3.2 基因工程的基本操作程序-【晨读晚练】2024-2025学年高二生物知识速记与提升（人教版2019选择性必修3）

3．2 基因工程的基本操作程序　 （必背要点+必知重难+知识检测） 一、目的基因的筛选与获取 1．目的基因 (1)概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期 表达产物 等的基因就是目的基因。 (2)作用：根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指 编码蛋白质 的基因。 (3)类型：与 生物抗逆性 、 生产药物 、 毒物降解 和工业用酶等相关的基因，如培育转基因抗虫棉用到的 Bt抗虫蛋白基因 ，即Bt基因。 2．合适目的基因的筛选 (1)方法：从相关的 已知结构和功能清晰 的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 (2)实例 (3)认识基因结构和功能的技术方法： DNA测序 技术、 遗传序列 数据库、 序列比对 工具。 3．利用PCR获取和扩增目的基因 (1)PCR的含义：PCR是 聚合酶链式反应 的缩写，它是一项根据 DNA半保留复制 的原理，在体外提供 参与DNA复制 的各种组分与反应条件，对 目的基因的核苷酸序列 进行大量复制的技术。 (2)目的：特异性的 快速扩增目的基因 。 提示：只有对目的基因或其 上下游的核苷酸序列 已知，才能合成目的基因。 (3)条件：缓冲溶液 条件或参与的组分 在DNA复制中的作用 高温 使DNA双链间的氢键断裂，解聚为单链 DNA母链（DNA模板） 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 耐高温的DNA聚合酶 催化合成DNA子链 两条模板链 结合的2种引物(长度通常为20～30个核苷酸) 2种，分别与两条模板链结合，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 (1)PCR反应需要在一定的缓冲液中才能进行。真核细胞和细菌的 DNA聚合酶 都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加 Mg2＋ 。 (2)在PCR体系中实际加入的原料是4种 dNTP (脱氧核苷三磷酸)，即dATP、dTTP、dGTP和dCTP，既可作为合成 DNA子链 的原料，又可为DNA的合成 提供能量 。　　　　　　　　　　　　　 (4)PCR扩增的过程 ①变性：温度上升到 90℃ 以上，目的基因DNA 受热变性后解聚为单链 。 ②复性：温度下降到 50℃ 左右时， 两种引物 通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 ③延伸：温度上升到 72℃ 左右时，溶液中 四种脱氧核苷酸 在耐高温的 DN A聚合酶的作用下加到 引物的3′端 合成子链。 ④重复循环多次。 (5)结果与鉴定 ①结果：重复循环多次，每一次循环后目的 基因的量 可以增加一倍，即成 指数形式扩增(约为2n，其中n为 扩增循环 的次数)。 ②鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 二、基因表达载体的构建(基因工程的核心) 1．构建基因表达载体的目的 (1)使目的基因在 受体细胞 中 稳定存在 ，并且可以 遗传 给下一代。 (2)使目的基因 能够表达 和发挥作用。 2．基因表达载体的组成及其作用 一个基因表达载体的组成，除了 目的基因 、 标记基因 外，还必须有 启动子 、 终止子 等(如图所示)。 (1)一般情况下，质粒载体有1～2个标记基因，为受体细胞提供 易于检测 的特征。由于构建基因表达载体的 目的 不同，需要的标记基因也不同。有的标记基因是质粒上固有的，有的标记基因是 人为加上去 的。 (2) 抗生素抗性基因 、荧光蛋白基因都可作为载体上的标记基因。 (3)有时为了满足应用需要，会在载体中 人工构建诱导型启动子 ，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。　　　　　　　　　　 3．构建过程：用同种限制酶或 能产生相同末端 的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和载体，再利用 DNA连接酶 将目的基因片段拼接到 载体的切口处 ，形成一个重组DNA分子。 4．构建基因表达载体时的4个关键点 (1)目的基因的获取与基因表达载体的构建都涉及 碱基互补配对 。 (2)启动子位于某基因的 首端 ，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动该基因的 转录 。在构建基因表达载体时，目的基因应插入 启动子 和 终止子 之间。 (3)复制原点是 DNA复制 的起始位点，若复制原点被破坏，则载体将不能复制。即完整的基因表达载体并非只有启动子、目的基因、终止子和标记基因，还有复制原点等结构。 (4)基因表达载体的构建过程中，一般用 同种限制酶 切割目的基因和载体，以获得 相同 的黏性末端(或平末端)，便于二者进行连接。但有时可用 两种 限制酶切割载体和目的基因，这样可使目的基因定向插入载体，同时可避免 载体与载体 之间、 目的基因与目的基因 之间的自身连接。　 4．基因表达载体的功能：通过基因表达载体将 目的基因 导入 受体细胞 。 三、将目的基因导入受体细胞 1．转化：目的基因进入受体细胞，并在受体细胞内 维持稳定 和 表达 的过程。 2．目的基因导入受体细胞的方法 (1)目的基因导入植物细胞 ①花粉管通道法 Ⅰ.用微量注射器将含目的基因的DNA溶液 直接注入子房 中。 Ⅱ.在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助 花粉管通道 进入 胚囊 。 ②农杆菌转化法 Ⅰ.农杆菌的特点：农杆菌自然条件下侵染 双子叶植物 和 裸子植物 ；农杆菌的 Ti质粒上的T­DNA能够整合到所侵染细胞的 染色体DNA 上。 Ⅱ.转化方法：将目的基因插入农杆菌 Ti质粒的T­DNA 中，让农杆菌 侵染植物细胞 。 提示：受体细胞可以是 受精卵 或 体细胞 ，因为植物细胞具有全能性。 (2)目的基因导入动物细胞 ①常用方法： 显微注射法 。 ②常用受体细胞： 受精卵 。 提示：受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的 全能性高 ，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。 (3)目的基因导入微生物细胞 ①方法：用 Ca2＋处理法 ，使细胞处于一种能 吸收 周围环境中 DNA分子 的生理状态，然后将重组表达载体导入其中。 ②常用受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是 大肠杆菌 )。 提示：大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为 真核细胞 (具有多种细胞器)，所以酵母菌在用于生产需要加工和分泌的蛋白质时比大肠杆菌有优势。 四、目的基因的检测与鉴定 1．操作目的 检测和鉴定 目的基因 是否可以在受体细胞中 稳定维持 和 表达其遗传特性 是基因工程的第四步工作，也是检查基因工程是否成功的一步。 