专题八 [重点突破] 第7练 基因编辑原理、过程及应用-【步步高·考前三个月】2025年高考生物学复习讲义课件（鲁湘辽吉黑）（课件PPT+word教案）

专题八　 [重点突破]　第7练 基因编辑原理、过程及应用 真题演练 模拟预测 内容索引 1.(2024·山东，25节选)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异 性结合基因组上的目标序列并 发挥作用。载体信息、目标基 因L部分序列及相关结果等如 图所示。 真题演练 PART ONE 1 2 3 4 5 LB/RB：T－DNA的边界序列；Kanr：卡那霉素抗性基因；Ampr氨苄青霉素抗性基因。 甲　载体信息 1 2 3 4 5 乙　目标基因L部分序列 1 2 3 4 5 丙　限制酶识别序列、切割位点及电泳结果 (1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越____(填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有___________种。载体信息如图甲所示，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′－_______－3′和5′－_______________________－3′。 1 2 3 4 5 低 256(或44) GTTT CAAT(或CAAT　GTTT) 单链突出序列NNNN为黏性末端，N代表任一碱基，所以，用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上能得到256种黏性末端。载体上有2个BsaⅠ酶切位点，最后两个空序列为GTTT和CAAT，方向均从5′端到3′端。 1 2 3 4 5 (2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素__________筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是_______，其中纯合的突变植株是_____(填序号)。 1 2 3 4 5 卡那霉素 SacⅠ ④ 导入大豆细胞中的T－DNA片段中含有卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在SacⅠ酶切位点上存在差异，BamHⅠ和EcoRⅠ这两个酶切位点完全相同， 1 2 3 4 5 根据图丙及题意可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶SacⅠ，限制酶SacⅠ在突变序列存在酶切位点， 1 2 3 4 5 但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条，根据图丙结果可知，只有④为纯合的突变植株。 1 2 3 4 5 2.(2020·山东，25)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。 (1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是_______________________________，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为______。 1 2 3 4 5 限制性内切核酸酶和DNA连接酶 转化 1 2 3 4 5 构建基因表达载体需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶，可以对目的基因和载体进行切割和连接，重组载体进入受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。 (2)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了__________ _______________________，从而改变了Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列_______(填“发生”或“不发生”)改变，原因是________________ ____________________________。 1 2 3 4 5 RNA聚合 酶与启动子的识别和结合 不发生 编码直链淀粉合 成酶的碱基序列中不含启动子 1 2 3 4 5 RNA聚合酶与启动子识别和结合后启动转录，启动子的序列改变会影响与RNA聚合酶的识别和结合，从而改变基因的转录，3个突变品系中改变的是启动子的序列，影响mRNA的转录，而编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含有启动子的序列，所以编码合成的直链淀粉酶的氨基酸序列不发生改变。 (3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA (Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经________过程获得总cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是_______________________________ ________________________________________________。 1 2 3 4 5 逆转录 引物是根据Wx基因的一段已知序 列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合) 通过mRNA获得cDNA是逆转录过程。PCR过程中需要模板、原料、酶、引物等，其中引物是根据已知基因上的一段序列合成的，这样要从总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，关键是要根据Wx基因的一段已知序列合成出相应的引物。 (4)各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为________，原因是_____________________________________________ ____________________________________________。 1 2 3 4 5 品系3 品系3的Wx mRNA量最少，控制合成的直链淀粉合 成酶的量最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强 1 2 3 4 5 据题中信息可知，水稻胚乳中直链淀粉所占比例越小，糯性越强，题图中品系3中的Wx mRNA量最少，这样合成的直链淀粉合成酶的量最少，则合成的直链淀粉所占比例最小，糯性最强。 