3.2.1 基因工程的基本操作程序(3个课时)-【堂堂清】2024-2025学年高二生物下学期同步精品课件（2019人教版选择性必修3）

3.2.1 基因工程的基本操作程序 本节聚焦： 1.基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？ 2.基因工程操作的每一步涉及的技术和方法? 从社会中来 【资料1】我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。 【资料2】苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白(Bt抗虫蛋白)，破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫,用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害。 我们能否培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种呢？ 思考 00 从社会中来 【资料3】科学家通过实验，将苏云金杆菌的Bt抗虫基因(杀虫基因)转到棉花里，让棉花也能产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。 请结合我们学习过的内容思考， 培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？ 思考 00 从社会中来 苏云金杆菌 普通棉花 （无抗虫特性） 棉花细胞 抗虫棉 提取 表达Bt基因 导入 与载体拼接 Bt基因 重组DNA分子 ④目的基因的检测与鉴定 ①目的基因的 筛选与获取 ②基因表达 载体的构建 ③将目的基因导入受体细胞 00 基因工程的基本操作程序 ①目的基因的筛选与获取 ②基因表达载体的构建 ③将目的基因导入受体细胞 ④目的基因的检测和鉴定 00 重组DNA分子 ①目的基因的筛选与获取 目的基因的筛选与获取 01 目的基因一定是指编码蛋白质的基因吗？ 思考 （一）什么是目的基因？ 1.概念： 在基因工程的设计和操作中， 用于改变 或获得 等的基因。 2.作用： 根据不同的需要，目的基因是不同的， 它主要是指 的基因。 3.实例： 与生物 、 、 和 等相关的基因。 受体细胞性状 预期表达产物 编码蛋白质 抗逆性 生产药物 毒物降解 工业用酶 不一定； 也可以是一些具有调控作用的因子。 目的基因的筛选与获取 01 （二）如何筛选合适的目的基因？ ★较为有效的方法 从相关的 和 的基因中进行筛选。 实例：Bt抗虫蛋白基因(Bt基因)的筛选过程 用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂， 广泛用于防治棉花虫害已有多年历史 苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关 掌握了Bt基因的序列信息 对Bt基因的表达产物——Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解 Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因 已知结构 功能清晰 目的基因的筛选与获取 01 （三）如何获取目的基因？ 方法一： 目的基因； 方法二：通过构建 来获取目的基因； 方法三：常用 特异性地快速扩增目的基因。 人工合成 基因文库 PCR 扩展：人工合成目的基因 01 【资料1】在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中， 科学家采用的是人工合成的方法。 【资料2】若基因比较小、核苷酸序列已知，可通过DNA合成仪用化学方法 直接人工合成。常用的人工合成方法有反转录法、氨基酸序列推测法。 DNA合成仪 通过人工合成的目的基因有什么特点？ 思考 基因比较小、核苷酸序列已知。 扩展：基因文库 01 【资料3】将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 【资料4】基因文库的分类： ①基因组文库：含有一种生物所有基因的文库; ②部分基因文库：只含有一种生物部分基因的文库,如：cDNA(互补DNA)文库。 基因文库中是直接储存相应基因吗？ 思考 基因文库中不是直接储存相应基因， 而是保存受体菌，受体菌中含有基因。 扩展：基因文库 01 基因组文库 cDNA文库 某生物体内全部DNA 限制酶 与载体 连接导入 许多DNA片段 受体菌群体 某生物某时期的mRNA 逆转录等 与载体 连接导入 cDNA（互补DNA） 受体菌群体 扩展：基因文库 01 【思考】cDNA(互补DNA)的合成过程： ①逆转录酶以 为模板合成一条与RNA互补的 链， 形成RNA-DNA杂交分子； ②核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的 链，使之变成单链DNA； ③以单链 为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的 链， 形成双链DNA分子，即cDNA。 