2．目的基因的检测与鉴定的方法比较 类型 检测内容 方法 结果显示 分子水平检测 目的基因是否插入转基因生物的DNA上 PCR技术、电泳　 电泳带(琼脂糖凝胶电泳来鉴定) 目的基因是否转录出mRNA PCR技术、电泳　 目的基因是否翻译成蛋白质 抗原—抗体杂交(蛋白质和蛋白质之间) 是否出现杂交带 个体生 物学水 平鉴定 是否具有抗性及抗性程度 对转基因生物进行抗性的接种实验 是否赋予了预期抗性或蛋白质活性 基因工程产品与天然产品的功能活性是否相同 比较基因工程产品与天然产品的功能活性 五、DNA片段的扩增及电泳鉴定 1．实验原理 (1)DNA片段的扩增 PCR利用了DNA的热变性 原理，通过调节 温度 来控制DNA双链的 解聚与结合 。 (2)琼脂糖凝胶电泳 ①带电粒子：DNA分子具有 可解离 的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上 正电荷 或 负电荷 。 ②迁移动力与方向：在 电场 的作用下，带电分子会向着与它所带电荷 相反 的电极移动，这个过程就是电泳。 ③迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的 大小 和 构象 等有关。 ④检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的 紫外 灯下被检测出来。 2．PCR实验操作步骤 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94 ℃，5 min / / 30次 94 ℃，30 s 55 ℃，30 s 72 ℃，1 min 最后1次 94 ℃，1 min 55 ℃，30 s 72℃，1 min 3．DNA的电泳鉴定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为 300nm 的紫外灯下被检测出来。　　　　　　　　　　　　 4．实验注意事项 (1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行 高压蒸汽灭菌 处理。 (2)该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在 －20 ℃储存 。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在 冰块上 缓慢融化。 (3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后， 移液器 上的枪头都必须更换。 (4)PCR扩增 不能 随意加大试剂用量。 一、目的基因的筛选与获取 [问题探究] 1．PCR过程中为什么需要引物？ 引物是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始序列，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。存在于自然界中 生物的DNA复制和人工合成中的多聚酶链式反应(PCR)之所以需要引物，是因为在DNA合成时DNA聚合酶只能从5′端到3′端合成子链。 2．PCR扩增目的基因时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，复性温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，假设引物的长度相同，在GC含量高时，对复性温度的设定有什么要求？说明理由。 在引物的GC含量高时，设定的复性温度要高一些。因为DNA分子中G—C之间有三个氢键，A—T之间有两个氢键 。 3．PCR中与引物有关的7个易错点 (1)引物的作用：使DNA聚合酶能够从引物的 3′端 开始延伸DNA链，同时限定了 复制区域 。 (2)设计两种引物的原因：基因的两条链都作为模板，其 碱基序列 不同，且DNA聚合酶只能 从3′端 延伸子链，用两种引物才能确保DNA的两条链同时被扩增。 (3)设计引物的依据：通常是目的基因两端 特异性较高 的核苷酸序列。 (4)引物长度：用于PCR的引物长度通常为 20～30个 核苷酸。若引物长度过短，则引物与模板链结合的 特异性较差 。 (5)其他要求 ①每种引物内部不能发生过多的 局部碱基互补配对 ，否则会导致自身折叠。 ②两种引物之间不能在 局部发生碱基互补配对 ，否则会导致引物二聚体产生。 (6)引物中设计限制酶的酶切位点 为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，可在引物的 5′端 加上限制酶的酶切位点，且常在两种引物上设计采用 不同的酶切位点 ，主要目的是保证目的基因与载体的正向连接。 (7)复性温度与设计的引物(长度、碱基组成)有关 ①长度相同但 G—C含量高 的引物需要设定的复性温度较高。 ②若复性温度过高，则会影响 引物 与 模板 的结合，可能导致PCR反应得不到任何扩增产物。 8．PCR扩增过程中的循环图示与规律 循环次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 含引物A(或B)的DNA分子数 1 3 7 2n－1 同时含引物A、B的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2 共消耗的引物数量 2＝21+1－2 6＝22+1－2 14＝23+1－2 2n+1－2 9．获取目的基因的方法 (1)通过化学方法直接 人工合成 目的基因：如果基因 比较小 ，核苷酸序列又 已知 ，可通过 DNA合成仪 用化学方法直接人工合成。 (2)利用PCR获取和扩增目的基因。 (3)通过基因文库获取目的基因：基因文库包括 基因组文库 (包含一种生物所有的基因)和 部分基因文库 (只包含一种生物的部分基因，如cDNA文库)。 二、基因表达载体的构建 [问题探究] 1．为什么不直接把目的基因导入受体细胞，而要用载体？ 游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制 ，导致子代细胞中不再含有目的基因。若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。 2．启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 化学成分 DNA片段 DNA片段 mRNA上三个相邻碱基 mRNA上三个相邻碱基 位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 作用 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 决定转录的结束 翻译的起始信号 决定翻译过程的结束 3．知识拓展——真、原核细胞基因的结构 三、将目的基因导入受体细胞　　　　　　　　　　　　　 [问题探究] 1．农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物和裸子植物的一种方法，农杆菌对大多数单子叶植物没有侵染能力，原因是双子叶植物和裸子植物能够产生一种吸引农杆菌的化学物质，而单子叶植物不能产生这种物质，能不能利用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物？