专题八 [重点突破] 第3练 限制酶的选择-【步步高·考前三个月】2025年高考生物学复习讲义课件（苏冀赣）（课件PPT+word教案）

专题八　 第3练 限制酶的选择 真题演练 模拟预测 内容索引 1.(2024·河北，22节选)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。回答下列问题： 实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为_______________________________启动子。Nos为终止子，其作用为___________。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶________和__________对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。 真题演练 PART ONE 1 2 3 4 水稻胚乳细胞中特异表达的基因的 终止转录 HindⅢ EcoRⅠ 1 2 3 4 根据题意可知，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP(启动子)应为水稻胚乳中特异表达的基因的启动子。Nos为终止子，其作用为终止转录过程。GtP内部含有KpnⅠ的酶切位点，用KpnⅠ酶切会破坏启动子，Nos下游含有SacⅠ的酶切位点，用SacⅠ酶切会使重组基因表达载体缺失终止子，故构建基因表达载体时，可选择限制酶HindⅢ和EcoRⅠ对r2HN基因与载体进行酶切。 2.(2024·江苏，23节选)为了高效纯化超氧化物歧化酶(SOD)，科研人员将ELP50片段插入pET－SOD构建重组质粒pET－SOD－ELP50，以融合表达SOD－ELP50蛋白，过程如图。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列－(GTTCCTGGTGTTGGC)50－限制酶b识别序列，50为重复次数。 1 2 3 4 步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是_________________。 EcoRⅠ、HindⅢ 1 2 3 4 目的基因应插入启动子和终止子之间，结合题意可知，ELP50应插入pET－SOD之后，由图可知，限制酶a和限制酶b分别是EcoRⅠ、HindⅢ。 3.(2022·湖北，24节选)如图是S基因的cDNA和载体的限制性内切核酸酶(限制性核酸内切酶)酶谱。为了成功构建重组表达载体，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用________________酶切割S基因的cDNA和载体。 1 2 3 4 XbaⅠ、HindⅢ 为了成功构建重组表达载体，不破坏载体关键结构和目的基因，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用XbaⅠ、HindⅢ酶切割S基因的cDNA和载体。 1 2 3 4 1 2 3 4 4.(2021·山东，25节选)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。 1 2 3 4 为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是_______，在R末端添加的序列所对应的限制酶是_______。本 SalⅠ EcoRⅠ 6 实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要_____种酶。 1 2 3 4 据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R端 与荧光蛋白基因中限制酶MunⅠ识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后， 1 2 3 4 两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有MunⅠ和XhoⅠ的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶MunⅠ和XhoⅠ所识别，故应该选用添加限制 酶EcoRⅠ和限制酶SalⅠ识别序列， 由图可知，限制酶MunⅠ识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoRⅠ识别并切割后的黏性末端相同，故R末端添加的序列所对应的限制酶是EcoRⅠ，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是SalⅠ；荧光蛋白基因中含有限制酶EcoR Ⅰ的识别位点，故对载体使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ切割。 1 2 3 4 综上所述，对载体使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ切割，对扩增后的产物用限制酶EcoRⅠ和限制酶SalⅠ识别序列，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用Taq酶催化，合成更多的产物，故 从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是Taq酶、限制酶EcoRⅠ、限制酶SalⅠ、限制酶MunⅠ、限制酶XhoⅠ、DNA连接酶。 1.(2024·吉安高三期末)人乳铁蛋白广泛分布于乳汁等外分泌液中，在初乳中含量较高，对细菌、真菌和病毒等有抑制作用。如图表示利用基因工程技术构建人乳铁蛋白基因重组质粒的过程(图中TetR表示四环素抗性基因，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因)，五种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。