专题八 [重点突破] 第6练 融合基因、融合蛋白、蛋白质相互作用-【步步高·考前三个月】2025年高考生物学复习讲义课件（鲁湘辽吉黑）（课件PPT+word教案）

[重点突破]　第6练　融合基因、融合蛋白、蛋白质相互作用　[分值：100分] 1．(11分)(2023·山东，25)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (1)(3分)与图甲中启动子结合的酶是____________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有_________________________________________________________ (答出2个结构即可)。 (2)(4分)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的________(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 (3)(4分)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了____________，条带2所检出的蛋白________(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 答案　(1)RNA聚合酶　复制原点、标记基因、限制酶切割位点等　(2)F1和R2(或F2和R1)　a链　(3)J－V5融合蛋白　不是 解析　(1)启动子位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位。作为载体必须具备的条件为：要具有限制酶的切割位点；要有标记基因(如抗性基因)，以便于重组DNA分子的筛选；能在宿主细胞中稳定存在并复制；是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来。图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有复制原点、标记基因、限制酶的切割位点等。(2)据图甲可知，引物F1与R2或F2与R1结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F1和R2或F2和R1。b是模板链，而根据图中启动子和终止子的位置可知转录方向是从左向右，对应的模板链方向应该是3′→5′，非模板链(a链)是5′→3′；考虑到DNA复制的方向是子链的5′→3′，引物延伸的方向也是5′→3′，所以引物结合的单链延伸方向是3′→5′；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3′→5′的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。(3)分析图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体检测后，均有条带1，说明细胞内表达了J－V5融合蛋白。用抗J蛋白抗体检测后，出现条带2，而用抗V5抗体检测后，没有出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。 2．(每空2分，共14分)(2022·山东，25)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P和FLAG－PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或PΔ的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或PΔ的功能。 (1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是___________________________________________________________。 为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的__________(填“3′端”或“5′端”)。 (2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是__________________ ________________________________________________________________________。 修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (3)融合蛋白表达成功后，将FLAG－P、FLAG－PΔ、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG－P和FLAG－PΔ不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是___________________________________________； 由②④组或③⑤组的差异推测，PΔ中缺失的特定序列的作用是_____________________。 (4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是_________________________________。 答案　(1)能与P基因母链的一段碱基序列配对、短单链核酸　5′端　(2)P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取　在引物中的EcoRⅠ识别序列3′端添加1个碱基　(3)增强FLAG－P与UBC的结合　参与P与UBC的结合　(4)药物A通过增强P与UBC结合促进P降解 解析　(1)DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3′端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5′端。(2)融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoRⅠ识别序列前后增加碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。(3)①组仅添加UBC，处理后，用UBC抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC和FLAG－P，出现杂交带；③组添加UBC、药物A和FLAG－P，杂交带更加明显，说明药物A的作用是促进UBC与FLAG－P的结合。②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG－P，出现杂交带，④⑤组使用FLAG－PΔ，不出现杂交带，据此推测PΔ中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列。(4)根据(3)的分析推测，药物A促进UBC与FLAG－P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。 3．(9分)(2024·江苏，23)为了高效纯化超氧化物歧化酶(SOD)，科研人员将ELP50片段插入pET－SOD构建重组质粒pET－SOD－ELP50，以融合表达SOD－ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列－(GTTCCTGGTGTTGGC)50－限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题： (1)(4分)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与____________结合，驱动转录，翻译SOD－ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是____________(从图2的“A～D”中选填)。 (2)(5分)步骤④为探寻高效纯化SOD－ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD－ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。 (ⅰ)20 ℃时，加入NaCl后实验结果是_________________________________________ ________________________________________________________________________。 (ⅱ)100 ℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是____________________________。 (ⅲ)据图分析，融合表达SOD－ELP50蛋白的优点有_____________________________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)启动子　C　(2)SOD－ELP50组纯化蛋白数量更多　高温使蛋白质变性　低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持 解析　(1)RNA聚合酶与启动子结合后，启动转录。由图1可知，SOD为462 bp，ELP50为750 bp，则形成的SOD－ELP50蛋白质大约含有(462＋750)÷3＝404(个)氨基酸，则SOD－ELP50蛋白相对分子质量约为404×0.11＝44.44(kDa)，电泳后应该为条带C。(2)(ⅰ)由图3可知，20 ℃时，较不加NaCl，加入NaCl后纯化蛋白数量更多。(ⅱ)100 ℃时，温度过高，导致蛋白质变性而沉淀。(ⅲ)20 ℃，加入NaCl时，较SOD，SOD－ELP50组沉淀中蛋白质相对含量较高，说明低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持。 4．(13分)(2023·江苏，22)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： (1)(3分)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有______________，扩增程序中最主要的不同是____________。 (2)(2分)有关基因序列如图2。引物F2－F、F1－R应在下列选项中选用________。 EGFP基因序列：5′ATGGTGAGCAAGGGC——GACGAGCTGTACAAG3′ AnB1基因序列：5′CATGTCCAGCTGCAG——CCAAAACCACAACCA3′ 图2 A．ATGGTG——CAACCA B．TGGTTG——CACCAT C．GACGAG——CTGCAG D．CTGCAG——CTCGTC (3)(2分)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，不需要使用的酶主要有________________________________________________________________________。 (4)(2分)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有________。 A．稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落 B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D．抗性平板上长出的单菌落不需要进一步划线纯化 (5)(2分)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板、用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有________。 (6)(2分)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)模板、引物　引物的设计　(2)CD　(3)限制酶、DNA连接酶　(4)ABC　(5)P3、P4(6)电泳只能测大小(长度)，不知道具体序列 解析　(1)PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2＋)。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时， 配制的两个反应体系中不同的有模板(片段F1、片段F2)、引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合。引物设计是决定PCR反应成败的最重要因素，因此扩增程序中最主要的不同是引物的设计。(2)引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA链，因此引物与模板链3′端互补，与5′端的碱基序列相同。由图1可知，引物F2－F的部分序列既能与F1片段(EGFP)的后部分5′端序列相同，又能与F2片段(Anb1)的前部分5′端序列相同，C选项中5′—GACGAG—3′在EGFP基因中存在，5′—CTGCAG—3′在AnB1基因中存在，因此引物F2－F选用C。由图1可知，引物F1－R与引物F2－F碱基是互补的，应选用D。(3)传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)和DNA连接酶。(4)用稀释涂布平板法培养计数时，为了使结果更准确，一般选择菌落数为30～300的平板，A错误；涂布平板时，培养基已凝固，不会烫死细菌，抗性平板上未长出菌落，最常见的原因是未能有效实现重组质粒构建，或未能进行有效转化，B错误；转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误；稀释涂布平板法和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落不需要进一步划线纯化，D正确。(5)EGFP为720 bp，AnB1为390 bp，二者的总长度为720 bp＋390 bp＝1 100 bp，用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，其长度接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。(6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。 1．(16分)(2024·长沙高三模拟)磷脂酸(PA)是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白(PABD)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体过程如图所示，请回答下列问题： (1)(4分)无缝克隆时，T5核酸外切酶沿________的方向水解DNA，其目的是形成________。T5核酸外切酶催化的最适温度为37 ℃，而过程①选择的温度为50 ℃，目的是降低酶活性，__________________。 (2)(3分)过程②两个片段复性后存在“缺口”的原因是________________________，过程③所需的酶有__________________________________________________________________。 (3)(2分)(多选)与传统的酶切再连法相比，无缝克隆技术构建重组质粒的优点有__________。 A．不受限制酶酶切位点的限制 B．不会引入多余碱基 C．操作时间短，成功率高 D．有利于多个小片段(小于50 bp)连接 (4)(4分)PCR扩增PABD基因时需依据_______________________________________ ________________________________________________________________________ 设计引物R1。据图分析扩增目的片段的引物F1和R2对应于下表中的__________。 