说明原因。 能，可从双子叶植物中提取该化合物，再用该化合物处理单子叶植物细胞，然后就可用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物细 胞。 2．将目的基因导入动物细胞的受体细胞除了受精卵外，还可以选择什么细胞？ 还可以将目的基因导入胚 胎干细胞，因为胚胎干细胞也能发育成动物个体。 3．农杆菌转化法过程分析 (1)构建携带 目的基因 的表达载体，需要两种工具酶：限制酶和DNA连接酶。 (2)基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用 Ca2＋处理 农杆菌细胞，使其处于感受态 ，利于重组质粒的导入。 (3)由导入目的基因的受体细胞培育成完整的植株要用到 植物组织培养技术 。 4．目的基因导入不同受体细胞的方法 5．农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入 (1)第一次拼接是将目的基因拼接到 Ti质粒的T－DNA 上，第二次拼接(非人工直接操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的 染色体DNA 上。 (2)第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入 农杆菌(Ca2+处理法) ，第二次导入(非人工直接操作)是指含目的基因的T－DNA导入 受体细胞(农杆菌转化法) 。 四、目的基因的检测和鉴定 1．目的基因的检测与鉴定 2．个体生物学水平检测的具体方法及成功标志 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 饲喂害虫(抗虫接种实验) 害虫死亡 抗病毒(菌)植物 病毒(菌)接种实验 未染病 抗盐植物 盐水浇灌 正常生长 抗除草剂植物 喷洒除草剂 正常生长 获取目的基因产物的转基因生物 提取细胞产物与天然产品进行功能、活性比较 细胞产物功能活性正常 提示：目的基因的检测与鉴定，不仅要检测转基因生物的DNA上是否 插入了目的基因 ，还要检测目的基因是否 转录出mRNA 以及 是否翻译成蛋白质 。 （限时：15min） 一、单选题 1．下列有关基因工程基本操作程序的叙述，正确的是（　　） A．目的基因检测时所用的核酸探针是指与目的基因相同的特定双链DNA B．基因文库包含基因库和cDNA文库 C．若基因比较小且核苷酸序列已知，则可直接通过化学方法合成 D．抗生素合成基因作为标记基因，可鉴别目的基因是否导入受体细胞 2．（2021·湖北·高考真题）某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是（     ） A．增加模板DNA的量 B．延长热变性的时间 C．延长延伸的时间 D．提高复性的温度 3．（2023·重庆·高考真题）某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（     ） A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇ B．步骤①所用的酶是SpeI和CfoI C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段 D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli连接酶或T4连接酶 4．研究发现，大豆GmNF-YA19基因在干旱胁迫中有响应。科研人员利用PCR扩增GmNF-YA19基因，构建GmNF-YA19基因表达载体并转化烟草，实验过程如图1、2所示。下列说法正确的是（     ） A．PCR扩增GmNF-YA19基因的前提是根据已知核苷酸序列合成一种引物 B．为获得能正确表达目的基因的重组质粒，应选用限制酶KpnⅠ、EcoRⅠ进行切割 C．终止子为一段DNA序列，其作用是使翻译在所需要的地方停下来 D．重组质粒转化烟草后，可使用含氨苄青霉素的培养基来筛选目的细胞 5．（2023·湖北·高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（　 　）    A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落 6．利用农杆菌转化法将苏云金杆菌的Bt基因导入棉花细胞获得抗虫棉，可有效减少农药使用，提高棉花产量。下列相关叙述错误的是（　 　） A．农杆菌转化法和肺炎链球菌转化实验的原理相同 B．苏云金杆菌和棉花的基因都是有遗传效应的DNA片段 C．农杆菌转化法一般需要农杆菌的Ti质粒作为表达载体 D．由该种方法获得的转基因抗虫棉无法将抗虫基因遗传给子代 7．“筛选”是生物技术与工程中重要的环节。下列相关叙述正确的是（     ） A．诱导甘蓝根尖细胞与白菜叶肉细胞原生质体融合，观察到叶绿体即可筛选出异种融合细胞 B．用灭活的病毒处理B淋巴细胞与骨髓瘤细胞，用来筛选出杂交瘤细胞 C．培育耐盐转基因植株时，通过PCR 等技术检测到目的基因及其mRNA即可筛选耐盐植株 D．制备动物乳腺生物反应器时，通过对滋养层细胞进行基因鉴定即可筛选出雌性胚胎 8．将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因PinⅡ导入杨树细胞，培育成了抗虫杨树。如下图表示含目的基因的DNA分子和农杆菌质粒，图中Amp＇表示氨苄青霉素抗性基因，Neo＇表示新霉素抗性基因，箭头表示识别序列完全不同的几种限制酶的切割位点。下列叙述正确的是（     ） A．用图中的限制酶构建重组质粒无法确定目的基因的插入方向 B．可以用TthⅢ和BamHⅠ对目的基因和载体双酶切构建重组载体 C．成功导入重组质粒的细胞会表现为不抗氨苄青霉素、抗新霉素 D．通过PCR检测发现目的基因成功导入杨树细胞中即成功培育了抗虫杨树 9．关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”的实验操作，下列说法错误的是（     ） A．取洋葱研磨液的上清液倒入离心管中经离心后，管底的沉淀物为粗提取的DNA B．将提取的白色丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液中，再加二苯胺试剂并进行沸水浴，用于鉴定DNA C．电泳鉴定实验中，将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具后再加入核酸染料 D．电泳时，接通电源后，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 10．THP9基因是野生玉米中控制高蛋白含量的优良基因，研究者利用基因工程技术将THP9基因转到玉米细胞内，从而获得转基因高蛋白玉米新品种。已知图中THP9基因转录的方向为从左往右。下列相关叙述错误的是（     ） EcoRⅠ BamHⅠ KpnⅠ MfeⅠ Hind Ⅲ A．THP9基因有2个游离的磷酸基团，而且游离的磷酸基团在5′端 B．构建基因表达载体时，用MfeⅠ、HindⅢ切割质粒，用EcoRⅠ、HindⅢ切割目的基因 C．利用PCR技术获取THP9基因时应选择引物1和引物4 D．为了检测转基因玉米新品种的培育是否成功，需要在个体水平上检测其蛋白质含量 11．