回答下列问题： 1 2 3 4 5 模拟预测 PART TWO 1 2 3 4 5 限制酶 BamHⅠ HaeⅢ BclⅠ Sau3AⅠ NotⅠ 识别序列及切割位点           (1)要将人乳铁蛋白基因插入载体中，若只使用一种限制酶，应选择的限制酶是__________。限制酶切割的是__________键。基因工程技术中为保证目的基因的正确连接，通常选择__________种限制酶进行酶切。 Sau3AⅠ 磷酸二酯 2(或两) 要将人乳铁蛋白基因插入载体中，若只允许使用一种限制酶，根据人乳铁蛋白基因两端的识别序列可知，BclⅠ和Sau3AⅠ可以切出相同的黏性末端，结合质粒上的限制酶识别序列可知，只用一种酶且切出相同的黏性末端，则应选择的限制酶是Sau3AⅠ。限制酶断开的是磷酸二酯键。为了避免目的基因和质粒自身环化和反向连接，基因工程技术中通常选择2种限制酶进行酶切，以形成不同的黏性末端。 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 (2)基因工程最核心的步骤是_______________ _______，重组质粒中启动子的功能是_______ ___________________________________________________________________________。 基因表达载体的 构建 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质 1 2 3 4 5 (3)人乳铁蛋白基因需要利用PCR技术进行扩增，扩增需要引物__________(在“Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ”中选择)。 Ⅱ、Ⅲ PCR中引物的作用是使耐高温的DNA聚合酶从引物的3′端连接游离的脱氧核苷酸，所以引物5′端应该与模板链的3′端配对，故引物应选择Ⅱ、Ⅲ。 1 2 3 4 5 (4)据图分析，成功获得含有人乳铁蛋白基因的重组质粒首先需要在含有__________(填“四环素”或“氨苄青霉素”)的培养基上进行筛选，然后将需要的重组质粒导入牛的受精卵，再利用_______工程技术获得转基因小牛。 氨苄青霉素 胚胎 据图分析，成功获得含有人乳铁蛋白基因的重组质粒含有氨苄青霉素抗性基因，需要在含有氨苄青霉素的培养基上筛选，然后将需要的重组质粒导入牛的受精卵，再利用胚胎工程技术获得转基因小牛。 1 2 3 4 5 2.(2024·石家庄高三一模)甜菜是我国重要的糖料作物之一，为提高其光合作用效率和产量，科研工作者利用基因工程技术将SBPase基因(编码卡尔文循环过程中的关键酶)导入甜菜中进行遗传改造。该过程所利用的质粒载体和SBPase基因分别如图1和图2所示。回答下列问题： 1 2 3 4 5 注：真核启动子可启动下游基因在真核细胞内的表达，原核启动子可启动下游基因在原核细胞内的表达。 (1)获取SBPase基因后利用______技术进行扩增，经__________________技术鉴定后，回收其中包含目的基因的DNA片段。 1 2 3 4 5 PCR (琼脂糖凝胶)电泳 获取目的基因后利用PCR技术进行扩增，经电泳鉴定后，切割凝胶，再将凝胶溶解，回收其中包含目的基因的DNA片段。 (2)SBPase基因两端不具有限制酶切割位点，为保证SBPase基因正确连接在质粒载体上，应在SBPase基因左、右两端分别添加限制酶___________ ________的识别序列，具体操作是在扩增SBPase基因时_______________ __________________。将质粒载体与扩增得到的目的基因用限制酶切割后再用__________酶处理，构建重组质粒。 1 2 3 4 5 AarⅠ、 HindⅢ 在引物的5′端加 限制酶的识别序列 DNA连接 由题图2中SBPase基因模板链3′端和5′端的位置可判断其转录方向为从右向左，即右端为基因上游，左端为基因下游，而由题图1可知，质粒载体上外源基因的转录方向为顺时针，为保证目的基因与质粒载体的正确连接，且不破坏潮霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因(两抗性基因在目的植株的获取过程中均发挥作用)，应在SBPase 基因的左、右两端分别添加限制酶AarⅠ和HindⅢ的识别序列，具体操作是在扩增SBPase基因时在引物的5′端加限制酶的识别序列。将质粒载体与扩增得到的目的基因用限制酶切割后再用DNA连接酶处理，构建重组质粒。 1 2 3 4 5 (3)已知卡那霉素和潮霉素可与原核细胞核糖体以及真核细胞线粒体、叶绿体中的核糖体结合，进而阻止基因表达的______过程，而不能与真核细胞细胞质基质中的核糖体结合，据此分析，重组质粒导入农杆菌后，需在含_________(填“卡那霉素”或“潮霉素”)的培养基上培养，从而筛选出含重组质粒的农杆菌。 1 2 3 4 5 翻译 卡那霉素 卡那霉素和潮霉素通过与原核细胞核糖体结合，直接影响基因的翻译过程。农杆菌属于原核生物，对卡那霉素和潮霉素均无抗性。成功导入重组质粒的农杆菌同时获得卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因，但由于潮霉素抗性基因上游为真核启动子，在原核细胞内无法表达，所以导入了重组质粒的农杆菌对潮霉素没有抗性，对卡那霉素具有抗性，未导入重组质粒的农杆菌对卡那霉素、潮霉素均没有抗性，故选择含卡那霉素的培养基可筛选出含重组质粒的农杆菌。 1 2 3 4 5 (4)将含有重组质粒的农杆菌与甜菜叶柄共培养一段时间后。再转入含有潮霉素的选择培养基，可筛选出抗性植株，机理为___________________ ____________________________________________________________________________________________________________________________。 1 2 3 4 5 农杆菌将重组质粒中的T－DNA转移并整合至受体细胞中，转化成功的植株可表现出对潮霉素的抗性，未转化成功的植株因线粒体、叶绿体功能异常而无法存活 农杆菌侵染甜菜叶柄细胞时将重组质粒中的T－DNA转移并整合至甜菜叶柄细胞中，所以在含有潮霉素的选择培养基上，转化成功的植株可表现出对潮霉素的抗性，未转化成功的植株因线粒体、叶绿体功能异常而无法存活。 