 ②科研人员设计的gRNA能靶向识别PD-1蛋白基因，与携带Cas9基因的PX330质粒构建gRNA重组质粒。其中PX330质粒部分碱基序列及Bbs1限制酶识别序列如图1所示。 据图1分析，限制酶Bhs1切割后质粒b处黏性末端序列（5’→3’）为 。 (3)研究人员以不同的方式处理黑色素肿瘤小鼠（如图2）。 其中注射物Ⅰ为 ，组6的作用为 。图2结果说明 。 (4)CRISPR-Cas9编辑T细胞为肿瘤治疗提供了新思路，有人说“科学技术是一把双刃剑，应当审慎地使用基因编辑技术。”请你辩证分析基因编辑技术可能带来的影响 。 7．（2025·北京丰台·一模）甘蓝型油菜是我国重要的油料作物之一。黑籽油菜具有耐寒、耐旱、耐盐碱等多种优良性状，黄籽油菜种子含油量（SOC）更高，木质纤维素含量（SLC）更低，二者均可用于甘蓝型油菜的育种。 (1)甘蓝型油菜是油菜（AA，）和甘蓝（CC，）杂交得到的异源四倍体，可通过 形成含有两个 的配子。 (2)目前已克隆的黄籽基因多为隐性基因，限制了甘蓝型油菜黄籽品种的培育。科研人员新发现一株种皮颜色（SCC）为黄色的甘蓝型油菜N，通过杂交实验确认其黄色SCC基因为显性基因，极大加快了甘蓝型油菜黄籽品种的培育进程。 ①从植株N中克隆出基因D。推测D对SCC、SOC和SLC三种性状都有改善作用，为验证此推测，进行如下实验。 实验组1：构建D基因表达载体，导入黑籽油菜中； 实验组2：构建能敲除D基因的表达载体，导入 中； 对照组： 。 ②与对照组相比，实验组2的预期结果为 。 a．SCC变黄  b．SOC升高  c．SLC升高  d．SCC变黑  e．SOC降低  f．SLC降低 (3)甘蓝型油菜种子含油量的部分调控机制如图，D基因在种皮中特异性表达， 苯丙烷、类黄酮生物合成途径， 原花青素和木质纤维素含量，使种皮发生相应变化。    (4)为培育出油量高、且能保持黑籽油菜品系（K）多种优良性状的油菜新品种，请写出杂交育种流程 。 8．（2025·北京顺义·一模）学习以下材料，回答（1）～（4）题。 基因编辑技术的变革 CRISPR/Cas9系统是基因编辑技术的常用工具.由Cas9蛋白和人工设计的gRNA构成。gRNA嵌入Cas9的RNA结合区，形成稳定的RNA-蛋白复合体。gRNA可识别目标序列，引导Cas9切断DNA双链。这种情况下，细胞内原有的负责修复DNA切口的酶将“行动”起来，修复断裂的DNA（如图示）。 肝脏合成的蛋白T若发生错误折叠后，会聚集在心脏、神经等组织引发疾病。科学家研发了基于CRISPR/Cas9技术的基因治疗产品，命名为N-2001。该产品包含靶向T基因的gRNA和编码Cas9的mRNA，并由亲肝性脂质体包裹，注射到患者体内，取得一定治疗效果。但gRNA识别的序列短小，可能结合基因组中与目标序列相似的非目标序列，造成脱靶。 Cas9的两个结构域分别负责切割DNA双链中的一条，其中一个结构域失活得到nCas9，只能切割DNA中与gRNA结合的那条链。利用nCas9在目标序列的两条链上产生邻近切口，造成双链断裂，能有效减少脱靶效应。但Cas9和nCas9均是对DNA序列的直接改变，一旦发生错误难以纠正。 若使Cas9的两个结构域同时失活，则获得dCas9，dCas9虽然失去了切割DNA的能力，但仍可在gRNA的引导下定位到特定DNA序列上。以此为基础，我国科研人员通过改造获得“dCas9-Tet1”融合蛋白，将Tet1（去甲基化因子）精确地定位到抑癌基因的启动子区域，激活抑癌基因表达。研究表明，该疗法治疗的肺癌模型小鼠，抑癌基因的表达量显著升高，癌细胞增殖迁移能力均明显降低。dCas9基因编辑技术通过改变特定位点的DNA甲基化修饰，调控基因表达，为相关疾病的治疗提供了新思路。 (1)以含Cas9基因的重组质粒为模板，通过 技术扩增得到含Cas9基因的线性DNA片段，在体外转录出Cas9mRNA。 (2)由文中信息可知，N-2001输入到患者体内后，在无外源模板的情况下，其发挥作用的过程是:脂质体进入肝细胞后降解并释放Cas9mRNA→ → →T基因被Cas9剪切发生 →T蛋白含量降低。 (3)切割DNA双链时，nCas9比Cas9脱靶概率低的原因是 。 (4)DNMT是一种作用于基因启动子区域的DNA甲基化酶，通过研究确定了编码DNMT催化结构域的基因序列。请在N-2001基础上，设计一种基因编辑疗法的产品，实现对肝细胞内T基因表达的抑制 。    9．（2025·北京朝阳·一模）番茄的花是两性花，杂交育种时需进行去雄操作.耗时费力且难以避免自交污染。我国研究者利用基因工程技术开发了雄性不育番茄品系，提高了番茄杂交育种的效率。 (1)研究者选择性状优良的WT品系番茄，对在雄蕊中特异性表达的S基因进行编辑，获得S基因中增加一个碱基对的纯合突变体甲。甲花粉不成活。甲与WT杂交，F1育性正常。F1自交，F2中216株育性正常，68株雄性不育。这表明甲的雄性不育性状属于 性状，该性状的遗传遵循分离定律。 (2)为了确认雄性不育是由S基因编辑导致的，研究者使用了一种竞争性等位基因特异性PCR，该PCR体系同时含3种引物和4种探针（如图）。探针的荧光基团与淬灭基团分离时显现荧光。 ①引物3'末端与模板的严格配对对于子链的延伸至关重要。引物I和引物II的3'末端碱基分别是 。该PCR体系从第 个循环开始，复性环节中带有荧光基团的探针与模板链结合，作为引物在延伸环节中掺入子链，使产物显现荧光。 ②用该体系对F2的基因组DNA进行PCR检测，育性不同植株的检测结果为 ，证实雄性不育性状是由S基因编辑导致的。 (3)甲无法自交保种。研究者将控制子叶为紫色的显性基因与WT型的S基因插入Ti质粒的T-DNA中，两基因紧密相邻。用农杆菌转化法导入甲，获得育性恢复的纯合品系乙。请写出用甲和乙为材料，连续生产甲的最简杂交方案。 (4)研究者在野生番茄中发现一个抗病基因，拟用杂交方法将此基因引入到甲、乙品系中。从操作的简便性出发，应将抗病基因先引入甲还是乙？请说明理由。 。 10．（2025·北京丰台·一模）高粱是重要的粮食和经济作物。为加速其遗传改良进程，科研人员对载体系统的构建进行了系列研究。 (1)目的基因进入受体细胞，并在受体细胞内维持稳定和 的过程称为转化。已有研究发现，过表达植物发育调节因子（WUS、BBM、GRF、GIF等）可有效提高转化效率。 (2)科研人员欲利用上述四种调节因子加速高粱的遗传改良，构建了图1所示的三种载体，其中LB和RB分别是T-DNA的左右边界，DsRed和NPTⅡ作为 用于筛选转化成功的受体细胞，每个插入单位均需含有 。GIF是GRF的辅助因子，从蛋白质结构和功能角度推测GRF-GIF以融合基因的形式插入的原因是 。    将三种载体分别导入高粱胚中，统计结果如下表。 组别 载体 胚 愈伤组织 存活率（%） 带芽的愈伤组织 再生率（%） 转化效率（%） 1 对照载体 121 56 46.28 8 14.29 6.61 2 WUS+BBM 98 55 56.12 21 38.18 21.43 3 GRF-GIF 96 46 47.92 25 54.35 26.04 ①转化效率的计算公式为 。 ②结果显示WUS+BBM的存活率高而转化效率低，GRF-GIF则相反。对此合理的解释是 。 ③观察3月龄植物生长状况，发现WUS+BBM会造成叶片扭曲、生育能力降低等生长缺陷，而GRF-GIF与对照组相比没有明显差异，说明 。 (3)科研人员欲将CRISPR-Cas9引入上述载体系统，建立一个高效的基因编辑工具。请在图2中补充相关元件 。（CRISPR-Cas9基因编辑技术是通过人工设计的sgRNA来识别目的基因序列，并引导Cas9蛋白有效切割DNA双链，切割后DNA修复会造成基因敲除或敲入等，实现对目标基因的编辑。）    