押题04 分子遗传学与基因工程（4大题型猜押）（安徽专用）-2025年高考生物冲刺抢押秘籍

押题04 分子遗传学与基因工程 猜押 4大题型 题型01表观遗传 题型02PCR技术原理与应用 题型03 基因工程操作 题型04 疾病诊断与基因治疗 猜押考点 3年真题 考情分析 押题依据 细胞分子组成及结构 2024年安徽卷·第11题2024年安徽卷·第19题 2024年安徽卷·第20题 2025年新高考生物新结构体系下，分子遗传学与基因工程板块注重实验设计与实际应用。命题呈现基础理论与技术前沿相结合的特点，并与细胞工程、生物进化等模块联动，强调知识迁移能力。实验题占比突出，要求学生具备技术原理理解与伦理辨析能力。 题目更加注重综合性、应用性、创新性，对知识点的背景和应用有更多的掌握。 当前《生物安全法》实施背景下，转基因作物生态风险、基因编辑伦理争议可能成为命题切入点，安徽本地农业科技案例（如抗虫棉推广）或与基因编辑技术结合考查。需强化“技术原理-操作流程-结果分析”的完整思维链训练。 题型1 表观遗传 1．秀丽隐杆线虫生长发育过程由lin-4和lin-14基因调控，lin-4基因转录产生的miRNA能够与lin-14基因转录产生的mRNA部分互补，从而调节lin-14基因的表达。秀丽隐杆线虫不同发育阶段lin-4和lin-14基因的表达量如下图所示，下列有关推测不合理的是（　　） A．lin-14基因编码的产物对线虫的成熟具有抑制作用 B．lin-4基因编码的miRNA能抑制lin-14基因的翻译 C．miRNA调控遗传信息的表达属于一种表观遗传现象 D．lin-4基因缺失突变的秀丽隐杆线虫生长发育会提前 【答案】D 【分析】基因表达包括转录和翻译两个过程，其中转录是以DNA的一条链为模板合成RNA的过程，该过程主要在细胞核中进行，需要RNA聚合酶参与；翻译是以mRNA为模板合成蛋白质的过程，该过程发生在核糖体上，需要以氨基酸为原料，还需要酶、能量和tRNA。 【详解】A、由图可知，lin-14基因在线虫发育早期表达量高，后期基本不表达，所以lin-14基因编码的产物可能对线虫的成熟具有抑制作用，A正确； B、lin-4基因转录产生的miRNA能与lin-14基因转录产生的mRNA部分互补，从而抑制lin-14基因的翻译，B正确； C、miRNA调控遗传信息的表达，不改变基因的碱基序列，属于表观遗传现象，C正确； D、lin-4基因缺失突变后，无法编码miRNA抑制lin-14基因表达，lin-14基因表达量高可能会抑制线虫成熟，导致生长发育延迟，D错误。 故选D。 2．miRNA是一类长度约为20~24个核苷酸的非编码RNA，与靶mRNA结合后，使其稳定性下降，从而易于被降解。下列叙述正确的是（　　） A．miRNA通过阻碍基因的转录从而调控基因的表达 B．miRNA和靶mRNA通过磷酸二酯键结合形成局部双链 C．miRNA调控和DNA甲基化都会改变基因的碱基序列 D．miRNA调控和DNA甲基化均可导致个体表型发生可遗传变化 【答案】D 【分析】基因表达包括转录和翻译两个过程，其中转录是以DNA的一条链为模板合成RNA的过程，该过程主要在细胞核中进行，需要解旋酶和RNA聚合酶参与；翻译是以mRNA为模板合成蛋白质的过程，该过程发生在核糖体上，需要以氨基酸为原料，还需要酶、能量和tRNA等。 【详解】A、据题干信息，miRNA与靶mRNA结合导致其降解，从而阻碍了基因的翻译过程，A错误； B、miRNA和靶mRNA通过氢键结合形成局部双链，B错误； CD、miRNA调控与DNA甲基化都属于表观遗传现象，表观遗传是指生物体基因的碱基序列保持不变，但基因表达和表型发生可遗传变化的现象，C错误，D正确。 故选D。 3．siRNA是一类长度为21~25bp的双链RNA分子，已广泛用于RNA干扰（RNAi）技术，其部分作用机制如图所示。下列说法错误的是（　　） 注：Dicer是一种核糖核酸内切酶，RISC（RNA诱导沉默复合体）是一种由siRNA、Argonaute蛋白和Dicer复合形成的复合体 A．外源siRNA递送进入靶细胞的过程需要消耗能量 B．若把外源siRNA的一条链送入细胞内，可能不会产生RNA干扰现象 C．该种RNAi技术和DNA的甲基化是在同一水平上抑制基因表达的 D．利用RNAi技术可以抑制某些病毒基因的表达，从而控制病毒的增殖 【答案】C 【分析】由图可知，siRNA解链成单链后，其中一条链引导RISC与靶mRNA结合，导致靶mRNA降解，因此若把外源siRNA的一条链送入细胞内，该条链可能无法与靶mRNA结合，可能不会产生RNA干扰现象 【详解】A、siRNA属于大分子物质，以胞吞的形式进入靶细胞，该过程需要消耗能量，A正确； B、由图可知，siRNA解链成单链后，其中一条链引导RISC与靶mRNA结合，导致靶mRNA降解，因此若把外源siRNA的一条链送入细胞内，该条链可能无法与靶mRNA结合，可能不会产生RNA干扰现象，B正确； C、该种RNAi技术是在翻译水平上抑制基因表达的，DNA的甲基化是在转录水平上抑制基因表达的，C错误； D、RNAi技术可以抑制基因表达，因此利用RNAi技术可以通过抑制病毒基因的表达，从而控制病毒的增殖，D正确。 故选C。 4．人细胞中 Rb编码的蛋白（pRB）通过结合转录因子抑制 DNA 合成相关酶类。当细胞受到生长信号刺激时，pRB被CDK（细胞周期依赖性激酶）磷酸化后失去原有活性，进而使细胞进入细胞周期。研究发现：①人13号染色体13q14区段丢失后，细胞中不存在pRB，人患成视网膜细胞瘤等疾病；②Rb某部位的高度甲基化会导致其转录沉默；③遗传性成视网膜细胞瘤患者的 Rb所编码的产物不具有生物活性。据此分析，下列说法错误的是（    ） A．Rb属于抑癌基因，位于13号染色体的13q14区段 B．导致 Rb转录沉默的高度甲基化发生在启动子、终止子部位 C．pRB的去磷酸化可抑制核 DNA 的复制，使细胞停留在G1期 D．Rb中碱基对的缺失、增添或替换可使人患遗传性成视网膜细胞瘤 【答案】B 【分析】基因表达包括转录和翻译两个过程，其中转录是以DNA的一条链为模板合成RNA的过程，该过程主要在细胞核中进行，需要解旋酶和RNA聚合酶参与；翻译是以mRNA为模板合成蛋白质的过程，该过程发生在核糖体上，需要以氨基酸为原料，还需要酶、能量和tRNA等。 【详解】A、结合题干“pRB被CDK（细胞周期依赖性激酶）磷酸化后失去原有活性，进而使细胞进入细胞周期”，推测Rb基因能抑制细胞进入细胞周期，故属于抑癌基因；人13号染色体13q14区段丢失后，细胞中不存在pRB，人患成视网膜细胞瘤等疾病，推测Rb基因应位于13号染色体的13q14区段，A正确； B、Rb某部位的高度甲基化会导致其转录沉默，转录沉默的高度甲基化通常发生在启动子区域（调控转录起始），另外题干未提及其甲基化部位，B错误； C、pRB被CDK（细胞周期依赖性激酶）磷酸化后失去原有活性，进而使细胞进入细胞周期，故pRB去磷酸化时具有活性，可抑制DNA合成相关酶类，从而阻滞细胞于G1期（进行相关蛋白质的合成），C正确； D、遗传性成视网膜细胞瘤患者的pRB无活性（题干③），可能因基因突变（如碱基对缺失/替换/增添）导致蛋白功能丧失，D正确。 故选B。 5．我国科研人员发现了肠癌DNA甲基化调控的新机制，为肠癌的早期检测和治疗提供了新思路，相关机制如图所示。另有多项研究结果表明维生素C能够促进TET2蛋白的活性。据图分析，下列叙述错误的是（    ）    A．抑癌基因表达的蛋白质能抑制细胞的生长和增殖，或者促进细胞凋亡 B．发生甲基化的上游序列可能是启动子，会影响转录过程，从而影响基因的表达 C．TET2在核糖体上合成，可通过核孔进入细胞核，需要β-catenin蛋白，不需要能量 D．β-catenin激活剂和维生素C联合使用有望为肠癌治疗提供新思路 【答案】C 【分析】1、人和动物细胞中的DNA上本来就存在与癌变相关的基因：原癌基因和抑癌基因。一般来说，原癌基因表达的蛋白质是细胞正常的生长和增殖所必需的，这类基因一旦突变或过量表达而导致相应蛋白质活性过强，就可能引起细胞癌变。相反，抑癌基因表达的蛋白质能抑制细胞的生长和增殖，或者促进细胞凋亡，这类基因一旦突变而导致相应蛋白质活性减弱或失去活性，也可能引起细胞癌变。 2、癌细胞与正常细胞相比，具有以下特征：能够无限增殖，形态结构发生显著变化，细胞膜上的糖蛋白等物质减少，细胞之间的黏着性显著降低，容易在体内分散和转移等。 【详解】A、抑癌基因表达的蛋白质能抑制细胞的生长和增殖，或者促进细胞凋亡 ，从而阻止细胞不正常的增殖，A正确; B、发生甲基化的上游序列可能是启动子，基因启动子甲基化后，可能会影响RNA聚合酶与DNA中启动子的结合，会影响转录过程，从而影响基因的表达 ，B正确; C、TET2在核糖体上合成，可通过核孔进入细胞核，该过程需要能量，激活的β-catenin蛋白可以激活TET2而发挥作用，C错误; D、维生素C能够促进TET2的活性，题图可知β−catenin激活剂能够促进TET2入核并催化抑癌基因去甲基化，从而使肿瘤清退，故β−catenin激活剂和维生素C联用的抗肿瘤方案有望为肠癌治疗提供新思路，D正确。 故选C。 6．某些植物需要经过低温诱导才能开花的现象称为春化作用，与FRI和FLC基因有关。温暖条件下，FRI蛋白与FLC基因结合使其表达，抑制植物开花；低温条件下，FRI蛋白在细胞内凝聚成团不与FLC基因结合，同时通过组蛋白修饰的调整抑制FLC基因的表达。下列说法正确的是（    ） A．春化作用的原理可能是低温通过抑制FRI基因的表达，解除对开花过程的抑制 B．组蛋白不是遗传物质，其乙酰化引起的植物表型改变是不会遗传给后代的 C．低温条件下，组蛋白氨基酸序列发生改变而凝聚成团，FRI蛋白的含量升高 D．温暖条件下，FRI蛋白使FLC基因的组蛋白乙酰化，促进FLC基因的表达 【答案】D 【分析】温暖条件下，FRI蛋白与FLC基因结合，组蛋白的乙酰化、泛素化，FLC基因表达，抑制植物开花。低温条件下，FRI蛋白在细胞内凝聚成团不与FLC基因结合，组蛋白去乙酰化、去泛素化，组蛋白甲基化修饰位点发生改变，抑制FLC基因表达，从而解除对植物开花的抑制。 【详解】A、低温条件下，FRI蛋白在细胞内凝聚成团不与FLC基因结合，同时通过组蛋白修饰的调整抑制FLC基因的表达，从而解除对开花过程的抑制，A错误； B、低温条件下的组蛋白去乙酰化、去泛素化并且不同位点进行甲基化修饰，FLC基因的表达受到抑制，说明组蛋白的乙酰化能促进该基因表达，表观遗传可以遗传，B错误； C、低温条件不影响组蛋白的氨基酸序列，FRI蛋白在细胞内凝聚成团不与FLC基因结合，使组蛋白去泛素化，但无法推知FRI蛋白的含量升高，C错误； D、温暖条件下，通过组蛋白修饰的调整促进FLC基因的表达，抑制植物开花，D正确。 