专题八 [重点突破] 第7练 基因编辑原理、过程及应用-【步步高·考前三个月】2025年高考生物学复习讲义课件（苏冀赣）（课件PPT+word教案）

[重点突破]　第7练　基因编辑原理、过程及应用　[分值：100分] 1．(每空3分，共9分)(2019·江苏，29节选)利用基因编辑技术将病毒外壳蛋白基因导入猪细胞中，然后通过核移植技术培育基因编辑猪，可用于生产基因工程疫苗。如图为基因编辑猪培育流程，请回答下列问题： (1)为获得更多基因编辑猪，可在胚胎移植前对胚胎进行________。产出的基因编辑猪的性染色体来自______号猪。 (2)为检测病毒外壳蛋白基因是否被导入4号猪并正常表达，可采用的方法有______(填序号)。 ①DNA测序　②染色体倍性分析　③体细胞结构分析　④抗原—抗体杂交 答案　(1)分割　2　(2)①④ 解析　(1)若要获得更多基因编辑猪，可采用胚胎分割技术对移植前的胚胎进行分割。子代猪的性别取决于核供体亲本，即2号猪。(2)为了判断目的基因是否被导入受体，可采用DNA分子杂交、DNA测序等技术进行检测；判断目的基因导入受体细胞后是否成功表达出相应的蛋白质，通常采用抗原—抗体杂交法从分子水平进行检测。 2．(10分)(2024·新课标，35节选)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题： (1)(6分)限制酶切割的化学键是________________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (2)(2分)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和____________________。 (3)(2分)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是____________________。 答案　(1)磷酸二酯键　使M1与M2之间有启动子、N基因、终止子，确保N基因能够顺利表达　(2)C－G、A－T、U－A　(3)菌株B2基因组DNA 3．(13分)(2021·海南，25节选)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA(SgRNA)引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。回答下列问题： (1)(2分)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定SgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是__________。 (2)(4分)过程③～⑤中，SgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是__________。随后，Cas9蛋白可切割__________序列。 (3)(4分)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1 200 bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是________________，基因敲除成功的判断依据是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (4)(3分)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程：________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)DNA连接酶　(2)碱基互补配对　目标(目的)DNA(基因)　(3)DNA分子杂交技术　经编辑过的DNA片段(从受体细胞中提取的基因组DNA)与标记的目标(对应)基因(探针)杂交，若无杂交带，则敲除成功　(4)CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，表达产物Cas9蛋白和转录产物SgRNA，两者形成复合体；SgRNA识别并结合目标DNA序列，引导Cas9蛋白进行切割；从而将目的基因插入基因组DNA中 解析　(1)基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA连接酶，限制酶负责切割，DNA连接酶负责连接，因此为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定SgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是DNA连接酶。(2)根据题图可知：在CRISPR/Cas9基因编辑技术中，SgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9能借助SgRNA分子与目标DNA进行特异性结合的原因在于SgRNA分子上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则实现SgRNA与目标DNA特定序列的特定识别，进而定位；由此可见，Cas9在功能上属于限制酶，可切割目标DNA特定的核苷酸序列。 4．(13分)(2020·山东，25)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。 (1)(3分)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是________________________________________________________________________ ____________，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为________。 (2)(4分)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了________________________________________________________________________， 从而改变了 Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列__________(填“发生”或“不发生”)改变，原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (3)(3分)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA (Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经____________过程获得总cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出 Wx基因的cDNA，原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (4)(3分)各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为________，原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)限制性内切核酸酶和DNA连接酶　转化　(2)RNA聚合酶与启动子的识别和结合　不发生　编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子　(3)逆转录　引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)　(4)品系3　品系3的Wx mRNA量最少，控制合成的直链淀粉合成酶的量最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强 解析　(1)构建基因表达载体需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶，可以对目的基因和载体进行切割和连接，重组载体进入受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。(2)RNA聚合酶与启动子识别和结合后启动转录，启动子的序列改变会影响与RNA聚合酶的识别和结合，从而改变基因的转录，3个突变品系中改变的是启动子的序列，影响mRNA的转录，而编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含有启动子的序列，所以编码合成的直链淀粉酶的氨基酸序列不发生改变。(3)通过mRNA获得cDNA是逆转录过程。PCR过程中需要模板、原料、酶、引物等，其中引物是根据已知基因上的一段序列合成的，这样要从总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，关键是要根据Wx基因的一段已知序列合成出相应的引物。(4)据题中信息可知，水稻胚乳中直链淀粉所占比例越小，糯性越强，题图中品系3中的Wx mRNA量最少，这样合成的直链淀粉合成酶的量最少，则合成的直链淀粉所占比例最小，糯性最强。 1．(13分)(2024·宜春高三三模)油菜是我国重要的油料作物，黄籽油菜比黑籽油菜的含油量更高，色素积累更少，但我国主栽的甘蓝型油菜缺乏天然的黄籽种质资源。研究表明，TT8基因作为一个重要的基因参与了黄籽性状的形成。科研人员首次利用CRISPR/Cas9技术对甘蓝型油菜中的BnaTT8基因进行定点突变改造(如图1)，PCR扩增BnaTT8基因，构建基因表达载体(如图2)，再将重组质粒通过农杆菌转化法导入受体甘蓝型油菜甲9707(J9707)中，创建甘蓝型油菜黄籽突变体，CRISPR/Cas9介导的BnaTT8基因突变可以显著提高种子的含油量和蛋白质含量，使得用甘蓝型油菜种子生产的菜籽油的营养价值更高。请回答下列问题： (1)(2分)图1中向导RNA与BnaTT8基因按照__________原则特异性结合，Cas9蛋白切割BnaTT8基因使α链和互补链中的__________断裂，通过随机增添、删除或替换部分碱基，获得所需目的基因。 (2)(5分)PCR扩增目的基因的原理是__________，需要根据所需的BnaTT8基因设计引物，引物在DNA复制中的作用是_____________________________________________________ ________________________________________________________________________。 为保证BnaTT8基因正确插入质粒中，需要在引物的______(填“3′端”或“5′端”)添加限制酶的识别序列。 (3)(3分)图2字母A～E表示不同限制酶的切割位点，构建基因表达载体时，将BnaTT8基因插入__________(填字母)处，目的是____________________。重组质粒导入受体细胞后，可在个体水平上通过________________________________来鉴定BnaTT8基因是否表达。 (4)(3分)基于CRISPR/Cas9系统强大的精确编辑植物基因组的能力，CRISPR/Cas9基因编辑技术已经成为农业中的一个强有力的工具，科研人员在CRISPR/Cas9的基础上进行改造，开发出了可以精准实现多种碱基替换和大片段插入和删除的基因编辑工具。请写出CRISPR/Cas9及其改造的产品在科学研究中的应用：________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________(答出一点即可)。 答案　(1)碱基互补配对　磷酸二酯键　(2)DNA半保留复制　使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸　5′端　(3)C　保证BnaTT8基因可以在J9707的细胞中表达　测定(纯合)突变体成熟种子的含油量和蛋白质含量　(4)对基因进行定点突变，抑制有害基因或致病基因的表达；利用基因编辑技术对作物的淀粉含量、香味、营养价值和贮藏品质等性状进行改良或精确地去除生产上无用或不理想的性状(答出一点且合理即可) 解析　(1)题图1中向导RNA与BnaTT8基因按照碱基互补配对原则特异性结合，Cas9蛋白切割BnaTT8基因使α链和互补链中的磷酸二酯键断裂，通过随机增添、删除或替换部分碱基，获得所需目的基因。