1 5′－TCCGGACTCAGATCTCGAGC－3′ 2 5′－AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC－3′ 3 5′－TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA－3′ 4 5′－GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCA－3′ (5)(2分)利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子(T1)进行表面消毒，均匀铺在含有__________的MS培养基上进行筛选和鉴定。T1代自交获得的T2代幼苗的抗性表现和比例为__________，说明T1为单位点插入的转基因株系。 (6)(1分)通过观测转基因拟南芥根尖细胞中______________，了解PA的动态变化。 答案　(1)5′→3′　黏性末端　防止过度水解DNA　(2)过程①形成的黏性末端长度不同　DNA聚合酶和DNA连接酶　(3)ABC(4)PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列　1、4　(5)草胺膦　抗草胺膦∶不抗草胺膦＝3∶1　(6)绿色荧光点的分布 解析　(1)由图可知，无缝克隆时，过程①中T5核酸外切酶沿5′→3′的方向水解DNA，以形成黏性末端。温度能影响酶活性，T5核酸外切酶催化的最适温度为37 ℃，而过程①选择的温度为50 ℃，其目的是降低酶活性，防止过度水解DNA。(2)过程②在复性的过程中，两个片段的黏性末端可根据互补序列进行配对结合，但由于过程①形成的黏性末端长度不同，因此在过程②复性后存在“缺口”。过程③缺口处DNA链的补齐可以看作DNA分子的复制过程，所需的酶有DNA聚合酶(DNA聚合酶将单个脱氧核苷酸加到子链3′端)和DNA连接酶(将两个DNA片段进行连接)。(3)传统的酶切再连法需要用特定的限制酶将目的基因和质粒先进行切割，再用DNA连接酶对目的基因和质粒进行连接，在该过程会形成多个小片段，操作复杂，而无缝克隆技术构建重组质粒不受限制酶酶切位点的限制；不会引入多余碱基；操作时间短，成功率高，但不利于多个小片段(小于50 bp)连接，A、B、C正确。(4)用于PCR扩增的引物是根据一段已知目的基因(PABD基因)的核苷酸序列来设计的，由图可知，PABD基因需要用载体进行连接，因此PCR扩增PABD基因时需依据PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列设计引物R1。由重组DNA图可知，GFP基因和PABD基因进行连接，PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列设计引物R2，而设计引物F1仅需根据PABD基因一端的核苷酸序列，因此引物F1的碱基序列比引物R2的碱基序列短，因此扩增目的片段的引物F1对应于表中的1。PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列设计引物R2，即引物R2的一部分能与引物F1进行碱基互补配对，综上所述，R2对应于表中的4。(5)由图可知，bar(草胺膦抗性基因)为标记基因，位于T－DNA上，农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子(T1)进行表面消毒，均匀铺在含有草胺膦的MS培养基上进行筛选和鉴定。若T1为单位点插入的转基因株系，假设抗性基因用A表示，非抗性基因为a，则T1的基因型为Aa，T1自交获得的T2幼苗的基因型及比例为A_∶aa＝3∶1，因此抗草胺膦∶不抗草胺膦＝3∶1。(6)由题意“将高度专一的PA结合蛋白(PABD)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量”可知，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中绿色荧光点的分布，了解PA的动态变化。 2．(14分)(2024·湖南湘西吉首竞赛)研究发现，实体肿瘤内部通常是缺氧的环境，蓖麻毒素蛋白(RTA)可作用于核糖体，使蛋白合成受阻，从而引起细胞死亡。TAT是一种短肽，可转导蛋白进入细胞，含有氧依赖性降解区域ODD(多肽)的融合蛋白可以适应低氧条件稳定存在，但在常氧条件下会被蛋白酶降解。科研人员以RTA作为抑制肿瘤细胞增殖的活性分子，利用TAT的作用将融合蛋白转运进入肿瘤细胞，并利用ODD的作用减轻RTA对正常细胞的毒性，分别构建了含TAT－RTA(660 bp)和TAT－RTA－ODD(870 bp)融合基因的表达载体，并成功得到相关融合蛋白。回答下列问题： (1)(6分)可采用PCR的方法获取融合基因TAT－RTA，需要根据TAT和RTA基因设计引物，引物的作用是______________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 已知RTA基因和欲得到的TAT－RTA融合基因的结构如图1所示，TAT基因编码链序列为5′ATGAGCTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGA3′，为顺利构建表达载体，需要在引物1的5′端加入__________酶切位点，引物2的5′端加入__________酶切位点，利用TAT和RTA核酸序列设计引物时，要求在RTA蛋白的前端引入TAT短肽，请根据要求写出引物1的部分碱基序列__________(写出引物5′→3′端的12个碱基即可)。 (2)(5分)载体的部分结构如图2所示。His标签由连续的6个组氨酸构成，可用于对重组融合蛋白进行分离纯化，将PCR得到的TAT－RTA融合基因和载体双酶切后，再用__________酶连接，但是在研究时，发现融合蛋白中没有His标签蛋白，据图分析，原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ____________，结合图1和图2可对引物2序列5′CTCGAGGAACTG……3′进行________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ 的设计可使His标签正常表达。 (3)(3分)科研人员将得到的重组融合蛋白经腹腔给药荷瘤小鼠(患实体肿瘤的小鼠称为荷瘤小鼠)，研究荷瘤小鼠肿瘤体积变化，结果如图3所示。TAT－RTA和TAT－RTA－ODD融合蛋白都可以抑制荷瘤小鼠肿瘤体积的增长，____________________的抑制效果更好，产生该实验结果的原因是___________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)与模板DNA单链互补配对，并且使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸　BamH Ⅰ　Xho Ⅰ　5′GGATCCATGAGC3′　(2)DNA连接　限制酶2识别序列后面的一个碱基A与His标签基因编码链的前两个碱基CA编码一个氨基酸，导致His标签基因对应的mRNA的密码子被错位读取　在5′CTCGAG3′和5′GAACTG3′之间任意增加2个碱基　(3)TAT－RTA－ODD　含有氧依赖性降解区域ODD(多肽)的融合蛋白可以适应肿瘤内部低氧条件稳定存在，从而更好地抑制肿瘤体积增长 解析　(1)PCR中，引物与模板DNA单链互补配对实现连接，并且使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。据图1可知，TAT－RTA融合基因TAT靠近启动子一侧有BamH Ⅰ的识别位点，RTA靠近终止子一侧有Xho Ⅰ的识别位点，则引物1的5′端加入BamH Ⅰ的酶切位点，引物2的5′端加入XhoⅠ的酶切位点。TAT基因编码链序列为5′ATGAGCTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGA3′，由于其5′端需要插入BamHⅠ的识别位点，根据碱基互补配对原则可知，其对应的引物的5′端应包含BamHⅠ的识别序列，故设计为5′GGATCCATGAGC3′，以便BamHⅠ切出相应的黏性末端。(2)切割后的DNA片段需要用DNA连接酶连接成完整DNA分子。