故选D。 7．基因印记是指受精卵形成过程中，来源于父亲或者来源于母亲的等位基因被修饰后，该印记导致下一代仅仅表达父源或者母源等位基因。这种修饰常为DNA甲基化修饰等，也包括组蛋白乙酰化、甲基化等修饰。 (1)研究发现某种小鼠有体型正常（N）和体型矮小（n）两种类型，N基因可根据亲代的不同而有不同的表达，表现出“基因印记”现象，如图为相关实验。 ①基因组印记中的DNA甲基化修饰、组蛋白修饰等，使得基因表达和表型变化可遗传，这种现象属于 。 ②由实验结果可知，F2个体不被表达的N基因可能来自其亲本F1中的 。 ③F2中体型正常的雌雄鼠自由交配，后代体型正常的概率为 。 (2)进一步研究发现，小鼠个体在生殖细胞形成早期，来自父方和母方的印记将全部被消除，精子和卵子形成时产生新的甲基化模式。此模式导致只有同时具有精子和卵细胞的细胞核的胚胎才能正常发育，具有两套母本基因组或两套父本基因组的“受精卵”不能正常发育成小鼠。某研究团队通过改变小鼠生殖细胞的“基因印记”使其“变性”，然后将一个极体注入修饰后的次级卵母细胞（类似受精作用），最终创造出“孤雌生殖”的小鼠。实验过程如下图所示。 ①图中囊胚进一步发育会出现 现象，否则胚胎无法继续发育；将极体注入修饰后的次级卵母细胞并融合，类似受精作用，该操作能成功创造孤雌小鼠，依赖的原理是 。 ②从打破基因印记对孤雌生殖的阻碍这个角度看，这些操作的目的是去除或改变阻碍孤雌生殖的基因印记，模拟 过程中基因表达所需的甲基化状态。 ③有人认为“孤雌小鼠”诞生过程没有精子参与，其核基因型与提供卵母细胞的雌鼠相同。请结合图中信息，分析该观点错误的原因： 。 【答案】(1) 表观遗传 母本 3/4 (2) 透明带破裂/孵化 动物体细胞的细胞核具有全能性 受精 孤雌小鼠的核基因除了来自卵母细胞，还来自注入的第二极体，核基因型与提供卵母细胞的雌鼠不完全相同 【分析】表观遗传是指DNA序列不发生变化，但基因的表达却发生了可遗传的改变，即基因型未发生变化而表现型却发生了改变，如DNA的甲基化，甲基化的基因不能与RNA聚合酶结合，故无法进行转录产生mRNA，也就无法进行翻译，最终无法合成相应蛋白，从而抑制了基因的表达。 【详解】（1）①基因组印记中的DNA甲基化修饰、组蛋白修饰等，使得基因表达和表型变化可遗传，这种现象属于表观遗传。 ②从实验情况可知亲代雄性NN与雌性nn杂交，子一代均为正常体型，所以从父本传递下来的N基因不被印记，即F2个体不被表达的N基因可能来自其亲本F1中的母本。 ③选取F2中体型正常的雌雄鼠自由交配，则选取的基因型为1/2NN和1/2Nn，产生雄配子比例为N:n=3:1，雌配子比例为N：n=3：1，随机交配的结果见下表。 雌配子雄配子 3/4N 1/4n 3/4N 9/16NN（体型正常） 3/16Nn（体型正常） 1/4n 3/16Nn（体型矮小） 1/16nn（体型矮小） 注：父本传递下来的基因不被印记，正常表达 所以表型正常的比例为9/16+3/16=3/4。 （2）①图中囊胚进一步发育，会导致透明带破裂，胚胎从其中伸展出来，即出现孵化现象，否则胚胎无法继续发育；将极体注入修饰后的次级卵母细胞并融合，类似受精作用，该操作能成功创造孤雌小鼠，其依赖的生物学原理是动物体细胞的细胞核具有全能性。 ②从打破基因印记对孤雌生殖的阻碍这个角度看，这些操作的目的是去除或改变阻碍孤雌生殖的基因印记，其模拟的是受精作用过程中，基因表达所需的甲基化状态。 ③据图可知，孤雌生殖的小鼠的核基因来自次级卵母细胞和第二极体，所以核基因型与提供卵母细胞的雌鼠不完全相同。 题型2 PCR技术原理与应用 1．研究人员利用PCR技术体外扩增基因A．下列叙述错误的是（    ） A．PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度控制PCR进程 B．Taq DNA聚合酶从基因A模板链的5′端到3′端方向催化子链的合成 C．PCR中使用的一对引物的碱基数量可以不同，一般为20~30个核苷酸 D．PCR反应体系加入的扩增缓冲液中一般要添加Mg2+ 【答案】B 【分析】PCR反应过程包括变性、复性和延伸三个步骤： （1）变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链。 （2）复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 （3）延伸：当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 【详解】A、PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度控制DNA双链的解聚与结合，A正确； B、Taq DNA聚合酶从基因A模板链的3′端到5′端方向催化子链的合成，B错误； C、PCR中使用的一对引物的碱基数量可以不同，一般为20~30个核苷酸，C正确； D、真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活，因此，PCR反应体系加入的扩增缓冲液中一般要添加Mg2+，D正确。 故选B。 2．以T-DNA 作载体将某突变基因导入拟南芥的染色体DNA时，可出现三种结果：仍为野生型（导入失败）、突变杂合子（在一对同源染色体上只导入1个突变基因）及突变纯合子。研究人员用引物LP、RP 和BP对甲、乙、丙三株拟南芥进行核酸电泳检测，结果如下图。下列说法错误的是（    ） A．PCR 时，脱氧核苷酸最初添加在引物的3'端 B．模板链过长时无 PCR产物 C．乙为突变纯合子 D．丙自交后代的核酸电泳结果与丙相同 【答案】D 【分析】PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按 碱基互补配对的原则结合，再调 温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶 沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。 【详解】A、在PCR反应中，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶作用下从引物的3'端开始添加脱氧核苷酸，A正确； BC、乙只有BP+RP扩增条带，为突变纯合子；丙同时具有LP+RP及BP+RP扩增条带，为突变杂合子。LP与RP间为1.1kb,T-DNA为17kb,T-DNA插入到LP与RP之间会显著增大模板链长度，导致LP+RP无扩增产物，B、C正确； D、丙为杂合子，有1/2的自交后代与丙的核酸电泳结果相同，D错误。 故选D。 3．转基因抗虫棉的Bt蛋白在细胞质积累，可能与内源蛋白相互作用，产生非期望效应。C蛋白能结合纤维素，科研人员将C基因与Bt基因连接构建融合基因（如图）导入棉花细胞。相关叙述正确的是（    ） A．使用DNA聚合酶催化C基因和Bt基因连接 B．选择引物2和4进行PCR以确定基因正确连接 C．可通过花粉管通道法将融合基因导入棉花细胞 D．融合基因表达可促进Bt蛋白在细胞膜定向积累 【答案】C 【分析】基因工程需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定；构建基因表达载体就是要让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使目的基因能够表达和发挥作用，这一步是基因工程的核心工作。 【详解】A、DNA聚合酶的功能是催化DNA链的延伸（如PCR中），而连接两个基因需要的是DNA连接酶（如T4 DNA连接酶），因此使用DNA连接酶催化C基因和Bt基因连接，A错误； B、PCR检测融合基因时，需选择位于两个基因外侧的引物（如C基因上游和Bt基因下游），确保仅当基因正确连接时才能扩增出目标片段，因此选择引物1和4进行PCR才可以确定基因正确连接，B错误； C、花粉管通道法通过将外源DNA直接导入花粉管，利用受精过程将基因整合到胚胎细胞中，因此可通过花粉管通道法将融合基因导入棉花细胞，C正确； D、C蛋白能结合纤维素（主要存在于细胞壁），融合基因表达后，Bt蛋白通过与C蛋白的结合被定向至细胞壁附近，减少细胞质中的积累，从而避免非期望效应，D错误。 故选C。 4．目的基因A含有100对碱基，其中腺嘌呤占30%，现利用目的基因A片段两侧的特异性序列设计引物I、引物Ⅱ，用PCR技术扩增该目的基因，结构如下图所示。PCR扩增共循环50次。下列说法错误的是（　　）    A．PCR仪实质上是一台温度自动调控仪器，循环50次理论上复制50代 B．含目的基因A的DNA片段经PCR循环50次，需要两种引物共250个 C．PCR过程与体内DNA复制的方式相同，但是只需要一种酶的参与 D．若只考虑目的基因A，经PCR循环50次需要鸟嘌呤(250-1)×40个 【答案】B 【分析】PCR技术：（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。（2）原理：DNA复制。（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一对引物。（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 【详解】A、PCR的实质是DNA的半保留复制，该过程需经过高温变性、低温复性、中温延伸，PCR仪实质上是一台温度自动调控仪器，循环50次理论上复制50代，A正确； B、含目的基因A的DNA片段经PCR循环50次，产生250个子代DNA，每个DNA分子需要2个引物，亲本DNA除外，故需要两种引物共251-2个，B错误； C、PCR过程与体内DNA复制的方式相同，都是半保留复制，但是只需要耐高温聚合酶的参与，C正确； D、由题意可知，目的基因A含有100对碱基，其中腺嘌呤占30%，则G占20%，为40个，若只考虑目的基因A，经PCR循环50次需要鸟嘌呤(250-1)×40个，D正确。 故选B。 5．为制备带有荧光标记的DNA探针，研究人员在反应系统内只添加了DNA聚合酶、缓冲液、H2O和4种dNTP（dN—Pα～Pβ～Pγ，其中dGTP被荧光标记）的反应管①～③中分别加入适量单链DNA（如图）。形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。