某课题组为得到青蒿素产量高的新品系，将青蒿素合成过程的某一关键酶基因fps在野生青蒿中过量表达，其过程如下图所示。有关叙述正确的是（     ） A．酶1、酶2、酶3都能连接两个核苷酸之间的磷酸二酯键和氢键 B．fps基因在青蒿植株中的复制和表达必须通过农杆菌的复制和表达来实现 C．利用fps基因的mRNA做成分子探针可检测fps基因在青蒿细胞内是否表达 D．必须检测转基因青蒿植株的青蒿素产量才能判断课题组的研究目的是否达到 二、非选择题 12．为了培育出抗病毒的优良玉米，研究人员利用基因工程技术进行了相关实验，其中抗病毒基因、P载体及相关限制酶的切割位点如图1所示。已知P载体上含有绿色荧光蛋白基因（GFP）和抗性基因，一般情况下，抗性基因在真核细胞中表达时，细胞具有新霉素抗性，在原核细胞中表达时，细胞具有卡那霉素抗性。请回答下列问题：    (1)据图1分析，利用PCR技术扩增抗病毒基因时，应选择的引物是 。在PCR反应体系中的作用是 。 (2)将抗病毒基因与P载体构建成重组质粒时，应选择的限制酶是 ；用限制酶切割后，进行DNA连接时宜选择T4DNA连接酶而不是选用E.coliDNA连接酶，推测原因是 。为了初步鉴定重组质粒是否构建成功、研究人员用上述选择的限制酶切割相应质粒后进行了电泳，结果如图2所示，其中X、Y分别为 。    (3)在筛选转化成功的玉米细胞时，应在培养基中添加 （填“新霉素”或“卡那霉素”）、原因是 。除转基因技术外，培育优良玉米的途径还有 （答出2种）等。 4 / 4 学科网（北京）股份有限公司 $$ 3．2 基因工程的基本操作程序　 （必背要点+必知重难+知识检测） 一、目的基因的筛选与获取 1．目的基因 (1)概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期 表达产物 等的基因就是目的基因。 (2)作用：根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指 编码蛋白质 的基因。 (3)类型：与 生物抗逆性 、 生产药物 、 毒物降解 和工业用酶等相关的基因，如培育转基因抗虫棉用到的 Bt抗虫蛋白基因 ，即Bt基因。 2．合适目的基因的筛选 (1)方法：从相关的 已知结构和功能清晰 的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。 (2)实例 (3)认识基因结构和功能的技术方法： DNA测序 技术、 遗传序列 数据库、 序列比对 工具。 3．利用PCR获取和扩增目的基因 (1)PCR的含义：PCR是 聚合酶链式反应 的缩写，它是一项根据 DNA半保留复制 的原理，在体外提供 参与DNA复制 的各种组分与反应条件，对 目的基因的核苷酸序列 进行大量复制的技术。 (2)目的：特异性的 快速扩增目的基因 。 提示：只有对目的基因或其 上下游的核苷酸序列 已知，才能合成目的基因。 (3)条件：缓冲溶液 条件或参与的组分 在DNA复制中的作用 高温 使DNA双链间的氢键断裂，解聚为单链 DNA母链（DNA模板） 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 耐高温的DNA聚合酶 催化合成DNA子链 两条模板链结合的2种引物(长度通常为20～30个核苷酸) 2种，分别与两条模板链结合，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 (1)PCR反应需要在一定的缓冲液中才能进行。真核细胞和细菌的 DNA聚合酶 都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加 Mg2＋ 。 (2)在PCR体系中实际加入的原料是4种 dNTP (脱氧核苷三磷酸)，即dATP、dTTP、dGTP和dCTP，既可作为合成 DNA子链 的原料，又可为DNA的合成 提供能量 。　　　　　　　　　　　　　 (4)PCR扩增的过程 ①变性：温度上升到 90℃ 以上，目的基因DNA 受热变性后解聚为单链 。 ②复性：温度下降到 50℃ 左右时， 两种引物 通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 ③延伸：温度上升到 72℃ 左右时，溶液中 四种脱氧核苷酸 在耐高温的 DNA聚合酶的作用下加到 引物的3′端 合成子链。 ④重复循环多次。 (5)结果与鉴定 ①结果：重复循环多次，每一次循环后目的 基因的量 可以增加一倍，即成 指数形式扩增(约为2n，其中n为 扩增循环 的次数)。 ②鉴定：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。 二、基因表达载体的构建(基因工程的核心) 1．构建基因表达载体的目的 (1)使目的基因在 受体细胞 中 稳定存在 ，并且可以 遗传 给下一代。 (2)使目的基因 能够表达 和发挥作用。 2．基因表达载体的组成及其作用 一个基因表达载体的组成，除了 目的基因 、 标记基因 外，还必须有 启动子 、 终止子 等(如图所示)。 (1)一般情况下，质粒载体有1～2个标记基因，为受体细胞提供 易于检测 的特征。由于构建基因表达载体的 目的 不同，需要的标记基因也不同。有的标记基因是质粒上固有的，有的标记基因是 人为加上去 的。 (2) 抗生素抗性基因 、荧光蛋白基因都可作为载体上的标记基因。 (3)有时为了满足应用需要，会在载体中 人工构建诱导型启动子 ，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。　　　　　　　　　　 3．构建过程：用同种限制酶或 能产生相同末端 的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和载体，再利用 DNA连接酶 将目的基因片段拼接到 载体的切口处 ，形成一个重组DNA分子。 4．构建基因表达载体时的4个关键点 (1)目的基因的获取与基因表达载体的构建都涉及 碱基互补配对 。 (2)启动子位于某基因的 首端 ，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动该基因的 转录 。在构建基因表达载体时，目的基因应插入 启动子 和 终止子 之间。 (3)复制原点是 DNA复制 的起始位点，若复制原点被破坏，则载体将不能复制。即完整的基因表达载体并非只有启动子、目的基因、终止子和标记基因，还有复制原点等结构。 (4)基因表达载体的构建过程中，一般用 同种限制酶 切割目的基因和载体，以获得 相同 的黏性末端(或平末端)，便于二者进行连接。但有时可用 两种 限制酶切割载体和目的基因，这样可使目的基因定向插入载体，同时可避免 载体与载体 之间、 目的基因与目的基因 之间的自身连接。　 4．基因表达载体的功能：通过基因表达载体将 目的基因 导入 受体细胞 。 三、将目的基因导入受体细胞 1．转化：目的基因进入受体细胞，并在受体细胞内 维持稳定 和 表达 的过程。 2．目的基因导入受体细胞的方法 (1)目的基因导入植物细胞 ①花粉管通道法 Ⅰ.用微量注射器将含目的基因的DNA溶液 直接注入子房 中。 Ⅱ.在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助 花粉管通道 进入 胚囊 。 ②农杆菌转化法 Ⅰ.农杆菌的特点：农杆菌自然条件下侵染 双子叶植物 和 裸子植物 ；农杆菌的 Ti质粒上的T­DNA能够整合到所侵染细胞的 染色体DNA 上。 