(2)PCR扩增目的基因的原理是DNA半保留复制，由于DNA的两条链反向平行，且DNA聚合酶只能使新合成的DNA子链从5′端→3′端方向延伸，所以需要根据BnaTT8基因两端的核苷酸(或碱基)序列设计特异性引物序列。为了保证BnaTT8基因正确插入质粒中，还需要在引物的5′端添加限制酶识别序列。 2．(14分)(2024·常州高三联考)Cre/LoxP重组酶系统是在基因或染色体水平上对生物基因进行遗传改造的一种技术，可以在DNA的特定序列进行定点切割和重新连接。请回答下列问题： (1)(5分)图1是利用Cre/LoxP酶系统敲除基因的过程。LoxP序列具有方向性，由中间的间隔序列和两侧的反向重复序列组成，其中决定方向的序列是__________。图1中一条DNA片段上待敲除基因的两端存在同向LoxP序列，Cre酶能识别并结合到LoxP序列的反向重复序列区，定点切断间隔序列的____________，从而实现目标基因的敲除，敲除的基因片段会形成__________(填“线状”或“环状”)结构。若经Cre酶作用使得2个LoxP位点间的序列发生反转，其原因可能是______________________________________________。 (2)(2分)Cre/LoxP酶系统可以调控基因的表达，在目的基因______________(填“上游”或“下游”)插入一个带有LoxP位点的编码终止密码子的序列，在Cre酶存在的情况下，目的基因______________(填“表达”或“不表达”)。 (3)(7分)图2是利用Cre/LoxP酶系统构建融合基因的过程。首先分别扩增Bt基因和Bar基因，以获得所需要的DNA片段，然后用Cre/LoxP酶系统处理连接后的DNA片段，获得Bt－Bar融合基因片段。PCR1过程中，所用的2种引物的结合位置分别在______________________；该过程中，还需添加的物质有____________________(至少写2种)等。有研究表明，大多数限制酶对裸露的位点不能识别切割，因此必须对识别序列5′末端进行修饰并加上一个至几个保护碱基，如GGG。由此推测，对Bar基因引物5′端序列的要求是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)间隔序列　磷酸二酯键　环状　两个LoxP序列方向相反　(2)上游　表达　(3)启动子外侧和终止子内侧　Taq DNA聚合酶、dNTP、(含Mg2＋)缓冲液　引物的5′端均要连接上LoxP序列，并在末端加上保护碱基序列(GGG) 解析　(1)两侧的反向重复序列的碱基排列顺序一致，无法确定方向，则能决定方向的只有中间的间隔序列。碱基序列之间通过磷酸二酯键连接。由于敲除的基因片段会露出相同的黏性末端，则剪出的基因两端自动碱基互补配对成环状结构。如果两个LoxP位点位于同一条DNA上且方向相反，Cre酶会使LoxP间的序列反转。(2)Cre/LoxP重组酶系统调控基因的表达，在目的基因上游插入带有LoxP位点的编码终止密码子的序列，Cre酶会对LoxP位点进行切割，终止密码子不发挥作用，因此目的基因表达。(3)启动子是决定RNA聚合酶转录起始位点的DNA序列，终止子是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列，启动子一般在目的基因的左侧，终止子在目的基因的右侧，因为要获得Bt－Bar融合基因片段，即需要Bt带上启动子(不需要终止子)、Bar带上终止子(不需要启动子)，因此在用PCR1扩增Bt基因时，所用的2种引物的结合位置在Bt的启动子外侧和终止子内侧。PCR过程中除了添加引物外，还需要添加Taq DNA聚合酶、dNTP、(含Mg2＋)缓冲液等。据图2可知，Bt－Bar融合基因片段中Bar基因的左侧和右侧都含有LoxP序列，又因为大多数限制酶对裸露的位点不能识别切割，因此必须对识别序列5′末端进行修饰并加上一个至几个保护碱基，如GGG，据此可知，对Bar基因引物5′端序列的要求是引物的5′端均要连接上LoxP序列，并在末端加上保护碱基序列(GGG)。 3．(13分)(2024·南通高三模拟)In－Fusion技术是一项新型的无缝克隆技术，技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列，通常为15～20 bp)，然后用In－Fusion酶(能识别双链线性化DNA片段5′→3′末端16个碱基，并使其降解)处理即可实现无缝连接。与传统构建重组质粒的方法相比，In－Fusion技术的优势之一是不受限制酶切割位点的限制；可以把目的基因插入任何位点；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏。它的操作步骤(如图)大致为：①利用PCR技术将质粒线性化；②PCR扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因；③目的基因与线性化质粒同源区域在In－Fusion酶作用下形成重组质粒；④将重组质粒导入受体细胞。回答下列问题： (1)(2分)过程①需要用到的酶是____________；质粒线性化前后所含有的游离磷酸基团的个数分别为____________个。 (2)(3分)过程③中，同源序列1、2中的碱基序列不同，这样设计的优点是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (3)(6分)过程④中，用____________处理大肠杆菌，以便使重组质粒导入受体细胞。重组质粒利用大肠杆菌细胞中的DNA聚合酶和______________酶，实现完全环化。 (4)(6分)通过检测大肠杆菌的致死率可反映其转化后的抗性效果。