1 2 3 4 5 3.(2024·新课标，35节选)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到 菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、 引物(P1～P4)的结合位置、片 段甲替换区如图所示，→表 示引物5′→3′方向。回答 下列问题： 1 2 3 4 5 (1)限制酶切割的化学键是____________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是___________________________________________ _____________________。 磷酸二酯键 使M1与M2之间有启动子、N基因、终止子，确 保N基因能够顺利表达 1 2 3 4 5 (2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和_____________________。 C－G、A－T、U－A 1 2 3 4 5 (3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是___________________。 菌株B2基因组DNA 1 2 3 4 5 4.(2021·海南，25节选)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA(SgRNA)引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。回答下列问题： 1 2 3 4 5 (1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定SgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是____________。 DNA连接酶 1 2 3 4 5 基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA连接酶，限制酶负责切割，DNA连接酶负责连接，因此为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定SgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是DNA连接酶。 1 2 3 4 5 (2)过程③～⑤中，SgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是____________。随后，Cas9蛋白可切割______________ _______序列。 碱基互补配对 目标(目的)DNA (基因) 1 2 3 4 5 根据题图可知：在CRISPR/Cas9基因编辑技术中，SgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9能借助SgRNA分子与目标DNA进行特异性结合的原因在于SgRNA分子上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则实现SgRNA与目标DNA特定序列的特定识别，进而定位；由此可见，Cas9在功能上属于限制酶，可切割目标DNA特定的核苷酸序列。 1 2 3 4 5 (3)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1 200 bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是__________________，基因敲除成功的判断依据是____________________ _________________________________________________________________________________________。 DNA分子杂交技术 经编辑过的DNA片段(从受体细胞中提取的基因组DNA)与标记的目标(对应)基因(探针)杂交，若无杂交带，则敲除成功 1 2 3 4 5 (4)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程：____________________ _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。 CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，表达产物Cas9蛋白和转录产物SgRNA，两者形成复合体；SgRNA识别并结合目标DNA序列，引导Cas9蛋白进行切割；从而将目的基因插入基因组DNA中 1 2 3 4 5 5.(2022·重庆，24节选)科学家用基因编辑技术由野生型番茄(HH)获得突变体番茄(hh)，发现突变体中DML2基因的表达发生改变，进而影响乙烯合成相关基因ACS2等的表达及果实中乙烯含量(如图Ⅰ、Ⅱ)，导致番茄果实成熟期改变。请回答以下问题： 1 2 3 4 5 (1)图Ⅰ中，基因h是由基因H编码区第146位碱基后插入一个C(虚线框所示)后突变产生，致使h蛋白比H蛋白少93个氨基酸，其原因是__________________ _____________。基因h转录形成的 翻译的过程中提前出 现终止密码子 mRNA上第49个密码子为______。另有研究发现，基因H发生另一突变后，其转录形成的mRNA上有一密码子发生改变，但翻译的多肽链氨基酸序列和数量不变，原因是__________________。 GCC 密码子具有简并性 由图Ⅰ可知：基因h是由基因H编码区第146位碱基后插入一个C后突变产生，插入一个C后导致基因h后的碱基排列顺序发生改变，即终止密 码子的位置提前，导致翻译过程提 前终止，所以致使h蛋白比H蛋白少93个氨基酸；密码子是由位于mRNA上的3个相邻的碱基决定的，基因h是由基因H编码区第146位碱基后插入一个C后突变产生，插入一个C后就变成了147位的碱基， 1 2 3 4 5 所以基因h转录形成的mRNA上第49个密码子为GCC；由于密码子具有简并性，当基因H发生另一突变后，其转录形成的mRNA上有一密码子发生改变，但翻译的多肽链氨基酸序列和数量可能不变。 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 (2)图Ⅱ中，t1～t2时段，突变体番茄中DML2基因转录的mRNA相对量低于野生型，推测在该时间段，H蛋白对DML2基因的作用是________________________。