Ⅱ.转化方法：将目的基因插入农杆菌 Ti质粒的T­DNA 中，让农杆菌 侵染植物细胞 。 提示：受体细胞可以是 受精卵 或 体细胞 ，因为植物细胞具有全能性。 (2)目的基因导入动物细胞 ①常用方法： 显微注射法 。 ②常用受体细胞： 受精卵 。 提示：受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的 全能性高 ，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。 (3)目的基因导入微生物细胞 ①方法：用 Ca2＋处理法 ，使细胞处于一种能 吸收 周围环境中 DNA分子 的生理状态，然后将重组表达载体导入其中。 ②常用受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是 大肠杆菌 )。 提示：大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为 真核细胞 (具有多种细胞器)，所以酵母菌在用于生产需要加工和分泌的蛋白质时比大肠杆菌有优势。 四、目的基因的检测与鉴定 1．操作目的 检测和鉴定 目的基因 是否可以在受体细胞中 稳定维持 和 表达其遗传特性 是基因工程的第四步工作，也是检查基因工程是否成功的一步。 2．目的基因的检测与鉴定的方法比较 类型 检测内容 方法 结果显示 分子水平检测 目的基因是否插入转基因生物的DNA上 PCR技术、电泳　 电泳带(琼脂糖凝胶电泳来鉴定) 目的基因是否转录出mRNA PCR技术、电泳　 目的基因是否翻译成蛋白质 抗原—抗体杂交(蛋白质和蛋白质之间) 是否出现杂交带 个体生 物学水 平鉴定 是否具有抗性及抗性程度 对转基因生物进行抗性的接种实验 是否赋予了预期抗性或蛋白质活性 基因工程产品与天然产品的功能活性是否相同 比较基因工程产品与天然产品的功能活性 五、DNA片段的扩增及电泳鉴定 1．实验原理 (1)DNA片段的扩增 PCR利用了DNA的热变性 原理，通过调节 温度 来控制DNA双链的 解聚与结合 。 (2)琼脂糖凝胶电泳 ①带电粒子：DNA分子具有 可解离 的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上 正电荷 或 负电荷 。 ②迁移动力与方向：在 电场 的作用下，带电分子会向着与它所带电荷 相反 的电极移动，这个过程就是电泳。 ③迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的 大小 和 构象 等有关。 ④检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的 紫外 灯下被检测出来。 2．PCR实验操作步骤 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94 ℃，5 min / / 30次 94 ℃，30 s 55 ℃，30 s 72 ℃，1 min 最后1次 94 ℃，1 min 55 ℃，30 s 72℃，1 min 3．DNA的电泳鉴定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为 300nm 的紫外灯下被检测出来。　　　　　　　　　　　　 4．实验注意事项 (1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行 高压蒸汽灭菌 处理。 (2)该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在 －20 ℃储存 。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在 冰块上 缓慢融化。 (3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后， 移液器 上的枪头都必须更换。 (4)PCR扩增 不能 随意加大试剂用量。 一、目的基因的筛选与获取 [问题探究] 1．PCR过程中为什么需要引物？ 引物是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始序列，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。存在于自然界中生物的DNA复制和人工合成中的多聚酶链式反应(PCR)之所以需要引物，是因为在DNA合成时DNA聚合酶只能从5′端到3′端合成子链。 2．PCR扩增目的基因时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，复性温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，假设引物的长度相同，在GC含量高时，对复性温度的设定有什么要求？说明理由。 在引物的GC含量高时，设定的复性温度要高一些。因为DNA分子中G—C之间有三个氢键，A—T之间有两个氢键。 3．PCR中与引物有关的7个易错点 (1)引物的作用：使DNA聚合酶能够从引物的 3′端 开始延伸DNA链，同时限定了 复制区域 。 (2)设计两种引物的原因：基因的两条链都作为模板，其 碱基序列 不同，且DNA聚合酶只能 从3′端 延伸子链，用两种引物才能确保DNA的两条链同时被扩增。 (3)设计引物的依据：通常是目的基因两端 特异性较高 的核苷酸序列。 (4)引物长度：用于PCR的引物长度通常为 20～30个 核苷酸。若引物长度过短，则引物与模板链结合的 特异性较差 。 (5)其他要求 ①每种引物内部不能发生过多的 局部碱基互补配对 ，否则会导致自身折叠。 ②两种引物之间不能在 局部发生碱基互补配对 ，否则会导致引物二聚体产生。 (6)引物中设计限制酶的酶切位点 为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，可在引物的 5′端 加上限制酶的酶切位点，且常在两种引物上设计采用 不同的酶切位点 ，主要目的是保证目的基因与载体的正向连接。 (7)复性温度与设计的引物(长度、碱基组成)有关 ①长度相同但 G—C含量高 的引物需要设定的复性温度较高。 ②若复性温度过高，则会影响 引物 与 模板 的结合，可能导致PCR反应得不到任何扩增产物。 8．PCR扩增过程中的循环图示与规律 循环次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物A(或B)的DNA分子数 1 3 7 2n－1 同时含引物A、B的DNA分子数 0＝21－2 2＝22－2 6＝23－2 2n－2 共消耗的引物数量 2＝21+1－2 6＝22+1－2 14＝23+1－2 2n+1－2 9．获取目的基因的方法 (1)通过化学方法直接 人工合成 目的基因：如果基因 比较小 ，核苷酸序列又 已知 ，可通过 DNA合成仪 用化学方法直接人工合成。 (2)利用PCR获取和扩增目的基因。 (3)通过基因文库获取目的基因：基因文库包括 基因组文库 (包含一种生物所有的基因)和 部分基因文库 (只包含一种生物的部分基因，如cDNA文库)。 二、基因表达载体的构建 [问题探究] 1．为什么不直接把目的基因导入受体细胞，而要用载体？ 游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。 