3.2 基因工程的基本操作程序-【省心备课】2024-2025学年高二生物同步教学精优课件（人教版2019选择性必修3）

第2节 基因工程的基本操作程序 第二步 基因表达载体的构建 贺老师 第3章 基因工程 1 1、目的基因的筛选： 从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选 2、目的基因的获取： 人工合成、基因文库、利用PCR获取和扩增目的基因等 DNA半保留复制 原理: PCR反应体系（条件） 过程: 3、利用PCR获取和扩增目的基因 DNA模板（目的基因） 4种脱氧核苷酸（dNTP） 引物：一小段DNA单链，与DNA母链的一段碱基序列互补配对 酶：耐高温的DNA聚合酶（Taq酶） 缓冲液、温控条件等 变性（ 90℃以上，双链DNA解聚为单链） 复性（ 50℃左右，引物与两条单链DNA结合） 延伸（ 72℃左右，Taq酶合成新的DNA链。 ） 温故知新 2 获得了足量的Bt基因后，能否直接将游离的Bt蛋白基因送入棉花细胞？ （1）游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解； （2）就算可以进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。 构建基因表达载体 （1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代； （2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。 1 构建基因表达载体的目的 思考：要想目的基因实现以上功能，载体需要哪些结构？ 基因表达载体 抗虫基因 与载体拼接 ——基因工程的核心 P80 3 2 基因表达载体的组成 标记基因 复制原点 终止子 启动子 插入目的基因 复制原点： DNA复制的起始位点 标记基因：作用为鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 启动子： 本质：有特殊序列结构的 片段 位置：基因的 。 功能： 识别和结合的部位，驱动基因转录出 。 DNA 上游 RNA聚合酶 mRNA 终止子： 本质：有特殊序列结构的 片段 位置：基因的 。 功能：终止 。 DNA 下游 转录 目的基因：能控制表达所需要的特殊性状 位置：必须插到 和 之间 启动子 终止子 抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。 限制酶切位点 目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子和终止子之间的部位，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。 4 1、基因表达载体中启动子、终止子的来源： ①如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的。 诱导型启动子： 有时为了满足需要，在载体中人工构建诱导型启动子，当 存在时，可以 或 目的基因的表达。 在构建基因表达载体时，不需要在质粒上接上特定的启动子、终止子。 ——已含有启动子、终止子 ②如果目的基因是通过人工方法合成的，或是cDNA。 ——目的基因不含启动子和终止子 在构建基因表达载体时，需要在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。 诱导物 激活 抑制 5 【拓展】 启动子的类型 ① 组成型启动子 这类启动子一般来自管家基因，可连续不断地启动基因的表达。 ② 组织特异性启动子 其调控作用使基因往往只在某些特定器官或组织中表达，且表现出发育调节的特性。 ③ 诱导型启动子 当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。 6 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 位置 功能 DNA片段 DNA片段 mRNA上 三个相邻的碱基 mRNA上 三个相邻的碱基 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 终止转录 翻译的起始信号（编码氨基酸） 翻译的结束信号（不编码氨基酸） 启动子、终止子、起始密码子、终止密码子的比较 7 辨析概念： 克隆载体 vs 表达载体 基因克隆载体必须具备的组分 标记基因 复制原点 启动子 终止子 限制酶切位点 基因表达载体必须具备的组分 考虑到翻译，基因表达载体插入的目的基因中必须含有能转录出完整 、 和 的序列。 mRNA的结构： 核糖体结合位点 起始密码子 终止密码子 二者在组成上有什么区别？表达载体：在克隆载体基础上增加表达元件，使外源基因在宿主细胞中转录和翻译。克隆载体：专注于DNA复制和保存，不包含表达元件（如启动子、终止子）。。 二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。 表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。 8 DNA分子 （含目的基因） 限制酶处理 带有黏性末端或平末端的切口 带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段 DNA连接酶 重组DNA分子 （重组质粒） 同种 载体 （质粒） 2 基因表达载体的构建过程 目的基因 限制酶 切割位点 标记基因 启动子 限制酶切割位点 终止子 复制原点 限制酶 限制酶 DNA连接酶 重组 DNA分子 9 活动1. 模拟基因表达载体的构建： (1)用图中的质粒和DNA构建基因表达载体时,不能使用SmaⅠ切割,原因是　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　 　。  SmaⅠ会①破坏质粒的抗生素抗性基因 ②破坏外源DNA中的目的基因  Hind Ⅲ BamHⅠ  EcoRⅠ  EcoRⅠ smaⅠ  Bt基因 方案一： 只用EcoRⅠ切割目的基因和质粒 方案二： 同时用BamHⅠ和HindⅢ (或EcoRⅠ和HindⅢ)切割目的基因和质粒 图甲、乙表示质粒及目的基因所在DNA片段,图中箭头表示相关限制酶的酶切位点。 10 使用一种限制酶（EcoR Ⅰ）进行切割Bt基因和pBI121质粒，共有几种连接情况？请大家尝试剪切、拼接操作。 载体与目的基因反向连接 载体与目的基 因正向连接 目的基因与目的基因之间的连接 目的基因自身环化 载体 自身环化 载体与载体之间的连接 方案一：单酶切法 转录方向错误影响：若目的基因包含启动子或依赖载体上的启动子，反向插入会导致转录方向与预期相反，无法生成功能性mRNA。 案例：假设目的基因编码绿色荧光蛋白（GFP），反向插入后，即使转录生成mRNA，其序列也会与正向插入的mRNA互补，无法翻译为GFP蛋白。若载体上的启动子为RNA聚合酶II依赖型，反向插入可能导致转录提前终止或生成无意义的转录本。 11 载体 自身环化 片段间 的连接 目的基因自身环化 质粒自身环化 目的基因与质粒连接 目的基因与目的基因连接 质粒与质粒连接 正向连接 反向连接 目的基因 1 1’ 2 2’ 1 2 2’ 1’ 2 2’ 1’ 1 ①质粒、目的基因自身环化； ②质粒与目的基因随意连接 单酶切法缺点： 总结：如果用同一种限制酶分别切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶处理后会出现几种产物？(只考虑两两结合) 12 如何防止目的基因和质粒自身环化以及目的基因反向连接？ a b a b 双酶切的优点: 防止质粒、目的基因自身环化 防止质粒与目的基因随意连接 选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割，使基因两端产生两个不同的粘性末端 方案二：双酶切法 a酶： b酶： 13 14 思考：若目的基因两端无合适的限制酶切割位点怎么办？ 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 5' 3' 5' 5' 3' 3' 3' 3' 引物1 引物2 引入限制酶识别序列 引入限制酶识别序列 5' 3' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 3' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 3' 使用引物设计引入酶切位点，通过PCR扩增实现突变。 15 16 活动1. 模拟基因表达载体的构建 方案一：HindⅢ 方案二：EcoRⅠ、HindⅢ 方案三:XbaⅠ、BamHⅠ 方案四:HindⅢ、BamHⅠ      17 a b c d 限制酶切割 DNA连接酶连接 缺点1 缺点2 缺点3 思考：如何确定以上缺点？ 单酶切的缺点 反向连接重组DNA 质粒重新环化 目的基因被环化 18 19 $$