突变体番茄果实成熟期改变的可能机制为：H突变为h后，由于DML2基因的作用，果实中ACS2基因__________，导致果实成熟期______(填“提前”或“延迟”)。 促进DML2基因的转录过程 延迟表达 延迟 1 2 3 4 模拟预测 PART TWO 1.(2024·岳阳高三二模)In－Fusion技术是一项新型的无缝克隆技术，技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列，通常为15～20 bp)，然后用In－Fusion酶(能识别双链线性化DNA片段5′→3′末端16个碱基，并使其降解)处理即可实现无缝连接。与传统构建重组质粒的方法相比，In－Fusion技术的优势之一是不受限制酶切割位点的限制；可以把目的基因插入任何位点；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏。 1 2 3 4 它的操作步骤(如图)大致为：①利用PCR技术将质粒线性化；②PCR扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因；③目的基因与线性化质粒同源区域在In－Fusion酶作用下形成重组质粒；④将重组质粒导入受体细胞。回答下列问题： 1 2 3 4 (1)过程①需要用到的酶是___________________________________；质粒线性化前后所含有的游离磷酸基团的个数分别为_______个。 Taq DNA聚合酶(耐高温的DNA聚合酶) 0、2 过程①是利用两种引物进行的质粒线性化过程，该过程属于PCR技术的应用，故需要Taq DNA聚合酶(耐高温的DNA聚合酶)；环状质粒无游离磷酸基团，一条DNA链含有一个游离的磷酸基团；线性化DNA是双链，则含有2个游离的磷酸基团，故质粒线性化前后所含有的游离磷酸基团的个数分别为0和2。 1 2 3 4 1 2 3 4 (2)过程③中，同源序列1、2中的碱基序列不同，这样设计的优点是_____________________ ______________________________________。 防止目的基因反向连 接，防止线性化质粒或目的基因自身环化 1 2 3 4 过程③是基因表达载体的构建过程，该过程中，同源序列1、2中的碱基序列不同，这样设计的优点是防止目的基因反向连接，防止线性化质粒或目的基因的自身环化，以保证目的基因能够正确连接并表达。 1 2 3 4 (3)过程④中，用_______处理大肠杆菌，以便使重组质粒导入受体细胞。重组质粒利用大肠杆菌细胞中的DNA聚合酶和___________酶，实现完全环化。 Ca2＋ DNA连接 1 2 3 4 DNA连接酶能将DNA片段连接成一个重组DNA分子，故重组质粒利用大肠杆菌细胞中的DNA聚合酶和DNA连接酶，实现完全环化。 1 2 3 4 (4)通过检测大肠杆菌的致死率可反映其转化后的抗性效果。在含____________的液体培养基中培养一段时间，然后分别用显微镜计数法和稀释涂布平板法进行计数，计数结果分别是M、N，则致死率可用____________×100%表示，此结果较真实值偏大，原因是后一种计数时_______________________________________________________。 氨苄青霉素 (M－N)/M 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 1 2 3 4 结合题图，标记基因为氨苄青霉素抗性基因，故在含氨苄青霉素的液体培养基中培养一段时间，然后分别用显微镜计数法(死菌和活菌均被计数)和稀释涂布平板法(用于活菌计数)进行计数， 故若计数结果分别是M、N，致死率可用(M－N)/M×100%表示。由于在用稀释涂布平板法计数时，当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，会导致N偏小，进而导致上述结果较真实值偏大。 1 2 3 4 2.(2024·大庆高三三模)CRISPR/Cas9基因编辑技术可以按照人们的意愿精准剪切、改变任意靶基因的遗传信息，从而达到基因定点敲除、插入、突变的目的。在该基因编辑技术中，SgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列。请回答下列问题： (1)Cas9准确切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列的过程体现了酶具有_____性；该过程依赖于SgRNA与靶基因DNA序列之间的_____________。 专一 碱基互补配对 1 2 3 4 (2)SgRNA是人工合成的一段能与靶基因互补配对的特殊序列，由23个连续的碱基组成。研究发现，SgRNA有时会出现脱靶问题，试分析其原因可能是________________________________________________________；解决措施是__________________________________________________。 SgRNA序列过短，易与靶基因以外的DNA序列互补配对而脱靶 适当增加SgRNA的长度，提高其与靶基因识别的特异性 1 2 3 4 (3)为了实现某基因的特异性敲除，如图1所示，科研人员将含有3个不同的但靶向相同基因的SgRNA编码基因的重组质粒组装到具有特殊元件的载体上，形成新的重组质粒。 1 2 3 4 理论上，一个SgRNA便能实现靶基因的敲除，请分析构建图1所示重组质粒的优势：___________________________________________________ _______________________(答出2点)。 只构建一个表达载体即可，能准确插入目标生物基因组中，能通过绿色荧光进行筛选 由图1可知，EGFP是增强型绿色荧光蛋白基因；I－SecⅠ是归位内切酶，可将质粒随机插入目标生物的基因组中，理论上，一个SgRNA便能实现靶基因的敲除，构建图1所示重组质粒的优势有：只构建一个表达载体即可，能准确插入目标生物基因组中，能通过绿色荧光进行筛选等。 1 2 3 4 1 2 3 4 (4)为筛选特定D基因“敲除”的果蝇，在D基因的DNA断裂位点插入绿色荧光蛋白基因(EGFP)需构建携带绿色荧光蛋白基因的供体质粒。把EGFP基因和His标签基因(His标签由6个组氨酸组成)连接起来构建融合基因并构建重组质粒，图2为载体、EGFP基因的结构、不同限制酶的识别序列及切割位点，欲将标签基因连接在绿色荧光蛋白基因(EGFP)编码区的首端，已知组氨酸的密码子为CAU，起始密码子为AUG。 1 2 3 4 ①写出His基因模板链的碱基序列：5′－_____________________________－3′。 