mRNA DNA RNA DNA DNA 重难点：利用PCR获得和扩增目的基因 01 1.概念：PCR是 (全称)的缩写。 它是一项根据 的原理， 在 (操作环境)提供参与DNA复制的 与 ， 对 进行大量复制的技术(目的/优点)。 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 体外 目的基因的核苷酸序列 PCR扩增仪(PCR仪) DNA复制需要什么组分和 反应条件？ 思考 各种组分 反应条件 旧知识回顾：DNA的复制过程 01 ①解旋:需要细胞提供 ，需要 催化，使 断裂； ②合成子链 模板： ； 原料： ； 酶： ； ③重新螺旋形成新的DNA分子. 能量 解旋酶 氢键 体外用高温代替！ 亲代DNA的两条链(母链) 游离的4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶不能直接将 单个的核苷酸聚合成链。 引物 引物:是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 DNA聚合酶 旧知识回顾：DNA的复制过程 01 ①解旋:需要细胞提供 ，需要 催化，使 断裂； ②合成子链 模板： ； 原料： ； 酶： ； ③重新螺旋形成新的DNA分子. 能量 解旋酶 氢键 体外用高温代替！ 亲代DNA的两条链(母链) 游离的4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶不能直接将 单个的核苷酸聚合成链。 引物 DNA聚合酶 DNA子链的延伸方向是5’-端→3’-端，则DNA聚合酶能够从引物的哪一段端开始连接脱氧核苷酸？ 思考 3’-端。 重难点：利用PCR获得和扩增目的基因 01 2.DNA体内复制的条件： 参与的组分 在DNA复制中的作用 断开氢键，打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成DNA子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物 的3’端开始连接脱氧核苷酸 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 重难点：利用PCR获得和扩增目的基因 01 2.DNA体外复制（PCR）的条件： 参与的组分 在DNA复制中的作用 断开氢键，打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成DNA子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物 的3’端开始连接脱氧核苷酸 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 无需解旋酶，用高温代替 耐高温的DNA聚合酶② 2种，长度通常为20-30个核苷酸③ 4种脱氧核苷酸（dNTP）① 重难点：利用PCR获得和扩增目的基因 01 【补充说明①】dNTP dNTP是脱氧核苷三磷酸的缩写， N是指A、T、G、C四种含氮碱基， 包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。 P P P ～ ～ N 脱氧核糖 A T G C 脱氧核苷酸 即可作原料，又可提供能量。 在PCR过程中实际加入的原料为dNTP，有什么优点？ 思考 重难点：利用PCR获得和扩增目的基因 01 【补充说明②】耐高温的DNA聚合酶 1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。真核细胞和细菌的DNA聚合酶需要Mg2＋激活。 真核细胞和细菌的DNA聚合酶需要Mg2＋激活。 因此，PCR反应缓冲液中一般还需要添加什么物质？ 思考 Mg2＋. 重难点：利用PCR获得和扩增目的基因 01 【补充说明③】引物 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。 长度通常为20-30个核苷酸。引物可以是DNA单链，也可以为RNA单链。 细胞内通常以RNA单链为引物，细胞外（PCR）一般以DNA单链为引物。 用于PCR的引物有何特点？ 思考 ①一般是DNA单链。 ②长度通常为20～30个核苷酸。 重难点：利用PCR获得和扩增目的基因 01 ① ： 当温度 时， 双链DNA 为单链。 ② ： 当温度下降到 时， 通过碱基互补配对 与两条单链DNA结合。 ③ ： 当温度上升到 时， 溶液中的4种脱氧核苷酸在 的作用下， 根据 原则合成 新的DNA链。 变性 超过90℃ 解聚 复性 50℃左右 两种引物 延伸 72℃左右 耐高温的DNA聚合酶 碱基互补配对 3.DNA体外复制（PCR）的过程：在 中自动完成。 