专题八 [重点突破] 第6练 融合基因、融合蛋白、蛋白质的相互作用-【步步高·考前三个月】2025年高考生物学复习讲义课件（苏冀赣）（课件PPT+word教案）

专题八　 第6练 融合基因、融合蛋白、蛋白质的相互作用 真题演练 模拟预测 内容索引 1.(2024·江苏，23节选)为了高效纯化超氧化物歧化酶(SOD)，科研人员将ELP50片段插入pET－SOD构建重组质粒pET－SOD－ELP50，以融合表达SOD－ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列－(GTTCCTGGTGTTGGC)50－限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题： 真题演练 PART ONE 1 2 3 (1)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与_______结合，驱动转录，翻译SOD－ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是_____(从图2的“A～D”中选填)。 1 2 3 启动子 C 1 2 3 RNA聚合酶与启动子结合后，启动转录。由图1可知，SOD为462 bp，ELP50为750 bp，则形成的SOD－ELP50蛋白质大约含有(462＋750)÷3＝404(个)氨基酸，则SOD－ELP50蛋白相对分子质量约为404×0.11＝44.44(kDa)，电泳后应该为条带C。 (2)步骤④为探寻高效纯化SOD－ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD－ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。 1 2 3 (ⅰ)20 ℃时，加入NaCl后实验结果是______________________________。 SOD－ELP50组纯化蛋白数量更多 由图3可知，20 ℃时，较不加NaCl，加入NaCl后纯化蛋白数量更多。 (ⅱ)100 ℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是_________________。 1 2 3 高温使蛋白质变性 100 ℃时，温度过高，导致蛋白质变性而沉淀。 (ⅲ)据图分析，融合表达SOD－ELP50蛋白的优点有_________________________ __________________________________________。 1 2 3 低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持 20 ℃，加入NaCl时，较SOD，SOD－ELP50组沉淀中蛋白质相对含量较高，说明低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持。 2.(2023·江苏，22)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： 1 2 3 (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有____________，扩增程序中最主要的不同是____________。 模板、引物 引物的设计 1 2 3 PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2＋)。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时， 配制的两个反应体系中不同的有模板(片段F1、片段 F2)、引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合。引物设计是决定PCR反应成败的最重要因素，因此扩增程序中最主要的不同是引物的设计。 (2)有关基因序列如图2。引物F2－F、F1－R应在下列选项中选用______。 1 2 3 EGFP基因序列：5′ATGGTGAGCAAGGGC——GACGAGCTGTACAAG3′ AnB1基因序列：5′CATGTCCAGCTGCAG——CCAAAACCACAACCA3′ 图2 A.ATGGTG——CAACCA B.TGGTTG——CACCAT C.GACGAG——CTGCAG D.CTGCAG——CTCGTC CD 1 2 3 引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA链，因此引物与模板链3′端互补，与5′端的碱基序列相同。由图1可知，引物F2－F的部分序列既能与F1片段(EGFP)的后部分5′端 序列相同，又能与F2片段(Anb1)的前部分5′端序列相同，C选项中5′—GACGAG—3′在EGFP基因中存在，5′—CTGCAG—3′在AnB1基因中存在，因此引物F2－F选用C。由图1可知，引物F1－R与引物F2－F碱基是互补的，应选用D。 (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，不需要使用的酶主要有____________________。 1 2 3 限制酶、DNA连接酶 传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)和DNA连接酶。 (4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有________。 A.稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落 B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D.