专题八 [重点突破] 第3练 限制酶的选择-【步步高·考前三个月】2025年高考生物学复习讲义课件（鲁湘辽吉黑）（课件PPT+word教案）

专题八　 [重点突破]　第3练 限制酶的选择 真题演练 模拟预测 内容索引 1.(2021·辽宁，24节选)PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列(简称phb2基因)，大小为0.9 kb(1 kb＝1 000碱基对)，利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题： (1)为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经________过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。 真题演练 PART ONE 1 2 3 4 5 6 逆转录 (2)图为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见表。为使phb2基因(该基因序列不含图中限制酶的识别序列)与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入_________和________两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的 1 2 3 4 5 6 phb2基因和载体进行连接时，可选用________________(填“E.coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。 EcoR Ⅰ Pvit Ⅱ T4 DNA连接酶 1 2 3 4 5 6 相关限制酶的识别序列及切割位点 名称 识别序列及 切割位点 名称 识别序列 及切割位点 Hind Ⅲ A↓AGCTT TTCGA↑A EcoR Ⅰ G↓AATTC CTTAA↑G Pvit Ⅱ CAG↓CTG GTC↑GAC Pst Ⅰ CTGC↓AG GA↑CGTC Kpn Ⅰ G↓GTACC CCATG↑G BamHⅠ G↓GATCC CCTAG↑G 注：箭头表示切割位点。 根据启动子和终止子的生理作用可知，目的基因应导入启动子和终止子之间，但两者之间存在三种限制酶切点，但是由于Kpn Ⅰ在质粒上不止一个酶切位点，所以应该选择EcoR Ⅰ和Pvit Ⅱ两种不同限制酶的识别序列；根据Pvit Ⅱ的酶切 序列可知，切出了平末端，所以构建基因表达载体时，应该用T4 DNA连接酶连接质粒和目的基因。 1 2 3 4 5 6 2.(2021·山东，25节选)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增 了γ基因上游不同长度的片段，将 这些片段分别插入表达载体中进 行转化和荧光检测，以确定 BCL11A蛋白结合位点的具体位 置。相关信息如图所示。 1 2 3 4 5 6 为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是______，在R末端添加的序列所对应的限制酶是________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要______种酶。 1 2 3 4 5 6 SalⅠ EcoRⅠ 6 1 2 3 4 5 6 据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R端与荧光蛋白基因中限 制酶MunⅠ识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。 1 2 3 4 5 6 而扩增后的产物中可能含有MunⅠ和XhoⅠ的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶MunⅠ和XhoⅠ所识别，故应该选用添加限制酶EcoRⅠ和限制酶SalⅠ识别序列， 由图可知，限制酶MunⅠ识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoRⅠ识别并切割后的黏性末端相同，故R末端添加的序列所对应的限制酶是EcoRⅠ，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是SalⅠ； 1 2 3 4 5 6 荧光蛋白基因中含有限制酶EcoR Ⅰ的识别位点，故对载体使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ切割。综上所述，对载体使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ切割，对扩增后的产物用限制酶EcoRⅠ和限制酶SalⅠ识别序列，然后在DNA连接酶的催化作用下， 连接形成重组载体；产物扩增中需要使用Taq酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是Taq酶、限制酶EcoRⅠ、限制酶SalⅠ、限制酶MunⅠ、限制酶XhoⅠ、DNA连接酶。 1 2 3 4 5 6 3.(2024·湖南，21节选)百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题： 研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。 1 2 3 4 5 6 研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取pL，首先选用_________________酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。 HindⅢ、BamHⅠ 1 2 3 4 5 6 根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，若要获得启动子pL并连接到质粒上，可选用限制酶HindⅢ、BamHⅠ进行酶切，以替换Ti质粒中的启动子，从而达到根据GUS酶活性反映启动子活性的目的。 1 2 3 4 5 6 4.