在含____________的液体培养基中培养一段时间，然后分别用显微镜计数法和稀释涂布平板法进行计数，计数结果分别是M、N，则致死率可用____________×100%表示，此结果较真实值偏大，原因是后一种计数时________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)Taq DNA聚合酶(耐高温的DNA聚合酶)　0、2　(2)防止目的基因反向连接，防止线性化质粒或目的基因自身环化　(3)Ca2＋　DNA连接　(4)氨苄青霉素　(M－N)/M　当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 解析　(1)过程①是利用两种引物进行的质粒线性化过程，该过程属于PCR技术的应用，故需要Taq DNA聚合酶(耐高温的DNA聚合酶)；环状质粒无游离磷酸基团，一条DNA链含有一个游离的磷酸基团；线性化DNA是双链，则含有2个游离的磷酸基团，故质粒线性化前后所含有的游离磷酸基团的个数分别为0和2。(2)过程③是基因表达载体的构建过程，该过程中，同源序列1、2中的碱基序列不同，这样设计的优点是防止目的基因反向连接，防止线性化质粒或目的基因的自身环化，以保证目的基因能够正确连接并表达。(3)DNA连接酶能将DNA片段连接成一个重组DNA分子，故重组质粒利用大肠杆菌细胞中的DNA聚合酶和DNA连接酶，实现完全环化。(4)结合题图，标记基因为氨苄青霉素抗性基因，故在含氨苄青霉素的液体培养基中培养一段时间，然后分别用显微镜计数法(死菌和活菌均被计数)和稀释涂布平板法(用于活菌计数)进行计数，故若计数结果分别是M、N，致死率可用(M－N)/M×100%表示。由于在用稀释涂布平板法计数时，当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，会导致N偏小，进而导致上述结果较真实值偏大。 4．(15分)(2024·石家庄高三二模)研究表明羊乳中的β－乳球蛋白(BLG)是人体主要过敏原，图1为研究人员利用基因编辑技术敲除山羊中BLG基因，同时导入人乳铁蛋白(hLF)基因并获得转基因山羊的操作过程。图1中sgBLG/Cas9复合物中，sgBLG为能准确识别图1中母羊甲DNA特定序列的RNA，并引导Cas9蛋白对DNA进行切割。回答下列问题： (1)(2分)上述操作过程中的目的基因是________。Cas9蛋白类似于基因工程中常用到的________酶。 (2)(1分)图中③应用到的技术为_____________________________________________。 (3)(5分)为获取更多母羊丙的卵母细胞，需对丙注射________，并对获取的细胞进行培养至________期后去核，去核的目的是____________________________。早期胚胎移植之前，需对母羊丁进行________处理。 (4)(3分)研究人员利用人乳铁蛋白基因的mRNA进行逆转录得到了cDNA，已知mRNA的序列为5′－UUACUUCCUG…(中间序列)…CAAGUUUCAU－3′。在目的基因两端加上相应的限制酶识别序列后利用PCR技术扩增，目的基因和图2中的质粒连接构建表达载体。请分别写出PCR扩增时所需两种DNA引物按5′到3′方向的前12个碱基序列：________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (5)(4分)筛选后得到的早期胚胎细胞中不能检测到该药用蛋白，________(填“能”或“不能”)作为目的基因是否成功导入并表达的依据，理由是 ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)人乳铁蛋白(hLF)基因　限制(或限制性内切核酸)　(2)显微操作去核技术　(3)促性腺激素　MⅡ(或MⅡ中或减数分裂Ⅱ中或减数第二次分裂中)　确保重构胚的核(遗传物质)来自供体细胞　同期发情　(4)5′－GAATTCTTACTT－3′、5′－CTGCAGATGAAA－3′　(5)不能　人乳铁蛋白(目的)基因只能在转基因动物的乳腺细胞内表达 解析　(1)依据题意“利用基因编辑技术敲除山羊中BLG基因，同时导入人乳铁蛋白(hLF)基因并获得转基因山羊”可知，目的基因是人乳铁蛋白基因。题干中“引导Cas9蛋白对DNA进行切割”，说明Cas9蛋白可以切割DNA分子，所以与限制性内切核酸酶(限制酶)作用类似。(2)图中③对母羊的卵母细胞进行去核操作，应用到的技术为显微操作去核技术。(3)通过超数排卵处理，可以获得较多的卵母细胞，该过程需对丙注射促性腺激素，并对获取的细胞进行培养至减数第二次分裂中期后去核，去核的目的是确保重构胚的核(遗传物质)来自供体细胞。图中母羊丁是受体，早期胚胎移植之前，需对母羊丁进行同期发情处理，使其生理状态与供体母羊丙相同。(4)由题干信息可知，mRNA的序列为5′－UUACUUCCUG…(中间序列)…CAAGUUUCAU－3′，通过逆转录得到的cDNA双链(目的基因)，其模板链序列为3′－AATGAAGGAC…(中间序列)…GTTCAAAGTA－5′，对应的编码链序列为5′－TTACTTCCTG…(中间序列)…CAAGTTTCAT－3′；设计引物进行PCR扩增，引物需要从5′端到3′端，且已知双链cDNA的两端序列，设计的引物从cDNA的两端向中间方向扩增，则引物1序列为5′－TTACTTCCTG－3′，引物2序列为5′－ATGAAACTTG－3′；根据图2载体中乳腺蛋白基因的启动子和终止子的位置及限制酶识别序列位点可知，cDNA(目的基因)需要插入EcoRⅠ和PstⅠ的识别序列，由于EcoRⅠ位于乳腺蛋白基因的启动子一侧，又依据cDNA的模板链序列，可知扩增的目的基因引物1所在的一端应该靠近乳腺蛋白基因的启动子，引物2所在的一端应该靠近终止子；cDNA(目的基因)没有EcoRⅠ和PstⅠ的识别序列，故设计引物时需要在引物的5′端添加相应的识别序列，根据上述分析，引物1的 5′端增添EcoRⅠ识别序列，而引物2的 5′端增添PstⅠ识别序列，即引物1添加后序列为5′－GAATTCTTACTT－3′(下图左侧的引物)，引物2添加后序列为5′－CTGCAGATGAAA－3′(下图右侧的引物)。如图所示： (5)由于人乳铁蛋白(目的)基因只能在转基因动物的乳腺细胞内表达，筛选后得到的早期胚胎细胞中不能检测到该药用蛋白，不能作为目的基因是否成功导入并表达的依据。 学科网（北京）股份有限公司 $$ 专题八　 第7练 基因编辑原理、过程及应用 真题演练 模拟预测 内容索引 (1)为获得更多基因编辑猪，可在胚胎移植前对胚胎进行________。产出的基因编辑猪的性染色体来自______号猪。 真题演练 PART ONE 1 2 3 4 1.