PCR扩增仪 重难点：利用PCR获得和扩增目的基因 01 第二轮循环的产物 第三轮循环的产物 第一轮循环的 . 作为第二轮反应的 ， 经过 、 . 和 三步产生 第二轮循环的产物。 产物 模板 变性 复性 延伸 第二轮循环的 . 作为第三轮反应的 ， 经过 、 . 和 三步产生 第三轮循环的产物。 产物 模板 变性 复性 延伸 一次PCR一般要经历30次循环 重难点：利用PCR获得和扩增目的基因 01 重难点：利用PCR获得和扩增目的基因 01 4.PCR的结果： 由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板， 因而每一次循环后目的基因的量可以增加 倍。即成 形式扩增。 （约为 ，其中n为扩增循环的次数）。 5.PCR产物的鉴定:常采用 来鉴定PCR的产物。 一 指数 2n 琼脂糖凝胶电泳 提示：由于DNA聚合酶不能直接将单个的核苷酸聚合成链。 所以，复制的DNA片段，其长度是由 决定的。 引物的位置 复制的DNA片段，其长度是有什么决定的？ 思考 重难点：利用PCR获得和扩增目的基因 01 【素养提升①】获得所需的目的基因： 一 5' 3' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 目的片段 第一轮 【思考】第几轮PCR循环结束时，可出现两条单链等长的目的片段？ 5' 3' 5' 3' 引物A 3' 5' 5' 3' 引物B 目的片段 1.若两条引物均从DNA分子端部结合， 则第 轮PCR循环结束时出现两条单链等长的目的片段。 重难点：利用PCR获得和扩增目的基因 01 【素养提升①】获得所需的目的基因： 2.若一条引物从DNA分子端部结合，另一条引物从DNA分子中间部位结合， 则第 轮PCR循环结束时出现两条单链等长的目的片段。 5' 3' 5' 3' 引物A 3' 5' 5' 3' 引物B 目的片段 第一轮 第二轮 目的片段 5' 3' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 二 5' 3' 5' 3' 5' 3' 目的片段 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 重难点：利用PCR获得和扩增目的基因 01 【素养提升①】获得所需的目的基因： 3.若两条引物均从DNA分子中间部位结合时， 则第 轮PCR循环结束时出现两条单链等长的目的片段。 5' 3' 5' 3' 引物A 3' 5' 5' 3' 引物B 目的片段 第一轮 第二轮 5' 3' 5' 3' 5' 3' 目的片段 5' 3' 目的片段 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 5' 第三轮 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 三 重难点：利用PCR获得和扩增目的基因 01 【素养提升②】PCR中的数量关系： (设n为扩增循环的次数，即DNA复制次数) 1.DNA分子数： 。 2.含引物的DNA分子数： 。 3.含其中一种引物的DNA分子数： 。 4.同时含两种引物的DNA分子数： 。 5.共消耗引物的对数： 。 6.含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数： 。 （注：以两条引物均从DNA分子中间部位结合为例） 第三轮 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 2n 2n 2n－1 2n－2 2n－1 2n－2n 重难点：利用PCR获得和扩增目的基因 01 【素养提升③】引物的设计： 1．PCR扩增的 (填“是”或“不是”) 完整的模板DNA分子， 理由是 。 2．如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是 。 3.要保证目的基因能与载体相连接，要在两种引物的 分别 添加上 。 不是 PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段 根据目的基因两端（ ′端）的核苷酸序列设计引物 5′端 限制酶的识别序列 3 重难点：利用PCR获得和扩增目的基因 01 【素养提升③】引物的设计： 4.图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理， 第1组不合理的原因： 。 第2组不合理的原因： 。 引物Ⅰ和引物Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而失效 引物Ⅰ′自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效 设计引物的原则： ①两种引物之间: ； ②每种引物内部: ； 不能在局部发生碱基互补配对 不能在局部发生碱基互补配对 只要引物是过量的，模板与引物配对结合的概率就特别高，就能保证复性时是引物和模板链配对结合。 