3.2 基因工程的基本操作程序（第三课时）- 【精讲课堂】2024-2025学年高二生物同步教学实用课件（人教版2019选择必修3）

第2节：基因工程的基本操作程序 （第三课时） 以信息技术为支撑；以现代教育教学理论为指导；强调新型教学模式的构建；教学内容具有更强的时代性和丰富性；教学更适合学生的学习需要和特点。信息化教学不仅仅是在传统教学的基础上对教学媒体 和手段的改变,而且是以现代信息技术为基础的整体的教学体系的一系列的改革和变化。 授课人：大道至简 微信：a533722113333 第三章 基因工程 1 核心素养 1.生命观念：运用结构与功能观等观念理解PCR技术的过程、原理、条件等。 2.科学思维：结合实例，采用文字和图示方式说明基因工程的基本操作程序。 2．科学探究：针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。 2 实验原理 材料用具 实验步骤 DNA体外扩增的原理 DNA片段电泳鉴定原理 DNA片段的扩增及电泳鉴定 一、实验原理 （一）DNA体外扩增的原理： PCR仪 ①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。 ②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理； PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 （二）DNA片段电泳鉴定原理： DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。 凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。 琼脂糖凝胶电泳 DNA分子电泳 DNA片段的扩增及电泳鉴定 一、实验原理 （二）DNA片段电泳鉴定原理： DNA片段的扩增及电泳鉴定 一、实验原理 二、材料用具 （一）仪器： PCR仪 微量离心管 电泳装置 微量移液器 自动控温，实现DNA的扩增 实际上是进行PCR反应的场所 用于向微量离心管转移PCR配方中的液体 包括电泳仪、电泳槽等 DNA片段的扩增及电泳鉴定 二、材料用具 （二）试剂： （1）无菌水、琼脂糖； （2）电泳缓冲液（TAE或TBE）； （3）凝胶载样缓冲液（内含指示剂——溴酚蓝）； （4）核酸染料（常用核酸染料为EB即溴化乙锭）。 （5）PCR反应体系的配方 材料 用量 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28～33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U 模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL 凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子， 当溴酚蓝到凝胶2/3处时(可看蓝色条带)，则停止电泳。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 三、实验步骤 （一）DNA片段的扩增： 移液 离心 扩增 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率） 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃,5min 30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min 最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min / / 可根据目的片段长度适当调整延伸时间 预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 三、实验步骤 （一）DNA片段的扩增： DNA片段的扩增及电泳鉴定 配制琼脂糖溶液 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀 制备凝胶 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜 加样 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物 电泳 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 观察记录 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 三、实验步骤 （二）DNA片段的电泳鉴定： DNA片段的扩增及电泳鉴定 三、实验步骤 （二）DNA片段的电泳鉴定： DNA片段的扩增及电泳鉴定 三、实验步骤 （二）DNA片段的电泳鉴定： DNA片段的扩增及电泳鉴定 四、注意事项 05 为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 PCR扩增不能随意加大试剂用量。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ 可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。 M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果 你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因？ 如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。 如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.下列有关电泳的叙述，不正确的是（ ） A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率 C.进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动 D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定 C 课堂练习 2．PCR技术可用于遗传多样性的研究。下图是对两个跳虫（A和B）DNA分析的实验过程，有关叙述错误的是（　　） A. 蛋白酶可以分解组织中的蛋白质，在提取DNA时加入蛋白酶有助于释放出DNA B．Taq DNA聚合酶能够耐高温，高温下不会变性，常在PCR中用于DNA链的解旋 C．将已知长度的DNA片段装到凝胶上作参照，可用于估测样本DNA片段的大小D．阴性对照是未加DNA模板但加入PCR扩增过程所需的混合物，以监测试剂是否污染 课堂练习 B Multimedia Cloud Transcode (cloud.baidu.com) Lavf58.51.100 Lavf58.51.100 $$