3.2.2 基因工程的基本操作程序(实验)-【堂堂清】2024-2025学年高二生物下学期同步精品课件（2019人教版选择性必修3）

【实验】DNA片段的扩增及电泳鉴定 变性 90˚C 延伸 72˚C 复性 50˚C 目的要求： 1.了解PCR和电泳鉴定的基本原理。 2.尝试进行PCR的基本操作并用电泳 鉴定PCR的产物。 1 旧知识回顾：利用PCR获得和扩增目的基因 1.含义：PCR是 (全称)的缩写。 它是一项根据 的原理， 在 (操作环境)提供参与DNA复制的 与 ， 对 进行大量复制的技术(目的/优点)。 2.基本条件：①场所：在一定的 液中进行，其中一般要添加 。 ②模板：DNA母链。 ③原料： 。 ④酶： 。 ⑤引物：使DNA聚合酶能够从引物的 端开始连接脱氧核苷酸。 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外 目的基因的核苷酸序列 各种组分 反应条件 缓冲 Mg2+ 4种脱氧核苷酸 耐高温的DNA聚合酶 3’ 旧知识回顾：利用PCR获得和扩增目的基因 3.过程：在 中自动完成。 ① ：当温度 时，双链DNA 为单链。 ② ：当温度下降到 时， 通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 ③ ：当温度上升到 时，溶液中的4种脱氧核苷酸 在 的作用下， 根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 超过90℃ 解聚 50℃左右 两种引物 72℃左右 耐高温的DNA聚合酶 PCR扩增仪 变性 复性 延伸 旧知识回顾：利用PCR获得和扩增目的基因 4.结果： 上一轮循环的产物可以作为下一个循环的 ， 因而每一次循环后目的基因的量可以 ， 即成 形式扩增(约为 ，其中n为扩增循环的次数)。 5.鉴定： 常采用 来鉴定PCR的产物。 模板 指数 2n 琼脂糖凝胶电泳 增加一倍 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定 变性 90˚C 延伸 72˚C 复性 50˚C 实验原理 实验一：DNA片段的扩增 1.利用 可以在体外进行DNA片段的扩增。 2.PCR利用了DNA的 原理， 通过调节 来控制DNA双链的解聚与结合， PCR仪实质上就是 。 3.一次PCR一般要经历 次循环。 热变性 温度 30 一台能够自动调控温度的仪器 PCR 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定 实验原理 实验二：DNA扩增产物的电泳鉴定 1.DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是 。 2.PCR的产物一般通过 来鉴定。 在凝胶中DNA分子的迁移速率与 、 等有关。 3.凝胶中的DNA分子通过 ，可以在波长为300nm的 下被检测出来。 琼脂糖凝胶电泳 注：一般情况下，DNA分子带负电，可以向 极移动。 正 凝胶的浓度 DNA分子的大小和构象 注：①凝胶浓度越大，迁移速度越 ；②DNA分子越大，迁移速度越 。 慢 慢 紫外灯 染色 电泳 注：常用核酸染料为溴化乙锭(简称EB)。 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定 材料用具：试剂 ①PCR反应体系的配方 材料 用量 10倍浓缩的扩增缓冲液（含 ） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为 ） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28～33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶 （即 的DNA聚合酶） 1～2U 模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL Mg2+ dNTP 耐高温 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定 材料用具：试剂 ②无菌水、琼脂糖； ③电泳缓冲液（TAE或TBE）； ④凝胶载样缓冲液（内含指示剂溴酚蓝和蔗糖）； ⑤核酸染料（常用核酸染料为溴化乙锭，简称EB）； →配制凝胶； →增加导电性；维持电泳过程中合适的pH; →溴酚蓝作为前沿指示剂可以预测电泳进程；蔗糖：可以增加样品密度； →使核酸染色，便于观察； 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定 材料用具：用具 ①PCR仪 ②微量离心管 ③微量移液器 ④一次性吸液枪头 ⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等） →自动控温，实现DNA的扩增 →实际上是进行PCR反应的场所 →用于向微量离心管转移PCR配方中的液体 →微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头 用 按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书， 在 中依次加入各组分。 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。 将微量离心管放入 里，离心约 ，使反应液集中在管的 。 参照下表的参数，设置好 PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入 中进行反应。 加液 离心 反应 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定 方法步骤 实验一：DNA片段的扩增 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃,5min / / 30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min 最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,10min 微量移液器 微量离心管 离心机 10s 底部 提高反应速率 PCR仪 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定 方法步骤 实验一：DNA片段的扩增 使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。 注：可根据目的片段长度适当调整延伸时间。 预变性的目的是什么？ 思考 最后一次循环通常在72℃维持10分钟，目的是什么？ 思考 使子链充分延伸。 