(2019·江苏，29节选)利用基因编辑技术将病毒外壳蛋白基因导入猪细胞中，然后通过核移植技术培育基因编辑猪，可用于生产基因工程疫苗。如图为基因编辑猪培育流程，请回答下列问题： 分割 2 1 2 3 4 若要获得更多基因编辑猪，可采用胚胎分割技术对移植前的胚胎进行分割。子代猪的性别取决于核供体亲本，即2号猪。 1 2 3 4 ①④ (2)为检测病毒外壳蛋白基因是否被导入4号猪并正常表达，可采用的方法有____(填序号)。 ①DNA测序　 ②染色体倍性分析　 ③体细胞结构分析　 ④抗原—抗体杂交 1 2 3 4 为了判断目的基因是否被导入受体，可采用DNA分子杂交、DNA测序等技术进行检测；判断目的基因导入受体细胞后是否成功表达出相应的蛋白质，通常采用抗原—抗体杂交法从分子水平进行检测。 2.(2024·新课标，35节选)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题： 1 2 3 4 (1)限制酶切割的化学键是____________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是___________________________________________ ___________________。 1 2 3 4 磷酸二酯键 使M1与M2之间有启动子、N基因、终止子，确保N基因能够顺利表达 (2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和____________________。 1 2 3 4 (3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是___________________。 C－G、A－T、U－A 菌株B2基因组DNA 3.(2021·海南，25节选)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA(SgRNA)引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。回答下列问题： 1 2 3 4 (1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定SgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是___________。 1 2 3 4 DNA连接酶 1 2 3 4 基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA连接酶，限制酶负责切割，DNA连接酶负责连接，因此为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定SgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是DNA连接酶。 (2)过程③～⑤中，SgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是_____________。随后，Cas9蛋白可切割____________________序列。 1 2 3 4 碱基互补配对 目标(目的)DNA(基因) 1 2 3 4 根据题图可知：在CRISPR/Cas9基因编辑技术中，SgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9能借助SgRNA分子与目标DNA进行特异性结合的原因在于SgRNA分子上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则实现SgRNA与目标DNA特定序列的特定识别，进而定位；由此可见，Cas9在功能上属于限制酶，可切割目标DNA特定的核苷酸序列。 (3)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1 200 bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是________________，基因敲除成功的判断依据是______________________________________ ______________________________________________________________ _____。 1 2 3 4 DNA分子杂交技术 经编辑过的DNA片段(从受体细胞中提取的基因组DNA)与标记的目标(对应)基因(探针)杂交，若无杂交带，则敲除成功 (4)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程：____________________________________________________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________。 1 2 3 4 CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，表达产物Cas9蛋白和转录产物SgRNA，两者形成复合体；SgRNA识别并结合目标DNA序列，引导Cas9蛋白进行切割；从而将目的基因插入基因组DNA中 1 2 3 4 4.(2020·山东，25)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。 (1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是______________________________，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为________。 限制性内切核酸酶和DNA连接酶 转化 1 2 3 4 构建基因表达载体需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶，可以对目的基因和载体进行切割和连接，重组载体进入受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。 