11．基因敲除是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。科学家常借助基因敲除技术，使特定的基因功能丧失，从而使部分功能被屏蔽，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。基于同源序列，来源于λ噬菌体的Red系统可通过同源重组的方式实现大肠杆菌等一系列工程菌的基因敲除。 (1)Red同源重组由λ噬菌体的exo、bet、gam3个基因组成，分别编码EXO、BET、GAM3种蛋白质，EXO为双链核酸外切酶，可以结合在双链DNA的末端，从5'向3'降解DNA单链，产生 （选填“3'”或“5'”）黏性末端；BET结合在exo外切产生的末端单链上，促进其与受体细胞内正在复制的靶序列进行同源重组，替换靶基因；GAM蛋白能够抑制受体细胞内核酸外切酶活性，进而 （选填“抑制”或“促进”）受体细胞对外源DNA的降解。 (2)Red同源重组技术要用到质粒pKD46，该质粒含有温度敏感型的复制起点oriR101，在30℃培养时可以正常复制，而高于37℃时会自动丢失；还有由ParaB启动子调控的exo、bet、gam基因，需要L-阿拉伯糖诱导表达。λ-Red系统介导的基因敲除过程如下图所示。      ①首先，要将pKD46导入处于 （某种状态）的大肠杆菌，为使pKD46在细菌内正常复制、Red重组酶正常合成，必须满足 的培养条件。过程I能用含有青霉素的培养基筛选成功导入了pKD46的大肠杆菌，这说明 。 ②然后，用PCR技术扩增卡那霉素抗性基因，PCR引物由两部分组成，靠近5'端的区域为 的序列，靠近3'端的区域与模板DNA互补，将获得的线性DNA片段导入大肠杆菌，通过同源重组将大肠杆菌基因组DNA上的特定靶基因敲除。 ③为筛选出同源重组成功（即靶基因被敲除）的大肠杆菌，过程Ⅱ所用的培养基需加入 ；然后再通过 ，把质粒pKD46除去。 (3)上述操作使得大肠杆菌基因组DNA上的靶基因被卡那霉素抗性基因取代，若想将卡那霉素抗性基因也清除，需要借助于FLP/FRT位点特异性重组系统。FRT是有方向性的，不同方向FRT位点经重组酶FLP作用结果不同，具体如下图所示。因此在PCR扩增卡那霉素抗性基因时需在该基因______。（填字母）    A．左侧引入一个FRT位点 B．右侧引入一个FRT位点 C．两侧引入两个同向的FRT位点 D．两侧引入两个反向的FRT位点 (4)确定靶基因敲除成功且pKD46除去后，再引入温敏型（温度过高时质粒丧失复制能力）质粒pCP20表达重组酶FLP，表达方式是热启动。请说明使用pCP20的优势： 。 12．大肠杆菌“蓝白斑筛选实验”的原理为：β-半乳糖苷酶（LacZ基因的表达产物）可将无色的X-Gal分解为蓝色物质，使菌落呈现蓝色；若有外源DNA片段插入载体中，则产生白色菌落，质粒载体如图1所示。回答下列问题：    (1)用于构建重组质粒的载体上含抗氨苄青霉素基因，其可作为 ，作用是 。 (2)将外源DNA质粒连接构建基因表达载体时，还需使用的工具有 ，将构建好的基因表达载体转入大肠杆菌前，需在低温、低浓度的CaCl2溶液中处理大肠杆菌，这样做的目的是 。在上述转化过程中，实际转化效率介于50%～85.7%之间，推测其原因可能与 （答出一点）有关。 (3)进行“蓝白斑筛选实验”时，将转化后的大肠杆菌采用 法接种到添加了 的固体培养基中培养获得单菌落。理论上培养基上生长的菌落都应呈现白色，但实际结果是仍有少量蓝色菌落存在，推测其原因可能是 。 (4)为判断上述推测是否正确，依据LacZ基因两端的序列设计引物，利用PCR技术进行特异性扩增，完成后常用 法来鉴定PCR产物。