2．启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 化学成分 DNA片段 DNA片段 mRNA上三个相邻碱基 mRNA上三个相邻碱基 位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 作用 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 决定转录的结束 翻译的起始信号 决定翻译过程的结束 3．知识拓展——真、原核细胞基因的结构 三、将目的基因导入受体细胞　　　　　　　　　　　　　 [问题探究] 1．农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物和裸子植物的一种方法，农杆菌对大多数单子叶植物没有侵染能力，原因是双子叶植物和裸子植物能够产生一种吸引农杆菌的化学物质，而单子叶植物不能产生这种物质，能不能利用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物？说明原因。 能，可从双子叶植物中提取该化合物，再用该化合物处理单子叶植物细胞，然后就可用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物细胞。 2．将目的基因导入动物细胞的受体细胞除了受精卵外，还可以选择什么细胞？ 还可以将目的基因导入胚胎干细胞，因为胚胎干细胞也能发育成动物个体。 3．农杆菌转化法过程分析 (1)构建携带 目的基因 的表达载体，需要两种工具酶：限制酶和DNA连接酶。 (2)基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用 Ca2＋处理 农杆菌细胞，使其处于感受态 ，利于重组质粒的导入。 (3)由导入目的基因的受体细胞培育成完整的植株要用到 植物组织培养技术 。 4．目的基因导入不同受体细胞的方法 5．农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入 (1)第一次拼接是将目的基因拼接到 Ti质粒的T－DNA 上，第二次拼接(非人工直接操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的 染色体DNA 上。 (2)第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入 农杆菌(Ca2+处理法) ，第二次导入(非人工直接操作)是指含目的基因的T－DNA导入 受体细胞(农杆菌转化法) 。 四、目的基因的检测和鉴定 1．目的基因的检测与鉴定 2．个体生物学水平检测的具体方法及成功标志 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 饲喂害虫(抗虫接种实验) 害虫死亡 抗病毒(菌)植物 病毒(菌)接种实验 未染病 抗盐植物 盐水浇灌 正常生长 抗除草剂植物 喷洒除草剂 正常生长 获取目的基因产物的转基因生物 提取细胞产物与天然产品进行功能、活性比较 细胞产物功能活性正常 提示：目的基因的检测与鉴定，不仅要检测转基因生物的DNA上是否 插入了目的基因 ，还要检测目的基因是否 转录出mRNA 以及 是否翻译成蛋白质 。 （限时：15min） 一、单选题 1．下列有关基因工程基本操作程序的叙述，正确的是（　　） A．目的基因检测时所用的核酸探针是指与目的基因相同的特定双链DNA B．基因文库包含基因库和cDNA文库 C．若基因比较小且核苷酸序列已知，则可直接通过化学方法合成 D．抗生素合成基因作为标记基因，可鉴别目的基因是否导入受体细胞 【答案】C 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、DNA探针是指用放射性同位素或荧光分子标记的DNA单链，利用碱基互补配对原则，检测目的基因是否导入受体细胞中，A错误； B、基因文库包括基因组文库和cDNA文库，B错误； C、若基因比较小且核苷酸序列已知，则可直接通过人工合成的方法获取，C正确； D、运载体上的抗生素抗性基因作为标记基因，可用于检测目的基因是否导入受体细胞，D错误。 故选C。 2．（2021·湖北·高考真题）某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是（     ） A．增加模板DNA的量 B．延长热变性的时间 C．延长延伸的时间 D．提高复性的温度 【答案】D 【分析】多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，PCR过程一般经历下述三循环：95℃下使模板DNA变性、解链→55℃下复性（引物与DNA模板链结合）→72℃下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。 【详解】A、增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带，A错误； BC、延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少反应非特异性条带，BC错误； D、非特异性产物增加的原因可能是复性温度过低会造成引物与模板的结合位点增加，故可通过提高复性的温度来减少反应非特异性条带的产生，D正确。 故选D。 3．（2023·重庆·高考真题）某小组通过PCR（假设引物长度为8个碱基短于实际长度）获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切（下图），再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是（     ） A．其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇ B．步骤①所用的酶是SpeI和CfoI C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了2个片段 D．酶切片段和载体连接时，可使用E．coli连接酶或T4连接酶 【答案】B 【分析】E.coliDNA连接酶只能连接黏性末端；T4DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。 【详解】A、由于引物只能引导子链从5＇到3＇，根据碱基互补配对原则，其中一个引物序列为5＇TGCGCAGT-3＇，A正确； B、根据三种酶的酶切位点，左侧的黏性末端是使用NheI切割形成的，右边的黏性末端是用CfoI切割形成的，B错误； C、用步骤①的酶对载体进行酶切，使用了NheI和CfoI进行切割，根据他们的识别位点以及原本DNA的序列，切割之后至少获得了2个片段，C正确； D、图中形成的是黏性末端，而E.coliDNA连接酶能连接黏性末端；T4DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端，D正确。 故选B。 4．研究发现，大豆GmNF-YA19基因在干旱胁迫中有响应。科研人员利用PCR扩增GmNF-YA19基因，构建GmNF-YA19基因表达载体并转化烟草，实验过程如图1、2所示。下列说法正确的是（     ） A．PCR扩增GmNF-YA19基因的前提是根据已知核苷酸序列合成一种引物 B．