1 2 3 4 (2)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了_________________________________，从而改变了Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列__________(填“发生”或“不发生”)改变，原因是________________________________________。 RNA聚合酶与启动子的识别和结合 不发生 编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子 1 2 3 4 RNA聚合酶与启动子识别和结合后启动转录，启动子的序列改变会影响与RNA聚合酶的识别和结合，从而改变基因的转录，3个突变品系中改变的是启动子的序列，影响mRNA的转录，而编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含有启动子的序列，所以编码合成的直链淀粉酶的氨基酸序列不发生改变。 1 2 3 4 (3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA (Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经________过程获得总cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是_____________________________ ______________________________________________。 逆转录 引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合) 1 2 3 4 通过mRNA获得cDNA是逆转录过程。PCR过程中需要模板、原料、酶、引物等，其中引物是根据已知基因上的一段序列合成的，这样要从总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，关键是要根据Wx基因的一段已知序列合成出相应的引物。 1 2 3 4 (4)各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为________，原因是____________________________________________ ___________________________________________。 品系3 品系3的Wx mRNA量最少，控制合成的直链淀粉合成酶的量最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强 1 2 3 4 据题中信息可知，水稻胚乳中直链淀粉所占比例越小，糯性越强，题图中品系3中的Wx mRNA量最少，这样合成的直链淀粉合成酶的量最少，则合成的直链淀粉所占比例最小，糯性最强。 1.(2024·宜春高三三模)油菜是我国重要的油料作物，黄籽油菜比黑籽油菜的含油量更高，色素积累更少，但我国主栽的甘蓝型油菜缺乏天然的黄籽种质资源。研究表明，TT8基因作为一个重要的基因参与了黄籽性状的形成。科研人员首次利用CRISPR/Cas9技术对甘蓝型油菜中的BnaTT8基因进行定点突变改造(如图1)，PCR扩增BnaTT8基因，构建基因表达载体(如图2)，再将重组质粒通过农杆菌转化法导入受体甘蓝型油菜甲9707(J9707)中，创建甘蓝型油菜黄籽突变体，CRISPR/Cas9介导的BnaTT8基因突变可以显著提高种子的含油量和蛋白质含量，使得用甘蓝型油菜种子生产的菜籽油的营养价值更高。请回答下列问题： 1 2 3 4 模拟预测 PART TWO 25 1 2 3 4 (1)图1中向导RNA与BnaTT8基因按照______________原则特异性结合，Cas9蛋白切割BnaTT8基因使α链和互补链中的____________断裂，通过随机增添、删除或替换部分碱基，获得所需目的基因。 碱基互补配对 磷酸二酯键 题图1中向导RNA与BnaTT8基因按照碱基互补配对原则特异性结合，Cas9蛋白切割BnaTT8基因使α链和互补链中的磷酸二酯键断裂，通过随机增添、删除或替换部分碱基，获得所需目的基因。 1 2 3 4 (2)PCR扩增目的基因的原理是___________ ______，需要根据所需的BnaTT8基因设计引物，引物在DNA复制中的作用是________________________________________________。 DNA半保留 复制 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 为保证BnaTT8基因正确插入质粒中，需要在引物的______(填“3′端”或“5′端”)添加限制酶的识别序列。 5′端 PCR扩增目的基因的原理是DNA半保留复制，由于DNA的两条链反向平行，且DNA聚合酶只能使新合成的DNA子链从5′端→3′端方向延伸，所以需要根据BnaTT8基因两端的核苷酸(或碱基)序列设 计特异性引物序列。为了保证BnaTT8基因正确插入质粒中，还需要在引物的5′端添加限制酶识别序列。 1 2 3 4 1 2 3 4 (3)图2字母A～E表示不同限制酶的切割位点，构建基因表达载体时，将BnaTT8基因插入____(填字母)处，目的是____________ ____________________________。重组质粒导入受体细胞后，可在个体水平上通过 C 保证BnaTT8基因可以在J9707的细胞中表达 ______________________________________________来鉴定BnaTT8基因是否表达。 定(纯合)突变体成熟种子的含油量和蛋白质含量测 1 2 3 4 (4)基于CRISPR/Cas9系统强大的精确编辑植物基因组的能力，CRISPR/Cas9基因编辑技术已经成为农业中的一个强有力的工具，科研人员在CRISPR/Cas9的基础上进行改造，开发出了可以精准实现多种碱基替换和大片段插入和删除的基因编辑工具。