图2为扩增产物的鉴定结果（LacZ基因长度为1482bp），若推测正确，则图中 （填“1”或“2”）表示目标菌落。 13．研究人员在玉米自交品系中偶然发现了一雄性不育突变体ms2020，将其与野生型玉米杂交，F1均表现为雄性可育，F2中雄性可育玉米与雄性不育玉米的比例为3：1。请回答下列问题： (1)据实验结果分析，该雄性不育基因为 （填“显性”或“隐性”）基因。该对相对性状的遗传遵循 定律。 (2)已知玉米的甜度由位于9号染色体上的等位基因D、d控制，非甜对甜为显性。为了确定雄性不育基因是否也在9号染色体上，研究人员设计了如下实验，请将实验过程及预期结果补充完整。 实验过程：让纯合雄性不育非甜玉米与纯合雄性可育甜玉米杂交，F1均为雄性可育非甜玉米； 。 预期结果：若 ，则雄性不育基因在9号染色体上；若 ，则雄性不育基因不在9号染色体上。 (3)研究发现，SSR是DNA分子中的简单重复序列，非同源染色体上的SSR重复单位不同，不同品种中同一种染色体上的SSR重复次数不同，因此常用于染色体特异性标记。研究人员利用玉米2号、5号染色体上特异的SSR进行PCR扩增，亲本野生型雄性可育玉米和雄性不育突变体ms2020及其部分杂交后代的SSR电泳结果如图所示。 由图可知，雄性不育基因最可能位于 号染色体上，依据是 ；推测8号个体出现图示结果的原因可能是 。 14．科学研究表明t-PA蛋白能降解血栓，是脑血栓患者的特效药，但其促进血拴溶解的特异性不高，若将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸（密码子是UCU），获得改良的tPA蛋白，其溶解血栓的效率明显提升。图1和图2为改造t-PA蛋白基因及构建表达工体的过程。 (1)在PCR技术中高温变性的目的是 ，图1中重叠延伸时 （填“是”或“否"）需要引物。 (2)t-PA蛋白第84位的半胱氨酸对应的基因模板链碱基序列是ACA，图1中黑点表示突变位点的碱基，若要得到改良t-PA蛋白，则引物b中该位点的碱基是 。 (3)若图1得到的改良t-PA蛋白基因非模板链序列为5'-TGAACGCTA…（中间序列）…GTCGACTCG-3'。为了便于将扩增后的基因和质粒pCLY11成功构建成重组质粒，请写出用于PCR扩增的一对引物的碱基序列 （要求：至少写出10个碱基，并标注5'端），PCR的产物一般通过 来鉴定。 (4)运用乳房生物反应器可以从转基因牛的乳汁中获得t-PA改良蛋白，具体流程如图3。 过程②运用的具体方法为 ；④过程前需取 （填部位）的细胞进行性别鉴定。若改用膀胱生物反应器在尿液中获得t-PA改良蛋白，在构建基因表达载体时，需要添加 的启动子。 15．乳糖酶可被用于水解牛奶中的乳糖来生产低乳糖牛奶。普通乳糖酶热稳定差，在低温条件下才具有水解活性。为了获得高产耐高温乳糖酶的重组枯草杆菌，科研人员将bgaB基因（表达产物是一种乳糖酶）插入含有强启动子P43的质粒pZ01中，构建重组质粒pZ01-bgaB并转化至枯草杆菌中表达，主要技术路线如下图。    回答下列问题： (1)牛奶生产中一般不使用抗生素，低温下生产低乳糖牛奶过程中可能存在 ，使牛奶质量不能得到保障。科研人员在众多产乳糖酶微生物中选择了嗜热脂肪芽孢杆菌为材料获取乳糖酶基因，理由是 。 (2)pZ01上的P43是 识别和结合的部位，可驱动目的基因高效转录出mRNA。P43中含KpnI酶切位点，酶切后将失去其所必须的序列（E序列）；bgaB基因不含限制酶切割位点。据图分析，为保证bgaB基因能与pZ01正确连接并正常表达，在设计扩增bgaB基因的引物时，应在引物1的5'端添加 ；引物2的5'端添加 。 (3)过程①需用到的工具酶是 ，双酶切pZ01后回收 kb（引物5'端添加的序列长度均忽略不计）的DNA片段用于重组质粒的构建。