抗性平板上长出的单菌落不需要进一步划线纯化 1 2 3 ABC 1 2 3 用稀释涂布平板法培养计数时，为了使结果更准确，一般选择菌落数为30～300的平板，A错误； 涂布平板时，培养基已凝固，不会烫死细菌，抗性平板上未长出菌落，最常见的原因是未能有效实现重组质粒构建，或未能进行有效转化，B错误； 转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误； 稀释涂布平板法和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落不需要进一步划线纯化，D正确。 (5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板、用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有________。 1 2 3 P3、P4 EGFP为720 bp，AnB1为390 bp，二者的总长度为720 bp＋390 bp＝1 100 bp，用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，其长度接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。 (6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是______________________________________。 1 2 3 电泳只能测大小(长度)，不知道具体序列 琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。 3.(2022·江苏，24节选)纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题： 1 2 3 (1)纤毛结构如图Ⅰ所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由_____________组成。基体由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是 _______________________。 磷脂、蛋白质 发出星射线，形成纺锤体 (2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是__________。PCR扩增时，需在___________ _____________催化下，在引物_____端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。 1 2 3 溶解DNA 耐高温DNA 聚合酶(Taq酶) 3′ 从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，DNA在2.0 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最大，高于或低于这一浓度，DNA的溶解度均会下降，因此实验过程中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是溶解DNA。PCR扩增时，需在DNA聚合酶(即Taq酶)的催化下，在引物的3′端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。 1 2 3 (3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X－GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y－M重组质粒(在EcoR Ⅴ位点插入片段)。请完成下表。 1 2 3 1 2 3 分步实验目标 简易操作、结果、分析 PCR鉴定正向重组质粒Y－M(图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头，代表方向) ①选择图Ⅱ引物________； ②PCR目的产物约为_______bp 确保M及连接处序列正确，Y－M的连接处上游含有Hind Ⅲ＋EcoR Ⅴ的识别序列，下游含有EcoR Ⅴ＋BamH Ⅰ的识别序列 ③质粒测序，图Ⅲ中正确的是______(选填序列编号) a、b 1 100 Q4 1 2 3 分步实验目标 简易操作、结果、分析 检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y－GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y－M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明____________ ____________ ______________________________________ X蛋白参与中 心体的形成 PCR扩增目的DNA片段时，在引物的3′端进行DNA链的延伸，据图可知，应选择图Ⅱ中的引物a和引物b，PCR目的产物约为300＋800＝1 100(bp)。为确保M及连接处序列正确，Y－M的连接处上游含有Hind Ⅲ＋EcoR Ⅴ的识别序列，下游含有EcoR Ⅴ＋BamH Ⅰ的识别序列，根据题干信息构建Y－M重组质粒(在EcoR Ⅴ位点插入片段)，Y－M的连接处测序后部分序列可含有EcoR Ⅴ＋BamH Ⅰ的识别位点，根据各限制酶识别位点，应选择序列Q4。对照质粒Y－GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y－M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明蛋白质X参与中心体的组成。 1 2 3 1.(2024·南通高三二模)酵母双杂交技术是筛选能与已知蛋白互作的蛋白质的方法，其主要原理如图1。黄瓜花叶病毒(CMV)可侵染200多种植物，病毒的外壳蛋白(CMV CP)直接参与病毒的细胞间转移、症状表现等。