目的基因的筛选与获取·判断正误P60 01 (1)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应(　　)(2)PCR扩增技术中，需用解旋酶使双链DNA解聚(　　)(3)PCR过程使用的DNA聚合酶的特点是耐高温(　　)(4)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高， DNA变性解链的温度就越高(　　) × 为了变性、复性、延伸，DNA聚合酶催化子链的延伸。 × 高温。 √ √ 目的基因的筛选与获取·落实思维方法P61 01 1．下列有关获取目的基因的叙述，错误的是(　　) A．目的基因就是编码蛋白质的基因 B．获取目的基因是基因工程的第一步 C．来自苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因可作为转基因抗虫棉的目的基因 D．序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会 A 也可以是一些具有调控作用的因子，×； 目的基因的筛选与获取·落实思维方法P61 01 2．如图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。 下列有关叙述错误的是(　　) D A．耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3′端 B．在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段 C．引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因 D．从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4 第三轮循环共产生8个DNA，其中含有引物A的DNA是7个，即占7/8，×； 3.2.2 基因工程的基本操作程序 本节聚焦： 1.基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？ 2.基因工程操作的每一步涉及的技术和方法? 旧知识回顾 00 获取目的基因的方法： ① 目的基因； ②通过构建 来获取目的基因； ③常用 特异性地快速扩增目的基因。 人工合成 基因文库 PCR 获得了目的基因后能不能直接将目的基因导入受体细胞，为什么？ 思考 提示：不能，原因：①游离的DNA进入细胞后，一般会 ； ②即使可以进行转录和翻译，游离的DNA也无法跟着 进行复制， 导致子代细胞中 。 直接被分解 细胞分裂 不再含有目的基因 那怎样才能让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代呢？ 基因工程的基本操作程序 00 重组DNA分子 ①目的基因的筛选与获取 ②基因表达载体的构建 ③将目的基因导入受体细胞 ④目的基因的检测和鉴定 ★核心工作 基因1 基因2 基因3 知识扩展：原核细胞基因的结构 02 DNA分子 基因通常是有遗传效应的DNA片段，一个DNA上有多个基因。 原核生物 的基因 ↓放大 ① 编码区： 转录相应的mRNA， 编码(翻译)出蛋白质的DNA区段。 ②非编码区： 转录相应的mRNA， 编码(翻译)出蛋白质的DNA区段。 注：非编码区含有能调控遗传信息表达的DNA序列。 能 能 不能 不能 ① 编码区：能转录相应的mRNA，进一步编码(翻译)出蛋白质的DNA区段。 ②非编码区：不能转录相应的mRNA，也不能编码(翻译)出蛋白质的DNA区段。 知识扩展：原核细胞基因的结构 02 启动子 终止子 ①启动子： 本质：一段有特殊序列结构的DNA片段； 位置：位于基因的 ； 作用： 酶识别并结合的部位，能驱动基因转录出mRNA； ②终止子： 本质：一段有特殊序列结构的DNA片段； 位置：位于基因的 ； 作用： ； 上游 RNA聚合 下游 终止转录 注：根据启动子的转录模式，有三种类型； ① 编码区：能转录相应的mRNA，进一步编码(翻译)出蛋白质的DNA区段。 ②非编码区：不能转录相应的mRNA，也不能编码(翻译)出蛋白质的DNA区段。 知识扩展：原核细胞基因的结构 02 启动子 终止子 【拓展延伸】根据启动子的转录模式，可分为： ① 启动子：其调控作用使得基因在不同部位或组织中的表达水平相当。 这类启动子一般来自管家基因，可连续不断地启动基因的表达。 ② 启动子：其调控作用使得基因往往只在某些特定器官或组织中表达。这类启动子一般来自奢侈基因，其启动的外源基因在仅在特定的部位特异表达。 ③ 启动子：当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。 组成型 组织特异性 诱导型 ① 编码区：能转录相应的mRNA，进一步编码(翻译)出蛋白质的DNA区段。 ②非编码区：不能转录相应的mRNA，也不能编码(翻译)出蛋白质的DNA区段。 