(2024·河北，22节选)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。回答下列问题： 实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为_________________________ _______启动子。Nos为终止子，其作用为_________。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶________和________对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。 水稻胚乳细胞中特异表达的 基因的 终止转录 HindⅢ EcoRⅠ 1 2 3 4 5 6 根据题意可知，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP(启动子)应为水稻胚乳中特异表达的基因的启动子。Nos为终止子，其作用为终止转录过程。GtP内部含有KpnⅠ的酶切位点，用KpnⅠ酶切会破坏启动子，Nos下游含有SacⅠ的酶切位点，用SacⅠ酶切会使重组基因表达载体缺失终止子，故构建基因表达载体时，可选择限制酶HindⅢ和EcoRⅠ对r2HN基因与载体进行酶切。 1 2 3 4 5 6 5.(2022·湖北，24节选)如图是S基因的cDNA和载体的限制性内切核酸酶(限制性核酸内切酶)酶谱。为了成功构建重组表达载体，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用________________酶切割S基因的cDNA和载体。 XbaⅠ、HindⅢ 为了成功构建重组表达载体，不破坏载体关键结构和目的基因，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用XbaⅠ、HindⅢ酶切割S基因的cDNA和载体。 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 6.(2024·全国甲，38节选)某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题： 质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在____________________________________________________________(答出两点即可)；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是_______ _______。 避免目的基因和质粒的反向连接，防止目的基因和质粒的自身环化 T4 DNA 连接酶 1 2 3 4 5 6 构建重组质粒时，与单酶切相比，采用双酶切法可以形成不同的黏性末端，双酶切可以避免目的基因和质粒的反向连接，防止目的基因和质粒的自身环化。酶c单酶切后形成平末端，宜选用T4 DNA连接酶连接。 1 2 3 4 5 模拟预测 PART TWO 1.(2024·齐齐哈尔高三三模)人乳铁蛋白广泛分布于乳汁等外分泌液中，在初乳中含量较高，对细菌、真菌和病毒等有抑制作用。如图表示利用基因工程技术构建人乳铁蛋白基因重组质粒的过程(图中TetR表示四环素抗性基因，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因)， 1 2 3 4 5 五种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。回答下列问题： 限制酶 BamHⅠ HaeⅢ BclⅠ Sau3AⅠ NotⅠ 识别序列及 切割位点 (1)要将人乳铁蛋白基因插入载体中，若只使用一种限制酶，应选择的限制酶是__________。限制酶切割的是__________键。基因工程技术中为保证目的基因的正确连接，通常选择________种限制酶进行酶切。 Sau3AⅠ 磷酸二酯 2(或两) 要将人乳铁蛋白基因插入载体中，若只允许使用一种限制酶，根据人乳铁蛋白基因两端的识别序列可知，BclⅠ和Sau3AⅠ可以切出相同的黏性末端，结合质粒上的限制酶识别序列可知，只用一种酶且切出相同的黏性末端，则应选择的限制酶是Sau3AⅠ。限制酶断开的是磷酸二酯键。为了避免目的基因和质粒自身环化和反向连接，基因工程技术中通常选择2种限制酶进行酶切，以形成不同的黏性末端。 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 (2)基因工程最核心的步骤是______________ ______，重组质粒中启动子的功能是_______ __________________________________________________________________________。 (3)人乳铁蛋白基因需要利用PCR技术进行扩增，扩增需要引物__________(在“Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ”中选择)。 基因表达载体的 构建 RNA聚 合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质 Ⅱ、Ⅲ 1 2 3 4 5 PCR中引物的作用是使耐高温的DNA聚合酶从引物的3′端连接游离的脱氧核苷酸，所以引物5′端应该与模板链的3′端配对，故引物应选择Ⅱ、Ⅲ。 1 2 3 4 5 (4)据图分析，成功获得含有人乳铁蛋白基因的重组质粒首先需要在含有___________(填“四环素”或“氨苄青霉素”)的培养基上进行筛选，然后将需要的重组质粒导入牛的受精卵，再利用_____工程技术获得转基因小牛。 氨苄青霉素 胚胎 1 2 3 4 5 据图分析，成功获得含有人乳铁蛋白基因的重组质粒含有氨苄青霉素抗性基因，需要在含有氨苄青霉素的培养基上筛选，然后将需要的重组质粒导入牛的受精卵，再利用胚胎工程技术获得转基因小牛。 1 2 3 4 5 2.(2024·湘潭高三开学考)紫色花青素是一种天然色素，广泛存在于多种植物中，尤其是在花朵、果实和叶子中。紫色花青素能够清除自由基，有助于保护视网膜，抑制癌细胞生长的潜力等。