ATGATGATGATGATGATGCAT 已知His标签由6个组氨酸组成，组氨酸的密码子为CAU，起始密码子为AUG，所以His基因模板链的碱基序列为5′－ATGATGATGATGATGATGCAT－3′。 1 2 3 4 1 2 3 4 ②为构建融合基因并将其插入载体，科研人员设计了一对与EGFP基因编码区两端序列互补配对的引物，设计时需在引物______(填“A”或“B”)的5′端增加相应的限制酶识别序列和His基因的编码序列，请写出该引物开头的12个碱基序列：5′－_________________－3′。 A CAATTGATGCAT 1 2 3 4 设计与EGFP基因编码区两端序列互补配对的引物时，要保证限制酶切割位点不能破坏EGFP基因且标签基因连接在绿色荧光蛋白基因(EGFP)编码区的首端，故需在引物A的5′端增加相应的限制酶识别序列和His基因的编码序列，由图2分析可知，选择MunⅠ限制酶，结合组氨酸的密码子为CAU，起始密码子为AUG，引物序列为5′－CAATTGATGCAT－3′。 1 2 3 4 3.(2024·临沂高三二模)Cre/LoxP重组酶系统是在基因或染色体水平上对生物基因进行遗传改造的一种技术，可以在DNA的特定序列进行定点切割和重新连接。请回答下列问题： 1 2 3 4 (1)图1是利用Cre/LoxP酶系统敲除基因的过程。LoxP序列具有方向性，由中间的间隔序列和两侧的反向重复序列组成，其中决定方向的序列是_________。图1中一条DNA片段上待敲除基因的两端存在同向LoxP序列，Cre酶能识别并结合到LoxP序列的反向重复序列区，定点切断间隔序列的___________，从而实现目标基因的敲除，敲除的基因片段会形成_____(填“线状”或“环状”)结构。若经Cre酶作用使得2个LoxP位点间的序列发生反转，其原因可能是______________________。 间隔序列 磷酸二酯键 环状 两个LoxP序列方向相反 1 2 3 4 两侧的反向重复序列的碱基排列顺序一致，无法确定方向，则能决定方向的只有中间的间隔序列。碱基序列之间通过磷酸二酯键连接。由于敲除的基因片段会露出相同的黏性末端，则剪出的基因两端自动碱基互补配对成环状结构。如果两个LoxP位点位于同一条DNA上且方向相反，Cre酶会使LoxP间的序列反转。 1 2 3 4 (2)Cre/LoxP酶系统可以调控基因的表达，在目的基因______(填“上游”或“下游”)插入一个带有LoxP位点的编码终止密码子的序列，在Cre酶存在的情况下，目的基因______(填“表达”或“不表达”)。 上游 表达 1 2 3 4 Cre/LoxP重组酶系统调控基因的表达，在目的基因上游插入带有LoxP位点的编码终止密码子的序列，Cre酶会对LoxP位点进行切割，终止密码子不发挥作用，因此目的基因表达。 1 2 3 4 (3)图2是利用Cre/LoxP酶系统构建融合基因的过程。首先分别扩增Bt基因和Bar基因，以获得所需要的DNA片段，然后用Cre/LoxP酶系统处理连接后的DNA片段，获得Bt－Bar融合基因片段。PCR1过程中，所用的2种引物的结合位置分别在________________________；该过程中，还需添加的物质有_______________________________________(至少写2种)等。 启动子外侧和终止子内侧 Taq DNA聚合酶、dNTP、(含Mg2＋)缓冲液 1 2 3 4 有研究表明，大多数限制酶对裸露的位点不能识别切割，因此必须对识别序列5′末端进行修饰并加上一个至几个保护碱基，如GGG。由此推测，对Bar基因引物5′端序列的要求是_____________________________ ____________________________________。 引物的5′端均要连接上LoxP序 列，并在末端加上保护碱基序列(GGG) 1 2 3 4 启动子是决定RNA聚合酶转录起始位点的DNA序列，终止子是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列，启动子一般在目的基因的左侧，终止子在目的基因的 右侧，因为要获得Bt－Bar融合基因片段，即需要Bt带上启动子(不需要终止子)、Bar带上终止子(不需要启动子)，因此在用PCR1扩增Bt基因时，所用的2种引物的结合位置在Bt的启动子外侧和终止子内侧。 1 2 3 4 PCR过程中除了添加引物外，还需要添加Taq DNA聚合酶、dNTP、(含Mg2＋)缓冲液等。据图2可知，Bt－Bar融合基因片段中Bar基因的左侧和右侧都含有 LoxP序列，又因为大多数限制酶对裸露的位点不能识别切割，因此必须对识别序列5′末端进行修饰并加上一个至几个保护碱基，如GGG，据此可知，对Bar基因引物5′端序列的要求是引物的5′端均要连接上LoxP序列，并在末端加上保护碱基序列(GGG)。 1 2 3 4 4.(2024·锦州高三模拟)“脑彩虹”是一项最新的大脑成像技术，通过荧光蛋白“点亮”大脑内的神经元，帮助科学家了解大脑。Cre－LoxP系统能够实现特定基因的敲除，其技术过程如图1所示。 1 2 3 4 (1)当两个LoxP序列位于同一个DNA分子上且方向相同时，Cre重组酶能将两个切割位点之间的核苷酸序列切除并形成环状而失活，剩余序列会连接起来。在特定基因的敲除过程中，若两个LoxP序列方向相反时，Cre重组酶使两个LoxP间的序列颠倒，由此产生的变异本质上属于________________。 染色体结构变异 1 2 3 4 (2)图1中LoxP序列的方向取决于序号____对应的区域。一个LoxP序列的内部被Cre酶切割后，将在DNA序列的_____(填“5′”或“3′”)端形成游离的磷酸基团。 ② 5′ 1 2 3 4 根据图示可知，LoxP序列①和③是反向重复序列，因此图1中LoxP序列的方向取决于序号②对应的区域。一个LoxP序列内部经过切割后会增加两个游离的磷酸基团，位于DNA序列的5′端。 1 2 3 4 (3)科学家以小鼠为材料，将三种荧光蛋白基因、两种LoxP序列与脑组织特异表达启动子M相连接，构建图2所示的基因表达载体，再用________法将该基因表达载体导入小鼠的受精卵中，进而得到仅含一个图2所示片段的转基因小鼠，再经过进一步操作，获得纯合的转基因小鼠a(不含Cre酶)。 显微注射 1 2 3 4 (4)图2所示序列的两个LoxP1之间或两个LoxP2之间的基因，只会被Cre酶识别并切割一次。为使脑组织细胞中Cre酶的表达受调控，研究者将Cre酶基因与启动子N(由信号分子X开启)连接，经一系列操作，获得纯合转基因小鼠b，将纯合小鼠a和b杂交，得到F1。 a.若无X作用时，该小鼠脑组织的色彩为___色，其他组织细胞颜色为___色。 黄 无 1 2 3 4 b.若有X作用时，该小鼠脑组织会出现“脑彩虹”，请阐述机理：______ ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。 