3.(2024·南昌高三三模)人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值，以传统方法只能从血浆中制备，科学家利用基因工程和细胞工程技术制得了重组HSA(rHSA)。回答下列问题： (1)获取HSA基因的途径之一：提取总RNA，利用________酶合成总cDNA，然后以cDNA为模板，采用PCR技术扩增HSA基因。已知HSA基因一条链两端的序列为5′AAGGGCGG－HSA基因－GGGAAACT3′，根据其两端序列，则需要选择的一对引物序列是______(填字母)。若某一双链cDNA在PCR仪中进行了5次循环，则需要消耗______个引物。 A.引物Ⅰ是5′－AAGGGCGG—3′，引物Ⅱ是5′－GGGAAACT－3′ B.引物Ⅰ是5′－AAGGGCGG—3′，引物Ⅱ是5′－AGTTTCCC－3′ C.引物Ⅰ是5′－CCGCCCTT－3′，引物Ⅱ是5′－GGGAAACT－3′ D.引物Ⅰ是5′－CCGCCCTT－3′，引物Ⅱ是5′－AGTTTCCC－3′ 1 2 3 4 5 逆转录 B 62 合成总cDNA需提取细胞中所有的mRNA，在逆转录酶的作用下通过逆转录过程获得。采用PCR技术扩增HSA基因(5′AAGGGCGG－HSA基因－GGGAAACT3′)时，PCR中需要一对特异性的引物，该引物能与目的基因3′端的碱基互补配对，子链延伸时是从引物的5′端向3′端延伸，所以符合条件的引物Ⅰ是5′－AAGGGCGG—3′，引物Ⅱ是5′－AGTTTCCC－3′，故选B。一双链cDNA在PCR仪中进行5次循环，共产生25＝32(个)DNA分子，所以共有26＝64(条)链，其中62条链是新合成的，需要引物，所以需要64－2＝62(个)引物。 1 2 3 4 5 (2)如图甲为获取的含有HSA基因的DNA片段，中间一段为HSA基因。Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ为三种限制酶，图中箭头所指为三种限制酶的切点；图乙是三种限制酶的识别序列与酶切位点示意图；图丙是土壤农杆菌中用于携带目的基因的Ti质粒结构示意图。 1 2 3 4 5 为保证目的基因和质粒正确连接，切割含有目的基因的DNA片段和质粒经常会用到两种限制酶，在该实验中，切割含有目的基因DNA片段使用的限制酶为__________________，原因是___________________________ _______________________________________________________________ ______________________________________________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________。 1 2 3 4 5 EcoRⅠ和BamHⅠ 切割质粒只能用EcoRⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶，但由于Sau3AⅠ会破坏(切割)目的基因，所以切割含有目的基因的DNA片段不能用Sau3AⅠ；由于BamHⅠ与Sau3AⅠ切出的黏性末端相同且BamHⅠ和EcoRⅠ切割含有目的基因的DNA片段后可得到与质粒两端黏性末端相同的目的基因，故应该用EcoRⅠ和BamHⅠ切割含有目的基因的DNA片段 图丙中有EcoRⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶，为了防止目的基因与质粒间的任意连接，应该选择Sau3AⅠ、EcoRⅠ切割质粒。结合图甲、乙和丙分析，Sau3AⅠ会破坏目的基因，Sau3AⅠ和BamHⅠ切出的黏性末端相同，故采用BamHⅠ、EcoRⅠ充分切割目的基因，可得到与质粒两端黏性末端相同的目的基因。 1 2 3 4 5 (3)若要在水稻胚乳细胞中提取rHSA，需要用到植物组织培养技术，该技术的原理是______________；若要利用乳腺生物反应器来生产rHSA，则应将目的基因与_____________________等调控元件重组构建的基因表达载体，通过_________方法导入________受体细胞中。 1 2 3 4 5 细胞的全能性 乳腺蛋白基因启动子 显微注射 受精卵 若要在水稻胚乳细胞中提取rHSA，需要用到植物组织培养技术，该技术的原理是细胞的全能性。为了让人血清白蛋白(HSA)在乳腺细胞中表达，应将目的基因与乳腺蛋白基因启动子等调控元件重组构建的基因表达载体，通过显微注射方法导入受精卵中，原因是受精卵具有全能性。 1 2 3 4 5 4.(2024·沧州高三二模)L-天冬酰胺酶因其能水解L-天冬酰胺(丙烯酰胺的前体)，而有效降低油炸食品中潜在致癌物质丙烯酰胺的含量，在食品安全领域受到高度关注。某科研机构欲利用pET22b质粒将L-天冬酰胺酶基因导入对氨苄青霉素敏感的宿主菌中，以构建高效表达L-天冬酰胺酶的菌株。图1是L-天冬酰胺酶基因附近的限制酶切点以及基因两侧的部分碱基序列，图2是pET22b质粒的结构模式图及其涉及的限制酶切点，其中的LacZ基因编码产生的半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，否则菌落为白色。回答下列问题： 1 2 3 4 5 (1)利用PCR从提取的DNA中扩增目的基因时需要引物，引物的作用是__________________________________________________。要将L-天冬酰胺酶基因导入到pET22b质粒中，需使用的两种限制酶是_________________。 1 2 3 4 5 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 KpnⅠ、EcoRⅠ 1 2 3 4 5 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。引物的作用：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。若用PstⅠ或BglⅡ会破坏目的基因，若用BamHⅠ会破坏氨苄青霉素抗性基因。