由图2可知，限制酶2识别序列与His标签序列之间多出一个碱基A，这一个碱基A与His标签基因编码链的前两个碱基CA编码一个氨基酸，导致His标签基因对应的mRNA的密码子被错位读取，导致不能正确编码出His标签蛋白，所以可在引物2 5′CTCGAG3′和5′GAACTG3′之间任意添加两个碱基。(3)由图3可知，较对照组而言，TAT－RTA和TAT－RTA－ODD组的荷瘤小鼠肿瘤体积较小，且TAT－RTA－ODD组的荷瘤小鼠肿瘤体积最小，说明TAT－RTA和TAT－RTA－ODD均能抑制肿瘤体积增大，其中后者抑制效果更显著。产生该实验结果的原因是TAT将融合蛋白转运进入肿瘤细胞，RTA可作用于核糖体，使蛋白合成受阻，从而引起细胞死亡，而ODD可以适应低氧条件稳定存在，实体肿瘤内部通常是缺氧的环境，所以ODD可以在肿瘤细胞中正常发挥作用，更好地抑制肿瘤体积增长，使抗肿瘤效果更加显著。 3．(10分)(2024·枣庄高三模拟)我国科研人员成功从某种癌细胞中筛选出标志性蛋白质T。研究中同时发现TP、P2、P4和AD四种蛋白质在细胞癌变过程中也存在一定作用，为研究上述四种蛋白与T蛋白之间的相互作用，科研人员进行了一系列实验。 (1)(2分)研究人员提取该种癌细胞的总mRNA，以________________为原料在__________酶的催化下获得总cDNA。 (2)(6分)通过PCR技术从总cDNA中扩增出T蛋白基因。经4轮扩增，产物中等长的T蛋白基因片段的数量是__________个，需要消耗引物__________个。为了将T蛋白基因准确连接到图1的PcDNA3.1质粒载体上，在扩增T蛋白基因时需要在引物的__________(填“5′”或“3′”)端添加________________限制酶的识别序列，质粒中抗生素抗性基因的作用是______________________。 (3)(2分)免疫共沉淀技术是在体外研究蛋白质之间相互作用的一种技术。其原理是：抗体A可与蛋白质A特异性结合，将抗体A与磁珠偶联，磁珠可以使抗体A与蛋白质A沉淀下来，若蛋白质B与蛋白质A相互作用，那么蛋白质B也会被一起沉淀下来，可以通过对沉淀物中的蛋白质进行检测最终确定蛋白质之间的相互作用关系。研究人员将T蛋白高表达的癌细胞裂解后，利用抗T蛋白的抗体偶联磁珠，对裂解液中的TP、P2、P4和AD四种蛋白质进行免疫共沉淀，结果如图2。该结果表明与T蛋白相互作用的蛋白质是______________________。 答案　(1)脱氧核苷酸　逆转录　(2)8　30　5′　XhoⅠ和Hind Ⅲ　便于重组DNA分子的筛选　(3)TP和P4 解析　(2)PCR过程中第一、二轮循环合成的子链长度均不同，根据DNA分子的半保留复制特点可知，前两轮循环产生的四个DNA分子的两条链均不等长，第三轮循环产生的DNA分子中存在等长的两条核苷酸链。第四次循环中，第三轮出现2个等长的DNA经过复制产生4个等长的DNA，另外有四个DNA通过复制也会分别产生1个等长的DNA，即总共8个。PCR技术的原理是DNA双链复制，使DNA以指数形式增加，复制n次后，产生的DNA总数为2n，扩增过程中，需要引物与DNA单链结合，再进行子链的延伸，所以产生的子代DNA链中都有引物，因此PCR过程中需要消耗引物为2n＋1－2个，复制4次，需要引物为30个。设计引物时应在其5′端添加限制酶的识别序列，选择限制酶时应当保证目的基因插入位点在启动子和终止子之间，并保证目的基因的正确连接，故可在XhoⅠ、Hind Ⅲ、NdeⅠ中选择两种，由于NdeⅠ在质粒上还有一个酶切位点，因此不能选择NdeⅠ，应当选择XhoⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶。抗性基因为质粒上的标记基因，其作用为便于重组DNA分子的筛选。(3)结合免疫共沉淀技术的原理及表中结果可知，TP和P4是与T蛋白相互作用的蛋白质。 4．(13分)(2024·长沙高三模拟)酵母细胞基因转录需要转录因子，转录因子包括DNA结合结构域(DNA－BD)和转录激活结构域(DNA－AD)，两结构域分开时不能激活转录。如果将待测蛋白质X与DNA－BD融合，蛋白质Y与DNA－AD融合，蛋白质X和Y有相互作用时，两结构域能重新呈现完整转录因子活性，并可激活报告基因的转录，过程如图1所示。已知报告基因LacZ表达的酶可以将无色化合物X－gal水解成蓝色产物。研究人员为了验证蛋白质X和Y是否具有相互作用，分别构建不同的酵母表达载体(如图2和图3所示)，其中AmpR为氨苄青霉素抗性基因，HIS3和TRP1分别为控制组氨酸和色氨酸合成的基因。分析回答下列问题： (1)(3分)获得BD－X蛋白和AD－Y蛋白的关键是将相应基因序列连接形成________。X与Y的结合能使转录因子的BD和AD同时结合到报告基因的上游，进而招募____________催化LacZ基因的转录。 (2)(3分)为将目的基因定向插入相应位点，扩增蛋白质X编码区序列时需在两个引物的5′端分别添加序列________________________；为验证目的基因在PCR扩增时是否发生了基因突变，可对PCR产物进行________(填“电泳”“测序”或“电泳或测序”)。 (3)(2分)pLexA－JL和pB42AD载体构建时用特定限制酶切割目的基因和载体并连接，连接产物导入大肠杆菌后扩增；为确定质粒构建是否成功，需要抽提两种质粒并酶切，并________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (4)(3分)将成功构建的pLexA－JL和pB42AD载体导入________(填“同一个”或“不同的”)营养缺陷型的酵母菌中，与普通酵母菌相比，该营养缺陷型的酵母菌的特点是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (5)(2分)请预测实验结果并写出相应的实验结论：_____________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)融合基因　RNA聚合酶　(2)GAATTC和GGATCC　测序　(3)电泳后观察是否出现预期大小的目标条带　(4)同一个　自身不能合成组氨酸和色氨酸　(5)若实验结果中菌落出现蓝色，则说明蛋白质X和Y具有相互作用；若实验结果菌落全部为白色(或不出现蓝色)，则说明蛋白质X和Y无相互作用 解析　(1)获得BD－X蛋白和AD－Y蛋白的关键是将相应基因序列连接形成融合基因，催化基因转录的应为RNA聚合酶。(2)据图2可知，pLexA－JL中蛋白质X编码区序列插入位置的两端是限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列，故扩增蛋白质X编码区序列时需在两个引物的5′端分别添加序列GAATTC和GGATCC；电泳只能反映DNA分子的大小和构象，并不能显示目的基因中碱基的排列顺序，因此为验证目的基因在PCR扩增时是否发生了基因突变，可对PCR产物进行测序。(3)构建好基因表达载体后，可以抽提两种质粒并酶切，使用DNA电泳，观察电泳结果是否出现预期大小的目标条带，来确定表达载体构建是否成功。(4)根据酵母双杂交的机制，应将成功构建的pLexA－JL和pB42AD载体导入同一个酵母菌中，在一个细胞中同时表达BD－X蛋白和AD－Y蛋白，观察是否具有相互作用。pLexA－JL和pB42AD载体中的标记基因HIS3和TRP1分别为控制组氨酸和色氨酸合成的基因，因此培养基中不能添加组氨酸和色氨酸，所用营养缺陷型的酵母菌为组氨酸和色氨酸合成缺陷型酵母菌。只有同时导入了pLexA­JL和pB42AD载体的酵母菌才能合成组氨酸和色氨酸，从而在培养基上存活，从而起到筛选作用。(5)由于只有当蛋白质X和蛋白质Y有相互作用时，转录因子的DNA结合结构域(DNA－BD)和转录激活结构域(DNA－AD)才能发挥作用，进而激活报告基因的启动子，从而驱动报告基因(LacZ基因)的转录，进而得以表达，报告基因LacZ表达的酶可以将无色化合物X－gal水解成蓝色产物。因此，可以通过检测菌落的颜色(菌落是否呈现蓝色)来确定蛋白质X和Y是否具有相互作用。 学科网（北京）股份有限公司 $$ 专题八　 [重点突破]　第6练 融合基因、融合蛋白、蛋白质相互作用 真题演练 模拟预测 内容索引 1.