F1为杂 合子，有编码黄色、红色、蓝色荧光蛋白的基因、LoxP1、LoxP2及Cre酶基因；有信号分子X时，启动Cre酶表达，不同脑细胞中Cre酶表达情况不同，Cre酶识别的LoxP不同，因而不同细胞会差异表达黄色、红色或蓝色荧光蛋白基因 1 2 3 4 F1为杂合子，脑组织细胞中有编码黄色、红色、蓝色荧光蛋白的基因、LoxP1、LoxP2及Cre酶基因。无信号分子X时，Cre酶不表达，仅表达与启动子相邻的荧光蛋白的基因即黄色荧光蛋白基因，使脑组织细胞呈黄色。 $$ [重点突破]　第7练　基因编辑原理、过程及应用　[分值：100分] 1．(10分)(2024·山东，25节选)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。 LB/RB：T－DNA的边界序列；Kanr：卡那霉素抗性基因；Ampr氨苄青霉素抗性基因。 甲　载体信息 乙　目标基因L部分序列 丙　限制酶识别序列、切割位点及电泳结果 (1)(5分)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越________(填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有________种。载体信息如图甲所示，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′－________－3′和5′－________－3′。 (2)(5分)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素________筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是________，其中纯合的突变植株是________(填序号)。 答案　(1)低　256(或44)　GTTT　CAAT(或CAAT　GTTT)　(2)卡那霉素　SacⅠ　④ 解析　(1)单链突出序列NNNN为黏性末端，N代表任一碱基，所以，用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上能得到256种黏性末端。载体上有2个BsaⅠ酶切位点，最后两个空序列为GTTT和CAAT，方向均从5′端到3′端。(2)导入大豆细胞中的T－DNA片段中含有卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在SacⅠ酶切位点上存在差异，BamHⅠ和EcoRⅠ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及题意可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶SacⅠ，限制酶SacⅠ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条，根据图丙结果可知，只有④为纯合的突变植株。 2．(14分)(2020·山东，25)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。 (1)(3分)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是________________________________________________________________________ ____________，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为________。 (2)(5分)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了________________________________________________________________________， 从而改变了 Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列__________(填“发生”或“不发生”)改变，原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (3)(3分)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA (Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经____________过程获得总cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出 Wx基因的cDNA，原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (4)(3分)各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为________，原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)限制性内切核酸酶和DNA连接酶　转化　(2)RNA聚合酶与启动子的识别和结合　不发生　编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子　(3)逆转录　引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)　(4)品系3　品系3的Wx mRNA量最少，控制合成的直链淀粉合成酶的量最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强 解析　(1)构建基因表达载体需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶，可以对目的基因和载体进行切割和连接，重组载体进入受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。(2)RNA聚合酶与启动子识别和结合后启动转录，启动子的序列改变会影响与RNA聚合酶的识别和结合，从而改变基因的转录，3个突变品系中改变的是启动子的序列，影响mRNA的转录，而编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含有启动子的序列，所以编码合成的直链淀粉酶的氨基酸序列不发生改变。(3)通过mRNA获得cDNA是逆转录过程。PCR过程中需要模板、原料、酶、引物等，其中引物是根据已知基因上的一段序列合成的，这样要从总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，关键是要根据Wx基因的一段已知序列合成出相应的引物。