重组质粒中保留卡那霉素抗性基因的目的是 。 16．研究发现实体肿瘤内部通常是缺氧环境，蓖麻毒紫蛋白(RTA)可作用于核糖体，使蛋白合成受阻，从而引起细胞死亡。TAT是一种短肽，可转导蛋白进入细胞，含有氧依赖性降解区域ODD(多肽)的融合蛋白可以适应低氧条件稳定存在，但在常氧条件下会被蛋白酚降解。科研人员以RTA作为抑制肿瘤细胞增殖的活性分子，利用TAT的作用将融合蛋白转运进入肿瘤细胞，并利用ODD的作用减轻RTA 对正常细胞的毒性,分别构建了含TAT-RTA(660bp)和 TAT-RTA-ODD(870bp)融合基因的表达载体，并成功得到相关融合蛋白。 (1)可通过PCR技术获取TAT-RTA融合基因，前提是根据TAT 和RTA基因设计引物，引物的作用是 。已知RTA基因部分序列如图1(a)所示：TAT 基因编码链序列为5' ATGAGCTACGGCCGTAAAAGAGACGCCAACGTACA 3': 欲得到TAT-RTA 融合基因的结构如图1(b)所示。为顺利构建表达载体，除图示外，还需具有 结构。且需在引物1、2的 端分别加入 酶切位点：要求在RTA 蛋白的前端引入TAT短肽，则引物2的前12个碱基序列为 A．5' GGATCCATGAGC 3'           B．S' GGATCCATCTTC 3' C． 5' GGATCCTACTCG 3'           D．S' CTCGAGATGAGC 3' (2)载体的部分结构如图2所示，His标签由连续的6个组氨酸构成，可用于对重组融合蛋白进行分离纯化。将PCR 得到的TAT-RTA 融合基因和载体双酶切后，再用 酶连接。但在研究时发现融合蛋白中没有 His标签蛋白。据图分析原因很可能是 ，导致 His标签基因对应的mRNA的密码子被错位读取。 (3)科研人员将得到的重组融合蛋白经腹腔给药忠实体肿瘤的小鼠，发现TAT-RTA 和 TAT-RTA-ODD融台蛋白都可以抑制患实体肿瘤小鼠肿瘤体积的增长，但TAT-RTA-ODD 的抑制效果更好，产生该实验结果的原因是 。 17．磷脂酸（PA）既是一种结构膜脂，也是植物的一个关键信号分子，为验证盐碱胁迫下植物的PA响应，研究人员构建PA荧光探针：将特异性PA结合蛋白结合域（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFD）基因通过无缝克隆技术连接构建重组DNA，导入拟南芥。DNA无缝连接的原理如图1（a），重组DNA的构建过程如图1（b），P1-P4为引物。 (1)磷脂酸是合成磷脂和三酰甘油等的原料，据此推测细胞中游离的磷脂酸聚集较多的场所是______。 A．线粒体 B．叶绿体 C．高尔基体 D．内质网 (2)关于图1（a）中T5核酸外切酶描述合理的是______。 A．作用部位是磷酸二酯键 B．可使DNA分子形成单链末端 C．可将DNA分子切割为多个片段 D．与限制性内切核酸酶活性中心相同 (3)图1中①处需使用的酶为 （编号选填），②处需使用的酶应为 （编号选填）。 ①RNA聚合酶  ②DNA解旋酶  ③DNA连接酶  ④限制性内切核酸酶  ⑤核酸外切酶 (4)图1（b）中引物P1的碱基序列也会存在于引物 。（编号选填）。 ①P2  ②P3  ③P4 (5)以下是在拟南芥受体细胞组织培养的培养基中所添加的物质，这些物质中不属于营养成分的有 （编号选填）。 ①琼脂  ②生长素  ③硝酸铵（NH4NO3）  ④草铵膦  ⑤甘氨酸  ⑥氯化钙（CaCl2） 绿色荧光蛋白的发色团受到光子辐射后吸收能量从低能级状态跃迁到高能级状态，高能级状态不稳定，再跃迁至低能级状态过程中发出绿色荧光，原理如图2（a）。在等量光子辐射和相同盐碱胁迫下，与仅转入GFD基因的拟南芥相比，转入PABD-GFD融合基因的拟南芥发出的绿色荧光明显增强。