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定 方法步骤 实验二：DNA扩增产物的电泳鉴定 4.根据待分离DNA片段的大小，用 配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为 的琼脂糖溶液。 在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。 稍冷却后，加入适量的 混匀。 5.将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的 梳子，以形成 。 6.待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子， 取出凝胶放入 内。 制备凝胶 融化 倒模 凝固 电泳缓冲液 0.8%～1.2% 核酸染料 加样孔 电泳槽 增加导电性；维持pH 溴化乙锭，简称EB 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定 方法步骤 实验二：DNA扩增产物的电泳鉴定 10.取出凝胶置于 下观察和照相。 7.将 加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶 为宜。 8.将扩增得到的PCR产物与 （内含指示剂） 混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的 内。 留一个加样孔加入 。 9.接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为 V/cm。待 迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。 电泳缓冲液 1mm 凝胶载样缓冲液 加样孔 指示分子大小的标准参照物（Marker） 1～5 指示剂前沿 进行电泳 加液 加样 电泳 观察鉴定 紫外灯 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定 注意 1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行 处理。 2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份， 并在 储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上 融化。 3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须 。 4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 高压灭菌 -20℃ 缓慢 更换 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定 结果 如图所示： 进行电泳鉴定的结果为 条条带，该片段大小约为 bp(碱基对)。 一 750 分布 成功扩增出DNA片段的判断依据是： 紫外灯下直接观察到DNA条带的 ① (代表扩增产物的类型); ② (代表扩增产物量的多少)。 粗细程度 DNA分子越大， 迁移速度越慢。 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定 结果 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.如果扩增失败没有条带(即未出现扩增条带)，分析其可能原因： ① 失活。 ②Mg2＋浓度过 。 ③ 出现质量问题。 ④变性时的温度 ，变性时间 。 结果分析 TaqDNA聚合酶 低 引物 低 短 注：DNA聚合酶需要Mg2+激活； 注：双链DNA没有解聚为单链， 导致模板DNA失效。 模板、引物、原料、酶(反应组分)失效 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定 2.如果不止一条条带(即出现非特异性扩增)，分析其可能原因： ①模板DNA出现 。 ② 特异性不强或形成 二聚体。 ③Mg2＋浓度过 。 ④复性时的温度 等。 结果分析 污染 引物 引物 高 过低 模板、引物、原料、酶(反应组分)特异性差 注：Mg2+浓度过高(影响酶)和复性温度过低 会过度稳定非特异性结合的引物-模板复合物。 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定 用PCR可以扩增mRNA吗？ 思考 mRNA不可以直接扩增， 需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。 通过电泳条带能否确定扩增产物一定是所需的DNA片段？为什么 思考 不能确定；因为电泳条带仅能显示扩增片段的大致长度， 不能显示精准的DNA碱基数量，也不能呈现碱基序列。 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定·随堂小练P67 【例1】关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列相关叙述正确的是(　　) A．PCR仪实质上就是一台能自动调控温度的仪器，但在使用时需根据扩增的DNA 片段以及引物的情况人工设定合适的温度 B．PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在复性过程中起作用 C．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水 和移液器等在使用前都必须进行高压灭菌处理 D．电泳时，电泳缓冲液不能没过凝胶，以免凝胶加样孔中的电泳样液流出 A 延伸，×； 移液器不需要高压灭菌，×； 电泳时，电泳缓冲液以没过凝胶1mm为宜，×； 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定·随堂小练P67 【例2】用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为无菌蒸馏水，PCR时加入的模板DNA如图所示。 实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定·随堂小练P67 据此作出的分析，不合理的是(　　) A．PCR产物的分子大小在250～500 bp之间 B．3号样品为不含目的基因的载体DNA C．9号样品对应植株不是所需的转基因植株 D．10号确定反应体系等对结果没有干扰 B 同4～9号，含有，×； Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.6.10 $$