(4)据题中信息可知，水稻胚乳中直链淀粉所占比例越小，糯性越强，题图中品系3中的Wx mRNA量最少，这样合成的直链淀粉合成酶的量最少，则合成的直链淀粉所占比例最小，糯性最强。 3．(每空2分，共8分)(2024·新课标，35节选)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题： (1)限制酶切割的化学键是________________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和____________________。 (3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是____________________。 答案　(1)磷酸二酯键　使M1与M2之间有启动子、N基因、终止子，确保N基因能够顺利表达　(2)C－G、A－T、U－A　(3)菌株B2基因组DNA 4．(每空2分，共12分)(2021·海南，25节选)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA(SgRNA)引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。回答下列问题： (1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定SgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是____________。 (2)过程③～⑤中，SgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是__________。随后，Cas9蛋白可切割________序列。 (3)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1 200 bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是________________，基因敲除成功的判断依据是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (4)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程：_________________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)DNA连接酶　(2)碱基互补配对　目标(目的)DNA(基因)　(3)DNA分子杂交技术　经编辑过的DNA片段(从受体细胞中提取的基因组DNA)与标记的目标(对应)基因(探针)杂交，若无杂交带，则敲除成功　(4)CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，表达产物Cas9蛋白和转录产物SgRNA，两者形成复合体；SgRNA识别并结合目标DNA序列，引导Cas9蛋白进行切割；从而将目的基因插入基因组DNA中 解析　(1)基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA连接酶，限制酶负责切割，DNA连接酶负责连接，因此为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定SgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是DNA连接酶。(2)根据题图可知：在CRISPR/Cas9基因编辑技术中，SgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9能借助SgRNA分子与目标DNA进行特异性结合的原因在于SgRNA分子上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则实现SgRNA与目标DNA特定序列的特定识别，进而定位；由此可见，Cas9在功能上属于限制酶，可切割目标DNA特定的核苷酸序列。 5．(每空2分，共12分)(2022·重庆，24节选)科学家用基因编辑技术由野生型番茄(HH)获得突变体番茄(hh)，发现突变体中DML2基因的表达发生改变，进而影响乙烯合成相关基因ACS2等的表达及果实中乙烯含量(如图Ⅰ、Ⅱ)，导致番茄果实成熟期改变。请回答以下问题： (1)图Ⅰ中，基因h是由基因H编码区第146位碱基后插入一个C(虚线框所示)后突变产生，致使h蛋白比H蛋白少93个氨基酸，其原因是__________________________。基因h转录形成的mRNA上第49个密码子为__________。另有研究发现，基因H发生另一突变后，其转录形成的mRNA上有一密码子发生改变，但翻译的多肽链氨基酸序列和数量不变，原因是________________________________________________________________________ ____________。 (2)图Ⅱ中，t1～t2时段，突变体番茄中DML2基因转录的mRNA相对量低于野生型，推测在该时间段，H蛋白对DML2基因的作用是________________________。突变体番茄果实成熟期改变的可能机制为：H突变为h后，由于DML2基因的作用，果实中ACS2基因____________，导致果实成熟期____________(填“提前”或“延迟”)。 答案　(1)翻译的过程中提前出现终止密码子　GCC　密码子具有简并性　(2)促进DML2基因的转录过程　延迟表达　延迟 解析　(1)由图Ⅰ可知：基因h是由基因H编码区第146位碱基后插入一个C后突变产生，插入一个C后导致基因h后的碱基排列顺序发生改变，即终止密码子的位置提前，导致翻译过程提前终止，所以致使h蛋白比H蛋白少93个氨基酸；密码子是由位于mRNA上的3个相邻的碱基决定的，基因h是由基因H编码区第146位碱基后插入一个C后突变产生，插入一个C后就变成了147位的碱基，所以基因h转录形成的mRNA上第49个密码子为GCC；由于密码子具有简并性，当基因H发生另一突变后，其转录形成的mRNA上有一密码子发生改变，但翻译的多肽链氨基酸序列和数量可能不变。 1．(10分)(2024·岳阳高三二模)In－Fusion技术是一项新型的无缝克隆技术，技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列，通常为15～20 bp)，然后用In－Fusion酶(能识别双链线性化DNA片段5′→3′末端16个碱基，并使其降解)处理即可实现无缝连接。