（已知PABD不影响GFD的荧光强度） (6)等量光子辐射下，转入PABD-GFD融合基因的拟南芥绿色荧光增强是因为在高能级向低能级状态跃迁过程中释放的能量 （更多/更少）用于非辐射能量的损耗。 (7)若实验结果说明盐碱胁迫下植物PA发生了响应。尝试解释：为什么转入PABD-GFD融合基因的拟南芥经上述处理后，绿色荧光较仅转入GFD基因的拟南芥增强，且随处理时间增加荧光强度会发生如图2变化？ 。 题型3 发酵工程 1．（2025·北京房山·一模）发酵制作酱油在我国具有悠久的历史。某企业通过发酵制作酱油的流程示意图如下。下列叙述错误的是（    ）    A．大豆中的蛋白质可为菌种生长提供碳源、氮源 B．该过程利用乳酸菌、酵母菌等微生物的有氧呼吸 C．发酵罐和原料需要灭菌，加盐可调味并防止杂菌滋生 D．米曲霉分泌蛋白酶、淀粉酶等利于原料中有机物的分解 2．（2025·北京顺义·一模）大肠杆菌在伊红-亚甲蓝琼脂培养基（EMB）上会形成有金属光泽的深紫色菌落。利用EMB鉴定自制酸奶中的大肠杆菌，相关操作错误的是（    ） A．培养基经湿热灭菌后再倒平板 B．将酸奶样品稀释后涂抹在EMB表面 C．观察菌落颜色进行初步鉴定 D．将使用过的培养基直接丢弃 3．（2025·北京顺义·一模）取样调查法强调从总体中抽取样本调查，并根据样本数据推断总体特征。下列研究活动中，没有采用取样调查法的是（    ） A．测定土壤中尿素分解菌的数量 B．研究土壤中小动物类群丰富度 C．调查人群中红绿色盲发病率 D．我国开展的七次全国人口普查 4．（2025·北京丰台·一模）研究者对比了家庭米酒制作与工业化啤酒生产的微生物调控策略。相关叙述正确的是（    ） A．两者均需对原料进行严格灭菌以保证单一菌种的优势 B．两种工艺均需在发酵后期降低温度以加速产物的生成 C．米酒制作中酵母菌的繁殖与产乙醇阶段对氧气的需求不同 D．啤酒生产的主发酵阶段需持续通入无菌空气以促进乙醇合成 5．（2025·北京通州·模拟预测）青霉菌处在葡萄糖浓度不足的环境中时，会通过分泌青霉索杀死细菌，以保证自身生存所需的能量供应。关于青霉索的工业化生产过程叙述错误的是（　　） A．青霉素有杀菌作用发酵罐不需灭菌 B．深层通气液体发酵技术可提高产量 C．高产菌株扩大培养后接种到发酵罐中 D．发酵液中的碳源不宜使用葡萄糖 6．甲乙两个生物小组的“酵母菌纯培养”结果如图所示。下列说法正确的是（　　） A．两组平板都分成4个区进行划线 B．甲组操作过程需4次灼烧接种环 C．乙组适合对酵母菌活菌进行计数 D．单菌落大小反映菌种种类差异 7．（2025·北京·一模）琥珀酸是一种天然有机酸，广泛应用于制药、食品等行业。产琥珀酸放线杆菌（SW）生长的最适pH为7.0，能利用糖类发酵生产琥珀酸，但耐酸能力较弱。 (1)培养SW的培养基包含水、NaCl、K2HPO4、葡萄糖、蛋白胨等成分，其中葡萄糖为SW提供 。 (2)有些微生物进化出由GadC和GadB组成的Gad系统以抵抗酸胁迫。研究人员将编码Gad系统的基因导入SW中，拟获得耐酸性强的重组菌株GSW（如图1）。当外界环境pH降低时，启动Gad系统，运到细胞内的谷氨酸（Glu）转化为γ-氨基丁酸（GABA）运出细胞，此过程 ，同时运出细胞的H+也减少，从而缓解酸胁迫。 (3)研究人员对SW、GSW进行耐酸性实验测定。 ①首先将等量菌液分为两组，分别接种到含或不含 且pH为4.6的液体培养基中培养1.5 h。 ②将上述菌液进行 后，依次分别涂布于pH为7的固体培养基上，37℃培养24 h，图2所示结果说明GSW菌株耐酸能力明显提高。此步骤配制的固体培养基pH为7而非4.6，目的是 。 (4)若要确定GSW菌株是否适用于工业生产，还需检测 。 8．（2025·北京石景山·一模）铜绿假单胞菌（P菌）易对抗生素产生耐药性，导致现有治疗P菌感染的效果不佳。