研究人员利用酵母双杂交技术，从CMV感染的番茄叶片cDNA文库中筛选出CMV CP互作蛋白基因，图2为构建CMV CP诱饵载体(能表达出BD－CP融合蛋白)的流程。请据图回答下列问题： 1 2 3 模拟预测 PART TWO 1 2 3 (1)图1中，获得BD－X蛋白的关键是将相应序列连接形成融合基因，融合基因获得过程属于__________(变异类型)。X与Y的结合能使转录因子的BD和AD同时结合到启动子上，进而招募酶X催化LacZ基因的转录，酶X是____________。 基因突变 RNA聚合酶 由图可知，融合蛋白基因是插入一段碱基序列形成了新的基因，属于基因突变；催化基因转录的酶是RNA聚合酶，故招募的酶X是RNA聚合酶。 1 2 3 (2)图2中，过程①提取总RNA时选择有明显感染症状叶片的原因是______________________________ _________________________。 过程②中通常利用RT－PCR技术获得cDNA，上述技术中不同循环次数的扩增产物电泳结果如图3，则最适宜的循环次数是____次，依据是_________ _________________________________________________。 症状明显叶片细胞中含有大量CMV病毒，有丰富的CP基因 18 2号条带比1号条带宽，而3号条带较弥散(或2号条带明亮、整齐) 过程①提取总RNA时选择有明显感染症状的叶片，因为这种叶片细胞中含有大量CMV病毒，有丰富的CP基因。由图3可知，循环次数最佳为18次，因为18次的2号条带比1号条带宽，而3号条带较弥散。 1 2 3 1 2 3 (3)图2过程③构建诱饵载体时，为保证CP cDNA能定向插入指定位置，需要在过程②设计PCR引物时，_____________________________________________________。用获得的诱饵载体先转化大肠杆菌，再用______________法将菌液接种到含__________的选择培养基上，挑取阳性单菌落细胞进行测序，确认插入的基因序列正确。 在两种引物的5′端分别添加BamHⅠ和EcoRⅠ的识别序列 稀释涂布平板 卡那霉素 由图2可知，CP基因插入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点间，所以引物设计需要在两种引物的5′端分别添加BamHⅠ和EcoRⅠ的识别序列。接种菌液用稀释涂布平板法，载体上的标记基因是卡那霉素抗性基因，所以选择培养基添加卡那霉素。 1 2 3 1 2 3 (4)获得CMV CP诱饵载体转化的酵母菌后，研究人员进一步开展CMV CP互作蛋白的筛选研究，其主要实验流程是构建感染CMV的番茄cDNA文库→构建一系列靶蛋白载体→________________________ _____________________→接种培养，获取呈______色的菌落细胞→筛选、鉴定互作蛋白。 分别将靶蛋白载体导入诱饵载体转化后的酵母菌 蓝 2.(2024·盐城高三联考)雷帕霉素是一种新型酯类免疫抑制剂，研究者通过实验探究雷帕霉素对小鼠成肌细胞能量代谢的影响。 (1)________是驱动细胞生命活动的直接能源物质，动物细胞中该物质的能量来自__________这一代谢过程，发生场所为__________________。 1 2 3 ATP 细胞呼吸 细胞质基质和线粒体 ATP是驱动细胞生命活动的直接能源物质，动物细胞中合成ATP的能量来自细胞呼吸；细胞呼吸包括无氧呼吸和有氧呼吸：无氧呼吸整个过程都在细胞质基质中进行，而有氧呼吸的场所是细胞质基质和线粒体，故细胞呼吸的场所是细胞质基质和线粒体。 (2)PGC-1、YY1和mTOR是细胞中调节线粒体基因转录的转录因子。研究人员用一定浓度的雷帕霉素处理小鼠成肌细胞，检测转录因子PGC-1的mRNA相对含量和蛋白质含量，如图甲，结果显示：_______________ _____________________________。 1 2 3 雷帕霉素降低了 成肌细胞内PGC-1基因的表达量 1 2 3 通过题图甲可以看出，未添加雷帕霉素的组，mRNA和PGC-1的含量都高于添加雷帕霉素的组，而PGC-1是细胞中调节线粒体基因转录的转录因子，所以题图甲结果显示：雷帕霉素降低了成肌细胞内PGC-1基因的表达量。 (3)免疫共沉淀技术是在体外进行的研究蛋白质相互作用的一种技术。其原理是抗体A可与蛋白A特异性结合，因此使用抗体A可将蛋白A“沉淀”。如果蛋白B与蛋白A相互结合形成复合体，那么抗体A在将蛋白A“沉淀”的同时，也会把蛋白B“沉淀”下来。 1 2 3 ①研究人员欲研究这三种转录因子(蛋白质)之间的相互作用，利用免疫共沉淀技术检测不同处理条件下，PGC-1、YY1、mTOR被YY1抗体“沉淀”的情况，结果如图乙。实验中研究人员检测各蛋白提取结果的目的是_____________________________。 1 2 3 保证雷帕霉素不会降解三种蛋白 1 2 3 实验中研究人员检测各蛋白提取结果的目的是保证雷帕霉素不会降解PGC-1、YY1、mTOR这三种蛋白。 ②根据图乙结果，推测线粒体中雷帕霉素与被“沉淀”蛋白间存在互作模式。若要验证该互作模式，可继续选择________(a：mTOR；b：PGC-1；c：无关)(填序号)抗体进行免疫共沉淀。若互作模式成立，请在图丙中相应位置用“——”画出可“沉淀”出的条带。 1 2 3 b 答案　如图所示　 1 2 3 通过题图乙中YY1抗体免疫共沉淀结果得出，PGC-1加入雷帕霉素与YY1抗体免疫无沉淀形成，故想验证该互作模式，可继续选择b(PGC-1)抗体进行免疫共沉淀。若互作模式成立，图丙中可“沉淀”出的条带见答案。 (4)综合上述实验，说明雷帕霉素对细胞能量代谢影响的分子机制是____________________________________________________________________________________________________________________________ ___________________。 