(2023·山东，25)科研人员构建了可表达 J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (1)与图甲中启动子结合的酶是__________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有____________________ __________________(答出2个结构即可)。 真题演练 PART ONE 1 2 3 4 RNA聚合酶 复制原点、标记基因、 限制酶切割位点等 启动子位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位。作为载体必须具备的条件为：要具有限制酶的切割位点；要有标记基因(如抗性基因)，以便于重组DNA分子的筛选；能在宿主细胞中稳定存在并复制；是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来。 图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有复制原点、标记基因、限制酶的切割位点等。 1 2 3 4 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物__________________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的_____(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 1 2 3 4 F1和R2(或F2和R1) a链 1 2 3 4 据图甲可知，引物F1与R2或F2与R1结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F1和R2或F2和R1。b是模板链，而根据图中启动子和终止子的位置可知转录方向是从左 向右，对应的模板链方向应该是3′→5′，非模板链(a链)是5′→3′； 1 2 3 4 考虑到DNA复制的方向是子链的5′→3′，引物延伸的方向也是5′→3′，所以引物结合的单链延伸方向是3′→5′；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3′→5′的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了_______________，条带2所检出的蛋白______(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 1 2 3 4 J－V5融合蛋白 不是 1 2 3 4 分析图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体检测后，均有条带1，说明细胞内表达了J－V5融合蛋白。用抗J蛋白抗体检测后，出现条带2，而用抗V5抗体检测后，没有出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。 2.(2022·山东，25)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P和FLAG－PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或PΔ的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或PΔ的功能。 (1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是__________________________________ ___________。为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的_______(填“3′端”或“5′端”)。 能与P基因母链的一段碱基序列配对、 短单链核酸 5′端 1 2 3 4 1 2 3 4 DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3′端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5′端。 (2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。 1 2 3 4 据图甲分析，出现该问题的原因是_________________________________ ____________________________________________________________________。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是__________________________________________。 1 2 3 4 P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ 识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取 在引物中的EcoRⅠ识别序列3′端添加1个碱基 1 2 3 4 融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P 基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoRⅠ识别序列前后增加碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。 (3)融合蛋白表达成功后，将FLAG－P、FLAG－PΔ、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG－P和FLAG－PΔ不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是__________________________；由②④组或③⑤组的差异推测，PΔ中缺失的特定序列的作用是___________________。 1 2 3 4 增强FLAG－P与UBC的结合 参与P与UBC的结合 1 2 3 4 ①组仅添加UBC，处理后，用UBC抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC和FLAG－P，出现杂交带；③组添加UBC、药物A和FLAG－P，杂交带更加明显，说明药物A的作用是促进UBC与FLAG－P的结合。 ②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG－P，出现杂交带，④⑤组使用FLAG－PΔ，不出现杂交带，据此推测PΔ中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列。 (4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是_____________________ ___________________。 1 2 3 4 药物A通过增强P与 UBC结合促进P降解 根据(3)的分析推测，药物A促进UBC与FLAG－P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。 1 2 3 4 3.(2024·江苏，23)为了高效纯化超氧化物歧化酶(SOD)，科研人员将ELP50片段插入pET－SOD构建重组质粒pET－SOD－ELP50，以融合表达SOD－ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段， 序列为：限制酶a识别序列－(GTTCCTGGTGTTGGC)50－限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题： 1 2 3 4 (1)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与________结合，驱动转录，翻译SOD－ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是_____(从图2的“A～D”中选填)。 