P菌有两类，其中Pa菌能产生脓毒素S蛋白，杀死不能产生S蛋白的Pb菌。研究者尝试改造S蛋白用于靶向治疗P菌感染，并利用近红外光控制工程菌精准放药。 (1)将Pa菌接种于固体培养基中获得 ，再利用液体培养基进行 ，收集发酵液分离得到S蛋白并分析其结构与功能。 (2)如图1所示，S蛋白的R、U、T功能区可协同将S蛋白特异性转入Pb菌，N能降解Pb菌中DNA。Pa菌能表达Is蛋白与S蛋白形成复合物，保护自身免受S蛋白的毒害。大肠杆菌分泌的抗生素E的功能区C会使核糖体失活，IE可与E形成保护自身的复合物。用 （填酶的名称）构建重组质粒，导入Pa菌中获得工程菌，生产嵌合脓毒素S′蛋白。    用S和S′蛋白分别对Pa菌、Pb菌和大肠杆菌进行抑菌试验，观察抑菌圈出现情况，证实S′蛋白可作为靶向治疗P菌感染的药物。请写出抑菌试验的结果 。 (3)为使工程菌在特定的部位释放S′蛋白，研究者构建图2所示的表达载体。其工作原理为：黑暗条件下，菌体中c-di-GMP浓度低，不能产生裂解蛋白L。近红外光照射激活启动子R， ，进而激活启动子P，合成的Q蛋白 。裂解蛋白L积累到一定量时，工程菌裂解，从而释放S′蛋白。    (4)若要将构建的工程菌用于治疗伤口的P菌感染，在临床应用前，还需要 。 9．细菌的接合生殖与细菌的质粒F因子有关。有F因子的菌株为雄性，没有的为雌性。F因子携带的基因表达可以使细菌产生仅用于接合生殖的性菌毛，见图1。具有游离F因子的细菌称为F+菌株。部分细菌中F因子可以整合到细菌拟核DNA上，成为Hfr菌株。Hfr菌株的F因子可能从拟核DNA上脱离下来，又变成游离的F因子。这种脱离下来的F因子上携带了部分拟核DNA基因，使菌株成为F＇菌株。不存在F因子的雌性菌株称为F菌株。    (1)雄性菌株与雌性菌株接合时，雄性菌株的性菌毛同雌性菌株紧密连接在一起，然后F因子的一条链被切开，这条链会进入雌性菌株内，在雌性菌株内进行复制，形成一个新的F因子。留在雄性菌株内的F因子单链也会DNA复制成双链。因此，F＇菌株和F菌株接合生殖后，菌株的种类是 。虽然细菌存在接合生殖的方式，但是自然界中雌雄菌株的数量依然保持均衡，结合所学知识，请推测其原因： 。 (2)Hfr菌株在和F-菌株接合时，仅有部分F因子片段和部分拟核DNA片段进入雌性菌株内，因为进入F-菌株的F因子片段不完整，使接合后的F-菌株不具有雄性菌株的特点，既接合后的细菌种类依然是Hfr行菌株和F-菌株。但在这一过程中， 菌株拟核DNA发生了 ，有利于细菌的进化。 (3)细菌利用乳糖的机制如下图所示，当存在乳糖时，乳糖可以和阻遏蛋白结合，导致阻遏蛋白无法和操纵基因结合，启动乳糖利用相关基因的表达。某雌性菌株的调节基因发生突变，导致其表达的阻遏蛋白无法与乳糖结合。若这个菌株与F因子携带了正常调节基因的F＇菌株进行接合生殖，请分析接合后这个菌株能否利用乳糖，并说明原因： 。    题型4 胚胎工程 1．（2025·北京·一模）我国科研人员成功地将大熊猫皮肤成纤维细胞培养成诱导多能干细胞（iPSC），这些iPSC注入小鼠体内后逐渐形成了一个包括神经、肌肉和上皮组织的团块。下列叙述错误的是（    ） A．动物细胞培养技术是获得iPSC的基础 B．细胞培养基中应含有糖类和动物血清等 C．iPSC注入小鼠体内属于细胞融合技术 D．iPSC可用于心血管等疾病治疗的研究 2．（2025·北京朝阳·一模）mTOR是一种对细胞生长和增殖有调节作用的胞内蛋白激酶。抑制mTOR活性可使小鼠囊胚的内细胞团增殖减慢，进而导致胚胎发育停滞；当mTOR被重新激活时，囊胚恢复正常发育。相关叙述错误的是（    ） A．通过体外受精和胚胎培养技术可获得小鼠囊胚 B．囊胚移植到受体母鼠前要进行受体发情处理 C．移植前用mTOR抑制剂处理囊胚可提高移植成功率 D．