若用EcoRⅠ对目的基因和质粒进行切割，由于切割后目的基因和质粒两端的黏性末端相同，因此至少会产生4种连接产物，即目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因和质粒正向连接以及目的基因和质粒反向连接。用KpnⅠ和EcoRⅠ对目的基因和质粒进行切割，切割后目的基因和质粒两端的黏性末端不相同，因此不会出现自身环化和反向连接的情况。 (2)若图1下方的序列为目的基因的部分碱基序列，则获取目的基因时设计B端的引物序列是_______________________________只写出16个碱基即可)。 1 2 3 4 5 3′－TAAGTTGTCTCTTAAG－5′ 获取目的基因时设计B端的引物，B端的引物是与B端的3′端互补配对，同时，要在引物的5′端添加EcoRⅠ的识别序列，因此B端的引物序列是3′－TAAGTTGTCTCTTAAG－5′。 (3)利用感受态法的转化成功率并不是100%，科研人员将转化后的宿主菌接种在含氨苄青霉素和X-gal的固体培养基上，以此筛选出成功导入重组质粒的宿主菌。 ①若只使用限制酶EcoRⅠ构建重组质粒，导入重组质粒的菌落呈现____色，这些菌落__________(填“能”“不能”或“不一定能”)产生L-天冬酰胺酶，理由是__________________________________________ _________________________________________________________________________。 1 2 3 4 5 白 不一定能 EcoRⅠ切割目的基因和质粒产生的黏性末端相同，构建的重组质粒可能是目的基因和质粒反向连接而成，目的基因无法正常表达 ②若使用(1)中的限制酶处理，则菌落呈______色的为符合要求的宿主菌，理由是____________________________________________________ ________________________。 1 2 3 4 5 白 重组质粒由于LacZ基因被切断，无法合成半乳糖苷酶，不能分解X-gal，菌落呈白色 1 2 3 4 5 若用EcoRⅠ对目的基因和质粒进行切割，由于切割后目的基因和质粒两端的黏性末端相同，因此至少会产生4种连接产物，即目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因和质粒正向连接以及目的基因和质粒反向连接，重组质粒由于LacZ基因被切断，无法合成半乳糖苷酶，不能分解X-gal，菌落呈白色，但重组质粒可能是目的基因和质粒反向连接而成，目的基因无法正常表达，因此呈白色的菌落不一定能产生L-天冬酰胺酶。用EcoRⅠ和KpnⅠ对目的基因和质粒进行切割，切割后目的基因和质粒两端的黏性末端不相同，因此不会出现自身环化和反向连接的情况，但重组质粒由于LacZ基因被切断，无法合成半乳糖苷酶分解X-gal，菌落呈白色，因此白色的菌落为成功导入重组质粒的宿主菌。 (4)能够发挥作用的L-天冬酰胺酶是由4个亚基形成的，如果选择大肠杆菌作为受体菌，只能从大肠杆菌中提取到4条单链肽链，不能得到有活性的L-天冬酰胺酶，原因是______________________________________ _________________________________________________________。 1 2 3 4 5 大肠杆菌细胞内无内质网和高尔基体等细胞器，不能对肽链进行加工、折叠形成具有一定空间结构的蛋白质 1 2 3 4 5 能够发挥作用的L-天冬酰胺酶是由4个亚基形成的，如果选择大肠杆菌作为受体菌，大肠杆菌是原核生物，细胞内只有核糖体，只能形成肽链，无内质网和高尔基体等细胞器，不能对肽链进行加工、折叠形成具有一定空间结构的蛋白质，因此，不能得到有活性的L-天冬酰胺酶。 5.(2024·常州高三三模)拟南芥体内的基因X具有多个启动子，通过一种光受体对不同光质刺激进行应答，选择不同的启动子并转录出长度不同的mRNA，从而表达出存在于细胞内不同位置的蛋白质，使拟南芥呈现出不同的生长状态。其相关蛋白的合成过程如图1所示。 1 2 3 4 5 (1)启动子与起始密码子发挥的作用分别是__________________________ ______。 1 2 3 4 5 驱动基因的转录、翻译开始的 信号 (2)据图1分析，与蛋白质X②相比，蛋白质X①的a末端在结构上的特点是___________________。 1 2 3 4 5 含有叶绿体转移信号 (3)研究人员通过特定技术，将绿色荧光蛋白(GFP)基因的片段(GFP基因不含启动子和终止子)插入基因X的特定位置，使表达出的蛋白质X①、X②能带有绿色荧光蛋白，以实现它们在细 1 2 3 4 5 GFP基因片段应插入基因X内启动子②的下游 胞内的可视化，由此得到A系植株。 ①根据图1，GFP基因片段不能插入基因X的B位置，原因是_________________________________________。 ②根据图2中GFP基因两侧的碱基序列选择表格中的______________酶可以将其从染色体基因组中切割下来。 1 2 3 4 5 限制酶 识别序列 限制酶 识别序列 BamHⅠ G↓GATCC CCTAG↑G NotⅠ G↓CGGCCGC CGCCGGC↑G HindⅢ A↓AGCTT TTCGA↑A EcoRⅠ G↓AATTC CTTAA↑G BamHⅠ、NotⅠ 1 2 3 4 5 分析题图1可知，GFP基因片段应插入基因X内启动子②的下游，即字母C表示的特定位置，从而经过转录、翻译得到目的产物。限制酶能识别DNA分子中特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，分析题图2可知，序列中含有GGATCC序列 和GCGGCCGC序列，故应选择表中的BamHⅠ和NotⅠ酶将GFP基因从染色体基因组中切割下来。 (4)研究人员在A系植株的基础上，去除光受体基因后得到B系植株。随后，分别在黑暗条件和红光条件下培养A、B两系植株，培养条件及观测到荧光的部位如表所示。 