紫色西红柿经基因编辑后可产生比普通西红柿多9倍的花青素(紫色)，如图是花青素基因(S)的cDNA(某种生物发育某个时期的mRNA经逆转录产生的互补DNA)和Ti质粒图。回答下列问题： 1 2 3 4 5 (1)紫色花青素能够清除自由基，保护细胞免受氧化损伤。自由基损害细胞主要表现为___________________________________________________________________________________________(答2点)。紫色花青素处理癌细胞可使其细胞周期______(填“缩短”“延长”或“不变”)。 攻击生物膜，损伤生物膜结构与功能；攻击DNA，引起基因突变；攻击蛋白质，使蛋白质活性降低 延长 1 2 3 4 5 (2)构建基因表达载体时，最好选择限制酶________________切割S基因的cDNA和Ti质粒，以保证目的基因与载体定向连接，从而提高重组效率。利用PCR技术扩增花青素基因的cDNA时，需要_____种引物，一般还需要往PCR反应缓冲液中加入Mg2＋，其原因是__________________________。 XbaⅠ、Hind Ⅲ 2 DNA聚合酶需要Mg2＋激活 1 2 3 4 5 PCR扩增的产物进行电泳时，发现除了目标序列外还有很多非特异性条带，出现该现象的原因可能有__________________________ _________________________________________________________________________________________________________________________(答2点)。 引物设计太短(或引物特异性不强，即与非目的序列有同源性)、两引物之间碱基互补配对(形成引物二聚体)、复性温度过低、Mg2＋浓度过高、DNA模板出现污染等 限制酶选择原则：不破坏目的基因和标记基因等；应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶；使用不同限制酶，避免目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接。据图可知，最好选用XbaⅠ、Hind Ⅲ切割S基因的cDNA和Ti质粒，既能保证目的基因与载体产生相同的黏性末端，又不破坏目的基因。 1 2 3 4 5 PCR扩增目的基因时需要2种引物，一般需要往PCR反应缓冲液中加入Mg2＋，Mg2＋可激活(耐高温的)DNA聚合酶。PCR扩增的产物进行电泳时，除了目标序列外还有很多非特异性条带，出现非目的序列产物的原因可能有引物设计太短(或引物特异性不强，即与非目的序列有同源性)、两引物之间碱基互补配对(形成引物二聚体)、复性温度过低、Mg2＋浓度过高、DNA模板出现污染等。 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 (3)基因编辑作物的安全性和监管是一个重要议题。在研发过程中，需要确保紫色西红柿的安全性。花青素的合成途径涉及多个基因，其中包括转录因子，这些转录因子可以激活或抑制花青素合成相关基因的表达。增加花青素的产量的措施有____________________ ___________________________________________(答1点)。 激活或增强西红柿中花青素合成的相关基因；编辑转录因子的基因 1 2 3 4 5 3.(2024·娄底高三期末)中重度盐碱地逆境胁迫条件下，科研人员利用根瘤农杆菌介导法将水稻Leap启动子(一种强启动子)调控的SNAC1基因导入早粳稻中，成功培育了SNAC1基因耐盐碱水稻。转基因耐盐碱候选品种呈现SNAC1基因超强表达，产品性状及产量明显优于普通水稻。其培育过程如图所示，回答下列问题： 1 2 3 4 5 (1)Leap启动子是一段有特殊结构的DNA片段，能被____________识别并结合，驱动基因的持续转录。为使SNAC1基因在普通水稻植株中超量表达，应选用限制酶________________切割图中的Ti质粒和DNA片段。 RNA聚合酶 BamHⅠ、KpnⅠ 1 2 3 4 5 Leap启动子是一段有特殊结构的DNA片段，能被RNA聚合酶识别并结合，驱动基因的持续转录。为使SNAC1基因在普通水稻植株中超量表达，必须含有强启动子，结合质粒上终止子的位置，所以目的基因上含有强启动子需要用限制酶BamHⅠ和KpnⅠ切割图中的Ti质粒和DNA片段。 1 2 3 4 5 (2)过程①是培育转基因耐盐碱水稻的核心工作，其目的是____________ _____________________________________________________。T－DNA的作用是将SNAC1基因导入普通水稻细胞并_______________________。 让目的基因 (或SNAC1基因)在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代 整合到其染色体的DNA上 1 2 3 4 5 基因工程的核心是基因表达载体的构建，目的是让目的基因(或SNAC1基因)在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代。T－DNA的作用是将SNAC1基因导入普通水稻细胞并整合到其染色体的DNA上。 1 2 3 4 5 (3)已知转录时mRNA自身的延伸方向为5′→3′，得出SNAC1基因以____(填“A”或“B”)链为转录模板链。在筛选含有SNAC1基因的水稻幼苗时，除必要的营养物质，还需要在培养基中添加__________。 B 卡那霉素 1 2 3 4 5 已知转录时mRNA自身的延伸方向为5′→3′，根据碱基互补配对原则以及RNA聚合酶结合位点，得出SNAC1基因以B链为转录模板链。重组质粒含有卡那霉素抗性基因，故可在培养基中添加卡那霉素进行筛选。 1 2 3 4 5 4.(2024·潍坊高三联考)L-天冬酰胺酶因其能水解L-天冬酰胺(丙烯酰胺的前体)，而有效降低油炸食品中潜在致癌物质丙烯酰胺的含量，在食品安全领域受到高度关注。某科研机构欲利用pET22b质粒将L-天冬酰胺酶基因导入对氨苄青霉素敏感的宿主菌中，以构建高效表达L-天冬酰胺酶的菌株。