该研究可为体外培养胚胎的非冷冻保存提供理论基础 3．甘加藏羊是甘肃高寒牧区的优良品种，是季节性发情动物，每年产羔一次，每胎一羔，繁殖率较低。为促进畜牧业发展，研究人员通过体外受精、胚胎移植等胚胎工程技术提高藏羊的繁殖率，流程如下图。下列叙述错误的是（    ） A．藏羊甲需用促性腺激素处理使其卵巢卵泡发育和超数排卵 B．藏羊乙的获能精子能与刚采集到的藏羊甲的卵母细胞受精 C．受体藏羊丙需和藏羊甲进行同期发情处理 D．后代丁的遗传物质来源于藏羊甲和藏羊乙 4．科学家通过培育小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞，成功获得了“1母亲0父亲”的雌性小鼠，且该雌性小鼠能正常生殖产生后代，有关技术如图所示。下列相关叙述错误的是（　　） A．用雌激素对母鼠进行超数排卵处理可以获得更多的卵母细胞 B．图中过程①②的分裂方式分别为减数分裂和有丝分裂 C．用于过程③的细胞取自孤雌单倍体囊胚中的内细胞团 D．第2阶段的卵子为次级卵母细胞，过程④为减数分裂Ⅱ的部分过程 5．中国空间站在国际上首次实现干细胞在太空早期造血。在太空培养的干细胞呈现出优于地面的生长方式，在微重力环境中干细胞的体外培养更接近于胚胎内干细胞的增殖与分化。下列关于干细胞的叙述，不正确的是（　　） A．造血干细胞只能分化为特定的细胞或组织 B．诱导多能干细胞应用前景优于胚胎干细胞，但临床应用会有导致肿瘤发生的危险 C．可以借助载体将特定基因导入已分化的B细胞或成纤维细胞转化而来 D．干细胞的分化会导致细胞形态结构及遗传物质改变 6．近年来国内第三代试管婴儿技术快速发展，已被广泛应用于不孕不育夫妇和遗传病患者的生育。如图为培育试管婴儿的两条途径。下列叙述错误的是（　　） A．①过程中精子需要在获能液中获能后才能与成熟的卵细胞受精 B．②过程中需要在培养早期胚胎的培养液中加入血清 C．途径1中，胚胎移植前通常选择囊胚的内细胞团细胞进行基因检测 D．途径1和途径2都要进行胚胎检测，但二者检测的目的不同 7．肉羊良种繁育技术的应用可提高羊的生长速度、肉质以及疾病抵抗力，有效促进品种改良和遗传资源的优化。人工授精技术是肉羊良种繁育中的重要手段。下列叙述正确的是（    ） A．从雌性肉羊的卵巢中采集卵母细胞后应立即进行体外受精 B．冷冻精子在解冻、离心分离后，注入ATP溶液可使精子获能 C．对受体母羊与供体肉羊需要饲喂激素来进行同期发情处理 D．经选择早期胚胎移植产生的后代，其遗传特性与受体不同 8．某极度濒危的爬行类物种仅余少量雄性个体，科研团队早前已保存其雄性个性的精子，并借助体外受精技术获得胚胎，现欲将该胚胎移植至同种健康雌性体内助其繁衍。下列叙述错误的是（　　） A．从卵巢采集的卵母细胞经获能处理后才可与精子体外受精 B．胚胎分割时需注意对内细胞团均等分割以保障胚胎发育潜能 C．胚胎移植前需对受体雌性进行同期发情处理以营造适宜环境 D．胚胎移植所产子代的遗传特性主要取决于雄性精子和雌性供体的卵细胞 9．中国科学家将可表达绿色荧光蛋白的供体猴的胚胎干细胞注射至与其遗传信息不同的猴胚胎中，形成嵌合胚胎，得到嵌合体猴。下列叙述正确的是（    ） A．实验过程所需的胚胎干细胞可取自囊胚中的滋养层细胞 B．体外培养嵌合胚胎需在含有95%O₂和5%CO₂的气体环境中 C．胚胎干细胞与受体胚胎细胞同步分化是因为遗传物质发生了融合 D．检测绿色荧光细胞的分布及比例可反映实验猴的嵌合程度 10．下列有关动物细胞培养和胚胎发育的叙述，正确的是（    ） A．动物体细胞核移植的难度明显高于胚胎细胞核移植 B．体外培养的大多数细胞能够悬浮在培养液中生长 C．卵裂期胚胎中细胞数目和有机物总量在不断增加 D．桑葚胚从透明带中伸展出来的过程称为“孵化” 1 / 1 学科网（北京）股份有限公司 $$