1 2 3 雷帕霉素可抑制小鼠成肌细胞中PGC-1基因的表达，同时抑制小鼠成肌细胞线粒体中PGC-1蛋白与YY1－mTOR复合体的结合，从而进一步抑制线粒体基因的表达 1 2 3 综合上述实验，说明雷帕霉素对细胞能量代谢影响的分子机制是雷帕霉素可抑制小鼠成肌细胞中PGC-1基因的表达；同时抑制小鼠成肌细胞线粒体中PGC-1蛋白与YY1－mTOR复合体的结合，从而进一步抑制线粒体基因的表达。 3.研究发现，实体肿瘤内部通常是缺氧的环境，蓖麻毒素蛋白(RTA)可作用于核糖体，使蛋白合成受阻，从而引起细胞死亡。TAT是一种短肽，可转导蛋白进入细胞，含有氧依赖性降解区域ODD(多肽)的融合蛋白可以适应低氧条件稳定存在，但在常氧条件下会被蛋白酶降解。科研人员以RTA作为抑制肿瘤细胞增殖的活性分子，利用TAT的作用将融合蛋白转运进入肿瘤细胞，并利用ODD的作用减轻RTA对正常细胞的毒性，分别构建了含TAT－RTA(660 bp)和TAT－RTA－ODD(870 bp)融合基因的表达载体，并成功得到相关融合蛋白。回答下列问题： 1 2 3 (1)可采用PCR的方法获取融合基因TAT－RTA，需要根据TAT和RTA基因设计引物，引物的作用是___________________________________ _________________________________________。已知RTA基因和欲得到的TAT－RTA融合基因的结构如图1所示，TAT基因编码链序列 1 2 3 与模板DNA单链互补配对，并且使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 BamHⅠ XboⅠ 5′GGATCCATGAGC3′ 为5′ATGAGCTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGA3′，为顺利构建表达载体，需要在引物1的5′端加入_________酶切位点，引物2的5′端加入_______酶切位点，利用TAT和RTA核酸序列设计引物时，要求在RTA蛋白的前端引入TAT短肽，请根据要求写出引物1的部分碱基序列______________________(写出引物5′→3′端的12个碱基即可)。 PCR中，引物与模板DNA单链互补配对实现连接，并且使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。据图1可知，TAT－RTA融合基因TAT靠近启动子一侧有BamH Ⅰ的识别位点，RTA靠近终止子一侧有Xbo Ⅰ的识别位点，则引物1的5′端加入BamH Ⅰ的酶切位点，引物2的5′端加入XboⅠ的酶切位点。TAT基因编码链序列为5′ATGAGCTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGA3′，由于其5′端需要插入BamHⅠ的识别位点，根据碱基互补配对原则可知，其对应的引物的5′端应包含BamHⅠ的识别序列，故设计为5′GGATCCATGAGC3′，以便BamHⅠ切出相应的黏性末端。 1 2 3 (2)载体的部分结构如图2所示。His标签由连续的6个组氨酸构成，可用于对重组融合蛋白进行分离纯化，将PCR得到的TAT－RTA融合基因和 1 2 3 DNA连接 载体双酶切后，再用__________酶连接，但是在研究时，发现融合蛋白中没有His标签蛋白，据图分析，原因是____________________________ _______________________________________________________________ _____________________________________， 限制酶2识别序列后面的一个碱基A与His标签基因编码链的前两个碱基CA编码一个氨基酸，导致His标签基因对应的mRNA的密码子被错位读取 结合图1和图2可对引物2序列5′CTCGAGGAACTG……3′进行______________________________________________________的设计可使His标签正常表达。 1 2 3 在5′CTCGAG3′和5′GAACTG3′之间任意增加2个碱基 切割后的DNA片段需要用DNA连接酶连接成完整DNA分子。由图2可知，限制酶2识别序列与His标签序列之间多出一个碱基A，这一个碱基A与His标签基因编码链的前两个碱基CA编码一个氨基酸，导致His标签基因对应的mRNA的密码子被错位读取，导致不能正确编码出His标签蛋白，所以可在引物2 5′CTCGAG3′和5′GAACTG3′之间任意添加两个碱基。 1 2 3 (3)科研人员将得到的重组融合蛋白经腹腔给药荷瘤小鼠(患实体肿瘤的小鼠称为荷瘤小鼠)，研究荷瘤小鼠肿瘤体积变化，结果如图3所示。TAT－RTA和TAT－RTA－ODD融合蛋白都可以抑制荷瘤小鼠肿瘤体积的增长，____________________的抑制效果更好，产生该实验结果的原因是_______________________________________________________________ _________________________________________。 1 2 3 TAT－RTA－ODD 含有氧依赖性降解区域ODD(多肽)的融合蛋白可以适应肿瘤内部低氧条件稳定存在，从而更好地抑制肿瘤体积增长 由图3可知，较对照组而言，TAT－RTA和TAT－RTA－ODD组的荷瘤小鼠肿瘤体积较小，且TAT－RTA－ODD组的荷瘤小鼠肿瘤体积最小，说明TAT－RTA和TAT－RTA－ODD均能抑制肿瘤体积增大，其中 后者抑制效果更显著。产生该实验结果的原因是TAT将融合蛋白转运进入肿瘤细胞，RTA可作用于核糖体，使蛋白合成受阻，从而引起细胞死亡，而ODD可以适应低氧条件稳定存在，实体肿瘤内部通常是缺氧的环境，所以ODD可以在肿瘤细胞中正常发挥作用，更好地抑制肿瘤体积增长，使抗肿瘤效果更加显著。 1 2 3 $$ [重点突破]　第6练　融合基因、融合蛋白、蛋白质的相互作用　[分值：95分] 1．