图1是L-天冬酰胺酶基因附近的限制酶切点以及基因两侧的部分碱基序列， 1 2 3 4 5 图2是pET22b质粒的结构模式图及其涉及的限制酶切点，其中的LacZ基因编码产生的半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，否则菌落为白色。回答下列问题： 1 2 3 4 5 (1)利用PCR从提取的DNA中扩增目的基因时需要引物，引物的作用是_________________ _________________________________。要将 L-天冬酰胺酶基因导入到pET22b质粒中，需使用的两种限制酶是________________。 使DNA聚合酶能够 从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 KpnⅠ、EcoRⅠ 1 2 3 4 5 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。引物的作用：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。若用PstⅠ或BglⅡ会破坏目的基因，若用BamHⅠ会破坏氨苄青霉素抗性基因。若用EcoRⅠ对目的基因和质粒进行切割，由于切割后目的基因和质粒两端的黏性末端相同，因此至少会产生4种连接产物，即目的基因自身环化、质粒自身环化、 1 2 3 4 5 目的基因和质粒正向连接以及目的基因和质粒反向连接。用KpnⅠ和EcoRⅠ对目的基因和质粒进行切割，切割后目的基因和质粒两端的黏性末端不相同，因此不会出现自身环化和反向连接的情况。 1 2 3 4 5 (2)若图1下方的序列为目的基因的部分碱基序列，则获取目的基因时设计B端的引物序列是_____________________________ (只写出16个碱基即可)。 3′－TAAGTTGTCTCTTAAG－5′ 1 2 3 4 5 获取目的基因时设计B端的引物，B端的引物是与B端的3′端互补配对，同时，要在引物的5′端添加EcoRⅠ的识别序列，因此B端的引物序列是3′－TAAGTTGTCTCTTAAG－5′。 1 2 3 4 5 (3)利用感受态法的转化成功率并不是100%，科研人员将转化后的宿主菌接种在含氨苄青霉素和X-gal的固体培养基上，以此筛选出成功导入重组质粒的宿主菌。 ①若只使用限制酶EcoRⅠ构建重组质粒，导入重组质粒的菌落呈现____色，这些菌落___________ (填“能”“不能”或“不一定能”)产生L-天冬酰胺酶，理由是_____________________________ ___________________________________________________________________________________。 白 不一定能 EcoRⅠ切割目的基因和质粒产生的黏性末端相同，构建的重组质粒可能是目的基因和质粒反向连接而成，目的基因无法正常表达 1 2 3 4 5 ②若使用(1)中的限制酶处理，则菌落呈_____色的为符合要求的宿主菌，理由是_________________________________________________________ __________________。 白 重组质粒由于LacZ基因被切断，无法合成半乳糖苷酶，不能分解 X-gal，菌落呈白色 1 2 3 4 5 若用EcoRⅠ对目的基因和质粒进行切割，由于切割后目的基因和质粒两端的黏性末端相同，因此至少会产生4种连接产物，即目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因和质粒正向连接以及目的基因和质粒反向连接，重组质粒由于LacZ基因被切断，无法合成半乳糖苷酶，不能分解X-gal，菌落呈白色，但重组质粒可能是目的基因和质粒反向连接而成，目的基因无法正常表达，因此呈白色的菌落不一定能产生L-天冬酰胺酶。 1 2 3 4 5 用EcoRⅠ和KpnⅠ对目的基因和质粒进行切割，切割后目的基因和质粒两端的黏性末端不相同，因此不会出现自身环化和反向连接的情况，但重组质粒由于LacZ基因被切断，无法合成半乳糖苷酶分解X-gal，菌落呈白色，因此白色的菌落为成功导入重组质粒的宿主菌。 1 2 3 4 5 (4)能够发挥作用的L-天冬酰胺酶是由4个亚基形成的，如果选择大肠杆菌作为受体菌，只能从大肠杆菌中提取到4条单链肽链，不能得到有活性的L-天冬酰胺酶，原因是_________ _________________________________________________________________________________________。 大肠杆菌 细胞内无内质网和高尔基体等细胞器，不能对肽链进行加工、折叠形成具有一定空间结构的蛋白质 1 2 3 4 5 能够发挥作用的L-天冬酰胺酶是由4个亚基形成的，如果选择大肠杆菌作为受体菌，大肠杆菌是原核生物，细胞内只有核糖体，只能形成肽链，无内质网和高尔基体等细胞器，不能对肽链进行加工、折叠形成具有一定空间结构的蛋白质，因此，不能得到有活性的L-天冬酰胺酶。 1 2 3 4 5 5.(2024·长沙高三一模)研究人员将人胰岛素基因转入大肠杆菌培育出能生产人胰岛素的工程菌，该过程所用的质粒与含人胰岛素基因的DNA上相关限制酶的酶切位点分别如图1、图2所示。BamHⅠ识别的碱基序列为G↓GATCC；BclⅠ识别的碱基序列为T↓GATCA；Sau3AⅠ识别的碱基序列为↓GATC；HindⅢ识别的碱基序列为A↓AGCTT。请回答下列问题： 1 2 3 4 5 (1)生产该大肠杆菌，需要获取目的基因，研究人员常从人_______细胞中获取mRNA，通过_______________过程得到cDNA，然后用______技术对cDNA进行扩增。 胰岛B 逆转录(反转录) PCR 1 2 3 4 5 (2)用图中质粒和目的基因构建基因表达载体时，应该选择限制酶________切割质粒，选择限制酶_________(只选择一种)切割目的基因，用该方法切割目的基因、质粒后______(填“能”或“不能”)防止目的基因的自身环化或与质粒的反向连接。 BamHⅠ Sau3AⅠ 不能 目的基因应位于启动子和终止子之间，破坏Y抗生素抗性基因更加有利于目的基因的检测与鉴定，图中的BamHⅠ、BclⅠ的识别序列均包含Sau3AⅠ的识别序列，因此应选用限制酶BamHⅠ切割质粒，选用Sau3AⅠ切割含目的基因的DNA片段。