下列分析正确的是（    ） 反应管①：5′-GGCTATAGCCAGA-3′ 反应管②：5′-GTTTCGCGATGGC-3′；3′-AGCGCTACCGATG-5′ 反应管③：5′-CCAGGAGATTGC-3′；3′-CCTCTAACGATC-5′ A．实验中需要用荧光物质对dGTP的γ位磷酸基团进行标记 B．DNA聚合酶沿模板链将dNTP逐个连接到引物的5′端 C．反应管②的反应系统内因缺乏模板或引物不能进行PCR扩增 D．实验结束后，能得到带有荧光标记DNA探针的反应管只有③ 【答案】D 【分析】子链的延伸方向为5'→3'，由题意可知，在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，要能得到带有荧光标记的DNA探针，需要能根据所提供的模板进行扩增，且扩增子链种含有A。 【详解】A、dGTP的γ位与β位之间的高能磷酸键会断裂为PCR提供能量，因此若对dGTP的γ位磷酸基团进行标记，则标记不会出现在子链中，需要用荧光物质对dGTP的α位磷酸基团进行标记，A错误； B、DNA聚合酶沿模板链将dNTP逐个连接到引物的3′端，B错误； C、反应管②的两条单链DNA分子之间具有互补的序列，既是模板又是引物，可以进行PCR，但双链DNA区之外的5'端模板链中没有碱基C，不能与被荧光标记的dGTP结合，因此不能制备带有荧光标记的DNA探针，C错误； D、①中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，但双链DNA区之外的3'端无模板，因此无法进行DNA合成，不能得到带有荧光标记的DNA探针，③中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，且双链DNA区之外的5'端有模板和碱基C，在模板链的3'端能连接上被荧光标记的dGTP，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针，D正确。 故选D。 6．油菜素内酯（BR）对水稻具有多重效应。施加BR可导致籽粒数减少，千粒重增大，全局性BR缺失能导致籽粒数增加，千粒重下降。研究人员借助神舟飞船，将某非簇生稻培育成簇生稻（如图1），其籽粒数量增加，但千粒重不变。 回答下列问题： (1)研究人员推测簇生稻能提高产量，其依据是 。 (2)为探明簇生稻簇生机制，研究人员提取簇生稻DNA，测序后与 中的非簇生稻DNA序列比对，发现BRD3基因存在差异。提取簇生稻的核酸，DNA酶处理后与RNA探针杂交，检测结果如表所示。 样本来源 幼嫩稻穗 幼嫩叶片 成熟稻穗 成熟叶片 杂交结果 + - - - 注：“＋”表示存在双链RNA，“-”表示不存在双链RNA 探针杂交结果表明簇生稻中，BRD3基因的表达具有 特异性。检测发现仅幼嫩稻穗BR含量下降，其余部位与非簇生稻含量无显著差异。推测簇生稻的BRD3基因的表达产物具有 作用。 (3)PCR扩增时需设计引物，引物的特点有哪些？ （A．序列的特异性 B．引物内部不会形成双链结构 C．引物间不会形成双链结构）。利用PCR技术对簇生稻和非簇生稻植株BRD3基因上游DNA片段进行扩增，图3为所用引物位置，检测结果如图4所示。 由图示结果推测，相对于非簇生稻植株，簇生稻植株的BRD3基因上游A区域可能发生了碱基序列的 ，B区域可能发生了碱基序列的 。 【答案】(1)簇生稻籽粒数量增加，但千粒重不变 (2) 基因数据库 时空 促进BR降解/抑制BR合成 (3) ABC 倒位 缺失 【分析】基因突变是DNA分子中碱基对的增添、缺失或替换而引起的基因结构的改变。碱基对的增添、缺失或替换如果发生在基因的非编码区，则控制合成的蛋白质的氨基酸序列不会发生改变。 【详解】（1）题目中明确提到产量与籽粒数量和千粒重有关，需要从题干中找到簇生稻与产量相关的特征。已知簇生稻籽粒数量增加，千粒重不变，在千粒重不变的情况下，籽粒数量增多意味着总体产量会提高。 （2）在研究基因差异时，通常是将测序得到的目标生物（甦生稻）的基因序列与已有的基因数据库中同种生物（非簇生稻）的基因序列进行对比，从而发现差异。 从表格中可以看到，BRD3基因在不同的样本（幼嫩稻穗、幼嫩叶片、成熟稻穗、成熟叶片）中的表达情况不同，即该基因在不同的时间（幼嫩和成熟阶段）和不同的空间（稻穗和叶片部位）表达有差异，这体现了基因表达的时空特异性。 （3）PCR扩增时设计的引物需要具有序列的特异性，这样才能准确地结合到目标DNA序列上进行扩增；引物内部不能形成双链结构，否则引物自身会发生折叠等情况，无法正常与模板DNA结合；引物间也不能形成双链结构，不然引物之间会相互结合，影响与模板DNA的结合和扩增反应，ABC符合题意。 故选ABC。 从图4中可以看到，簇生稻在引物组合1 - ①④扩增时出现了条带，而在引物组合2 - ②⑤扩增时没有出现条带，结合图3引物位置，说明簇生稻在A区域可能发生了碱基序列的倒位，导致引物②⑤无法正常结合进行扩增。簇生稻在引物组合3 - ③⑥扩增时没有出现条带，说明B区域可能发生了碱基序列的缺失，使得引物③⑥没有对应的结合位点，从而无法扩增出条带。 7．木糖醇作为一种重要的功能性甜味剂，在食品和医药领域应用广泛。同源重组法是构建基因表达载体的重要方法，其原理是带有相似序列的DNA分子之间可以发生同源重组。某科研小组先将质粒线性化后，分别对木糖醇脱氢酶基因（XDH）、绿色荧光蛋白基因（GFP）和线性化载体进行PCR扩增（通过引物引入同源序列），再将得到的目的基因片段和线性质粒片段进行同源重组，构建表达载体，其过程如图所示，回答下列问题： 注：图中“→”表示PCR引物；条纹或颜色相同的序列表示同源序列或相同序列；KanR表示卡那霉素抗性基因。 (1)利用同源重组法构建基因表达载体的过程中，环状质粒经 处理后可获得线性化的质粒，PCR扩增目的产物片段的过程中，图中引物 的 端应含有质粒的同源序列，以便进行同源重组。 (2)据图分析，引物F2-F和F1-R的碱基序列应具有的特点有 。PCR扩增线性化质粒的过程中所用的引物组合是 ；向PCR产物片段和线性载体的混合体系中加入重组酶的作用可能是 。 (3)实验小组检测大肠杆菌中是否导入重组质粒时，会先挑取单个菌落，再通过热处理使细菌的细胞壁和细胞膜裂解，并直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，这种技术称为菌落PCR技术。与常规PCR相比，菌落PCR的优点和缺点是 （各列举1例）。 【答案】(1) 限制酶 F1-F和F2-R 5' (2) 引物F2-F和F1-R应包含基因XDH尾部和基因GFP头部的碱基序列，且二者等长并反向互补 P-F和P-R 催化目的基因片段和线性质粒片段之间发生同源重组 (3)优点：可同时对多个菌落进行鉴定，效率高；省去了提取基因组DNA和酶切鉴定的步骤，节约了时间和成本。缺点：模板中含有其他无关DNA序列，可能导致非特异性扩增；菌体可能热解不完全，部分DNA未充分暴露影响扩增效果；菌体热解后可能存在抑制PCR反应的物质 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）环状质粒经限制酶处理后会被切割开，从而可获得线性化质粒。因为DNA聚合酶是向引物的3'端添加脱氧核苷酸的，故PCR过程中，引物F1-F和F2-R的5'端应含有质粒的同源序列。 （2）分析图示，引物F2-F和F1-R用于基因XDH和基因GFP的融合扩增，故引物F2-F和F1-R应包含基因XDH尾部和GFP头部的碱基序列，且二者等长并反向互补。若要扩增线性化质粒，则需用的引物组合是P-F和P-R。在PCR体系中加入重组酶的作用是催化目的基因片段和线性质粒片段的同源重组，形成重组质粒。 （3）菌落PCR技术是利用菌体热解暴露的DNA为模板进行PCR扩增，因此可同时对多个菌落进行鉴定，效率高，且省去了提取基因组DNA和酶切鉴定的步骤，节约了时间和成本。但也可能存在模板含无关DNA序列导致非特异性扩增、菌体热解不完全影响扩增效果、菌体热解产生抑制PCR反应的物质等问题。 8．四甲基吡嗪（TTMP）是枯草芽孢杆菌的一种代谢产物，是影响白酒风味的重要物质。bdhA基因的表达产物是降低TTMP含量的关键酶，研究人员欲通过敲除枯草芽孢杆菌的bdhA基因提高TTMP产量。回答下列问题： (1)为获取枯草芽孢杆菌的纯净培养物E，可取少量枯草芽孢杆菌菌液接种到牛肉膏蛋白胨 （填“固体”或“液体”）培养基中，蛋白胨提供的主要营养是 。 (2)利用下图中的3对引物扩增出bdhA基因的上、下游片段和cat基因，将3种扩增产物和质粒1分别酶切后进行连接以获得质粒2。为使cat基因位于质粒2的上、下游片段之间，在设计引物5、6时，应在引物的 端分别加入限制酶 和 的识别序列。 (3)用质粒2转化菌株E时，可用 处理菌株E以提高转化的成功率。质粒2与菌株E的DNA发生同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与E中bdhA基因上、下游片段配对，并发生交换）使E的bdhA基因替换为cat基因。将转化处理的枯草芽孢杆菌置于含有 的培养基中以筛选出目的菌株E-。 (4)为检验E-的bdhA基因被成功敲除，以E-的基因组DNA为模板，选用引物 进行PCR，预期扩增只获得一种大小为 bp的DNA片段。对于PCR产物电泳结果符合预期的DNA片段，通常还需进一步通过基因测序确认，原因是 。为研究敲除bdhA基因是否影响菌株生长，可用接种环挑取E⁻后直接用 法进行接种，观察到菌落大小和形态与菌株E一致。 【答案】(1) 固体 碳源、氮源、维生素 (2) 5' BamHI XbaI (3) CaCl2 氯霉素 (4) 1和4 3117 电泳条带仅能显示扩增片段的大致长度，不能呈现碱基序列 平板划线 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）取少量枯草芽孢杆菌菌液接种到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，挑选单菌落，获得纯培养物；蛋白胨是将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外观呈淡黄色的粉剂，能为微生物提供碳源、氮源、维生素。 （2）为了在目的基因两侧加上限制酶识别序列，应在引物的5，端加上限制酶序列；结合图示可知，引物5、6扩增出的cat基因，同源替换到引物1、3扩增出的基因，需要相同的限制酶，引物1、3的两侧加入限制酶BamHI、XbaI的识别序列，因此引物5、6两侧应加入限制酶BamHI、XbaI的识别序列。 （3）CaCl2可以增加细胞膜的通透性，提高转化的成功率；E的bdhA基因替换为cat基因（氨苄青霉素抗性基因），将转化处理的枯草芽孢杆菌置于含有氨苄青霉素的培养基中以筛选出目的菌株E-（目的基因被破坏，替换成氨苄青霉素抗性基因）。 （4）选用引物1、4进行PCR，如果cat基因替换基因被敲除，则扩增出两边的序列长度为839+1540+738=3117；由于引物可能与其它地方发生配对，可能存在非特异性扩增，因此通常还需进一步通过基因测序确认；平板划线法是指用接种环在固体培养基表面连续划线，逐步使接种物随所划之线分散，便于形成单个菌落的操作。 题型3 基因工程操作 1．研究人员将编码OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四种不同的酶的四个基因分别与叶绿体转运肽 （引导合成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多基因表达载体（载体中部分序列如下图所示），利用农杆菌转化法转化水稻，在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列叙述不正确的是（    ） A．可用抗原-抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达量 B．四个基因转录时以 DNA 的不同条单链为模板 C．应选用含潮霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞 D．四个基因都在水稻叶绿体内进行转录翻译 【答案】D 【分析】1、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 2、目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。 3、将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞中染色体的DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。 【详解】A、可用抗原-抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达量，杂交带相对量越多，表明目的基因翻译成的蛋白质含量越高，A正确； B、由题图可知，在同一个T-DNA中OsGLO1启动子启动转录的方向与其他三个基因的不同，四个基因转录时不都以DNA的同一条单链为模板，B正确； C、卡那霉素抗性基因不在T-DNA中，而潮霉素抗性基因在T-DNA中，应选用含潮霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞，C正确； D、由题意知，利用农杆菌转化法转化水稻，可使目的基因插入到水稻细胞中染色体的DNA上，所以与叶绿体转运肽基因连接的四个基因，在水稻细胞核内进行转录，在核糖体中进行翻译，D错误。 故选D。 2．IL—2（白细胞介素—2）是一种具有抗肿瘤作用的细胞因子，B7是诱导特异性免疫的共刺激分子。研究通过在肿瘤细胞中表达IL—2或联合表达IL—2、B7，诱导机体产生抗肿瘤免疫应答，为IL—2基因治疗进入临床提供依据。回答下列问题： (1)重组逆转录病毒的构建（部分过程见图1、图2）：根据图11-1进行分析，对逆转录病毒载体及IL-2基因片段都使用 （填序号）酶处理（A．EcoRI  B．HindIII  C．HpaI  D．BamHI），并在 酶的作用下连接获得IL-2重组载体。先用 处理大肠杆菌细胞，再将重组载体导入，扩增后提取大肠杆菌DNA鉴定目的基因。利用上述限制酶进行酶切，由图2可知，IL-2基因已定向插入载体内，基因长度约为 bp。将IL-2重组载体转染至CRIP细胞（某种能被逆转录病毒感染的宿主细胞），在多孔细胞板进行 培养并筛选阳性细胞，收集含有IL—2病毒的上清液。 (2)IL-2基因导入肿瘤细胞及表达检测：取病毒上清液感染小鼠胰腺癌细胞，提取肿瘤细胞内 ，构建RT—PCR（逆转录聚合酶链式反应）体系，分析确定肿瘤细胞内IL-2基因是否正常插入到染色体DNA。 (3)B7基因导入肿瘤细胞及表达检测：再将B7基因导入上述转基因肿瘤细胞，培养后提取蛋白质，加入带有荧光染料的单克隆抗体，利用 技术检测B7基因的表达水平。 (4)体内致瘤性实验：将同品系小鼠分成3组，背部皮下注射 肿瘤细胞的小鼠作为对照组，皮下注射已导入IL-2基因的肿瘤细胞的小鼠以及已导入IL-2和B7双基因的肿瘤细胞的小鼠作为实验组，观察小鼠肿瘤的生长情况，根据下图可以得出结论： ① ；② 。 (5)分析与讨论：IL—2是重要的免疫调节细胞因子，能诱导T淋巴细胞的增殖。转基因肿瘤细胞通过细胞因子的分泌调节激活了小鼠体内的 免疫，使机体产生抗肿瘤免疫效应。 【答案】(1) AD DNA连接 Ca2+ 300 克隆化 (2)RNA (3)抗原—抗体杂交 (4) 导入空载体（或“未转基因”“未导入外源基因”） 与对照组比较，导入ⅡL−2基因的肿瘤细胞和导入IL−2和B7双基因肿瘤细胞的小鼠的肿瘤生长受抑制 导入Ⅱ−2和B7双基因肿瘤细胞的小鼠比只导入Ⅱ−2基因肿瘤细胞的小鼠的肿瘤生长受抑制程度更大，出现肿瘤的时间延迟 (5)细胞 【分析】基因工程需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）逆转录病毒载体上便于目的基因插入的限制酶有EcoR Ⅰ 、Hpa Ⅰ、Xho Ⅰ和BamH Ⅰ，IL-2基因片段及旁侧序列上有四个限制酶，分别是EcoR Ⅰ 、Hind Ⅲ 、Hpa Ⅰ和BamH Ⅰ，其中Hind Ⅲ 、Hpa Ⅰ位于基因内部，不能用于构建表达载体，所以选择逆转录病毒载体和IL-2基因片段共有的限制酶，即EcoR Ⅰ 和BamH Ⅰ。DNA连接酶能够能够将两个DNA片段连接起来，所以借助于DNA连接酶逆转录病毒载体及IL-2基因片段获得重组载体。将重组载体导入感受态大肠杆菌（用钙离子处理大肠杆菌），扩增后提取大肠杆菌DNA鉴定目的基因。比较图乙中空载体和重组载体的酶切图，重组载体比空载体多出300 bp的电泳条带，所以基因长度约为300 bp。将IL-2重组载体转染至CRIP细胞，在多孔细胞板进行克隆培养并筛选阳性细胞，收集含有IL-2病毒的上清液。 （2）IL-2基因导入肿瘤细胞及表达检测：取病毒上清液感染小鼠胰腺癌细胞，提取肿瘤细胞内RNA，构建RT-PCR（逆转录·聚合酶链式反应）体系，PCR结果利用琼脂糖凝胶电泳分析，确定肿瘤细胞内IL-2基因已正常转录。 （3） B7基因导入肿瘤细胞及表达检测：再将B7基因导入上述转基因肿瘤细胞，培养后提取蛋白质，加入单克隆抗体作探针，蛋白质之间存在相互作用，所以利用抗原-抗体杂交技术检测B7基因的表达水平。 （4）将同品系小鼠分成三组，背部皮下注射未导入外源基因肿瘤细胞的小鼠作为对照组，皮下注射导入IL−2基因的肿瘤细胞、导入lL−2和B7双基因的肿瘤细胞作为实验组，观察小鼠肿瘤的生长情况。图3横坐标是肿瘤细胞接种后的天数，纵坐标是肿瘤的平均直径。随着肿瘤接种后天数的增加，对照组、实验组（导入IL−2基因的肿瘤细胞及导入lL−2和B7双基因的肿瘤细胞）的肿瘤直径均增加，在相同时间内，两个实验组的肿瘤直径增加值均低于对照组，且导入IL−2和B7双基因的肿瘤细胞的直径增加值低于导入IL−2基因的肿瘤细胞的，由此可以得出结论：①与对照组比较，导入IL−2基因的肿瘤细胞和导入IL−2和B7双基因肿瘤细胞的小鼠的肿瘤生长受抑制；②导入IL−2和B7双基因肿瘤细胞的小鼠比只导入IL−2基因肿瘤细胞的小鼠的肿瘤生长受抑制程度更大，成瘤时间延迟。 （5）肿瘤的裂解要依赖于活化的细胞毒性T细胞，IL-2是重要的免疫调节细胞因子，能诱导T淋巴细胞的增殖。转基因肿瘤细胞通过细胞因子的分泌调节激活了小鼠体内的细胞免疫，使机体产生抗肿瘤免疫效应。 3．科学家从某细菌中提取抗盐基因，并将该基因转入烟草培育成转基因抗盐烟草。图1为培育转基因植株时选用的质粒载体的结构示意图，图2为抗盐基因的结构示意图。图中限制酶的识别序列均不同。据图分析，回答下列问题： (1)PCR过程中，需要在反应体系中加入的原料是 。利用PCR技术扩增抗盐基因时，需要在两种引物的 （填“5′”或“3′”）端分别加上限制酶识别序列。一个目的基因利用PCR进行扩增时，循环n次，共需要消耗引物 个。 (2)利用农杆菌转化法将重组质粒导入植物细胞时，有两次导入和两次拼接，其中第一次导入是指 ，第二次拼接是指 。转化成功后，通过 技术获得转基因植株。 (3)根据质粒和目的基因的结构示意图分析，构建基因表达载体时需要选用的限制酶是 ，这样选择的理由是 。 (4)将目的基因导入受体细胞时，一般不将目的基因整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上，原因是 。 【答案】(1) 四种脱氧核苷酸 5′ 2n+1-2 (2) 将含有目的基因的Ti质粒导入农杆菌 将插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上 植物组织培养 (3) HindⅢ和NcoⅠ 质粒和含有目的基因的片段上都含有这两种酶的识别位点，并且切割后产生的黏性末端不同，连接时不会出现自身环化现象，而限制酶BamHⅠ会破坏质粒上所有的标记基因，不宜采用 (4)如果将目的基因整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上，细胞分裂时可能导致目的基因丢失，不能稳定遗传 【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）PCR过程中，需要在反应体系中加入四种脱氧核苷酸作为原料。利用PCR技术扩增抗盐基因时，在引物的5′端加上限制酶识别序列。PCR循环n次，共得到2n个DNA分子，除最初的两条DNA单链，每新合成一条DNA单链需要消耗一个引物，所以共需要消耗（2n+1-2）个引物。 （2）农杆菌转化法中包括两次导入、两次拼接。第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌；第二次导入是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接是指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上。将重组质粒导入植物细胞后，通过植物组织培养技术获得转基因植株。 （3）利用图中质粒和目的基因构建基因表达载体时，最好选用限制酶HindⅢ和NcoⅠ分别切割质粒和含有目的基因的DNA片段，因为质粒和含有目的基因的片段上都含有这两种限制酶的识别位点，并且切割后产生的黏性末端不同，连接时不会出现自身环化现象，而BamHⅠ会破坏质粒上所有的标记基因，不宜采用。 （4）将目的基因导入受体细胞时，如果将目的基因整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上，由于在减数分裂时，细胞质中的结构随机移动，导致形成的生殖细胞不一定含有目的基因，细胞分裂时可能导致目的基因丢失，不能稳定遗传。 4．利用敲除特定基因的模型小鼠进行实验，能够大幅提高实验数据的可靠性。Cre-LoxP系统是常用的基因敲、除工具，它由Cre蛋白和LoxP序列两部分组成，Cre蛋白可识别双链DNA分子中特定的LoxP序列，当DNA分子上存在两个同向LoxP序列时，Cre蛋白可将两个LoxP序列之间的DNA序列剪除，切口连接形成的环化产物被降解，从而达到敲除特定基因的目的，示意图如下。 (1)Cre蛋白的作用类似于基因工程中使用的 ，该酶切断的化学键是 。 (2)细胞膜上的CD36蛋白在脂质代谢中有重要作用。为进一步研究CD36蛋白的功能，研究者用Cre-Lox系统构建在肝细胞中特异性敲除CD36基因的小鼠，并对敲除结果进行检验，部分流程见下图。Alb是添加在Cre编码序列上游的特异性启动子，它的作用是 。③中Cre阳性-Flox杂合小鼠肝细胞中表达的蛋白质有 （填“CD36蛋白”“Cre蛋白”或“CD36蛋白和Cre蛋白”）。符合要求的肝特异性CD36基因敲除小鼠最早可在子 代出现。 (3)能说明在肝细胞中特异性敲除CD36基因的小鼠构建成功了的证据有___________。 A．小鼠不同组织中提取的DNA可检测到Cre序列 B．小鼠肝细胞中CD36基因的mRNA含量基本为零 C．在小鼠肝细胞提取物中检测不到CD36蛋白 D．在小鼠肝脏、心肌和肾脏组织提取物中CD36蛋白含量无明显差异 【答案】(1) 限制性内切核酸酶 磷酸二酯键 (2) 作为RNA聚合酶识别和结合的部位，只在肝细胞中驱动Cre编码序列转录 CD36蛋白和Cre蛋白 二 (3)BC 【分析】基因工程的基本步骤：（1）获取目的基因（从基因组文库中获取或、利用PCR技术扩增目的基因）；（2）基因表达载体的构建（这也是基因工程的核心）；（3）将目的基因导入受体细胞（植物、动物、微生物）；（4）目的基因的检测与鉴定 （DNA分子杂交技术,分子杂交技术、抗原抗体杂交）。 【详解】（1）Cre蛋白可将两个LoxP序列之间的DNA序列剪除，类似于基因工程中使用的限制性内切核酸酶；该酶切断的是磷酸二酯键。 （2）启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点。它是RNA聚合酶识别和结合的部位，只在肝细胞中驱动Cre编码序列转录； Cre蛋白可将两个LoxP序列之间的DNA序列剪除，结合图示可知，③中Cre阳性-Flox杂合小鼠肝细胞中有Alb-Cre编码序列可以编码Cre蛋白，Cre蛋白可以剪切两个LoxP序列之间的CD36基因，③中Cre阳性-Flox杂合小鼠肝细胞中有CD36基因可以表达CD36蛋白，故③中Cre阳性-Flox杂合小鼠肝细胞中表达的蛋白质有CD36蛋白和Cre蛋白；符合要求的肝特异性CD36基因敲除小鼠最早可在子二代中出现，其中只有Alb-Cre编码序列和Lox P-CD36 基因-Lox P序列，相当于获得了肝特异性CD36基因敲除目标小鼠。 （3）A、在肝细胞中特异性敲除CD36基因的小鼠构建成功，说明只需要在肝细胞中表达Cre基因，不同组织中提取的DNA可检测到Cre序列不能说明其只在肝脏细胞中表达，A错误； B、小鼠肝细胞中CD36基因的mRNA含量基本为零，说明CD36基因被剪切，B正确； C、在小鼠肝细胞提取物中检测不到CD36蛋白，说明CD36基因被敲除，C正确； D、在小鼠肝脏、心肌和肾脏组织提取物中CD36蛋白含量无明显差异，说明CD36基因未在肝脏细胞中被敲除，D错误。 故选BC。 5．研究发现实体肿瘤内部通常是缺氧环境，蓖麻毒紫蛋白(RTA)可作用于核糖体，使蛋白合成受阻，从而引起细胞死亡。TAT是一种短肽，可转导蛋白进入细胞，含有氧依赖性降解区域00D(多肽)的融合蛋白可以适应低氧条件稳定存在，但在常氧条件下会被蛋白酚降解。科研人员以RTA作为抑制肿瘤细胞增殖的活性分子，利用TAT的作用将融合蛋白转运进入肿瘤细胞，并利用ODD的作用减轻RTA 对正常细胞的毒性,分别构建了含TAT-RTA(660bp)和 TAT-RTA-ODD(870bp)融合基因的表达载体，并成功得到相关融合蛋白。 (1)可通过PCR技术获取TAT-RTA融合基因，前提是根据TAT 和RTA基因设计引物，引物的作用是 。已知RTA基因部分序列如图1(a)所示：TAT 基因编码链序列为5' ATGAGCTACGGCCGTAAAAGAGACGCCAACGTACA 3': 欲得到TAT-RTA 融合基因的结构如图1(b)所示。为顺利构建表达载体，除图示外，还需具有 结构。且需在引物1、2的 端分别加入 酶切位点：要求在RTA 蛋白的前端引入TAT短肽，则引物2的前12个碱基序列为 A．5' GGATCCATGAGC 3'           B．S' GGATCCATCTTC 3' C． 5' GGATCCTACTCG 3'           D．S' CTCGAGATGAGC 3' (2)载体的部分结构如图2所示，His标签由连续的6个组氨酸构成，可用于对重组融合蛋白进行分离纯化。将PCR 得到的TAT-RTA 融合基因和载体双酶切后，再用 酶连接。但在研究时发现融合蛋白中没有 His标签蛋白。据图分析原因很可能是 ，导致 His标签基因对应的mRNA的密码子被错位读取。 (3)科研人员将得到的重组融合蛋白经腹腔给药忠实体肿瘤的小鼠，发现TAT-RTA 和 TAT-RTA-ODD融台蛋白都可以抑制患实体肿瘤小鼠肿瘤体积的增长，但TAT-RTA-ODD 的抑制效果更好，产生该实验结果的原因是 。 【答案】(1) 与模板DNA单链互补配对，并且使Taq酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 复制原点、标记基因 5′ Xbo Ⅰ 、BamH Ⅰ（顺序不能颠倒） A (2) DNA连接 限制酶2识别序列后面的一个碱基A与His标签基因编码链的前两个碱基CA编码一个氨基酸，导致His标签基因对应的mRNA的密码子被错位读取 (3)含有氧依赖性降解区域ODD（多肽）的融合蛋白可以适应肿瘤内部低氧条件稳定存在，从而更好地抑制肿瘤体积增长 【分析】多聚酶链式反应扩增DNA片段：（1）PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4中游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。（2）PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 【详解】（1） PCR中，引物的作用是与模板DNA单链互补配对实现连接，并且使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸；表达载体有利于目的基因的转入和表达，除图示外，还需具有复制原点、标记基因等；据图1可知，TAT-RTA融合基因TAT靠近启动子一侧有BamHⅠ的位点，RTA靠近终止子一侧有XboⅠ的位点，则引物2的 5′端加入BamHⅠ，引物1的5′端加入XboⅠ；TAT基因编码链序列5'ATGAGCTACGGCCGTAAAAAGAGACGCCAACGTAGA3′，由于其5'端需插入BamHⅠ的识别位点，根据碱基互补配对原则可知，其对应的引物的5'端应包含BamHⅠ的识别序列，故设计为5'GGATCCATGAGC3'，以便BamH Ⅰ切出相应的黏性末端，故选A。 （2）切割后的DNA片段需要用DNA连接酶连接成完整DNA分子；由图2可知， 限制酶2识别序列与His标签序之间多出一个碱基A，这一个碱基A与His标签基因编码链的前两个碱基CA编码一个氨基酸，导致His标签基因对应的mRNA的密码子被错位读取，导致不能正确编码出His标签蛋白。 （3） 由图3可知，较对照组而言，TAT+RTA和TAT+RTA+ODD组的荷瘤小鼠肿瘤体积较小，且TAT+RTA+ODD组的荷瘤小鼠肿瘤体积最小，说明TAT+RTA和TAT+RTA+ODD均能抑制肿瘤体积增大，其中后者抑制效果更显著。产生该实验结果的原因是TAT将融合蛋白转运进入肿瘤细胞，RTA可作用于核糖体，使蛋白合成受阻，从而引起细胞死亡，而ODD可以适应低氧条件稳定存在，实体肿瘤内部通常是缺氧的环境，所以ODD可以在肿瘤细胞中正常发挥作用，更好地抑制肿瘤体积增长，使抗肿瘤效果更加显著。 6．PZA肽是一种“自我剪切”肽，能够使融合蛋白通过P2A肽的自我切割分离产生多种蛋白质独立行使各自功能（如图1）。水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因（如图2）的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为实现可视化监测，科学家将斑马鱼的vtg基因，与人工构建的载体（如图3）连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼。图3中Luc表示萤火虫荧光素酶基因，可以催化荧光素氧化产生荧光，已知载体中Luc基因缺乏启动子序列，vtg基因内部无图3中任何限制酶识别序列，请回答下列问题：    注：图3中Ampr为氨苄青霉素抗性基因，ori为复制起点，BamHI、EcoRI、Hindl、BsrGI为限制酶，→表示转录方向。 (1)根据题目信息，在重组载体中，图1中基因1对应的是 基因。 (2)为降低“空载”概率，构建vtg-Luc基因重组载体时应选用限制酶 切割Luc基因载体。 (3)通过PCR技术获取vtg基因时，需设计合适的引物。依据图1、图2信息，推测引物1包含的碱基序列为________。 A．5'-AACTAT-3' B．5'-GAATTCAACTAT-3' C．5'-TTGATA-3' D．5'-AAGCTTAACTAT-3' (4)将“vtg-Luc基因重组载体”导入大肠杆菌中进行扩增，为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含 的培养基中；若要判断斑马鱼转基因是否成功，可在水体中添加 进行检测。 