与传统构建重组质粒的方法相比，In－Fusion技术的优势之一是不受限制酶切割位点的限制；可以把目的基因插入任何位点；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏。它的操作步骤(如图)大致为：①利用PCR技术将质粒线性化；②PCR扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因；③目的基因与线性化质粒同源区域在In－Fusion酶作用下形成重组质粒；④将重组质粒导入受体细胞。回答下列问题： (1)(2分)过程①需要用到的酶是____________；质粒线性化前后所含有的游离磷酸基团的个数分别为____________个。 (2)(2分)过程③中，同源序列1、2中的碱基序列不同，这样设计的优点是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (3)(2分)过程④中，用____________处理大肠杆菌，以便使重组质粒导入受体细胞。重组质粒利用大肠杆菌细胞中的DNA聚合酶和______________酶，实现完全环化。 (4)(4分)通过检测大肠杆菌的致死率可反映其转化后的抗性效果。在含____________的液体培养基中培养一段时间，然后分别用显微镜计数法和稀释涂布平板法进行计数，计数结果分别是M、N，则致死率可用____________×100%表示，此结果较真实值偏大，原因是后一种计数时________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)Taq DNA聚合酶(耐高温的DNA聚合酶)　0、2　(2)防止目的基因反向连接，防止线性化质粒或目的基因自身环化　(3)Ca2＋　DNA连接　(4)氨苄青霉素　(M－N)/M　当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 解析　(1)过程①是利用两种引物进行的质粒线性化过程，该过程属于PCR技术的应用，故需要Taq DNA聚合酶(耐高温的DNA聚合酶)；环状质粒无游离磷酸基团，一条DNA链含有一个游离的磷酸基团；线性化DNA是双链，则含有2个游离的磷酸基团，故质粒线性化前后所含有的游离磷酸基团的个数分别为0和2。(2)过程③是基因表达载体的构建过程，该过程中，同源序列1、2中的碱基序列不同，这样设计的优点是防止目的基因反向连接，防止线性化质粒或目的基因的自身环化，以保证目的基因能够正确连接并表达。(3)DNA连接酶能将DNA片段连接成一个重组DNA分子，故重组质粒利用大肠杆菌细胞中的DNA聚合酶和DNA连接酶，实现完全环化。(4)结合题图，标记基因为氨苄青霉素抗性基因，故在含氨苄青霉素的液体培养基中培养一段时间，然后分别用显微镜计数法(死菌和活菌均被计数)和稀释涂布平板法(用于活菌计数)进行计数，故若计数结果分别是M、N，致死率可用(M－N)/M×100%表示。由于在用稀释涂布平板法计数时，当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，会导致N偏小，进而导致上述结果较真实值偏大。 2．(10分)(2024·大庆高三三模)CRISPR/Cas9基因编辑技术可以按照人们的意愿精准剪切、改变任意靶基因的遗传信息，从而达到基因定点敲除、插入、突变的目的。在该基因编辑技术中，SgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列。请回答下列问题： (1)(2分)Cas9准确切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列的过程体现了酶具有__________性；该过程依赖于SgRNA与靶基因DNA序列之间的__________。 (2)(3分)SgRNA是人工合成的一段能与靶基因互补配对的特殊序列，由23个连续的碱基组成。研究发现，SgRNA有时会出现脱靶问题，试分析其原因可能是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________； 解决措施是_______________________________________________________________。 (3)(2分)为了实现某基因的特异性敲除，如图1所示，科研人员将含有3个不同的但靶向相同基因的SgRNA编码基因的重组质粒组装到具有特殊元件的载体上，形成新的重组质粒。 理论上，一个SgRNA便能实现靶基因的敲除，请分析构建图1所示重组质粒的优势：________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________(答出2点)。 (4)(3分)为筛选特定D基因“敲除”的果蝇，在D基因的DNA断裂位点插入绿色荧光蛋白基因(EGFP)需构建携带绿色荧光蛋白基因的供体质粒。把EGFP基因和His标签基因(His标签由6个组氨酸组成)连接起来构建融合基因并构建重组质粒，图2为载体、EGFP基因的结构、不同限制酶的识别序列及切割位点，欲将标签基因连接在绿色荧光蛋白基因(EGFP)编码区的首端，已知组氨酸的密码子为CAU，起始密码子为AUG。 ①写出His基因模板链的碱基序列：5′－______________________________________ ________________________________________________________________________－3′。 ②为构建融合基因并将其插入载体，科研人员设计了一对与EGFP基因编码区两端序列互补配对的引物，设计时需在引物______(填“A”或“B”)的5′端增加相应的限制酶识别序列和His基因的编码序列，请写出该引物开头的12个碱基序列：5′－______________－3′。 答案　(1)专一　碱基互补配对　(2)SgRNA序列过短，易与靶基因以外的DNA序列互补配对而脱靶　适当增加SgRNA的长度，提高其与靶基因识别的特异性　(3)只构建一个表达载体即可，能准确插入目标生物基因组中，能通过绿色荧光进行筛选 (4)①ATGATGATGATGATGATGCAT ②A　CAATTGATGCAT 解析　(3)由图1可知，EGFP是增强型绿色荧光蛋白基因；I－SecⅠ是归位内切酶，可将质粒随机插入目标生物的基因组中，理论上，一个SgRNA便能实现靶基因的敲除，构建图1所示重组质粒的优势有：只构建一个表达载体即可，能准确插入目标生物基因组中，能通过绿色荧光进行筛选等。(4)①已知His标签由6个组氨酸组成，组氨酸的密码子为CAU，起始密码子为AUG，所以His基因模板链的碱基序列为5′－ATGATGATGATGATGATGCAT－3′。