(每空3分，共15分)(2024·江苏，23节选)为了高效纯化超氧化物歧化酶(SOD)，科研人员将ELP50片段插入pET－SOD构建重组质粒pET－SOD－ELP50，以融合表达SOD－ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列－(GTTCCTGGTGTTGGC)50－限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题： (1)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与____________结合，驱动转录，翻译SOD－ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是____________(从图2的“A～D”中选填)。 (2)步骤④为探寻高效纯化SOD－ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD－ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。 (ⅰ)20 ℃时，加入NaCl后实验结果是______________________________________ ________________________________________________________________________。 (ⅱ)100 ℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是________________________________________________________________________。 (ⅲ)据图分析，融合表达SOD－ELP50蛋白的优点有_____________________________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)启动子　C　(2)SOD－ELP50组纯化蛋白数量更多　高温使蛋白质变性　低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持 解析　(1)RNA聚合酶与启动子结合后，启动转录。由图1可知，SOD为462 bp，ELP50为750 bp，则形成的SOD－ELP50蛋白质大约含有(462＋750)÷3＝404(个)氨基酸，则SOD－ELP50蛋白相对分子质量约为404×0.11＝44.44(kDa)，电泳后应该为条带C。(2)(ⅰ)由图3可知，20 ℃时，较不加NaCl，加入NaCl后纯化蛋白数量更多。(ⅱ)100 ℃时，温度过高，导致蛋白质变性而沉淀。(ⅲ)20 ℃，加入NaCl时，较SOD，SOD－ELP50组沉淀中蛋白质相对含量较高，说明低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持。 2．(16分)(2023·江苏，22)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： (1)(4分)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有____________，扩增程序中最主要的不同是__________。 (2)(2分)有关基因序列如图2。引物F2－F、F1－R应在下列选项中选用________。 EGFP基因序列：5′ATGGTGAGCAAGGGC——GACGAGCTGTACAAG3′ AnB1基因序列：5′CATGTCCAGCTGCAG——CCAAAACCACAACCA3′ 图2 A．ATGGTG——CAACCA B．TGGTTG——CACCAT C．GACGAG——CTGCAG D．CTGCAG——CTCGTC (3)(2分)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，不需要使用的酶主要有________________________________________________________________________。 (4)(2分)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有________。 A．稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落 B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D．抗性平板上长出的单菌落不需要进一步划线纯化 (5)(2分)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板、用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有________。 (6)(4分)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)模板、引物　引物的设计　(2)CD　(3)限制酶、DNA连接酶　(4)ABC　(5)P3、P4　(6)电泳只能测大小(长度)，不知道具体序列 解析　(1)PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2＋)。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时， 配制的两个反应体系中不同的有模板(片段F1、片段F2)、引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合。引物设计是决定PCR反应成败的最重要因素，因此扩增程序中最主要的不同是引物的设计。(2)引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA链，因此引物与模板链3′端互补，与5′端的碱基序列相同。