【答案】(1)vtg基因 (2)EcoRI、HindⅢ (3)B (4) 氨苄青霉素 雌激素 荧光素 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞（显微注射法、农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、钙离子处理法）； （4）目的基因的检测与鉴定（分子水平和个体水平检测，前者包括DNA分子杂交、分子杂交和抗原抗体杂交；后者如抗虫抗病接种实验）。 【详解】（1）为实现可视化监测，科学家将斑马鱼的vtg基因，与人工构建的载体（如图3）连接，形成vtg-Luc基因重组载体，所以图1中基因1对应的是vtg基因。 （2）为降低“空载”概率,需要选用双酶切法，根据图3信息可知基因载体存在2个BamH Ⅰ酶切位点，不能使用，BsrG Ⅰ会把P2A序列切掉，因此也不能使用。所以使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，选用限制酶EcoR Ⅰ与Hind Ⅲ， （3）ABCD、依据图1推测引物1是以3’-TTGATA-5’为模板的，并与其互补，所以引物1碱基序列中应该含有5’ -AACTAT-3 ’，以及EcoR Ⅰ的识别序列（5’ -GAATTC-3 ’），故引物1包含的碱基序列为5’ -GAATTCAACTAT-3 ’，B符合题意，ACD不符合题意。 故选B。 （4）vtg-Luc基因重组载体中含Ampr抗性基因与Luc荧光素酶基因，所以将“vtg-Luc基因重组载体”导入大肠杆菌中进行扩增，为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基中。若要判断斑马鱼转基因是否成功，可在水体中添加雌激素，因为雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白从而激活vtg-Luc基因重组载体在转基因斑马鱼细胞中的表达。利用-Luc基因表达出的荧光素酶催化荧光素氧化产生荧光，以此实现判断斑马鱼转基因是否成功的目的，故水体中需要添加雌激素和荧光素。 题型4 疾病诊断与基因治疗 1．重症联合免疫缺陷（SCID）是一类免疫缺陷病，目前已发现15种基因突变类型，最常见的是由编码腺苷脱氨酶（ADA）的基因的碱基对替换，引起淋巴细胞增殖异常，导致体液免疫和细胞免疫缺陷（具体机理如图）。绝大部分SCID患儿表现为淋巴细胞减少症，若不及时治疗，患儿通常在2岁内死亡。下列分析错误的是（    ） 注：“+”表示促进，“－”表示抑制。 A．SCID有多种突变类型体现了基因突变的普遍性 B．ADA基因突变可能改变腺苷脱氨酶的氨基酸数目 C．ADA基因突变导致dATP含量升高，抑制淋巴细胞增殖 D．通过基因治疗的方法可根治SCID 【答案】A 【分析】免疫缺陷病是指由机体免疫功能不足或缺乏而引起的疾病。该病分为两类，一类是由于遗传而生来就有免疫缺陷的，叫作先天性免疫缺陷病，如重症联合免疫缺陷病，该病是由与淋巴细胞发育有关的基因突变或缺陷引起，患者多为新生儿和婴幼儿，他们存在严重的体液免疫和细胞免疫缺陷，任何一种病原体感染，对他们都是致命的。另 一类是由疾病和其他因素引起的，叫作获得性免疫缺陷病，如艾滋病。大多数免疫缺陷病都属于获得性免疫缺陷病。 【详解】A、SCID有多种突变类型体现了基因突变的随机性，A错误； B、编码腺苷脱氨酶（ADA）的基因的碱基对替换，可能导致终止密码子提前出现，则ADA基因突变可能改变腺苷脱氨酶的氨基酸数目，B正确； C、ADA基因突变导致dATP含量升高，导致体液免疫和细胞免疫缺陷，可能是抑制了淋巴细胞增殖，C正确； D、基因治疗的目的是使编码脱氨基腺苷酶的基因表达，能合成ADA，通过基因治疗的方法可根治SCID，D正确。 故选A。 2．肿瘤细胞表面的PD-L1蛋白与T细胞表面的受体蛋白PD-1结合，抑制T细胞的活化和增殖，使得肿瘤细胞开启免疫逃逸。为了达到更好的癌症治疗效果，科研人员对此开展系列研究。 (1)机体能通过 免疫杀伤癌细胞，该过程体现了免疫系统的 功能。 (2)科研人员欲通过基因编辑技术（CRISPR-Cas9）敲除T细胞表面的受体蛋白PD-1基因，以达到治疗癌症的目的。 ①基因编辑CRISPR-Cas9技术系统主要由人工设计的gRNA和Cas9蛋白组成，gRNA可与靶序列特异性结合，Cas9蛋白对靶序列所在DNA进行剪切，gRNA和Cas9蛋白复合体的功能类似于 酶。 ②科研人员设计的gRNA能靶向识别PD-1蛋白基因，与携带Cas9基因的PX330质粒构建gRNA重组质粒。其中PX330质粒部分碱基序列及Bbs1限制酶识别序列如图1所示。 据图1分析，限制酶Bhs1切割后质粒b处黏性末端序列（5’→3’）为 。 (3)研究人员以不同的方式处理黑色素肿瘤小鼠（如图2）。 其中注射物Ⅰ为 ，组6的作用为 。图2结果说明 。 (4)CRISPR-Cas9编辑T细胞为肿瘤治疗提供了新思路，有人说“科学技术是一把双刃剑，应当审慎地使用基因编辑技术。”请你辩证分析基因编辑技术可能带来的影响 。 【答案】(1) 细胞 免疫监视 (2) 限制酶/限制性核酸内切酶 G-T-T-T- (3) PX330或空质粒 作为对照，检测基因编辑治疗癌症的效果 淋巴结注射gRNA重组质粒可显著治疗癌症，效果好于肌肉注射和抗体治疗 (4)有利方面：疾病治疗、作物改良、酶的结构改造等…潜在风险：脱靶（误切割）带来的新的未知基因突变或癌变；安全和伦理问题 【分析】基因治疗是把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。大部分基因治疗的临床试验，都是先从病人体内获得某种细胞，进行培养。然后在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩增培养，最后重新输入患者体内，称为体外基因治疗。直接向人体组织细胞中转移基因的治病方法叫体内基因治疗。 【详解】（1）机体杀伤癌细胞依靠细胞免疫过程；免疫系统有三大功能，即免疫防御、免疫自稳和免疫监视，其中监视并清除体内出现的衰老、破损细胞以及癌细胞等异常细胞属于免疫监视功能。 （2）基因编辑CRISPR - Cas9技术中，gRNA与靶序列特异性结合，Cas9蛋白对靶序列所在DNA进行剪切，其功能类似限制酶（限制性核酸内切酶）。 由图1可知，限制酶Bbs1的识别序列是G - G - A - C - T，且切割位点在识别序列的下游，根据DNA单链的5' - 3'方向，切割后质粒5'黏性末端的序列为G - T - T - T - 。 （3）该实验设置了不同处理组，要探究基因编辑治疗癌症的效果，需要有空白对照组，即注射不含gRNA重组质粒的PX330空质粒。 图2中注射物2没有经过基因编辑处理，其作用是作为对照，检测基因编辑治疗癌症的效果。 从图2结果看，淋巴结注射gRNA重组质粒组的肿瘤相对体积明显小于其他组，说明淋巴结注射gRNA重组质粒可显著治疗癌症，效果好于肌肉注射和抗体治疗。 （4）从有利方面考虑，基因编辑技术可以用于疾病治疗，例如对一些遗传疾病进行基因修正；在作物改良上，通过编辑相关基因可以使作物具有更好的抗逆性、更高的产量等；还可以用于酶的结构改造，提高酶的性能等。 从潜在风险方面看，基因编辑过程中可能会出现脱靶（误切割）现象，从而带来新的未知基因突变甚至可能引发癌变；同时也会引发一系列安全和伦理问题，比如对人类生殖细胞进行基因编辑可能改变人类的基因库等。 试卷第18页，共19页 22 / 22 学科网（北京）股份有限公司 $$ 押题04 分子遗传学与基因工程 猜押 4大题型 题型01表观遗传 题型02PCR技术原理与应用 题型03 基因工程操作 题型04 疾病诊断与基因治疗 猜押考点 3年真题 考情分析 押题依据 细胞分子组成及结构 2024年安徽卷·第11题2024年安徽卷·第19题 2024年安徽卷·第20题 2025年新高考生物新结构体系下，分子遗传学与基因工程板块注重实验设计与实际应用。命题呈现基础理论与技术前沿相结合的特点，并与细胞工程、生物进化等模块联动，强调知识迁移能力。实验题占比突出，要求学生具备技术原理理解与伦理辨析能力。 题目更加注重综合性、应用性、创新性，对知识点的背景和应用有更多的掌握。 当前《生物安全法》实施背景下，转基因作物生态风险、基因编辑伦理争议可能成为命题切入点，安徽本地农业科技案例（如抗虫棉推广）或与基因编辑技术结合考查。需强化“技术原理-操作流程-结果分析”的完整思维链训练。 题型1 表观遗传 1．秀丽隐杆线虫生长发育过程由lin-4和lin-14基因调控，lin-4基因转录产生的miRNA能够与lin-14基因转录产生的mRNA部分互补，从而调节lin-14基因的表达。秀丽隐杆线虫不同发育阶段lin-4和lin-14基因的表达量如下图所示，下列有关推测不合理的是（　　） A．lin-14基因编码的产物对线虫的成熟具有抑制作用 B．lin-4基因编码的miRNA能抑制lin-14基因的翻译 C．miRNA调控遗传信息的表达属于一种表观遗传现象 D．lin-4基因缺失突变的秀丽隐杆线虫生长发育会提前 2．miRNA是一类长度约为20~24个核苷酸的非编码RNA，与靶mRNA结合后，使其稳定性下降，从而易于被降解。下列叙述正确的是（　　） A．miRNA通过阻碍基因的转录从而调控基因的表达 B．miRNA和靶mRNA通过磷酸二酯键结合形成局部双链 C．miRNA调控和DNA甲基化都会改变基因的碱基序列 D．miRNA调控和DNA甲基化均可导致个体表型发生可遗传变化 3．siRNA是一类长度为21~25bp的双链RNA分子，已广泛用于RNA干扰（RNAi）技术，其部分作用机制如图所示。下列说法错误的是（　　） 注：Dicer是一种核糖核酸内切酶，RISC（RNA诱导沉默复合体）是一种由siRNA、Argonaute蛋白和Dicer复合形成的复合体 A．外源siRNA递送进入靶细胞的过程需要消耗能量 B．若把外源siRNA的一条链送入细胞内，可能不会产生RNA干扰现象 C．该种RNAi技术和DNA的甲基化是在同一水平上抑制基因表达的 D．利用RNAi技术可以抑制某些病毒基因的表达，从而控制病毒的增殖 4．人细胞中 Rb编码的蛋白（pRB）通过结合转录因子抑制 DNA 合成相关酶类。当细胞受到生长信号刺激时，pRB被CDK（细胞周期依赖性激酶）磷酸化后失去原有活性，进而使细胞进入细胞周期。研究发现：①人13号染色体13q14区段丢失后，细胞中不存在pRB，人患成视网膜细胞瘤等疾病；②Rb某部位的高度甲基化会导致其转录沉默；③遗传性成视网膜细胞瘤患者的 Rb所编码的产物不具有生物活性。据此分析，下列说法错误的是（    ） A．Rb属于抑癌基因，位于13号染色体的13q14区段 B．