BamHⅠ、Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成的黏性末端相同，不能防止目的基因的自身环化或与质粒的反向连接。 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 (3)构建基因表达载体时，若要通过PCR扩增的方法，检测目的基因是否插入质粒，应该选择图中的_________(填“甲、乙”“甲、丙”或“丙、丁”)处碱基序列设计引物，若______________________，说明已成功将目的基因插入质粒。 甲、丙 能成功扩增出DNA片段 1 2 3 4 5 选择同时包含质粒、目的基因的碱基序列设计引物，若能成功扩增出DNA片段，说明目的基因已成功插入，而选择“甲、乙”或“丙、丁”，无论是否插入，都能扩增出DNA片段。 $$ [重点突破]　第3练　限制酶的选择　[分值：100分] 1．(每空2分，共8分)(2021·辽宁，24节选)PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列(简称phb2基因)，大小为0.9 kb(1 kb＝1 000碱基对)，利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题： (1)为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经________________过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。 (2)图为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见表。为使phb2基因(该基因序列不含图中限制酶的识别序列)与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入____________和______________两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用________________(填“E.coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。 相关限制酶的识别序列及切割位点 名称 识别序列及 切割位点 名称 识别序列 及切割位点 Hind Ⅲ A↓AGCTT TTCGA↑A EcoR Ⅰ G↓AATTC CTTAA↑G Pvit Ⅱ CAG↓CTG GTC↑GAC Pst Ⅰ CTGC↓AG GA↑CGTC Kpn Ⅰ G↓GTACC CCATG↑G BamHⅠ G↓GATCC CCTAG↑G 注：箭头表示切割位点。 答案　(1)逆转录　(2)EcoR Ⅰ　Pvit Ⅱ　T4 DNA连接酶 解析　(2)根据启动子和终止子的生理作用可知，目的基因应导入启动子和终止子之间，但两者之间存在三种限制酶切点，但是由于Kpn Ⅰ在质粒上不止一个酶切位点，所以应该选择EcoR Ⅰ和Pvit Ⅱ两种不同限制酶的识别序列；根据Pvit Ⅱ的酶切序列可知，切出了平末端，所以构建基因表达载体时，应该用T4 DNA连接酶连接质粒和目的基因。 2．(每空2分，共6分)(2021·山东，25节选)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。 为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是__________，在R末端添加的序列所对应的限制酶是____________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要______种酶。 答案　SalⅠ　EcoRⅠ　6 解析　据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R端与荧光蛋白基因中限制酶MunⅠ识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有MunⅠ和XhoⅠ的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶MunⅠ和XhoⅠ所识别，故应该选用添加限制酶EcoRⅠ和限制酶SalⅠ识别序列，由图可知，限制酶MunⅠ识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoRⅠ识别并切割后的黏性末端相同，故R末端添加的序列所对应的限制酶是EcoRⅠ，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是SalⅠ；荧光蛋白基因中含有限制酶EcoR Ⅰ的识别位点，故对载体使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ切割。综上所述，对载体使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ切割，对扩增后的产物用限制酶EcoRⅠ和限制酶SalⅠ识别序列，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用Taq酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是Taq酶、限制酶EcoRⅠ、限制酶SalⅠ、限制酶MunⅠ、限制酶XhoⅠ、DNA连接酶。 3．(4分)(2024·湖南，21节选)百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题： 研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取pL，首先选用______________酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。 答案　HindⅢ、BamHⅠ 解析　根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，若要获得启动子pL并连接到质粒上，可选用限制酶HindⅢ、BamHⅠ进行酶切，以替换Ti质粒中的启动子，从而达到根据GUS酶活性反映启动子活性的目的。 