1 2 3 4 5 植物类型 光照条件 黑暗条件 红光条件 A系植株 细胞质基质 叶绿体 B系植株 细胞质基质 细胞质基质 综合以上研究结果，红光条件下A系植株与B系植株基因X表达所使用的启动子分别是____________________，判断依据是___________________________ ___________________________________________。 启动子①、启动子② 在光受体作用下A系植株选择启动子①表达出蛋白质X①，B系植株没有被激活 1 2 3 4 5 分析表中数据可知，与去除光受体基因后得到B系植株相比，A系植株能对红光刺激作出应答被激活，原因是在光受体作用下A系植株选择启动子①表达出蛋白质X①，B系植株无法被激活，应是启动子②。 植物类型 光照条件 黑暗条件 红光条件 A系植株 细胞质基质 叶绿体 B系植株 细胞质基质 细胞质基质 $$ [重点突破]　第3练　限制酶的选择　[分值：100分] 1．(每空3分，共12分)(2024·河北，22节选)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。回答下列问题： 实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为______________________________________________启动子。Nos为终止子，其作用为____________。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶____________和__________对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。 答案　水稻胚乳细胞中特异表达的基因的　终止转录　HindⅢ　EcoRⅠ 解析　根据题意可知，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP(启动子)应为水稻胚乳中特异表达的基因的启动子。Nos为终止子，其作用为终止转录过程。GtP内部含有KpnⅠ的酶切位点，用KpnⅠ酶切会破坏启动子，Nos下游含有SacⅠ的酶切位点，用SacⅠ酶切会使重组基因表达载体缺失终止子，故构建基因表达载体时，可选择限制酶HindⅢ和EcoRⅠ对r2HN基因与载体进行酶切。 2．(4分)(2024·江苏，23节选)为了高效纯化超氧化物歧化酶(SOD)，科研人员将ELP50片段插入pET－SOD构建重组质粒pET－SOD－ELP50，以融合表达SOD－ELP50蛋白，过程如图。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列－(GTTCCTGGTGTTGGC)50－限制酶b识别序列，50为重复次数。 步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是____________________。 答案　EcoRⅠ、HindⅢ 解析　目的基因应插入启动子和终止子之间，结合题意可知，ELP50应插入pET－SOD之后，由图可知，限制酶a和限制酶b分别是EcoRⅠ、HindⅢ。 3．(4分)(2022·湖北，24节选)如图是S基因的cDNA和载体的限制性内切核酸酶(限制性核酸内切酶)酶谱。为了成功构建重组表达载体，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用____________________酶切割S基因的cDNA和载体。 答案　XbaⅠ、HindⅢ 解析　为了成功构建重组表达载体，不破坏载体关键结构和目的基因，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用XbaⅠ、HindⅢ酶切割S基因的cDNA和载体。 4．(每空3分，共9分)(2021·山东，25节选)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。 为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是__________，在R末端添加的序列所对应的限制酶是____________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要______种酶。 答案　SalⅠ　EcoRⅠ　6 解析　据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R端与荧光蛋白基因中限制酶MunⅠ识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有MunⅠ和XhoⅠ的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶MunⅠ和XhoⅠ所识别，故应该选用添加限制酶EcoRⅠ和限制酶SalⅠ识别序列，由图可知，限制酶MunⅠ识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoRⅠ识别并切割后的黏性末端相同，故R末端添加的序列所对应的限制酶是EcoRⅠ，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是SalⅠ；荧光蛋白基因中含有限制酶EcoR Ⅰ的识别位点，故对载体使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ切割。综上所述，对载体使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ切割，对扩增后的产物用限制酶EcoRⅠ和限制酶SalⅠ识别序列，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用Taq酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是Taq酶、限制酶EcoRⅠ、限制酶SalⅠ、限制酶MunⅠ、限制酶XhoⅠ、DNA连接酶。 1．(每空2分，共16分)(2024·吉安高三期末)人乳铁蛋白广泛分布于乳汁等外分泌液中，在初乳中含量较高，对细菌、真菌和病毒等有抑制作用。