启动子 C 1 2 3 4 RNA聚合酶与启动子结合后，启动转录。由图1可知，SOD为462 bp，ELP50为750 bp，则形成的SOD－ELP50蛋白质大约含有(462＋750) ÷3＝404(个)氨基酸，则SOD－ELP50蛋白相对分子质量约为404×0.11＝44.44(kDa)，电泳后应该为条带C。 1 2 3 4 (2)步骤④为探寻高效纯化SOD－ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD－ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。 (ⅰ)20 ℃时，加入NaCl后实验结果是_______________________________。 SOD－ELP50组纯化蛋白数量更多 由图3可知，20 ℃时，较不加NaCl，加入NaCl后纯化蛋白数量更多。 1 2 3 4 (ⅱ)100 ℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是__________________。 高温使蛋白质变性 100 ℃时，温度过高，导致蛋白质变性而沉淀。 1 2 3 4 (ⅲ)据图分析，融合表达SOD－ELP50蛋白的优点有__________________ _________________________________________________。 低温下添加NaCl有 利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持 1 2 3 4 20 ℃，加入NaCl时，较SOD，SOD－ELP50组沉淀中蛋白质相对含量较高，说明低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持。 1 2 3 4 4.(2023·江苏，22)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有___ _________，扩增程序中最主要的不同是___________。 模 板、引物 引物的设计 1 2 3 4 PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2＋)。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时， 配制的两个反应体系中不同的有模板(片段F1、片段F2)、引物。 PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合。引物设计是决定PCR反应成败的最重要因素，因此扩增程序中最主要的不同是引物的设计。 1 2 3 4 (2)有关基因序列如图2。引物F2－F、F1－R应在下列选项中选用_____。 EGFP基因序列：5′ATGGTGAGCAAGGGC——GACGAGCTGTACAAG3′ AnB1基因序列：5′CATGTCCAGCTGCAG——CCAAAACCACAACCA3′ 图2 A.ATGGTG——CAACCA B.TGGTTG——CACCAT C.GACGAG——CTGCAG D.CTGCAG——CTCGTC CD 1 2 3 4 引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA链，因此引物与模板链3′端互补，与5′端的碱基序列相同。由图1可知，引物F2－F的部分序列既能与F1片段(EGFP)的后部分5′端序列相同，又能与F2片段 (Anb1)的前部分5′端序列相同，C选项中5′—GACGAG—3′在EGFP基因中存在，5′—CTGCAG—3′在AnB1基因中存在，因此引物F2－F选用C。由图1可知，引物F1－R与引物F2－F碱基是互补的，应选用D。 1 2 3 4 (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，不需要使用的酶主要有____________________。 限制酶、DNA连接酶 传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)和DNA连接酶。 1 2 3 4 (4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有________。 A.稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落 B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D.抗性平板上长出的单菌落不需要进一步划线纯化 ABC 1 2 3 4 用稀释涂布平板法培养计数时，为了使结果更准确，一般选择菌落数为30～300的平板，A错误； 涂布平板时，培养基已凝固，不会烫死细菌，抗性平板上未长出菌落，最常见的原因是未能有效实现重组质粒构建，或未能进行有效转化，B错误； 转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误； 稀释涂布平板法和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落不需要进一步划线纯化，D正确。 1 2 3 4 (5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板、用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有________。 P3、P4 EGFP为720 bp，AnB1为390 bp，二者的总长度为720 bp＋390 bp＝ 1 100 bp，用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，其长度接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。 1 2 3 4 (6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是_____________________________________。 电泳只能测大小(长度)，不知道具体序列 琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。 1 2 3 4 模拟预测 PART TWO 1.(2024·长沙高三模拟)磷脂酸(PA)是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白(PABD)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体过程如图所示，请回答下列问题： 1 2 3 4 (1)无缝克隆时，T5核酸外切酶沿________的方向水解DNA，其目的是形成_________。T5核酸外切酶催化的最适温度为37 ℃，而过程①选择的温度为50 ℃，目的是降低酶活性，_________________。 5′→3′ 黏性末端 防止过度水解DNA 由图可知，无缝克隆时，过程①中T5核酸外切酶沿5′→3′的方向水解DNA，以形成黏性末端。温度能影响酶活性，T5核酸外切酶催化的最适温度为37 ℃，而过程①选择的温度为50 ℃，其目的是降低酶活性，防止过度水解DNA。 1 2 3 4 1 2 3 4 (2)过程②两个片段复性后存在“缺口”的原因是___________________________ ______，过程③所需的酶有___________ ______________。 过程①形成的黏性末端长度 不同 DNA聚合酶 和DNA连接酶 1 2 3 4 过程②在复性的过程中，两个片段的黏性末端可根据互补序列进行配对结合，但由于过程①形成的黏性末端长度不同，因此在过程②复性后存在“缺口”。过程③缺口处DNA链的补齐可以看作DNA分子的复制过程，所需的酶有DNA聚合酶(DNA聚合酶将单个脱氧核苷酸加到子链3′端)和DNA连接酶(将两个DNA片段进行连接)。 1 2 3 4 (3)(多选)与传统的酶切再连法相比，无缝克隆技术构建重组质粒的优点有______。 A.不受限制酶酶切位点的限制 B.不会引入多余碱基 C.操作时间短，成功率高 D.