由图1可知，引物F2－F的部分序列既能与F1片段(EGFP)的后部分5′端序列相同，又能与F2片段(Anb1)的前部分5′端序列相同，C选项中5′—GACGAG—3′在EGFP基因中存在，5′—CTGCAG—3′在AnB1基因中存在，因此引物F2－F选用C。由图1可知，引物F1－R与引物F2－F碱基是互补的，应选用D。(3)传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)和DNA连接酶。(4)用稀释涂布平板法培养计数时，为了使结果更准确，一般选择菌落数为30～300的平板，A错误；涂布平板时，培养基已凝固，不会烫死细菌，抗性平板上未长出菌落，最常见的原因是未能有效实现重组质粒构建，或未能进行有效转化，B错误；转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误；稀释涂布平板法和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落不需要进一步划线纯化，D正确。(5)EGFP为720 bp，AnB1为390 bp，二者的总长度为720 bp＋390 bp＝1 100 bp，用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，其长度接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。(6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。 3．(16分)(2022·江苏，24节选)纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题： (1)(3分)纤毛结构如图Ⅰ所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由________________组成。基体由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是 ________________________________________________________________________。 (2)(3分)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是________________________________________________________________________。 PCR扩增时，需在____________催化下，在引物__________端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。 (3)(10分)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X－GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y－M重组质粒(在EcoR Ⅴ位点插入片段)。请完成下表。 分步实验目标 简易操作、结果、分析 PCR鉴定正向重组质粒Y－M(图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头，代表方向) ①选择图Ⅱ引物__________； ②PCR目的产物约为__________bp 确保M及连接处序列正确，Y－M的连接处上游含有Hind Ⅲ＋EcoR Ⅴ的识别序列，下游含有EcoR Ⅴ＋BamH Ⅰ的识别序列 ③质粒测序，图Ⅲ中正确的是__________(选填序列编号) 检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y－GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y－M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明_________________________________ ______________________________________ 答案　(1)磷脂、蛋白质　发出星射线，形成纺锤体　(2)溶解DNA　耐高温DNA聚合酶(Taq酶)　3′　(3)①a、b　②1 100　③Q4　④X蛋白参与中心体的形成 解析　(2)从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，DNA在2.0 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最大，高于或低于这一浓度，DNA的溶解度均会下降，因此实验过程中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是溶解DNA。PCR扩增时，需在DNA聚合酶(即Taq酶)的催化下，在引物的3′端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。(3)PCR扩增目的DNA片段时，在引物的3′端进行DNA链的延伸，据图可知，应选择图Ⅱ中的引物a和引物b，PCR目的产物约为300＋800＝1 100(bp)。为确保M及连接处序列正确，Y－M的连接处上游含有Hind Ⅲ＋EcoR Ⅴ的识别序列，下游含有EcoR Ⅴ＋BamH Ⅰ的识别序列，根据题干信息构建Y－M重组质粒(在EcoR Ⅴ位点插入片段)，Y－M的连接处测序后部分序列可含有EcoR Ⅴ＋BamH Ⅰ的识别位点，根据各限制酶识别位点，应选择序列Q4。对照质粒Y－GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y－M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明蛋白质X参与中心体的组成。 1．