导致 Rb转录沉默的高度甲基化发生在启动子、终止子部位 C．pRB的去磷酸化可抑制核 DNA 的复制，使细胞停留在G1期 D．Rb中碱基对的缺失、增添或替换可使人患遗传性成视网膜细胞瘤 5．我国科研人员发现了肠癌DNA甲基化调控的新机制，为肠癌的早期检测和治疗提供了新思路，相关机制如图所示。另有多项研究结果表明维生素C能够促进TET2蛋白的活性。据图分析，下列叙述错误的是（    ）    A．抑癌基因表达的蛋白质能抑制细胞的生长和增殖，或者促进细胞凋亡 B．发生甲基化的上游序列可能是启动子，会影响转录过程，从而影响基因的表达 C．TET2在核糖体上合成，可通过核孔进入细胞核，需要β-catenin蛋白，不需要能量 D．β-catenin激活剂和维生素C联合使用有望为肠癌治疗提供新思路 6．某些植物需要经过低温诱导才能开花的现象称为春化作用，与FRI和FLC基因有关。温暖条件下，FRI蛋白与FLC基因结合使其表达，抑制植物开花；低温条件下，FRI蛋白在细胞内凝聚成团不与FLC基因结合，同时通过组蛋白修饰的调整抑制FLC基因的表达。下列说法正确的是（    ） A．春化作用的原理可能是低温通过抑制FRI基因的表达，解除对开花过程的抑制 B．组蛋白不是遗传物质，其乙酰化引起的植物表型改变是不会遗传给后代的 C．低温条件下，组蛋白氨基酸序列发生改变而凝聚成团，FRI蛋白的含量升高 D．温暖条件下，FRI蛋白使FLC基因的组蛋白乙酰化，促进FLC基因的表达 7．基因印记是指受精卵形成过程中，来源于父亲或者来源于母亲的等位基因被修饰后，该印记导致下一代仅仅表达父源或者母源等位基因。这种修饰常为DNA甲基化修饰等，也包括组蛋白乙酰化、甲基化等修饰。 (1)研究发现某种小鼠有体型正常（N）和体型矮小（n）两种类型，N基因可根据亲代的不同而有不同的表达，表现出“基因印记”现象，如图为相关实验。 ①基因组印记中的DNA甲基化修饰、组蛋白修饰等，使得基因表达和表型变化可遗传，这种现象属于 。 ②由实验结果可知，F2个体不被表达的N基因可能来自其亲本F1中的 。 ③F2中体型正常的雌雄鼠自由交配，后代体型正常的概率为 。 (2)进一步研究发现，小鼠个体在生殖细胞形成早期，来自父方和母方的印记将全部被消除，精子和卵子形成时产生新的甲基化模式。此模式导致只有同时具有精子和卵细胞的细胞核的胚胎才能正常发育，具有两套母本基因组或两套父本基因组的“受精卵”不能正常发育成小鼠。某研究团队通过改变小鼠生殖细胞的“基因印记”使其“变性”，然后将一个极体注入修饰后的次级卵母细胞（类似受精作用），最终创造出“孤雌生殖”的小鼠。实验过程如下图所示。 ①图中囊胚进一步发育会出现 现象，否则胚胎无法继续发育；将极体注入修饰后的次级卵母细胞并融合，类似受精作用，该操作能成功创造孤雌小鼠，依赖的原理是 。 ②从打破基因印记对孤雌生殖的阻碍这个角度看，这些操作的目的是去除或改变阻碍孤雌生殖的基因印记，模拟 过程中基因表达所需的甲基化状态。 ③有人认为“孤雌小鼠”诞生过程没有精子参与，其核基因型与提供卵母细胞的雌鼠相同。请结合图中信息，分析该观点错误的原因： 。 题型2 PCR技术原理与应用 1．研究人员利用PCR技术体外扩增基因A．下列叙述错误的是（    ） A．PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度控制PCR进程 B．Taq DNA聚合酶从基因A模板链的5′端到3′端方向催化子链的合成 C．PCR中使用的一对引物的碱基数量可以不同，一般为20~30个核苷酸 D．PCR反应体系加入的扩增缓冲液中一般要添加Mg2+ 2．以T-DNA 作载体将某突变基因导入拟南芥的染色体DNA时，可出现三种结果：仍为野生型（导入失败）、突变杂合子（在一对同源染色体上只导入1个突变基因）及突变纯合子。研究人员用引物LP、RP 和BP对甲、乙、丙三株拟南芥进行核酸电泳检测，结果如下图。下列说法错误的是（    ） A．PCR 时，脱氧核苷酸最初添加在引物的3'端 B．模板链过长时无 PCR产物 C．乙为突变纯合子 D．丙自交后代的核酸电泳结果与丙相同 3．转基因抗虫棉的Bt蛋白在细胞质积累，可能与内源蛋白相互作用，产生非期望效应。C蛋白能结合纤维素，科研人员将C基因与Bt基因连接构建融合基因（如图）导入棉花细胞。相关叙述正确的是（    ） A．使用DNA聚合酶催化C基因和Bt基因连接 B．选择引物2和4进行PCR以确定基因正确连接 C．可通过花粉管通道法将融合基因导入棉花细胞 D．融合基因表达可促进Bt蛋白在细胞膜定向积累 4．目的基因A含有100对碱基，其中腺嘌呤占30%，现利用目的基因A片段两侧的特异性序列设计引物I、引物Ⅱ，用PCR技术扩增该目的基因，结构如下图所示。PCR扩增共循环50次。下列说法错误的是（　　）    A．PCR仪实质上是一台温度自动调控仪器，循环50次理论上复制50代 B．含目的基因A的DNA片段经PCR循环50次，需要两种引物共250个 C．PCR过程与体内DNA复制的方式相同，但是只需要一种酶的参与 D．若只考虑目的基因A，经PCR循环50次需要鸟嘌呤(250-1)×40个 5．为制备带有荧光标记的DNA探针，研究人员在反应系统内只添加了DNA聚合酶、缓冲液、H2O和4种dNTP（dN—Pα～Pβ～Pγ，其中dGTP被荧光标记）的反应管①～③中分别加入适量单链DNA（如图）。形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。下列分析正确的是（    ） 反应管①：5′-GGCTATAGCCAGA-3′ 反应管②：5′-GTTTCGCGATGGC-3′；3′-AGCGCTACCGATG-5′ 反应管③：5′-CCAGGAGATTGC-3′；3′-CCTCTAACGATC-5′ A．实验中需要用荧光物质对dGTP的γ位磷酸基团进行标记 B．DNA聚合酶沿模板链将dNTP逐个连接到引物的5′端 C．反应管②的反应系统内因缺乏模板或引物不能进行PCR扩增 D．实验结束后，能得到带有荧光标记DNA探针的反应管只有③ 6．油菜素内酯（BR）对水稻具有多重效应。施加BR可导致籽粒数减少，千粒重增大，全局性BR缺失能导致籽粒数增加，千粒重下降。研究人员借助神舟飞船，将某非簇生稻培育成簇生稻（如图1），其籽粒数量增加，但千粒重不变。 回答下列问题： (1)研究人员推测簇生稻能提高产量，其依据是 。 (2)为探明簇生稻簇生机制，研究人员提取簇生稻DNA，测序后与 中的非簇生稻DNA序列比对，发现BRD3基因存在差异。提取簇生稻的核酸，DNA酶处理后与RNA探针杂交，检测结果如表所示。 样本来源 幼嫩稻穗 幼嫩叶片 成熟稻穗 成熟叶片 杂交结果 + - - - 注：“＋”表示存在双链RNA，“-”表示不存在双链RNA 探针杂交结果表明簇生稻中，BRD3基因的表达具有 特异性。检测发现仅幼嫩稻穗BR含量下降，其余部位与非簇生稻含量无显著差异。推测簇生稻的BRD3基因的表达产物具有 作用。 (3)PCR扩增时需设计引物，引物的特点有哪些？ （A．序列的特异性 B．引物内部不会形成双链结构 C．引物间不会形成双链结构）。利用PCR技术对簇生稻和非簇生稻植株BRD3基因上游DNA片段进行扩增，图3为所用引物位置，检测结果如图4所示。 由图示结果推测，相对于非簇生稻植株，簇生稻植株的BRD3基因上游A区域可能发生了碱基序列的 ，B区域可能发生了碱基序列的 。 7．木糖醇作为一种重要的功能性甜味剂，在食品和医药领域应用广泛。同源重组法是构建基因表达载体的重要方法，其原理是带有相似序列的DNA分子之间可以发生同源重组。某科研小组先将质粒线性化后，分别对木糖醇脱氢酶基因（XDH）、绿色荧光蛋白基因（GFP）和线性化载体进行PCR扩增（通过引物引入同源序列），再将得到的目的基因片段和线性质粒片段进行同源重组，构建表达载体，其过程如图所示，回答下列问题： 注：图中“→”表示PCR引物；条纹或颜色相同的序列表示同源序列或相同序列；KanR表示卡那霉素抗性基因。 (1)利用同源重组法构建基因表达载体的过程中，环状质粒经 处理后可获得线性化的质粒，PCR扩增目的产物片段的过程中，图中引物 的 端应含有质粒的同源序列，以便进行同源重组。 (2)据图分析，引物F2-F和F1-R的碱基序列应具有的特点有 。PCR扩增线性化质粒的过程中所用的引物组合是 ；向PCR产物片段和线性载体的混合体系中加入重组酶的作用可能是 。 (3)实验小组检测大肠杆菌中是否导入重组质粒时，会先挑取单个菌落，再通过热处理使细菌的细胞壁和细胞膜裂解，并直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，这种技术称为菌落PCR技术。与常规PCR相比，菌落PCR的优点和缺点是 （各列举1例）。 8．四甲基吡嗪（TTMP）是枯草芽孢杆菌的一种代谢产物，是影响白酒风味的重要物质。bdhA基因的表达产物是降低TTMP含量的关键酶，研究人员欲通过敲除枯草芽孢杆菌的bdhA基因提高TTMP产量。回答下列问题： (1)为获取枯草芽孢杆菌的纯净培养物E，可取少量枯草芽孢杆菌菌液接种到牛肉膏蛋白胨 （填“固体”或“液体”）培养基中，蛋白胨提供的主要营养是 。 (2)利用下图中的3对引物扩增出bdhA基因的上、下游片段和cat基因，将3种扩增产物和质粒1分别酶切后进行连接以获得质粒2。为使cat基因位于质粒2的上、下游片段之间，在设计引物5、6时，应在引物的 端分别加入限制酶 和 的识别序列。 (3)用质粒2转化菌株E时，可用 处理菌株E以提高转化的成功率。质粒2与菌株E的DNA发生同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与E中bdhA基因上、下游片段配对，并发生交换）使E的bdhA基因替换为cat基因。将转化处理的枯草芽孢杆菌置于含有 的培养基中以筛选出目的菌株E-。 (4)为检验E-的bdhA基因被成功敲除，以E-的基因组DNA为模板，选用引物 进行PCR，预期扩增只获得一种大小为 bp的DNA片段。对于PCR产物电泳结果符合预期的DNA片段，通常还需进一步通过基因测序确认，原因是 。为研究敲除bdhA基因是否影响菌株生长，可用接种环挑取E⁻后直接用 法进行接种，观察到菌落大小和形态与菌株E一致。 题型3 基因工程操作 1．研究人员将编码OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四种不同的酶的四个基因分别与叶绿体转运肽 （引导合成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多基因表达载体（载体中部分序列如下图所示），利用农杆菌转化法转化水稻，在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列叙述不正确的是（    ） A．