有利于多个小片段(小于50 bp)连接 ABC 1 2 3 4 传统的酶切再连法需要用特定的限制酶将目的基因和质粒先进行切割，再用DNA连接酶对目的基因和质粒进行连接，在该过程会形成多个小片段，操作复杂，而无缝克隆技术构建重组质粒不受限制酶酶切位点的限制；不会引入多余碱基；操作时间短，成功率高，但不利于多个小片段(小于50 bp)连接，A、B、C正确。 1 2 3 4 (4)PCR扩增PABD基因时需依据____________________________________ ________________设计引物R1。据图分析扩增目的片段的引物F1和R2对应于下表中的______。 1 5′－TCCGGACTCAGATCTCGAGC－3′ 2 5′－AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC－3′ 3 5′－TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA－3′ 4 5′－GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCA－3′ PABD基因一端的核苷酸序列和载体一 端的核苷酸序列 1、4 1 2 3 4 用于PCR扩增的引物是根据一段已知目的基因(PABD基因)的核苷酸序列来设计的，由图可知，PABD基因需要用载体进行连接，因此PCR扩增PABD基因时需依据PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列设计引物R1。由重组DNA图可知，GFP基因和PABD基因进行连接， 1 2 3 4 PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列设计引物R2，而设计引物F1仅需根据PABD基因一端的核苷酸序列，因此引物F1的碱基序列比引物R2的碱基序列短，因此扩增目的片段的引物F1对应于表中的1。PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列设计引物R2，即引物R2的一部分能与引物F1进行碱基互补配对，综上所述，R2对应于表中的4。 1 2 3 4 (5)利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子(T1)进行表面消毒，均匀铺在含有________的MS培养基上进行筛选和鉴定。T1代自交获得的T2代幼苗的抗性表现和比例为_____________ ________________，说明T1为单位点插入的转基因株系。 草胺膦 抗草胺膦∶不 抗草胺膦＝3∶1 1 2 3 4 由图可知，bar(草胺膦抗性基因)为标记基因，位于T－DNA上，农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子(T1)进行表面消毒，均匀铺在含有草胺膦的MS培养基上进行筛选和鉴定。 1 2 3 4 若T1为单位点插入的转基因株系，假设抗性基因用A表示，非抗性基因为a，则T1的基因型为Aa，T1自交获得的T2幼苗的基因型及比例为A_∶aa＝3∶1，因此抗草胺膦∶不抗草胺膦＝3∶1。 1 2 3 4 (6)通过观测转基因拟南芥根尖细胞中__________________，了解PA的动态变化。 绿色荧光点的分布 1 2 3 4 由题意“将高度专一的PA结合蛋白(PABD)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量”可知，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中绿色荧光点的分布，了解PA的动态变化。 1 2 3 4 2.(2024·湖南湘西吉首竞赛)研究发现，实体肿瘤内部通常是缺氧的环境，蓖麻毒素蛋白(RTA)可作用于核糖体，使蛋白合成受阻，从而引起细胞死亡。TAT是一种短肽，可转导蛋白进入细胞，含有氧依赖性降解区域ODD(多肽)的融合蛋白可以适应低氧条件稳定存在，但在常氧条件下会被蛋白酶降解。科研人员以RTA作为抑制肿瘤细胞增殖的活性分子，利用TAT的作用将融合蛋白转运进入肿瘤细胞，并利用ODD的作用减轻RTA对正常细胞的毒性，分别构建了含TAT－RTA(660 bp)和TAT－RTA－ODD(870 bp)融合基因的表达载体，并成功得到相关融合蛋白。回答下列问题： 1 2 3 4 (1)可采用PCR的方法获取融合基因TAT－RTA，需要根据TAT和RTA基因设计引物，引物的作用是_________________________________________ _______________________________________。 与模板DNA单链互补配对，并且使DNA聚合 酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 已知RTA基因和欲得到的TAT－RTA融合基因的结构如图1所示，TAT基因编码链序列为5′ATGAGCTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGA3′，为顺利构建表达载体，需要在引物1的5′端加入__________酶切位点，引物2的5′端加入_______酶切位点， 利用TAT和RTA核酸序列设计引物 时，要求在RTA蛋白的前端引入 TAT短肽，请根据要求写出引物1 的部分碱基序列 ______________________(写出引 物5′→3′端的12个碱基即可)。 BamH Ⅰ Xho Ⅰ 5′GGATCCATGAGC3′ 1 2 3 4 PCR中，引物与模板DNA单链互补配对实现连接，并且使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。据图1可知，TAT－RTA融合基因TAT靠近启动子一侧有BamH Ⅰ的 识别位点，RTA靠近终止子一侧有Xho Ⅰ的识别位点，则引物1的5′端加入BamH Ⅰ的酶切位点，引物2的5′端加入XhoⅠ的酶切位点。 1 2 3 4 TAT基因编码链序列为5′ATGAGCTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGA3′，由于其5′端需要插入BamHⅠ的识别位点，根据碱基互补配对原则可知，其对应 的引物的5′端应包含BamHⅠ的识别序列，故设计为5′GGATCCATGAGC3′，以便BamHⅠ切出相应的黏性末端。 1 2 3 4 1 2 3 4 (2)载体的部分结构如图2所示。His标签由连续的6个组氨酸构成，可用于对重组融合蛋白进行分离纯化，将PCR得到的TAT－RTA融合 基因和载体双酶切后，再用__________酶连接，但是在研究时，发现融合蛋白中没有His标签蛋白，据图分析，原因是______________________ __________________________________________________________________________________________________________， DNA连接 限制酶2识别序列后面的一个碱基A与His标签基因编码链的前两个碱基CA编码一个氨基酸，导致His标签基因对应的mRNA的密码子被错位读取 1 2 3 4 结合图1和图2可对引物2序列5′CTCGAGGAACTG……3′进行_____________________________________________________的设计可使His标签正常表达。 在5′CTCGAG3′和5′GAACTG3′之间任意增加2个碱基 切割后的DNA片段需要用DNA连接酶连接成完整DNA分子。由图2可知，限制酶2识别序列与His标签序列之间多出一个碱基A，这一个碱基A 与His标签基因编码链的前两个碱基CA编码一个氨基酸，导致His标签基因对应的mRNA的密码子被错位读取，导致不能正确编码出His标签蛋白，所以可在引物2 5′CTCGAG3′和5′GAACTG3′之间任意添加两个碱基。 1 2 3 4 1 2 3 4 (3)科研人员将得到的重组融合蛋白经腹腔给药荷瘤小鼠(患实体肿瘤的小鼠称为荷瘤小鼠)，研究荷瘤小鼠肿瘤体积变化，结果如图3所示。