4．(每空3分，共12分)(2024·河北，22节选)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。回答下列问题： 实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为______________________________________________启动子。Nos为终止子，其作用为____________。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶____________和__________对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。 答案　水稻胚乳细胞中特异表达的基因的　终止转录　HindⅢ　EcoRⅠ 解析　根据题意可知，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP(启动子)应为水稻胚乳中特异表达的基因的启动子。Nos为终止子，其作用为终止转录过程。GtP内部含有KpnⅠ的酶切位点，用KpnⅠ酶切会破坏启动子，Nos下游含有SacⅠ的酶切位点，用SacⅠ酶切会使重组基因表达载体缺失终止子，故构建基因表达载体时，可选择限制酶HindⅢ和EcoRⅠ对r2HN基因与载体进行酶切。 5．(4分)(2022·湖北，24节选)如图是S基因的cDNA和载体的限制性内切核酸酶(限制性核酸内切酶)酶谱。为了成功构建重组表达载体，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用____________________酶切割S基因的cDNA和载体。 答案　XbaⅠ、HindⅢ 解析　为了成功构建重组表达载体，不破坏载体关键结构和目的基因，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用XbaⅠ、HindⅢ酶切割S基因的cDNA和载体。 6．(每空4分，共8分)(2024·全国甲，38节选)某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题： 质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在___________________________ ________________________________________________________________________(答出两点即可)； 使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是________________。 答案　避免目的基因和质粒的反向连接，防止目的基因和质粒的自身环化　T4 DNA连接酶 解析　构建重组质粒时，与单酶切相比，采用双酶切法可以形成不同的黏性末端，双酶切可以避免目的基因和质粒的反向连接，防止目的基因和质粒的自身环化。酶c单酶切后形成平末端，宜选用T4 DNA连接酶连接。 1．(10分)(2024·齐齐哈尔高三三模)人乳铁蛋白广泛分布于乳汁等外分泌液中，在初乳中含量较高，对细菌、真菌和病毒等有抑制作用。如图表示利用基因工程技术构建人乳铁蛋白基因重组质粒的过程(图中TetR表示四环素抗性基因，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因)，五种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。回答下列问题： 限制酶 BamHⅠ HaeⅢ BclⅠ Sau3AⅠ NotⅠ 识别序列及 切割位点 (1)(3分)要将人乳铁蛋白基因插入载体中，若只使用一种限制酶，应选择的限制酶是__________。限制酶切割的是__________键。基因工程技术中为保证目的基因的正确连接，通常选择________________________________________________________________________ 种限制酶进行酶切。 (2)(3分)基因工程最核心的步骤是__________，重组质粒中启动子的功能是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (3)(2分)人乳铁蛋白基因需要利用PCR技术进行扩增，扩增需要引物__________(在“Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ”中选择)。 (4)(2分)据图分析，成功获得含有人乳铁蛋白基因的重组质粒首先需要在含有__________(填“四环素”或“氨苄青霉素”)的培养基上进行筛选，然后将需要的重组质粒导入牛的受精卵，再利用__________工程技术获得转基因小牛。 答案　(1)Sau3AⅠ　磷酸二酯　2(或两)　(2)基因表达载体的构建　RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质　(3)Ⅱ、Ⅲ　(4)氨苄青霉素　胚胎 解析　(1)要将人乳铁蛋白基因插入载体中，若只允许使用一种限制酶，根据人乳铁蛋白基因两端的识别序列可知，BclⅠ和Sau3AⅠ可以切出相同的黏性末端，结合质粒上的限制酶识别序列可知，只用一种酶且切出相同的黏性末端，则应选择的限制酶是Sau3AⅠ。限制酶断开的是磷酸二酯键。为了避免目的基因和质粒自身环化和反向连接，基因工程技术中通常选择2种限制酶进行酶切，以形成不同的黏性末端。(3)PCR中引物的作用是使耐高温的DNA聚合酶从引物的3′端连接游离的脱氧核苷酸，所以引物5′端应该与模板链的3′端配对，故引物应选择Ⅱ、Ⅲ。(4)据图分析，成功获得含有人乳铁蛋白基因的重组质粒含有氨苄青霉素抗性基因，需要在含有氨苄青霉素的培养基上筛选，然后将需要的重组质粒导入牛的受精卵，再利用胚胎工程技术获得转基因小牛。 2．(11分)(2024·湘潭高三开学考)紫色花青素是一种天然色素，广泛存在于多种植物中，尤其是在花朵、果实和叶子中。紫色花青素能够清除自由基，有助于保护视网膜，抑制癌细胞生长的潜力等。