可用抗原-抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达量 B．四个基因转录时以 DNA 的不同条单链为模板 C．应选用含潮霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞 D．四个基因都在水稻叶绿体内进行转录翻译 2．IL—2（白细胞介素—2）是一种具有抗肿瘤作用的细胞因子，B7是诱导特异性免疫的共刺激分子。研究通过在肿瘤细胞中表达IL—2或联合表达IL—2、B7，诱导机体产生抗肿瘤免疫应答，为IL—2基因治疗进入临床提供依据。回答下列问题： (1)重组逆转录病毒的构建（部分过程见图1、图2）：根据图11-1进行分析，对逆转录病毒载体及IL-2基因片段都使用 （填序号）酶处理（A．EcoRI  B．HindIII  C．HpaI  D．BamHI），并在 酶的作用下连接获得IL-2重组载体。先用 处理大肠杆菌细胞，再将重组载体导入，扩增后提取大肠杆菌DNA鉴定目的基因。利用上述限制酶进行酶切，由图2可知，IL-2基因已定向插入载体内，基因长度约为 bp。将IL-2重组载体转染至CRIP细胞（某种能被逆转录病毒感染的宿主细胞），在多孔细胞板进行 培养并筛选阳性细胞，收集含有IL—2病毒的上清液。 (2)IL-2基因导入肿瘤细胞及表达检测：取病毒上清液感染小鼠胰腺癌细胞，提取肿瘤细胞内 ，构建RT—PCR（逆转录聚合酶链式反应）体系，分析确定肿瘤细胞内IL-2基因是否正常插入到染色体DNA。 (3)B7基因导入肿瘤细胞及表达检测：再将B7基因导入上述转基因肿瘤细胞，培养后提取蛋白质，加入带有荧光染料的单克隆抗体，利用 技术检测B7基因的表达水平。 (4)体内致瘤性实验：将同品系小鼠分成3组，背部皮下注射 肿瘤细胞的小鼠作为对照组，皮下注射已导入IL-2基因的肿瘤细胞的小鼠以及已导入IL-2和B7双基因的肿瘤细胞的小鼠作为实验组，观察小鼠肿瘤的生长情况，根据下图可以得出结论： ① ；② 。 (5)分析与讨论：IL—2是重要的免疫调节细胞因子，能诱导T淋巴细胞的增殖。转基因肿瘤细胞通过细胞因子的分泌调节激活了小鼠体内的 免疫，使机体产生抗肿瘤免疫效应。 3．科学家从某细菌中提取抗盐基因，并将该基因转入烟草培育成转基因抗盐烟草。图1为培育转基因植株时选用的质粒载体的结构示意图，图2为抗盐基因的结构示意图。图中限制酶的识别序列均不同。据图分析，回答下列问题： (1)PCR过程中，需要在反应体系中加入的原料是 。利用PCR技术扩增抗盐基因时，需要在两种引物的 （填“5′”或“3′”）端分别加上限制酶识别序列。一个目的基因利用PCR进行扩增时，循环n次，共需要消耗引物 个。 (2)利用农杆菌转化法将重组质粒导入植物细胞时，有两次导入和两次拼接，其中第一次导入是指 ，第二次拼接是指 。转化成功后，通过 技术获得转基因植株。 (3)根据质粒和目的基因的结构示意图分析，构建基因表达载体时需要选用的限制酶是 ，这样选择的理由是 。 (4)将目的基因导入受体细胞时，一般不将目的基因整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上，原因是 。 4．利用敲除特定基因的模型小鼠进行实验，能够大幅提高实验数据的可靠性。Cre-LoxP系统是常用的基因敲、除工具，它由Cre蛋白和LoxP序列两部分组成，Cre蛋白可识别双链DNA分子中特定的LoxP序列，当DNA分子上存在两个同向LoxP序列时，Cre蛋白可将两个LoxP序列之间的DNA序列剪除，切口连接形成的环化产物被降解，从而达到敲除特定基因的目的，示意图如下。 (1)Cre蛋白的作用类似于基因工程中使用的 ，该酶切断的化学键是 。 (2)细胞膜上的CD36蛋白在脂质代谢中有重要作用。为进一步研究CD36蛋白的功能，研究者用Cre-Lox系统构建在肝细胞中特异性敲除CD36基因的小鼠，并对敲除结果进行检验，部分流程见下图。Alb是添加在Cre编码序列上游的特异性启动子，它的作用是 。③中Cre阳性-Flox杂合小鼠肝细胞中表达的蛋白质有 （填“CD36蛋白”“Cre蛋白”或“CD36蛋白和Cre蛋白”）。符合要求的肝特异性CD36基因敲除小鼠最早可在子 代出现。 (3)能说明在肝细胞中特异性敲除CD36基因的小鼠构建成功了的证据有___________。 A．小鼠不同组织中提取的DNA可检测到Cre序列 B．小鼠肝细胞中CD36基因的mRNA含量基本为零 C．在小鼠肝细胞提取物中检测不到CD36蛋白 D．在小鼠肝脏、心肌和肾脏组织提取物中CD36蛋白含量无明显差异 5．研究发现实体肿瘤内部通常是缺氧环境，蓖麻毒紫蛋白(RTA)可作用于核糖体，使蛋白合成受阻，从而引起细胞死亡。TAT是一种短肽，可转导蛋白进入细胞，含有氧依赖性降解区域00D(多肽)的融合蛋白可以适应低氧条件稳定存在，但在常氧条件下会被蛋白酚降解。科研人员以RTA作为抑制肿瘤细胞增殖的活性分子，利用TAT的作用将融合蛋白转运进入肿瘤细胞，并利用ODD的作用减轻RTA 对正常细胞的毒性,分别构建了含TAT-RTA(660bp)和 TAT-RTA-ODD(870bp)融合基因的表达载体，并成功得到相关融合蛋白。 (1)可通过PCR技术获取TAT-RTA融合基因，前提是根据TAT 和RTA基因设计引物，引物的作用是 。已知RTA基因部分序列如图1(a)所示：TAT 基因编码链序列为5' ATGAGCTACGGCCGTAAAAGAGACGCCAACGTACA 3': 欲得到TAT-RTA 融合基因的结构如图1(b)所示。为顺利构建表达载体，除图示外，还需具有 结构。且需在引物1、2的 端分别加入 酶切位点：要求在RTA 蛋白的前端引入TAT短肽，则引物2的前12个碱基序列为 A．5' GGATCCATGAGC 3'           B．S' GGATCCATCTTC 3' C． 5' GGATCCTACTCG 3'           D．S' CTCGAGATGAGC 3' (2)载体的部分结构如图2所示，His标签由连续的6个组氨酸构成，可用于对重组融合蛋白进行分离纯化。将PCR 得到的TAT-RTA 融合基因和载体双酶切后，再用 酶连接。但在研究时发现融合蛋白中没有 His标签蛋白。据图分析原因很可能是 ，导致 His标签基因对应的mRNA的密码子被错位读取。 (3)科研人员将得到的重组融合蛋白经腹腔给药忠实体肿瘤的小鼠，发现TAT-RTA 和 TAT-RTA-ODD融台蛋白都可以抑制患实体肿瘤小鼠肿瘤体积的增长，但TAT-RTA-ODD 的抑制效果更好，产生该实验结果的原因是 。 6．PZA肽是一种“自我剪切”肽，能够使融合蛋白通过P2A肽的自我切割分离产生多种蛋白质独立行使各自功能（如图1）。水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因（如图2）的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为实现可视化监测，科学家将斑马鱼的vtg基因，与人工构建的载体（如图3）连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼。图3中Luc表示萤火虫荧光素酶基因，可以催化荧光素氧化产生荧光，已知载体中Luc基因缺乏启动子序列，vtg基因内部无图3中任何限制酶识别序列，请回答下列问题：    注：图3中Ampr为氨苄青霉素抗性基因，ori为复制起点，BamHI、EcoRI、Hindl、BsrGI为限制酶，→表示转录方向。 (1)根据题目信息，在重组载体中，图1中基因1对应的是 基因。 (2)为降低“空载”概率，构建vtg-Luc基因重组载体时应选用限制酶 切割Luc基因载体。 (3)通过PCR技术获取vtg基因时，需设计合适的引物。依据图1、图2信息，推测引物1包含的碱基序列为________。 A．5'-AACTAT-3' B．5'-GAATTCAACTAT-3' C．5'-TTGATA-3' D．5'-AAGCTTAACTAT-3' (4)将“vtg-Luc基因重组载体”导入大肠杆菌中进行扩增，为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含 的培养基中；若要判断斑马鱼转基因是否成功，可在水体中添加 进行检测。 题型4 疾病诊断与基因治疗 1．重症联合免疫缺陷（SCID）是一类免疫缺陷病，目前已发现15种基因突变类型，最常见的是由编码腺苷脱氨酶（ADA）的基因的碱基对替换，引起淋巴细胞增殖异常，导致体液免疫和细胞免疫缺陷（具体机理如图）。绝大部分SCID患儿表现为淋巴细胞减少症，若不及时治疗，患儿通常在2岁内死亡。下列分析错误的是（    ） 注：“+”表示促进，“－”表示抑制。 A．SCID有多种突变类型体现了基因突变的普遍性 B．ADA基因突变可能改变腺苷脱氨酶的氨基酸数目 C．ADA基因突变导致dATP含量升高，抑制淋巴细胞增殖 D．通过基因治疗的方法可根治SCID 2．肿瘤细胞表面的PD-L1蛋白与T细胞表面的受体蛋白PD-1结合，抑制T细胞的活化和增殖，使得肿瘤细胞开启免疫逃逸。为了达到更好的癌症治疗效果，科研人员对此开展系列研究。 (1)机体能通过 免疫杀伤癌细胞，该过程体现了免疫系统的 功能。 (2)科研人员欲通过基因编辑技术（CRISPR-Cas9）敲除T细胞表面的受体蛋白PD-1基因，以达到治疗癌症的目的。 ①基因编辑CRISPR-Cas9技术系统主要由人工设计的gRNA和Cas9蛋白组成，gRNA可与靶序列特异性结合，Cas9蛋白对靶序列所在DNA进行剪切，gRNA和Cas9蛋白复合体的功能类似于 酶。 ②科研人员设计的gRNA能靶向识别PD-1蛋白基因，与携带Cas9基因的PX330质粒构建gRNA重组质粒。其中PX330质粒部分碱基序列及Bbs1限制酶识别序列如图1所示。 据图1分析，限制酶Bhs1切割后质粒b处黏性末端序列（5’→3’）为 。 (3)研究人员以不同的方式处理黑色素肿瘤小鼠（如图2）。 其中注射物Ⅰ为 ，组6的作用为 。图2结果说明 。 (4)CRISPR-Cas9编辑T细胞为肿瘤治疗提供了新思路，有人说“科学技术是一把双刃剑，应当审慎地使用基因编辑技术。”请你辩证分析基因编辑技术可能带来的影响 。 试卷第18页，共19页 16 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