TAT－RTA和TAT－RTA－ODD融合蛋白都可以抑制荷瘤小鼠肿瘤体积的增长，_________________的抑制 效果更好，产生该实验结果的原 因是________________________ ____________________________ ____________________________ ___________________________。 TAT－RTA－ODD 含有氧依赖性降解区域ODD(多肽)的融合蛋白可以适应肿瘤内部低氧条件稳定存在，从而更好地抑制肿瘤体积增长 由图3可知，较对照组而言，TAT－RTA和TAT－RTA－ODD组的荷瘤小鼠肿瘤体积较小，且TAT－RTA－ODD组的荷瘤小鼠肿瘤体积最小，说明TAT－RTA和TAT－RTA－ODD均能抑制肿瘤体 积增大，其中后者抑制效果更显著。产生该实验结果的原因是TAT将融合蛋白转运进入肿瘤细胞，RTA可作用于核糖体，使蛋白合成受阻，从而引起细胞死亡，而ODD可以适应低氧条件稳定存在，实体肿瘤内部通常是缺氧的环境，所以ODD可以在肿瘤细胞中正常发挥作用，更好地抑制肿瘤体积增长，使抗肿瘤效果更加显著。 1 2 3 4 1 2 3 4 3.(2024·枣庄高三模拟)我国科研人员成功从某种癌细胞中筛选出标志性蛋白质T。研究中同时发现TP、P2、P4和AD四种蛋白质在细胞癌变过程中也存在一定作用，为研究上述四种蛋白与T蛋白之间的相互作用，科研人员进行了一系列实验。 1 2 3 4 (1)研究人员提取该种癌细胞的总mRNA，以____________为原料在_____ ___酶的催化下获得总cDNA。 脱氧核苷酸 逆转 录 1 2 3 4 (2)通过PCR技术从总cDNA中扩增出T蛋白基因。经4轮扩增，产物中等长的T蛋白基因片段的数量是____个，需要消耗引物_____个。为了将T蛋白基因准确连接到图1的PcDNA3.1质粒载体上，在扩增T蛋白基因时需要在引物的_____(填“5′”或“3′”)端添加________________限制酶的识别序列，质粒中抗生素抗性基因的作用是________________________。 8 30 5′ XhoⅠ和Hind Ⅲ 便于重组DNA分子的筛选 1 2 3 4 PCR过程中第一、二轮循环合成的子链长度均不同，根据DNA分子的半保留复制特点可知，前两轮循环产生的四个DNA分子的两条链均不等长，第三轮循环产生的DNA分子中存在等长的两条核苷酸链。第四次循环中，第三轮出现2个等长的DNA经过复制产生4个等长的DNA，另外有四个DNA通过复制也会分别产生1个等长的DNA，即总共8个。 1 2 3 4 PCR技术的原理是DNA双链复制，使DNA以指数形式增加，复制n次后，产生的DNA总数为2n，扩增过程中，需要引物与DNA单链结合，再进行子链的延伸，所以产生的子代DNA链中都有引物，因此PCR过程中需要消耗引物为2n＋1－2个，复制4次，需要引物为30个。设计引物时应在其5′端添加限制酶的识别序列，选择限制酶时应当保证目的基因插入位点在启动子和终止子之间， 1 2 3 4 并保证目的基因的正确连接，故可在XhoⅠ、Hind Ⅲ、NdeⅠ中选择两种，由于NdeⅠ在质粒上还有一个酶切位点，因此不能选择NdeⅠ，应当选择XhoⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶。抗性基因为质粒上的标记基因，其作用为便于重组DNA分子的筛选。 1 2 3 4 (3)免疫共沉淀技术是在体外研究蛋白质之间相互作用的一种技术。其原理是：抗体A可与蛋白质A特异性结合，将抗体A与磁珠偶联，磁珠可以使抗体A与蛋白质A沉淀下来，若蛋白质B与蛋白质A相互作用，那么蛋白质B也会被一起沉淀下来，可以通过对沉淀物中的蛋白质进行检测最终确定蛋白质之间的相互作用关系。研究人员将T蛋白高表达的癌细胞裂解后，利用抗T蛋白的抗体偶联磁珠，对裂解液中的TP、P2、P4和AD四种蛋白质进行免疫共沉淀，结果如图2。该结果表明与T蛋白相互作用的蛋白质是__________。 TP和P4 1 2 3 4 结合免疫共沉淀技术的原理及表中结果可知，TP和P4是与T蛋白相互作用的蛋白质。 1 2 3 4 4.(2024·长沙高三模拟)酵母细胞基因转录需要转录因子，转录因子包括DNA结合结构域(DNA－BD)和转录激活结构域(DNA－AD)，两结构域分开时不能激活转录。如果将待测蛋白质X与DNA－BD融合，蛋白质Y与DNA－AD融合，蛋白质X和Y有相互作用时，两结构域能重新呈现完整转录因子活性，并可激 活报告基因的转录，过程如图1所示。已知报告基因LacZ表达的酶可以将无色化合物X－gal水解成蓝色产物。研究人员为了验证蛋白质X和Y是否具有相互作用，分别构建不同的酵母表达载体(如图2和图3所示)，其中AmpR为氨苄青霉素抗性基因，HIS3和TRP1分别为控制组氨酸和色氨酸合成的基因。分析回答下列问题： 1 2 3 4 (1)获得BD－X蛋白和AD－Y蛋白的关键是将相应基因序列连接形成_________。X与Y的结合能使转录因子的BD和AD同时结合到报告基因的上游，进而招募___________催化LacZ基因的转录。 融合基因 RNA聚合酶 获得BD－X蛋白和AD－Y蛋白的关键是将相应基因序列连接形成融合基因，催化基因转录的应为RNA聚合酶。 1 2 3 4 (2)为将目的基因定向插入相应位点，扩增蛋白质X编码区序列时需在两个引物的5′端分别添加序列____________________；为验证目的基因在PCR扩增时是否发生了基因突变，可对PCR产物进行______(填“电泳”“测序”或“电泳或测序”)。 GAATTC和GGATCC 测序 1 2 3 4 据图2可知，pLexA－JL中蛋白质X编码区序列插入位置的两端是限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列，故扩增蛋白质X编码区序列时需在两个引物的5′端分别添加序列GAATTC和GGATCC；电泳只能反映DNA分子的大小和构象，并不 能显示目的基因中碱基的排列顺序，因此为验证目的基因在PCR扩增时是否发生了基因突变，可对PCR产物进行测序。 1 2 3 4 (3)pLexA－JL和pB42AD载体构建时用特定限制酶切割目的基因和载体并连接，连接产物导入大肠杆菌后扩增；为确定质粒构建是否成功，需要抽提两种质粒并酶切，并___________________________________ _____。 电泳后观察是否出现预期大小的目标条带 构建好基因表达载体后，可以抽提两种质粒并酶切，使用DNA电泳，观察电泳结果是否出现预期大小的目标条带，来确定表达载体构建是否成功。 1 2 3 4 (4)将成功构建的pLexA－JL和pB42AD载体导入________(填“同一个”或“不同的”)营养缺陷型的酵母菌中，与普通酵母菌相比，该营养缺陷型的酵母菌的特点是_____ ________________________。 同一个 不能合成组氨酸和色氨酸 自身 1 2 3 4 根据酵母双杂交的机制，应将成功构建的pLexA－JL和pB42AD载体导入同一个酵母菌中，在一个细胞中同时表达BD－X蛋白和AD－Y蛋白，观察是否具有相互作用。pLexA－JL和pB42AD载体中的标记基因HIS3和TRP1分别为控制组氨酸和色氨酸合 成的基因，因此培养基中不能添加组氨酸和色氨酸，所用营养缺陷型的酵母菌为组氨酸和色氨酸合成缺陷型酵母菌。只有同时导入了pLexA-JL和pB42AD载体的酵母菌才能合成组氨酸和色氨酸，从而在培养基上存活，从而起到筛选作用。 1 2 3 4 (5)请预测实验结果并写出相应的实验结论：_________________________________________________________________________________________________________________________________。 若实验结果中菌落出现蓝色，则说明蛋白质X和Y具有相互作用；若实验结果菌落全部为白色(或不出现蓝色)，则说明蛋白质X和Y无相互作用 1 2 3 4 由于只有当蛋白质X和蛋白质Y有相互作用时，转录因子的DNA结合结构域(DNA－BD)和转录激活结构域(DNA－AD)才能发挥作用，进而激活报告基因的启动子，从而驱动报告基因(LacZ基 因)的转录，进而得以表达，报告基因LacZ表达的酶可以将无色化合物X－gal水解成蓝色产物。因此，可以通过检测菌落的颜色(菌落是否呈现蓝色)来确定蛋白质X和Y是否具有相互作用。 $$