如图表示利用基因工程技术构建人乳铁蛋白基因重组质粒的过程(图中TetR表示四环素抗性基因，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因)，五种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。回答下列问题： 限制酶 BamHⅠ HaeⅢ BclⅠ Sau3AⅠ NotⅠ 识别序列及切割位点 (1)要将人乳铁蛋白基因插入载体中，若只使用一种限制酶，应选择的限制酶是__________。限制酶切割的是__________键。基因工程技术中为保证目的基因的正确连接，通常选择__________种限制酶进行酶切。 (2)基因工程最核心的步骤是__________，重组质粒中启动子的功能是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (3)人乳铁蛋白基因需要利用PCR技术进行扩增，扩增需要引物__________(在“Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ”中选择)。 (4)据图分析，成功获得含有人乳铁蛋白基因的重组质粒首先需要在含有__________(填“四环素”或“氨苄青霉素”)的培养基上进行筛选，然后将需要的重组质粒导入牛的受精卵，再利用__________工程技术获得转基因小牛。 答案　(1)Sau3AⅠ　磷酸二酯　2(或两)　(2)基因表达载体的构建　RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质　(3)Ⅱ、Ⅲ　(4)氨苄青霉素　胚胎 解析　(1)要将人乳铁蛋白基因插入载体中，若只允许使用一种限制酶，根据人乳铁蛋白基因两端的识别序列可知，BclⅠ和Sau3AⅠ可以切出相同的黏性末端，结合质粒上的限制酶识别序列可知，只用一种酶且切出相同的黏性末端，则应选择的限制酶是Sau3AⅠ。限制酶断开的是磷酸二酯键。为了避免目的基因和质粒自身环化和反向连接，基因工程技术中通常选择2种限制酶进行酶切，以形成不同的黏性末端。(3)PCR中引物的作用是使耐高温的DNA聚合酶从引物的3′端连接游离的脱氧核苷酸，所以引物5′端应该与模板链的3′端配对，故引物应选择Ⅱ、Ⅲ。(4)据图分析，成功获得含有人乳铁蛋白基因的重组质粒含有氨苄青霉素抗性基因，需要在含有氨苄青霉素的培养基上筛选，然后将需要的重组质粒导入牛的受精卵，再利用胚胎工程技术获得转基因小牛。 2．(16分)(2024·石家庄高三一模)甜菜是我国重要的糖料作物之一，为提高其光合作用效率和产量，科研工作者利用基因工程技术将SBPase基因(编码卡尔文循环过程中的关键酶)导入甜菜中进行遗传改造。该过程所利用的质粒载体和SBPase基因分别如图1和图2所示。回答下列问题： 注：真核启动子可启动下游基因在真核细胞内的表达，原核启动子可启动下游基因在原核细胞内的表达。 (1)(4分)获取SBPase基因后利用______技术进行扩增，经__________________技术鉴定后，回收其中包含目的基因的DNA片段。 (2)(6分)SBPase基因两端不具有限制酶切割位点，为保证SBPase基因正确连接在质粒载体上，应在SBPase基因左、右两端分别添加限制酶______的识别序列，具体操作是在扩增SBPase基因时________________________。将质粒载体与扩增得到的目的基因用限制酶切割后再用______酶处理，构建重组质粒。 (3)(3分)已知卡那霉素和潮霉素可与原核细胞核糖体以及真核细胞线粒体、叶绿体中的核糖体结合，进而阻止基因表达的______过程，而不能与真核细胞细胞质基质中的核糖体结合，据此分析，重组质粒导入农杆菌后，需在含______(填“卡那霉素”或“潮霉素”)的培养基上培养，从而筛选出含重组质粒的农杆菌。 (4)(3分)将含有重组质粒的农杆菌与甜菜叶柄共培养一段时间后。再转入含有潮霉素的选择培养基，可筛选出抗性植株，机理为_______________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)PCR　(琼脂糖凝胶)电泳　(2)AarⅠ、HindⅢ　在引物的5′端加限制酶的识别序列　DNA连接　(3)翻译　卡那霉素　(4)农杆菌将重组质粒中的T－DNA转移并整合至受体细胞中，转化成功的植株可表现出对潮霉素的抗性，未转化成功的植株因线粒体、叶绿体功能异常而无法存活 解析　(1)获取目的基因后利用PCR技术进行扩增，经电泳鉴定后，切割凝胶，再将凝胶溶解，回收其中包含目的基因的DNA片段。(2)由题图2中SBPase基因模板链3′端和5′端的位置可判断其转录方向为从右向左，即右端为基因上游，左端为基因下游，而由题图1可知，质粒载体上外源基因的转录方向为顺时针，为保证目的基因与质粒载体的正确连接，且不破坏潮霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因(两抗性基因在目的植株的获取过程中均发挥作用)，应在SBPase基因的左、右两端分别添加限制酶AarⅠ和HindⅢ的识别序列，具体操作是在扩增SBPase基因时在引物的5′端加限制酶的识别序列。将质粒载体与扩增得到的目的基因用限制酶切割后再用DNA连接酶处理，构建重组质粒。(3)卡那霉素和潮霉素通过与原核细胞核糖体结合，直接影响基因的翻译过程。农杆菌属于原核生物，对卡那霉素和潮霉素均无抗性。成功导入重组质粒的农杆菌同时获得卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因，但由于潮霉素抗性基因上游为真核启动子，在原核细胞内无法表达，所以导入了重组质粒的农杆菌对潮霉素没有抗性，对卡那霉素具有抗性，未导入重组质粒的农杆菌对卡那霉素、潮霉素均没有抗性，故选择含卡那霉素的培养基可筛选出含重组质粒的农杆菌。(4)农杆菌侵染甜菜叶柄细胞时将重组质粒中的T－DNA转移并整合至甜菜叶柄细胞中，所以在含有潮霉素的选择培养基上，转化成功的植株可表现出对潮霉素的抗性，未转化成功的植株因线粒体、叶绿体功能异常而无法存活。 3．