(16分)(2024·南通高三二模)酵母双杂交技术是筛选能与已知蛋白互作的蛋白质的方法，其主要原理如图1。黄瓜花叶病毒(CMV)可侵染200多种植物，病毒的外壳蛋白(CMV CP)直接参与病毒的细胞间转移、症状表现等。研究人员利用酵母双杂交技术，从CMV感染的番茄叶片cDNA文库中筛选出CMV CP互作蛋白基因，图2为构建CMV CP诱饵载体(能表达出BD－CP融合蛋白)的流程。请据图回答下列问题： (1)(4分)图1中，获得BD－X蛋白的关键是将相应序列连接形成融合基因，融合基因获得过程属于__________(变异类型)。X与Y的结合能使转录因子的BD和AD同时结合到启动子上，进而招募酶X催化LacZ基因的转录，酶X是______。 (2)(5分)图2中，过程①提取总RNA时选择有明显感染症状叶片的原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 过程②中通常利用RT－PCR技术获得cDNA，上述技术中不同循环次数的扩增产物电泳结果如图3，则最适宜的循环次数是__________次，依据是_________________________ ________________________________________________________________________。 (3)(3分)图2过程③构建诱饵载体时，为保证CP cDNA能定向插入指定位置，需要在过程②设计PCR引物时，__________________________。用获得的诱饵载体先转化大肠杆菌，再用______________法将菌液接种到含__________的选择培养基上，挑取阳性单菌落细胞进行测序，确认插入的基因序列正确。 (4)(4分)获得CMV CP诱饵载体转化的酵母菌后，研究人员进一步开展CMV CP互作蛋白的筛选研究，其主要实验流程是构建感染CMV的番茄cDNA文库→构建一系列靶蛋白载体→______________________________→接种培养，获取呈______色的菌落细胞→筛选、鉴定互作蛋白。 答案　(1)基因突变　RNA聚合酶　(2)症状明显叶片细胞中含有大量CMV病毒，有丰富的CP基因　18　2号条带比1号条带宽，而3号条带较弥散(或2号条带明亮、整齐)　(3)在两种引物的5′端分别添加BamHⅠ和EcoRⅠ的识别序列　稀释涂布平板　卡那霉素　(4)分别将靶蛋白载体导入诱饵载体转化后的酵母菌　蓝 解析　(1)由图可知，融合蛋白基因是插入一段碱基序列形成了新的基因，属于基因突变；催化基因转录的酶是RNA聚合酶，故招募的酶X是RNA聚合酶。(2)过程①提取总RNA时选择有明显感染症状的叶片，因为这种叶片细胞中含有大量CMV病毒，有丰富的CP基因。由图3可知，循环次数最佳为18次，因为18次的2号条带比1号条带宽，而3号条带较弥散。(3)由图2可知，CP基因插入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点间，所以引物设计需要在两种引物的5′端分别添加BamHⅠ和EcoRⅠ的识别序列。接种菌液用稀释涂布平板法，载体上的标记基因是卡那霉素抗性基因，所以选择培养基添加卡那霉素。 2．(16分)(2024·盐城高三联考)雷帕霉素是一种新型酯类免疫抑制剂，研究者通过实验探究雷帕霉素对小鼠成肌细胞能量代谢的影响。 (1)(6分)________是驱动细胞生命活动的直接能源物质，动物细胞中该物质的能量来自________这一代谢过程，发生场所为__________________。 (2)(2分)PGC-1、YY1和mTOR是细胞中调节线粒体基因转录的转录因子。研究人员用一定浓度的雷帕霉素处理小鼠成肌细胞，检测转录因子PGC-1的mRNA相对含量和蛋白质含量，如图甲，结果显示：__________________________________________________。 (3)(5分)免疫共沉淀技术是在体外进行的研究蛋白质相互作用的一种技术。其原理是抗体A可与蛋白A特异性结合，因此使用抗体A可将蛋白A“沉淀”。如果蛋白B与蛋白A相互结合形成复合体，那么抗体A在将蛋白A“沉淀”的同时，也会把蛋白B“沉淀”下来。 ①研究人员欲研究这三种转录因子(蛋白质)之间的相互作用，利用免疫共沉淀技术检测不同处理条件下，PGC-1、YY1、mTOR被YY1抗体“沉淀”的情况，结果如图乙。实验中研究人员检测各蛋白提取结果的目的是_________________________________________ ________________________________________________________________________。 ②根据图乙结果，推测线粒体中雷帕霉素与被“沉淀”蛋白间存在互作模式。若要验证该互作模式，可继续选择________(a：mTOR；b：PGC-1；c：无关)(填序号)抗体进行免疫共沉淀。若互作模式成立，请在图丙中相应位置用“——”画出可“沉淀”出的条带。 (4)(3分)综合上述实验，说明雷帕霉素对细胞能量代谢影响的分子机制是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)ATP　细胞呼吸　细胞质基质和线粒体　(2)雷帕霉素降低了成肌细胞内PGC-1基因的表达量　(3)①保证雷帕霉素不会降解三种蛋白　②b　如图所示　(4)雷帕霉素可抑制小鼠成肌细胞中PGC-1基因的表达，同时抑制小鼠成肌细胞线粒体中PGC-1蛋白与YY1－mTOR复合体的结合，从而进一步抑制线粒体基因的表达 解析　(1)ATP是驱动细胞生命活动的直接能源物质，动物细胞中合成ATP的能量来自细胞呼吸；细胞呼吸包括无氧呼吸和有氧呼吸：无氧呼吸整个过程都在细胞质基质中进行，而有氧呼吸的场所是细胞质基质和线粒体，故细胞呼吸的场所是细胞质基质和线粒体。(2)通过题图甲可以看出，未添加雷帕霉素的组，mRNA和PGC-1的含量都高于添加雷帕霉素的组，而PGC-1是细胞中调节线粒体基因转录的转录因子，所以题图甲结果显示：雷帕霉素降低了成肌细胞内PGC-1基因的表达量。