为获得能正确表达目的基因的重组质粒，应选用限制酶KpnⅠ、EcoRⅠ进行切割 C．终止子为一段DNA序列，其作用是使翻译在所需要的地方停下来 D．重组质粒转化烟草后，可使用含氨苄青霉素的培养基来筛选目的细胞 【答案】D 【分析】基因工程技术的基本步骤： 1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 4、目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、PCR扩增GmNF-YA19基因的前提是根据已知核苷酸序列合成两种引物，A错误； B、根据图中信息，在质粒的启动子和终止子中间含有的限制酶为PvuⅡ、Kpn I和EcoR I三种限制酶切割位点，由于Kpn I在质粒中不止一个识别位点，因此最好选用PvuⅡ和EcoR I进行切割，且在目的基因的两端也存在着两种酶的识别位点，即选用PvuⅡ和EcoR I两种限制酶切割含目的基因的DNA片段和载体，这样可以保证目的基因和质粒正向连接、避免发生自身环，B错误； C、终止子为一段DNA序列，其作用是使转录在所需要的地方停下来，C错误； D、重组质粒转化烟草后，重组质粒中含有抗氨苄青霉素的基因，该基因可作为标记基因，因而使用含氨苄青霉素的培养基来筛选成功导入重组质粒的目的细胞，D正确。 故选D。 5．（2023·湖北·高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（　 　）    A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落 【答案】D 【分析】图中质粒内，氨苄青霉素抗性基因（AmpR）内含有AcaI和PvuI的酶切位点，四环素抗性基因（TetR）内含有HindIII、SphI和SalI的酶切位点。 【详解】A、若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确。 B、若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因（TetR），因此在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确； C、DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确； D、SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因（AmpR），因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。 故选D。 6．利用农杆菌转化法将苏云金杆菌的Bt基因导入棉花细胞获得抗虫棉，可有效减少农药使用，提高棉花产量。下列相关叙述错误的是（　 　） A．农杆菌转化法和肺炎链球菌转化实验的原理相同 B．苏云金杆菌和棉花的基因都是有遗传效应的DNA片段 C．农杆菌转化法一般需要农杆菌的Ti质粒作为表达载体 D．由该种方法获得的转基因抗虫棉无法将抗虫基因遗传给子代 【答案】D 【分析】农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。 【详解】A、农杆菌转化法和肺炎链球菌转化实验的原理相同，均是基因重组，A正确； B、苏云金杆菌和棉花的遗传物质均是DNA，故苏云金杆菌和棉花的基因都是有遗传效应的DNA片段，B正确； C、农杆菌转化法一般需要农杆菌的Ti质粒作为表达载体，Ti质粒上的T-DNA可以将目的基因转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上，C正确； D、农杆菌转化法将Bt基因插入到转基因抗虫棉的染色体DNA中，所以转基因抗虫棉体内的Bt抗虫基因可以通过有性生殖遗传给子代，D错误。 故选D。 7．“筛选”是生物技术与工程中重要的环节。下列相关叙述正确的是（     ） A．诱导甘蓝根尖细胞与白菜叶肉细胞原生质体融合，观察到叶绿体即可筛选出异种融合细胞 B．用灭活的病毒处理B淋巴细胞与骨髓瘤细胞，用来筛选出杂交瘤细胞 C．培育耐盐转基因植株时，通过PCR 等技术检测到目的基因及其mRNA即可筛选耐盐植株 D．制备动物乳腺生物反应器时，通过对滋养层细胞进行基因鉴定即可筛选出雌性胚胎 【答案】D 【分析】单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。 【详解】A、诱导甘蓝根尖细胞与白菜叶肉细胞原生质体融合，观察到叶绿体有可能是白菜原生质体之间相互融合，或是白菜叶肉细胞原生质体，没有发生融合，A错误； B、用灭活的病毒处理B淋巴细胞与骨髓瘤细胞，促进二者融合，而不是筛选杂交瘤细胞，B错误； C、培育耐盐转基因植株时，通过PCR 等技术检测到目的基因及其mRNA，表明植株含有目的基因，y也能转录出mRNA，但不一定表达出蛋白质，故不一定能筛选耐盐植株，C错误； D、滋养层细胞将来发育为胎膜和胎盘，可用于性别鉴定，故制备动物乳腺生物反应器时，对滋养层细胞进行基因鉴定阳性可筛选出雄性胚胎 ，D正确。 故选D。 8．将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因PinⅡ导入杨树细胞，培育成了抗虫杨树。如下图表示含目的基因的DNA分子和农杆菌质粒，图中Amp＇表示氨苄青霉素抗性基因，Neo＇表示新霉素抗性基因，箭头表示识别序列完全不同的几种限制酶的切割位点。下列叙述正确的是（     ） A．用图中的限制酶构建重组质粒无法确定目的基因的插入方向 B．可以用TthⅢ和BamHⅠ对目的基因和载体双酶切构建重组载体 C．成功导入重组质粒的细胞会表现为不抗氨苄青霉素、抗新霉素 D．通过PCR检测发现目的基因成功导入杨树细胞中即成功培育了抗虫杨树 【答案】C 【分析】题图分析：为使目的基因与质粒高效重组，防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，最好选用两种不同的限制酶作用于含目的基因的DNA和质粒，要想切割出目的基因，限制酶应该位于目的基因的两侧；又因为限制酶PstⅠ和限制酶TthⅢ分别位于标记基因Ampr和NeOr中，因此限制酶PstⅠ和限制酶TthⅢⅠ不能同时使用，即一定需要用到限制酶EcoRⅠ；如果限制酶EcoRⅠ和TthⅢ同时使用，会破坏质粒中的标记基因NeOr，同时会切除复制原点。因此只能选用EcoRⅠ和PstⅠ切割目的基因和质粒，然后再在DNA连接酶的作用下形成重组质粒。 【详解】ABC、根据图中所示限制酶的位置，为使目的基因与质粒高效重组，防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，最好选用两种不同的限制酶作用于含目的基因的DNA和质粒，要想切割出目的基因，限制酶应该位于目的基因的两侧；又因为限制酶PstⅠ和限制酶TthⅢ分别位于标记基因Ampr和NeOr中，因此限制酶PstⅠ和限制酶TthⅢⅠ不能同时使用，即一定需要用到限制酶EcoRⅠ；如果限制酶EcoRⅠ和TthⅢ同时使用，会破坏质粒中的标记基因NeOr，因此应选用EcoRⅠ和PstⅠ两种酶分别切割目的基因和质粒，能确定基因的插入方向，并破坏了氨苄青霉素抗性基因，成功导人重组质粒的细胞会表现为不抗氨苄青霉素、抗新霉素，A、B错误，C正确； D、需要进行个体水平的检测才能确定是否成功培育了抗虫杨树，D错误。 