紫色西红柿经基因编辑后可产生比普通西红柿多9倍的花青素(紫色)，如图是花青素基因(S)的cDNA(某种生物发育某个时期的mRNA经逆转录产生的互补DNA)和Ti质粒图。回答下列问题： (1)(3分)紫色花青素能够清除自由基，保护细胞免受氧化损伤。自由基损害细胞主要表现为________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________(答2点)。 紫色花青素处理癌细胞可使其细胞周期______(填“缩短”“延长”或“不变”)。 (2)(6分)构建基因表达载体时，最好选择限制酶____________切割S基因的cDNA和Ti质粒，以保证目的基因与载体定向连接，从而提高重组效率。利用PCR技术扩增花青素基因的cDNA时，需要________种引物，一般还需要往PCR反应缓冲液中加入Mg2＋，其原因是__________________________。PCR扩增的产物进行电泳时，发现除了目标序列外还有很多非特异性条带，出现该现象的原因可能有_______________________________________ ________________________________________________________________________(答2点)。 (3)(2分)基因编辑作物的安全性和监管是一个重要议题。在研发过程中，需要确保紫色西红柿的安全性。花青素的合成途径涉及多个基因，其中包括转录因子，这些转录因子可以激活或抑制花青素合成相关基因的表达。增加花青素的产量的措施有________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________(答1点)。 答案　(1)攻击生物膜，损伤生物膜结构与功能；攻击DNA，引起基因突变；攻击蛋白质，使蛋白质活性降低　延长　(2)XbaⅠ、Hind Ⅲ　2　DNA聚合酶需要Mg2＋激活　引物设计太短(或引物特异性不强，即与非目的序列有同源性)、两引物之间碱基互补配对(形成引物二聚体)、复性温度过低、Mg2＋浓度过高、DNA模板出现污染等　(3)激活或增强西红柿中花青素合成的相关基因；编辑转录因子的基因 解析　(2)限制酶选择原则：不破坏目的基因和标记基因等；应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶；使用不同限制酶，避免目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接。据图可知，最好选用XbaⅠ、Hind Ⅲ切割S基因的cDNA和Ti质粒，既能保证目的基因与载体产生相同的黏性末端，又不破坏目的基因。PCR扩增目的基因时需要2种引物，一般需要往PCR反应缓冲液中加入Mg2＋，Mg2＋可激活(耐高温的)DNA聚合酶。PCR扩增的产物进行电泳时，除了目标序列外还有很多非特异性条带，出现非目的序列产物的原因可能有引物设计太短(或引物特异性不强，即与非目的序列有同源性)、两引物之间碱基互补配对(形成引物二聚体)、复性温度过低、Mg2＋浓度过高、DNA模板出现污染等。 3．(每空2分，共12分)(2024·娄底高三期末)中重度盐碱地逆境胁迫条件下，科研人员利用根瘤农杆菌介导法将水稻Leap启动子(一种强启动子)调控的SNAC1基因导入早粳稻中，成功培育了SNAC1基因耐盐碱水稻。转基因耐盐碱候选品种呈现SNAC1基因超强表达，产品性状及产量明显优于普通水稻。其培育过程如图所示，回答下列问题： (1)Leap启动子是一段有特殊结构的DNA片段，能被______________识别并结合，驱动基因的持续转录。为使SNAC1基因在普通水稻植株中超量表达，应选用限制酶________________切割图中的Ti质粒和DNA片段。 (2)过程①是培育转基因耐盐碱水稻的核心工作，其目的是_____________________。T－DNA的作用是将SNAC1基因导入普通水稻细胞并________________。 (3)已知转录时mRNA自身的延伸方向为5′→3′，得出SNAC1基因以____________(填“A”或“B”)链为转录模板链。在筛选含有SNAC1基因的水稻幼苗时，除必要的营养物质，还需要在培养基中添加________________。 答案　(1)RNA聚合酶　BamHⅠ、KpnⅠ　(2)让目的基因(或SNAC1基因)在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代　整合到其染色体的DNA上　(3)B　卡那霉素 解析　(1)Leap启动子是一段有特殊结构的DNA片段，能被RNA聚合酶识别并结合，驱动基因的持续转录。为使SNAC1基因在普通水稻植株中超量表达，必须含有强启动子，结合质粒上终止子的位置，所以目的基因上含有强启动子需要用限制酶BamHⅠ和KpnⅠ切割图中的Ti质粒和DNA片段。(2)基因工程的核心是基因表达载体的构建，目的是让目的基因(或SNAC1基因)在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代。T－DNA的作用是将SNAC1基因导入普通水稻细胞并整合到其染色体的DNA上。(3)已知转录时mRNA自身的延伸方向为5′→3′，根据碱基互补配对原则以及RNA聚合酶结合位点，得出SNAC1基因以B链为转录模板链。重组质粒含有卡那霉素抗性基因，故可在培养基中添加卡那霉素进行筛选。 4．(15分)(2024·潍坊高三联考)L­天冬酰胺酶因其能水解L­天冬酰胺(丙烯酰胺的前体)，而有效降低油炸食品中潜在致癌物质丙烯酰胺的含量，在食品安全领域受到高度关注。某科研机构欲利用pET22b质粒将L­天冬酰胺酶基因导入对氨苄青霉素敏感的宿主菌中，以构建高效表达L­天冬酰胺酶的菌株。图1是L­天冬酰胺酶基因附近的限制酶切点以及基因两侧的部分碱基序列，图2是pET22b质粒的结构模式图及其涉及的限制酶切点，其中的LacZ基因编码产生的半乳糖苷酶可以分解X­gal产生蓝色物质，使菌落呈蓝色，否则菌落为白色。回答下列问题： (1)(4分)利用PCR从提取的DNA中扩增目的基因时需要引物，引物的作用是________________________________________________________________________。要将L­天冬酰胺酶基因导入到pET22b质粒中，需使用的两种限制酶是________________________。 (2)(2分)若图1下方的序列为目的基因的部分碱基序列，则获取目的基因时设计B端的引物序列是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________(只写出16个碱基即可)。 (3)(7分)利用感受态法的转化成功率并不是100%，科研人员将转化后的宿主菌接种在含氨苄青霉素和X­gal的固体培养基上，以此筛选出成功导入重组质粒的宿主菌。 ①若只使用限制酶EcoRⅠ构建重组质粒，导入重组质粒的菌落呈现__________色，这些菌落__________(填“能”“不能”或“不一定能”)产生L­天冬酰胺酶，理由是____________ ________________________________________________________________________。 ②若使用(1)中的限制酶处理，则菌落呈______色的为符合要求的宿主菌，理由是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 (4)(2分)能够发挥作用的L­天冬酰胺酶是由4个亚基形成的，如果选择大肠杆菌作为受体菌，只能从大肠杆菌中提取到4条单链肽链，不能得到有活性的L­天冬酰胺酶，原因是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。 答案　(1)使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸　KpnⅠ、EcoRⅠ　(2)3′－TAAGTTGTCTCTTAAG－5′　(3)①白　不一定能　EcoRⅠ切割目的基因和质粒产生的黏性末端相同，构建的重组质粒可能是目的基因和质粒反向连接而成，目的基因无法正常表达　②白　重组质粒由于LacZ基因被切断，无法合成半乳糖苷酶，不能分解X­gal，菌落呈白色　(4)大肠杆菌细胞内无内质网和高尔基体等细胞器，不能对肽链进行加工、折叠形成具有一定空间结构的蛋白质 解析　(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。引物的作用：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。若用PstⅠ或BglⅡ会破坏目的基因，若用BamHⅠ会破坏氨苄青霉素抗性基因。若用EcoRⅠ对目的基因和质粒进行切割，由于切割后目的基因和质粒两端的黏性末端相同，因此至少会产生4种连接产物，即目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因和质粒正向连接以及目的基因和质粒反向连接。用KpnⅠ和EcoRⅠ对目的基因和质粒进行切割，切割后目的基因和质粒两端的黏性末端不相同，因此不会出现自身环化和反向连接的情况。(2)获取目的基因时设计B端的引物，B端的引物是与B端的3′端互补配对，同时，要在引物的5′端添加EcoRⅠ的识别序列，因此B端的引物序列是3′－TAAGTTGTCTCTTAAG－5′。(3)若用EcoRⅠ对目的基因和质粒进行切割，由于切割后目的基因和质粒两端的黏性末端相同，因此至少会产生4种连接产物，即目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因和质粒正向连接以及目的基因和质粒反向连接，重组质粒由于LacZ基因被切断，无法合成半乳糖苷酶，不能分解X­gal，菌落呈白色，但重组质粒可能是目的基因和质粒反向连接而成，目的基因无法正常表达，因此呈白色的菌落不一定能产生L­天冬酰胺酶。用EcoRⅠ和KpnⅠ对目的基因和质粒进行切割，切割后目的基因和质粒两端的黏性末端不相同，因此不会出现自身环化和反向连接的情况，但重组质粒由于LacZ基因被切断，无法合成半乳糖苷酶分解X­gal，菌落呈白色，因此白色的菌落为成功导入重组质粒的宿主菌。(4)能够发挥作用的L­天冬酰胺酶是由4个亚基形成的，如果选择大肠杆菌作为受体菌，大肠杆菌是原核生物，细胞内只有核糖体，只能形成肽链，无内质网和高尔基体等细胞器，不能对肽链进行加工、折叠形成具有一定空间结构的蛋白质，因此，不能得到有活性的L­天冬酰胺酶。 5．(10分)(2024·长沙高三一模)研究人员将人胰岛素基因转入大肠杆菌培育出能生产人胰岛素的工程菌，该过程所用的质粒与含人胰岛素基因的DNA上相关限制酶的酶切位点分别如图1、图2所示。BamHⅠ识别的碱基序列为G↓GATCC；BclⅠ识别的碱基序列为T↓GATCA；Sau3AⅠ识别的碱基序列为↓GATC；HindⅢ识别的碱基序列为A↓AGCTT。请回答下列问题： (1)(3分)生产该大肠杆菌，需要获取目的基因，研究人员常从人______________细胞中获取mRNA，通过________过程得到cDNA，然后用________技术对cDNA进行扩增。 (2)(4分)用图中质粒和目的基因构建基因表达载体时，应该选择限制酶______切割质粒，选择限制酶______(只选择一种)切割目的基因，用该方法切割目的基因、质粒后______(填“能”或“不能”)防止目的基因的自身环化或与质粒的反向连接。 (3)(3分)构建基因表达载体时，若要通过PCR扩增的方法，检测目的基因是否插入质粒，应该选择图中的______(填“甲、乙”“甲、丙”或“丙、丁”)处碱基序列设计引物，若______________________，说明已成功将目的基因插入质粒。 答案　(1)胰岛B　逆转录(反转录)　PCR　(2)BamHⅠ　Sau3AⅠ　不能　(3)甲、丙　能成功扩增出DNA片段 解析　(2)目的基因应位于启动子和终止子之间，破坏Y抗生素抗性基因更加有利于目的基因的检测与鉴定，图中的BamHⅠ、BclⅠ的识别序列均包含Sau3AⅠ的识别序列，因此应选用限制酶BamHⅠ切割质粒，选用Sau3AⅠ切割含目的基因的DNA片段。BamHⅠ、Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成的黏性末端相同，不能防止目的基因的自身环化或与质粒的反向连接。(3)选择同时包含质粒、目的基因的碱基序列设计引物，若能成功扩增出DNA片段，说明目的基因已成功插入，而选择“甲、乙”或“丙、丁”，无论是否插入，都能扩增出DNA片段。 学科网（北京）股份有限公司 $$