pcr·电泳·实验 课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

P84 PCR仪器 PCR→PCR产物→电泳 2、DNA移动的方向： 向与自身带电情况相反的电极方向移动 一般使用的电泳缓冲液pH=8，DNA分子带负电荷，在电场中DNA便由负极向正极泳动。 1、DNA移动的原理 3、DNA移动进度的观测： 依靠：电泳指示剂 【拓展】电泳指示剂还可以：使上样孔中的样品可见，确保样品准确加入孔内。 电泳 原理：指示剂移动速率比DNA更快，当指示剂迁移至凝胶边缘时，提示应及时停止电泳，避免目标分子跑出凝胶。 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶 琼脂糖的微结构 资料卡片：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，从琼脂中提取而来，在电泳缓冲液中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的胶体胨，具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。 拓展：琼脂糖冷却后形成具有刚性滤孔的胶体胨，凝胶孔径的大小由琼脂糖的浓度决定。 笔记：琼脂糖凝胶电泳中影响DNA分子移动速率的因素： ①凝胶的浓度 ②DNA分子大小和构像 ③电压大小 （影响凝胶滤孔孔径大小） 规律：DNA分子越大，迁移越慢。 微量离心管：实际上是进行PCR反应的场所 微量移液器：用于向微量离心管转移PCR配方中的液体 扩增缓冲液：含镁离子、pH：8.0 电泳缓冲液：是Tris-乙酸盐缓冲液或Tris-硼酸盐缓冲液 含EDTA、 pH：8.0 作用：抑制核酸酶活性，保护DNA 微量离心管：实际上是进行PCR反应的场所 微量移液器：用于向微量离心管转移PCR配方中的液体 扩增缓冲液：含镁离子、pH：8.0 电泳缓冲液：是Tris-乙酸盐缓冲液或Tris-硼酸盐缓冲液 含EDTA、 pH：8.0 凝胶载样缓冲液： 含：溴酚蓝 是：电泳指示剂 作用：抑制核酸酶活性，保护DNA 微量离心管：实际上是进行PCR反应的场所 微量移液器：用于向微量离心管转移PCR配方中的液体 扩增缓冲液：含镁离子、pH：8.0 电泳缓冲液：是Tris-乙酸盐缓冲液或Tris-硼酸盐缓冲液 含EDTA、 pH：8.0 凝胶载样缓冲液： 含：溴酚蓝 是：电泳指示剂 作用：抑制核酸酶活性，保护DNA 核酸染料： 的作用：染剂与DNA结合后能吸收300nm波长的紫外光，发出可见荧光。其荧光强度与DNA分子的含量成正比。 与样品一起添加在加样孔中 配置凝胶糖溶液时添加在已融化并稍微冷却后的凝胶中 实验1：PCR 等浓度、等量 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量移液管中依次加入各组分。 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部 移液 离心 扩增 实验1：PCR 使DNA充分变性，双链打开，以利于引物更好地和模板结合 思考1：预变性的目的是什么？ 思考2：为什么最后1次变性时间延长？ 使DNA充分变性，双链打开， 以利于引物更好地和模板结合 思考1：预变性的目的是什么？ 原理： ①Taq DNA聚合酶活性会随着循环次数增加而下降，导致在后期的PCR循环中，会发生“部分片段可能没有完全延伸完，Taq DNA聚合酶就脱落了”的情况，形成“半成品DNA”。 ②与正常DNA产物相比，这种“半成品DNA”在变性时需要的能量更多。 目的：为了让未延伸完全的DNA双链部分完全解开，重新延伸。 思考3：为什么最后1次延伸时间延长？ 确保DNA链完整合成 梳子 配制琼脂糖溶液 制备凝胶 实验2：琼脂糖凝胶电泳 加样 配制琼脂糖溶液 制备凝胶 实验2：琼脂糖凝胶电泳 加样 【笔记】标准参照物（Marker） 1、是：已知的DNA分子大小的片段， 2、作用：在实验时和样本DNA同时进行凝胶电泳，通过对比两者的迁移速率，可以大致估计样本DNA的大小。 配制琼脂糖溶液 制备凝胶 加样 实验2：琼脂糖凝胶电泳 电泳、观察 分子量大 （长片段） 分子量小 （短片段） 含量少 （不亮、细带） 含量多 （很亮、粗带） 注意： 1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20 °C 储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 结果分析 1.你是否成功扩增出DNA片段?判断的依据是什么? 可以通过紫外灯下直接观察DNA条带的分布及粗细来评价扩增结果。 电泳方向 小片段 大片段 规律： DNA分子量越大，迁移的越慢（条带位置远离点样孔） DNA分子量越小，迁移的越快（条带位置靠近点样孔） 且DNA数量越多，条带越宽、越亮。 2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带?如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 如果扩增不成功，可能的原因有： ①漏加了PCR的反应成分， ②各反应成分的用量不当， ③PCR程序设置不当 如果扩增扩增结果不止一条条带，可能的原因有： ①引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合成二聚体 ②退后温度过低 ③DNA聚合酶的质量不好 若外源基因是单点（单个）插入植物核基因组（且未破坏内源基因），自交后通常表现为孟德尔分离比（如3:1或1:2:1）。 但是：大多数情况下，插入的目的基因数量、插入的位置都是随机的。 可能为单位点插入，或同一染色体多位点插入，或不同染色体多位点插入。 不同插入位点的基因独立分离，后代比例复杂化。 除此之外，外源基因失活、丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。 若外源基因整合至叶绿体/线粒体基因组，不遵循核基因的孟德尔遗传规律 Lavf57.83.100 $$