故选C。 9．关于“DNA的粗提取与鉴定”和“DNA片段的扩增及电泳鉴定”的实验操作，下列说法错误的是（     ） A．取洋葱研磨液的上清液倒入离心管中经离心后，管底的沉淀物为粗提取的DNA B．将提取的白色丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液中，再加二苯胺试剂并进行沸水浴，用于鉴定DNA C．电泳鉴定实验中，将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具后再加入核酸染料 D．电泳时，接通电源后，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 【答案】C 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、DNA在2mol/L的NaCl溶液中溶解度最大，取洋葱研磨液的上清液倒入离心管中经离心后，管底的沉淀物为粗提取的DNA，A正确； B、将提取的白色丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液中，再加二苯胺试剂并进行沸水浴，与DNA反应呈蓝色，用于鉴定DNA，B正确； C、电泳鉴定实验中，应该在微波炉中融化琼脂糖，稍冷却后加入核酸染料混匀，然后再将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，C错误； D、电泳时，接通电源后，待指示剂溴酚蓝前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳，D正确。 故选C。 10．THP9基因是野生玉米中控制高蛋白含量的优良基因，研究者利用基因工程技术将THP9基因转到玉米细胞内，从而获得转基因高蛋白玉米新品种。已知图中THP9基因转录的方向为从左往右。下列相关叙述错误的是（     ） EcoRⅠ BamHⅠ KpnⅠ MfeⅠ Hind Ⅲ A．THP9基因有2个游离的磷酸基团，而且游离的磷酸基团在5′端 B．构建基因表达载体时，用MfeⅠ、HindⅢ切割质粒，用EcoRⅠ、HindⅢ切割目的基因 C．利用PCR技术获取THP9基因时应选择引物1和引物4 D．为了检测转基因玉米新品种的培育是否成功，需要在个体水平上检测其蛋白质含量 【答案】C 【分析】由图分析可知，要保证将目的基因切割下来，但是又不破坏目的基因，不能选择MfeⅠ切割目的基因，要保证质粒结构的完整性，不能选择BamHⅠ切割质粒。 【详解】A、THP9基因有2个游离的磷酸基团，而且游离的磷酸基团在每一条链的5′端，A正确； B、构建基因表达载体时，用MfeⅠ、HindⅢ切割质粒时，形成的黏性末端分别是AATT-3'和AGCT-3'，用EcoRⅠ、HindⅢ切割目的基因时，形成的黏性末端分别是AATT-3'和AGCT-3'，形成的黏性末端对应相同，可以成功将目的基因插入质粒，同时避免目的基因自身环化和随意连接，B正确； C、利用PCR技术扩增基因时，引物从5'端朝着3'端延伸,故应与模板链3'端配对，故应选择引物2和引物3，C错误； D、为了检测转基因玉米新品种的培育是否成功，需要在个体水平上检测玉米蛋白质含量，D正确。 故选C。 11．某课题组为得到青蒿素产量高的新品系，将青蒿素合成过程的某一关键酶基因fps在野生青蒿中过量表达，其过程如下图所示。有关叙述正确的是（     ） A．酶1、酶2、酶3都能连接两个核苷酸之间的磷酸二酯键和氢键 B．fps基因在青蒿植株中的复制和表达必须通过农杆菌的复制和表达来实现 C．利用fps基因的mRNA做成分子探针可检测fps基因在青蒿细胞内是否表达 D．必须检测转基因青蒿植株的青蒿素产量才能判断课题组的研究目的是否达到 【答案】D 【分析】基因控制蛋白质合成包括转录和翻译两个环节： 1、转录是指以DNA的一条链为模板，按照碱基互补配对原则，合成RNA的过程。 2、翻译是指以mRNA为模板，合成具有一定氨基酸排列顺序的蛋白质的过程。 【详解】A、据图示可知，酶1促进逆转录的过程，故为逆转录酶，酶2、酶3用于切割目的基因和质粒，为限制酶和DNA连接酶，都能连接两个核苷酸之间的磷酸二酯键，但不能连接氢键，A错误； B、fps基因在青蒿植株中的复制和表达，不需要该基因在农杆菌中表达，B错误； C、fps基因的mRNA做成分子探针与青蒿基因组DNA杂交，可检测fps基因在青蒿细胞内是否转录，C错误； D、判断该课题组的研究目的是否达到，必须检测转基因青蒿植株中的青蒿素产量，若产量增高，则说明达到了目的，D正确。 故选D。 二、非选择题 12．为了培育出抗病毒的优良玉米，研究人员利用基因工程技术进行了相关实验，其中抗病毒基因、P载体及相关限制酶的切割位点如图1所示。已知P载体上含有绿色荧光蛋白基因（GFP）和抗性基因，一般情况下，抗性基因在真核细胞中表达时，细胞具有新霉素抗性，在原核细胞中表达时，细胞具有卡那霉素抗性。请回答下列问题：    (1)据图1分析，利用PCR技术扩增抗病毒基因时，应选择的引物是 。在PCR反应体系中的作用是 。 (2)将抗病毒基因与P载体构建成重组质粒时，应选择的限制酶是 ；用限制酶切割后，进行DNA连接时宜选择T4DNA连接酶而不是选用E.coliDNA连接酶，推测原因是 。为了初步鉴定重组质粒是否构建成功、研究人员用上述选择的限制酶切割相应质粒后进行了电泳，结果如图2所示，其中X、Y分别为 。    (3)在筛选转化成功的玉米细胞时，应在培养基中添加 （填“新霉素”或“卡那霉素”）、原因是 。除转基因技术外，培育优良玉米的途径还有 （答出2种）等。 【答案】(1) 引物1和引物4 激活DNA聚合酶 (2) Hind Ⅲ和Sma Ⅰ 限制酶切割产生的是平末端 P载体、重组质粒 (3) 新霉素 玉米细胞是真核细胞，抗性基因表达后具有新霉素抗性 杂交育种、诱变育种 【分析】基因工程技术的基本步骤：(1)目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。(2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。(3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。(4)目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）引物作为子链延伸的起点，应与模板的3'端结合，因此选择引物1和引物4。在PCR反应体系中 Mg2+ 的作用是激活DNA聚合酶。 （2）由于Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ会切断抗病毒基因，因此应当选择的限制酶是Hind Ⅲ和Sma Ⅰ。由于E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶，推测选用T4 DNA连接酶的原因是限制酶切割产生的是平末端。图中XY切割后有相同的长片段，而Y含有抗病毒基因，X不含。因此X、Y分别为P载体、重组质粒。 （3）抗性基因 Kanr/Neor 在真核细胞中表达时，细胞具有新霉素抗性，玉米细胞是真核细胞，应在培养基中添加新霉素筛选导入重组质粒的玉米细胞。除转基因技术外，培育优良玉米的途径还有杂交育种、诱变育种等。 4 / 4 学科网（北京）股份有限公司 $$