②设计与EGFP基因编码区两端序列互补配对的引物时，要保证限制酶切割位点不能破坏EGFP基因且标签基因连接在绿色荧光蛋白基因(EGFP)编码区的首端，故需在引物A的5′端增加相应的限制酶识别序列和His基因的编码序列，由图2分析可知，选择MunⅠ限制酶，结合组氨酸的密码子为CAU，起始密码子为AUG，引物序列为5′－CAATTGATGCAT－3′。 3．(12分)(2024·临沂高三二模)Cre/LoxP重组酶系统是在基因或染色体水平上对生物基因进行遗传改造的一种技术，可以在DNA的特定序列进行定点切割和重新连接。请回答下列问题： (1)(5分)图1是利用Cre/LoxP酶系统敲除基因的过程。LoxP序列具有方向性，由中间的间隔序列和两侧的反向重复序列组成，其中决定方向的序列是__________。图1中一条DNA片段上待敲除基因的两端存在同向LoxP序列，Cre酶能识别并结合到LoxP序列的反向重复序列区，定点切断间隔序列的____________，从而实现目标基因的敲除，敲除的基因片段会形成__________(填“线状”或“环状”)结构。若经Cre酶作用使得2个LoxP位点间的序列发生反转，其原因可能是_________________________________________________________。 (2)(2分)Cre/LoxP酶系统可以调控基因的表达，在目的基因______________(填“上游”或“下游”)插入一个带有LoxP位点的编码终止密码子的序列，在Cre酶存在的情况下，目的基因______________(填“表达”或“不表达”)。 (3)(5分)图2是利用Cre/LoxP酶系统构建融合基因的过程。首先分别扩增Bt基因和Bar基因，以获得所需要的DNA片段，然后用Cre/LoxP酶系统处理连接后的DNA片段，获得Bt－Bar融合基因片段。PCR1过程中，所用的2种引物的结合位置分别在______________________；该过程中，还需添加的物质有____________________(至少写2种)等。有研究表明，大多数限制酶对裸露的位点不能识别切割，因此必须对识别序列5′末端进行修饰并加上一个至几个保护碱基，如GGG。由此推测，对Bar基因引物5′端序列的要求是_______________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)间隔序列　磷酸二酯键　环状　两个LoxP序列方向相反　(2)上游　表达　(3)启动子外侧和终止子内侧　Taq DNA聚合酶、dNTP、(含Mg2＋)缓冲液　引物的5′端均要连接上LoxP序列，并在末端加上保护碱基序列(GGG) 解析　(1)两侧的反向重复序列的碱基排列顺序一致，无法确定方向，则能决定方向的只有中间的间隔序列。碱基序列之间通过磷酸二酯键连接。由于敲除的基因片段会露出相同的黏性末端，则剪出的基因两端自动碱基互补配对成环状结构。如果两个LoxP位点位于同一条DNA上且方向相反，Cre酶会使LoxP间的序列反转。(2)Cre/LoxP重组酶系统调控基因的表达，在目的基因上游插入带有LoxP位点的编码终止密码子的序列，Cre酶会对LoxP位点进行切割，终止密码子不发挥作用，因此目的基因表达。(3)启动子是决定RNA聚合酶转录起始位点的DNA序列，终止子是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列，启动子一般在目的基因的左侧，终止子在目的基因的右侧，因为要获得Bt－Bar融合基因片段，即需要Bt带上启动子(不需要终止子)、Bar带上终止子(不需要启动子)，因此在用PCR1扩增Bt基因时，所用的2种引物的结合位置在Bt的启动子外侧和终止子内侧。PCR过程中除了添加引物外，还需要添加Taq DNA聚合酶、dNTP、(含Mg2＋)缓冲液等。据图2可知，Bt－Bar融合基因片段中Bar基因的左侧和右侧都含有LoxP序列，又因为大多数限制酶对裸露的位点不能识别切割，因此必须对识别序列5′末端进行修饰并加上一个至几个保护碱基，如GGG，据此可知，对Bar基因引物5′端序列的要求是引物的5′端均要连接上LoxP序列，并在末端加上保护碱基序列(GGG)。 4．(12分)(2024·锦州高三模拟)“脑彩虹”是一项最新的大脑成像技术，通过荧光蛋白“点亮”大脑内的神经元，帮助科学家了解大脑。Cre－LoxP系统能够实现特定基因的敲除，其技术过程如图1所示。 (1)(2分)当两个LoxP序列位于同一个DNA分子上且方向相同时，Cre重组酶能将两个切割位点之间的核苷酸序列切除并形成环状而失活，剩余序列会连接起来。在特定基因的敲除过程中，若两个LoxP序列方向相反时，Cre重组酶使两个LoxP间的序列颠倒，由此产生的变异本质上属于____________________。 (2)(4分)图1中LoxP序列的方向取决于序号________对应的区域。一个LoxP序列的内部被Cre酶切割后，将在DNA序列的________(填“5′”或“3′”)端形成游离的磷酸基团。 (3)(2分)科学家以小鼠为材料，将三种荧光蛋白基因、两种LoxP序列与脑组织特异表达启动子M相连接，构建图2所示的基因表达载体，再用________法将该基因表达载体导入小鼠的受精卵中，进而得到仅含一个图2所示片段的转基因小鼠，再经过进一步操作，获得纯合的转基因小鼠a(不含Cre酶)。 (4)(4分)图2所示序列的两个LoxP1之间或两个LoxP2之间的基因，只会被Cre酶识别并切割一次。为使脑组织细胞中Cre酶的表达受调控，研究者将Cre酶基因与启动子N(由信号分子X开启)连接，经一系列操作，获得纯合转基因小鼠b，将纯合小鼠a和b杂交，得到F1。 a．若无X作用时，该小鼠脑组织的色彩为________色，其他组织细胞颜色为______色。 b．若有X作用时，该小鼠脑组织会出现“脑彩虹”，请阐述机理：________________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)染色体结构变异　(2)②　5′　(3)显微注射　(4)a.黄　无　b．F1为杂合子，有编码黄色、红色、蓝色荧光蛋白的基因、LoxP1、LoxP2及Cre酶基因；有信号分子X时，启动Cre酶表达，不同脑细胞中Cre酶表达情况不同，Cre酶识别的LoxP不同，因而不同细胞会差异表达黄色、红色或蓝色荧光蛋白基因 解析　(2)根据图示可知，LoxP序列①和③是反向重复序列，因此图1中LoxP序列的方向取决于序号②对应的区域。一个LoxP序列内部经过切割后会增加两个游离的磷酸基团，位于DNA序列的5′端。(4)F1为杂合子，脑组织细胞中有编码黄色、红色、蓝色荧光蛋白的基因、LoxP1、LoxP2及Cre酶基因。无信号分子X时，Cre酶不表达，仅表达与启动子相邻的荧光蛋白的基因即黄色荧光蛋白基因，使脑组织细胞呈黄色。 学科网（北京）股份有限公司 $$