(3)①实验中研究人员检测各蛋白提取结果的目的是保证雷帕霉素不会降解PGC-1、YY1、mTOR这三种蛋白。②通过题图乙中YY1抗体免疫共沉淀结果得出，PGC-1加入雷帕霉素与YY1抗体免疫无沉淀形成，故想验证该互作模式，可继续选择b(PGC-1)抗体进行免疫共沉淀。若互作模式成立，图丙中可“沉淀”出的条带见答案。(4)综合上述实验，说明雷帕霉素对细胞能量代谢影响的分子机制是雷帕霉素可抑制小鼠成肌细胞中PGC-1基因的表达；同时抑制小鼠成肌细胞线粒体中PGC-1蛋白与YY1－mTOR复合体的结合，从而进一步抑制线粒体基因的表达。 3．(16分)研究发现，实体肿瘤内部通常是缺氧的环境，蓖麻毒素蛋白(RTA)可作用于核糖体，使蛋白合成受阻，从而引起细胞死亡。TAT是一种短肽，可转导蛋白进入细胞，含有氧依赖性降解区域ODD(多肽)的融合蛋白可以适应低氧条件稳定存在，但在常氧条件下会被蛋白酶降解。科研人员以RTA作为抑制肿瘤细胞增殖的活性分子，利用TAT的作用将融合蛋白转运进入肿瘤细胞，并利用ODD的作用减轻RTA对正常细胞的毒性，分别构建了含TAT－RTA(660 bp)和TAT－RTA－ODD(870 bp)融合基因的表达载体，并成功得到相关融合蛋白。回答下列问题： (1)(6分)可采用PCR的方法获取融合基因TAT－RTA，需要根据TAT和RTA基因设计引物，引物的作用是__________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 已知RTA基因和欲得到的TAT－RTA融合基因的结构如图1所示，TAT基因编码链序列为5′ATGAGCTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGA3′，为顺利构建表达载体，需要在引物1的5′端加入__________酶切位点，引物2的5′端加入__________酶切位点，利用TAT和RTA核酸序列设计引物时，要求在RTA蛋白的前端引入TAT短肽，请根据要求写出引物1的部分碱基序列__________(写出引物5′→3′端的12个碱基即可)。 (2)(6分)载体的部分结构如图2所示。His标签由连续的6个组氨酸构成，可用于对重组融合蛋白进行分离纯化，将PCR得到的TAT－RTA融合基因和载体双酶切后，再用__________酶连接，但是在研究时，发现融合蛋白中没有His标签蛋白，据图分析，原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________， 结合图1和图2可对引物2序列5′CTCGAGGAACTG……3′进行________________ ________________________________________________________________________ 的设计可使His标签正常表达。 (3)(4分)科研人员将得到的重组融合蛋白经腹腔给药荷瘤小鼠(患实体肿瘤的小鼠称为荷瘤小鼠)，研究荷瘤小鼠肿瘤体积变化，结果如图3所示。TAT－RTA和TAT－RTA－ODD融合蛋白都可以抑制荷瘤小鼠肿瘤体积的增长，____________________的抑制效果更好，产生该实验结果的原因是______________________________________________________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)与模板DNA单链互补配对，并且使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸　BamHⅠ　XboⅠ　5′GGATCCATGAGC3′　(2)DNA连接　限制酶2识别序列后面的一个碱基A与His标签基因编码链的前两个碱基CA编码一个氨基酸，导致His标签基因对应的mRNA的密码子被错位读取　在5′CTCGAG3′和5′GAACTG3′之间任意增加2个碱基　(3)TAT－RTA－ODD　含有氧依赖性降解区域ODD(多肽)的融合蛋白可以适应肿瘤内部低氧条件稳定存在，从而更好地抑制肿瘤体积增长 解析　(1)PCR中，引物与模板DNA单链互补配对实现连接，并且使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。据图1可知，TAT－RTA融合基因TAT靠近启动子一侧有BamH Ⅰ的识别位点，RTA靠近终止子一侧有Xbo Ⅰ的识别位点，则引物1的5′端加入BamH Ⅰ的酶切位点，引物2的5′端加入XboⅠ的酶切位点。TAT基因编码链序列为5′ATGAGCTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGA3′，由于其5′端需要插入BamHⅠ的识别位点，根据碱基互补配对原则可知，其对应的引物的5′端应包含BamHⅠ的识别序列，故设计为5′GGATCCATGAGC3′，以便BamHⅠ切出相应的黏性末端。(2)切割后的DNA片段需要用DNA连接酶连接成完整DNA分子。由图2可知，限制酶2识别序列与His标签序列之间多出一个碱基A，这一个碱基A与His标签基因编码链的前两个碱基CA编码一个氨基酸，导致His标签基因对应的mRNA的密码子被错位读取，导致不能正确编码出His标签蛋白，所以可在引物2 5′CTCGAG3′和5′GAACTG3′之间任意添加两个碱基。(3)由图3可知，较对照组而言，TAT－RTA和TAT－RTA－ODD组的荷瘤小鼠肿瘤体积较小，且TAT－RTA－ODD组的荷瘤小鼠肿瘤体积最小，说明TAT－RTA和TAT－RTA－ODD均能抑制肿瘤体积增大，其中后者抑制效果更显著。产生该实验结果的原因是TAT将融合蛋白转运进入肿瘤细胞，RTA可作用于核糖体，使蛋白合成受阻，从而引起细胞死亡，而ODD可以适应低氧条件稳定存在，实体肿瘤内部通常是缺氧的环境，所以ODD可以在肿瘤细胞中正常发挥作用，更好地抑制肿瘤体积增长，使抗肿瘤效果更加显著。 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