(12分)(2024·南昌高三三模)人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值，以传统方法只能从血浆中制备，科学家利用基因工程和细胞工程技术制得了重组HSA(rHSA)。回答下列问题： (1)(3分)获取HSA基因的途径之一：提取总RNA，利用________酶合成总cDNA，然后以cDNA为模板，采用PCR技术扩增HSA基因。已知HSA基因一条链两端的序列为5′AAGGGCGG－HSA基因－GGGAAACT3′，根据其两端序列，则需要选择的一对引物序列是______(填字母)。若某一双链cDNA在PCR仪中进行了5次循环，则需要消耗________个引物。 A．引物Ⅰ是5′－AAGGGCGG—3′，引物Ⅱ是5′－GGGAAACT－3′ B．引物Ⅰ是5′－AAGGGCGG—3′，引物Ⅱ是5′－AGTTTCCC－3′ C．引物Ⅰ是5′－CCGCCCTT－3′，引物Ⅱ是5′－GGGAAACT－3′ D．引物Ⅰ是5′－CCGCCCTT－3′，引物Ⅱ是5′－AGTTTCCC－3′ (2)(5分)如图甲为获取的含有HSA基因的DNA片段，中间一段为HSA基因。Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ为三种限制酶，图中箭头所指为三种限制酶的切点；图乙是三种限制酶的识别序列与酶切位点示意图；图丙是土壤农杆菌中用于携带目的基因的Ti质粒结构示意图。 为保证目的基因和质粒正确连接，切割含有目的基因的DNA片段和质粒经常会用到两种限制酶，在该实验中，切割含有目的基因DNA片段使用的限制酶为__________________，原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (3)(4分)若要在水稻胚乳细胞中提取rHSA，需要用到植物组织培养技术，该技术的原理是__________________；若要利用乳腺生物反应器来生产rHSA，则应将目的基因与__________________等调控元件重组构建的基因表达载体，通过__________________方法导入________受体细胞中。 答案　(1)逆转录　B　62　(2)EcoRⅠ和BamHⅠ　切割质粒只能用EcoRⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶，但由于Sau3AⅠ会破坏(切割)目的基因，所以切割含有目的基因的DNA片段不能用Sau3AⅠ；由于BamHⅠ与Sau3AⅠ切出的黏性末端相同且BamHⅠ和EcoRⅠ切割含有目的基因的DNA片段后可得到与质粒两端黏性末端相同的目的基因，故应该用EcoRⅠ和BamHⅠ切割含有目的基因的DNA片段　(3)细胞的全能性　乳腺蛋白基因启动子　显微注射　受精卵 解析　(1)合成总cDNA需提取细胞中所有的mRNA，在逆转录酶的作用下通过逆转录过程获得。采用PCR技术扩增HSA基因(5′AAGGGCGG－HSA基因－GGGAAACT3′)时，PCR中需要一对特异性的引物，该引物能与目的基因3′端的碱基互补配对，子链延伸时是从引物的5′端向3′端延伸，所以符合条件的引物Ⅰ是5′－AAGGGCGG—3′，引物Ⅱ是5′－AGTTTCCC－3′，故选B。一双链cDNA在PCR仪中进行5次循环，共产生25＝32(个)DNA分子，所以共有26＝64(条)链，其中62条链是新合成的，需要引物，所以需要64－2＝62(个)引物。(2)图丙中有EcoRⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶，为了防止目的基因与质粒间的任意连接，应该选择Sau3AⅠ、EcoRⅠ切割质粒。结合图甲、乙和丙分析，Sau3AⅠ会破坏目的基因，Sau3AⅠ和BamHⅠ切出的黏性末端相同，故采用BamHⅠ、EcoRⅠ充分切割目的基因，可得到与质粒两端黏性末端相同的目的基因。(3)若要在水稻胚乳细胞中提取rHSA，需要用到植物组织培养技术，该技术的原理是细胞的全能性。为了让人血清白蛋白(HSA)在乳腺细胞中表达，应将目的基因与乳腺蛋白基因启动子等调控元件重组构建的基因表达载体，通过显微注射方法导入受精卵中，原因是受精卵具有全能性。 4．(15分)(2024·沧州高三二模)L-天冬酰胺酶因其能水解L-天冬酰胺(丙烯酰胺的前体)，而有效降低油炸食品中潜在致癌物质丙烯酰胺的含量，在食品安全领域受到高度关注。某科研机构欲利用pET22b质粒将L-天冬酰胺酶基因导入对氨苄青霉素敏感的宿主菌中，以构建高效表达L-天冬酰胺酶的菌株。图1是L-天冬酰胺酶基因附近的限制酶切点以及基因两侧的部分碱基序列，图2是pET22b质粒的结构模式图及其涉及的限制酶切点，其中的LacZ基因编码产生的半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，否则菌落为白色。回答下列问题： (1)(4分)利用PCR从提取的DNA中扩增目的基因时需要引物，引物的作用是________________________________________________________________________。要将L-天冬酰胺酶基因导入到pET22b质粒中，需使用的两种限制酶是________________________。 (2)(2分)若图1下方的序列为目的基因的部分碱基序列，则获取目的基因时设计B端的引物序列是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________(只写出16个碱基即可)。 (3)(7分)利用感受态法的转化成功率并不是100%，科研人员将转化后的宿主菌接种在含氨苄青霉素和X-gal的固体培养基上，以此筛选出成功导入重组质粒的宿主菌。 ①若只使用限制酶EcoRⅠ构建重组质粒，导入重组质粒的菌落呈现__________色，这些菌落__________(填“能”“不能”或“不一定能”)产生L-天冬酰胺酶，理由是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 ②若使用(1)中的限制酶处理，则菌落呈______色的为符合要求的宿主菌，理由是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (4)(2分)能够发挥作用的L-天冬酰胺酶是由4个亚基形成的，如果选择大肠杆菌作为受体菌，只能从大肠杆菌中提取到4条单链肽链，不能得到有活性的L-天冬酰胺酶，原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸　KpnⅠ、EcoRⅠ　(2)3′－TAAGTTGTCTCTTAAG－5′　(3)①白　不一定能　EcoRⅠ切割目的基因和质粒产生的黏性末端相同，构建的重组质粒可能是目的基因和质粒反向连接而成，目的基因无法正常表达　②白　重组质粒由于LacZ基因被切断，无法合成半乳糖苷酶，不能分解X-gal，菌落呈白色　(4)大肠杆菌细胞内无内质网和高尔基体等细胞器，不能对肽链进行加工、折叠形成具有一定空间结构的蛋白质 解析　(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。引物的作用：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。若用PstⅠ或BglⅡ会破坏目的基因，若用BamHⅠ会破坏氨苄青霉素抗性基因。若用EcoRⅠ对目的基因和质粒进行切割，由于切割后目的基因和质粒两端的黏性末端相同，因此至少会产生4种连接产物，即目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因和质粒正向连接以及目的基因和质粒反向连接。用KpnⅠ和EcoRⅠ对目的基因和质粒进行切割，切割后目的基因和质粒两端的黏性末端不相同，因此不会出现自身环化和反向连接的情况。(2)获取目的基因时设计B端的引物，B端的引物是与B端的3′端互补配对，同时，要在引物的5′端添加EcoRⅠ的识别序列，因此B端的引物序列是3′－TAAGTTGTCTCTTAAG－5′。(3)若用EcoRⅠ对目的基因和质粒进行切割，由于切割后目的基因和质粒两端的黏性末端相同，因此至少会产生4种连接产物，即目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因和质粒正向连接以及目的基因和质粒反向连接，重组质粒由于LacZ基因被切断，无法合成半乳糖苷酶，不能分解X-gal，菌落呈白色，但重组质粒可能是目的基因和质粒反向连接而成，目的基因无法正常表达，因此呈白色的菌落不一定能产生L-天冬酰胺酶。用EcoRⅠ和KpnⅠ对目的基因和质粒进行切割，切割后目的基因和质粒两端的黏性末端不相同，因此不会出现自身环化和反向连接的情况，但重组质粒由于LacZ基因被切断，无法合成半乳糖苷酶分解X-gal，菌落呈白色，因此白色的菌落为成功导入重组质粒的宿主菌。(4)能够发挥作用的L-天冬酰胺酶是由4个亚基形成的，如果选择大肠杆菌作为受体菌，大肠杆菌是原核生物，细胞内只有核糖体，只能形成肽链，无内质网和高尔基体等细胞器，不能对肽链进行加工、折叠形成具有一定空间结构的蛋白质，因此，不能得到有活性的L-天冬酰胺酶。 5．(每空2分，共12分)(2024·常州高三三模)拟南芥体内的基因X具有多个启动子，通过一种光受体对不同光质刺激进行应答，选择不同的启动子并转录出长度不同的mRNA，从而表达出存在于细胞内不同位置的蛋白质，使拟南芥呈现出不同的生长状态。其相关蛋白的合成过程如图1所示。 (1)启动子与起始密码子发挥的作用分别是_____________________________ ________________________________________________________________________。 (2)据图1分析，与蛋白质X②相比，蛋白质X①的a末端在结构上的特点是________________________________________________________________________。 (3)研究人员通过特定技术，将绿色荧光蛋白(GFP)基因的片段(GFP基因不含启动子和终止子)插入基因X的特定位置，使表达出的蛋白质X①、X②能带有绿色荧光蛋白，以实现它们在细胞内的可视化，由此得到A系植株。 ①根据图1，GFP基因片段不能插入基因X的B位置，原因是________________________________________________________________________。 ②根据图2中GFP基因两侧的碱基序列选择表格中的______________酶可以将其从染色体基因组中切割下来。 限制酶 识别序列 限制酶 识别序列 BamHⅠ G↓GATCC CCTAG↑G NotⅠ G↓CGGCCGC CGCCGGC↑G HindⅢ A↓AGCTT TTCGA↑A EcoRⅠ G↓AATTC CTTAA↑G (4)研究人员在A系植株的基础上，去除光受体基因后得到B系植株。随后，分别在黑暗条件和红光条件下培养A、B两系植株，培养条件及观测到荧光的部位如表所示。 植物类型 光照条件 黑暗条件 红光条件 A系植株 细胞质基质 叶绿体 B系植株 细胞质基质 细胞质基质 综合以上研究结果，红光条件下A系植株与B系植株基因X表达所使用的启动子分别是______________，判断依据是_____________________________________________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)驱动基因的转录、翻译开始的信号 (2)含有叶绿体转移信号　(3)①GFP基因片段应插入基因X内启动子②的下游　②BamHⅠ、NotⅠ　(4)启动子①、启动子②　在光受体作用下A系植株选择启动子①表达出蛋白质X①，B系植株没有被激活 解析　(3)分析题图1可知，GFP基因片段应插入基因X内启动子②的下游，即字母C表示的特定位置，从而经过转录、翻译得到目的产物。限制酶能识别DNA分子中特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，分析题图2可知，序列中含有GGATCC序列和GCGGCCGC序列，故应选择表中的BamHⅠ和NotⅠ酶将GFP基因从染色体基因组中切割下来。(4)分析表中数据可知，与去除光受体基因后得到B系植株相比，A系植株能对红光刺激作出应答被激活，原因是在光受体作用下A系植株选择启动子①表达出蛋白质X①，B系植株无法被激活，应是启动子②。 学科网（北京）股份有限公司 $$