请写出CRISPR/Cas9及其改造的产品在科学研究中的应用：________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________________________ _______________________(答出一点即可)。 对基因进行定点突变，抑制有害基因或致病基因的表达；利用基因编辑技术对作物的淀粉含量、香味、营养价值和贮藏品质等性状进行改良或精确地去除生产上无用或不理想的性状(答出一点且合理即可) 2.(2024·常州高三联考)Cre/LoxP重组酶系统是在基因或染色体水平上对生物基因进行遗传改造的一种技术，可以在DNA的特定序列进行定点切割和重新连接。请回答下列问题： 1 2 3 4 1 2 3 4 (1)图1是利用Cre/LoxP酶系统敲除基因的过程。LoxP序列具有方向性，由中间的间隔序列和两侧的反向重复序列组成，其中决定方向的序列是__________。图1中一条DNA片段上待敲除基因的两端存在同向LoxP序列，Cre酶能识别并结合到LoxP序列的反向重复序列区，定点切断间隔序列的____________，从而实现目标基因的敲除，敲除的基因片段会形成______(填“线状”或“环状”)结构。若经Cre酶作用使得2个LoxP位点间的序列发生反转，其原因可能是_______________________。 间隔序列 磷酸二酯键 环状 两个LoxP序列方向相反 1 2 3 4 两侧的反向重复序列的碱基排列顺序一致，无法确定方向，则能决定方向的只有中间的间隔序列。碱基序列之间通过磷酸二酯键连接。由于敲除的基因片段会露出相同的黏性末端，则剪出的基因两端自动碱基互补配对成环状结构。如果两个LoxP位点位于同一条DNA上且方向相反，Cre酶会使LoxP间的序列反转。 1 2 3 4 (2)Cre/LoxP酶系统可以调控基因的表达，在目的基因_______(填“上游”或“下游”)插入一个带有LoxP位点的编码终止密码子的序列，在Cre酶存在的情况下，目的基因________(填“表达”或“不表达”)。 上游 表达 Cre/LoxP重组酶系统调控基因的表达，在目的基因上游插入带有LoxP位点的编码终止密码子的序列，Cre酶会对LoxP位点进行切割，终止密码子不发挥作用，因此目的基因表达。 1 2 3 4 (3)图2是利用Cre/LoxP酶系统构建融合基因的过程。首先分别扩增Bt基因和Bar基因，以获得所需要的DNA片段，然后用Cre/LoxP酶系统处理连接后的DNA片段，获得Bt－Bar融合基因片段。PCR1过程中，所用的2种引物的结合位置分别在____________ _____________；该过程中，还需添加的物质有________________________________ _______(至少写2种)等。有研究表明，大多数限制酶对裸露的位点不能识别切割，因此必须对识别序列5′末端进行修饰并加上一个至几个保护碱基，如GGG。由此推测，对Bar基因引物5′端序列的要求是___________________________________________ _____________________。 启动子外侧 Taq DNA聚合酶、dNTP、(含Mg2＋) 引物的5′端均要连接上LoxP序列，并在末端加上保护碱基序列(GGG) 和终止子内侧 缓冲液 1 2 3 4 启动子是决定RNA聚合酶转录起始位点的DNA序列，终止子是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列，启动子一般在目的基因的左侧，终止子在 目的基因的右侧，因为要获得Bt－Bar融合基因片段，即需要Bt带上启动子(不需要终止子)、Bar带上终止子(不需要启动子)，因此在用PCR1扩增Bt基因时，所用的2种引物的结合位置在Bt的启动子外侧和终止子内侧。PCR过程中除了添加引物外，还需要添加Taq DNA聚合酶、 1 2 3 4 dNTP、(含Mg2＋)缓冲液等。据图2可知，Bt－Bar融合基因片段中Bar基因的左侧和右侧都含有LoxP序列，又因为大多数限制酶对裸露的位点不能识 别切割，因此必须对识别序列5′末端进行修饰并加上一个至几个保护碱基，如GGG，据此可知，对Bar基因引物5′端序列的要求是引物的5′端均要连接上LoxP序列，并在末端加上保护碱基序列(GGG)。 3.(2024·南通高三模拟)In－Fusion技术是一项新型的无缝克隆技术，技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列，通常为15～20 bp)，然后用In－Fusion酶(能识别双链线性化DNA片段5′→3′末端16个碱基，并使其降解)处理即可实现无缝连接。与传统构建重组 1 2 3 4 质粒的方法相比，In－Fusion技术的优势之一是不受限制酶切割位点的限制；可以把目的基因插入任何位点；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏。它的操作步骤(如图)大致为：①利用PCR技术将质粒线性化；②PCR扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因；③目的基因与线性化质粒同源区域在In－Fusion酶作用下形成重组质粒；④将重组质粒导入受体细胞。回答下列问题： (1)过程①需要用到的酶是________ __________________________；质粒线性化前后所含有的游离磷酸基团的个数分别为______个。 1 2 3 4 Taq DNA聚合酶(耐高温的DNA聚合酶) 0、2 过程①是利用两种引物进行的质粒线性化过程，该过程属于PCR技术的应用，故需要Taq DNA聚合酶(耐高温的DNA聚合酶)；环状质粒无游离磷酸基团，一条DNA链含有一个游离的磷酸基团；线性化DNA是双链，则含有2 个游离的磷酸基团，故质粒线性化前后所含有的游离磷酸基团的个数分别为0和2。 1 2 3 4 (2)过程③中，同源序列1、2中的碱基序列不同，这样设计的优点是________________________________________________________。 1 2 3 4 防止目的基因反向连接，防止线性化质粒或目的基因自身环化 过程③是基因表达载体的构建过程，该过程中，同源序列1、2中的碱基序列不同，这样设计的优点是防止目的基因反向连接，防止线性化质粒或目的基因的自身环化，以保证目的基因能够正确连接并表达。 (3)过程④中，用______处理大肠杆菌，以便使重组质粒导入受体细胞。重组质粒利用大肠杆菌细胞中的DNA聚合酶和___________酶，实现完全环化。 1 2 3 4 Ca2＋ DNA连接 DNA连接酶能将DNA片段连接成一个重组DNA分子，故重组质粒利用大肠杆菌细胞中的DNA聚合酶和DNA连接酶，实现完全环化。 (4)通过检测大肠杆菌的致死率可反映其转化后的抗性效果。在含____________的液体培养基中培养一段时间，然后分别用显微镜计数法和稀释涂布平板法进行计数，计数结果分别是M、N，则致死率可用____________×100%表示，此结果较真实值偏大，原因是后一种计数时_______________________________________________________。 1 2 3 4 氨苄青霉素 (M－N)/M 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 结合题图，标记基因为氨苄青霉素抗性基因，故在含氨苄青霉素的液体培养基中培养一段时间，然后分别用显微镜计数法(死菌和活菌均被计数)和稀释涂布平板法(用于活菌计数)进行计数，故若计数结果分别是M、N，致死率可 用(M－N)/M×100%表示。由于在用稀释涂布平板法计数时，当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，会导致N偏小，进而导致上述结果较真实值偏大。 1 2 3 4 4.(2024·石家庄高三二模)研究表明羊乳中的β－乳球蛋白(BLG)是人体主要过敏原，图1为研究人员利用基因编辑技术敲除山羊中BLG基因，同时导入人乳铁蛋白(hLF)基因并获得转基因山羊的操作过程。图1中sgBLG/Cas9复合物中，sgBLG为能准确识别图1中母羊甲DNA特定序列的RNA，并引导Cas9蛋白对DNA进行切割。回答下列问题： 1 2 3 4 (1)上述操作过程中的目的基因是____ _________________。Cas9蛋白类似于基因工程中常用到的_______________ ________酶。 1 2 3 4 人乳 铁蛋白(hLF)基因 限制(或限制性内 切核酸) 依据题意“利用基因编辑技术敲除山羊中BLG基因，同时导入人乳铁蛋白(hLF)基因并获得转基因山羊”可知，目的基因是人乳铁蛋白基因。题干中“引导Cas9蛋白对DNA进行切割”，说明Cas9蛋白可以切割DNA分子，所以与限制性内切核酸酶(限制酶)作用类似。 (2)图中③应用到的技术为__________ ________。 1 2 3 4 显微操作去 核技术 图中③对母羊的卵母细胞进行去核操作，应用到的技术为显微操作去核技术。 (3)为获取更多母羊丙的卵母细胞，需对丙注射____________，并对获取的 细胞进行培养至___________________ ______________________________期后去核，去核的目的是_____________ 1 2 3 4 促性腺激素 MⅡ(或MⅡ中或减数分裂Ⅱ中或减数第二次分裂中) ________________________。早期胚胎移植之前，需对母羊丁进行__________处理。 确保重构胚的核(遗传物质)来自供体细胞 同期发情 1 2 3 4 通过超数排卵处理，可以获得较多的卵母细胞，该过程需对丙注射促性腺激素，并对获取的细胞进行培养至减数第二次分裂中期后去核，去核的目的是确保重构胚的核(遗传物质)来自 供体细胞。图中母羊丁是受体，早期胚胎移植之前，需对母羊丁进行同期发情处理，使其生理状态与供体母羊丙相同。 (4)研究人员利用人乳铁蛋白基因的mRNA进行逆转录得到了cDNA，已知mRNA的序列为5′－UUACUUCCUG…(中间序列)…CAAGUUUCAU－3′。在目的基 1 2 3 4 因两端加上相应的限制酶识别序列后利用PCR技术扩增，目的基因和图2中的质粒连接构建表达载体。请分别写出PCR扩增时所需两种DNA引物按5′到3′方向的前12个碱基序列：____________________________ __________________________。 5′－GAATTCTTACTT－3′、 5′－CTGCAGATGAAA－3′ 1 2 3 4 由题干信息可知，mRNA的序列为5′－UUACUUCCUG…(中间序列)…CAAGUUUCAU－3′，通过逆转录得到的cDNA双链(目的基因)，其模板链序列为3′－AATGAAGGAC…(中间序列)…GTTCAAAGTA－5′，对应的编码链序列为5′－TTACTTCCTG…(中间序列)…CAAGTTTCAT－3′；设计引物进行PCR扩增，引物需要从5′端到3′端，且已知双链cDNA的两端序列，设计的引物从cDNA的两端向中间方向扩增，则引物1序列为5′－TTACTTCCTG－3′，引物2序列为5′－ATGAAACTTG－3′； 1 2 3 4 根据图2载体中乳腺蛋白基因的启动子和终止子的位置及限制酶识别序列位点可知，cDNA(目的基因)需要插入EcoRⅠ和PstⅠ的识别序列，由于EcoRⅠ位于乳腺蛋白基因的启动子一侧，又依据cDNA的模板链序列，可知 扩增的目的基因引物1所在的一端应该靠近乳腺蛋白基因的启动子，引物2所在的一端应该靠近终止子；cDNA(目的基因)没有EcoRⅠ和PstⅠ的识别序列，故设计引物时需要在引物的5′端添加相应的识别序列，根据上述分析，引物1的 5′端增添EcoRⅠ识别序列，而引物2的 5′端增添PstⅠ识别序列，即引物1添加后序列为5′－GAATTCTTACTT－3′(如图左侧的引物)，引物2添加后序列为5′－CTGCAGATGAAA－3′(如图右侧的引物)。如图所示： (5)筛选后得到的早期胚胎细胞中不能检测到该药用蛋白，________(填“能”或“不能”)作为目的基因是否成功导入并表达的依据，理由是 ____________________________________________________。 1 2 3 4 不能 人乳铁蛋白(目的)基因只能在转基因动物的乳腺细胞内表达 由于人乳铁蛋白(目的)基因只能在转基因动物的乳腺细胞内表达，筛选后得到的早期胚胎细胞中不能检测到该药用蛋白，不能作为目的基因是否成功导入并表达的依据。 $$