知识扩展：原核细胞基因的表达 02 启动子 终止子 转 录 mRNA 翻 译 多肽链 终止密码子不编码 氨基酸 ① 编码区：能转录相应的mRNA，进一步编码(翻译)出蛋白质的DNA区段。 ②非编码区：不能转录相应的mRNA，也不能编码(翻译)出蛋白质的DNA区段。 基因1 基因2 基因3 知识扩展：真核细胞基因的结构 02 DNA分子 基因通常是有遗传效应的DNA片段，一个DNA上有多个基因。 ↓放大 【注意】不同于原核生物的基因，真核生物的编码区是 。 又可分为：①外显子： 转录相应的mRNA， 编码蛋白质的DNA序列。 ②内含子： 转录相应的mRNA， 编码蛋白质的DNA序列。 真核生物 的基因 能 能 能 不能 不连续，有间隔的 数量关系：外显子=内含子+1 ① 编码区：能转录相应的mRNA，进一步编码(翻译)出蛋白质的DNA区段。 ②非编码区：不能转录相应的mRNA，也不能编码(翻译)出蛋白质的DNA区段。 知识扩展：真核细胞基因的表达 02 启动子 终止子 转 录 前体mRNA 翻 译 多肽链 加 工 成熟mRNA 终止密码子不编码 氨基酸 ① 编码区：能转录相应的mRNA，进一步编码(翻译)出蛋白质的DNA区段。 ②非编码区：不能转录相应的mRNA，也不能编码(翻译)出蛋白质的DNA区段。 基因表达载体的构建（基因工程的核心工作） 02 1.基因表达载体构建的目的： ①让目的基因在受体细胞中 ，并且可以遗传给下一代。 ②同时使目的基因能够 和 。 2.基因表达载体的组成： 稳定存在 表达 发挥作用 呆得住 能表达：转录、翻译 :便于重组DNA分子的筛选； : 位置：位于基因的上游； 作用：RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动转录； : :主要是指编码特定蛋白质的基因； 位置：位于基因的下游； 作用：终止转录； 终止子 启动子 标记基因 目的基因 复制原点：能够完成自主复制； 基因表达载体的构建（基因工程的核心工作） 02 目的基因插入位点是随意的吗？应注意什么？ 思考 提示： 随意的； 目的基因的表达需要 与 的调控， 所以目的基因应插入到启动子和终止子 的部位。 不是 启动子 终止子 之间 注：目的基因只有插入在启动子和终止子之间，才可以正常表达 基因表达载体的构建（基因工程的核心工作） 02 3.基因表达载体的构建过程: ①用一定的 切割载体(质粒)，使它出现 个切口。 ②用 限制酶或能产生 末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。 ③利用 将含目的基因的DNA片段拼接到载体的切口处， 这样就形成了 （即： ）。 限制酶 同种 相同 DNA连接酶 一 一个重组DNA分子 基因表达载体 基因表达载体的构建·判断正误P61 02 (1)基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取(　　) (2)基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子(　　) (3)标记基因不一定是抗生素抗性基因(　　) × 基因表达载体的构建。 × 终止子 √ 位置 作用 特点 启动子 的起始点 起 作用， 本身 ；. 终止子 的终点 起始密码子 的起始点 氨基酸 终止密码子 的终点 氨基酸 DNA上 mRNA上 翻译 翻译 转录 转录 不转录 编码 不编码 调控 提示： ； 原因：用SmaⅠ会破坏质粒的 ， 不利于 。 重难点：限制酶的选择原则 02 １．构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？ 不能 抗生素抗性基因（标记基因） 进一步筛选重组DNA分子 提示： ； 弊端：① ； ② ； ③ ； 重难点：限制酶的选择原则 02 相同的黏性末端，可以相互连接！ 2.只使用EcoRⅠ分别切割质粒和外源DNA，能否构建基因表达载体？ 能 质粒、目的基因会发生自身环化连接 质粒与目的基因会发生反向连接 会发生两两自身连接 注：用同种限制酶或 同尾酶处理，产生的 都是相同的黏性末端，均会出现以上弊端。 单酶切法 提示： ； 优点：① ； ② ； 重难点：限制酶的选择原则 02 3.使用Bam HⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA， 能否构建基因表达载体？ 可以防止质粒、目的基因的自身环化连接 还可以防止目的基因与载体的反向连接 注：不能防止 两两自身连接。 相同的黏性末端，可以相互连接！ 能 双酶切法 善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点和作用是：①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接，即DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向(或描述为“RNA聚合酶的移动方向”)必须是相同的。否则目的基因导入后无法正常转录、表达。 重难点：限制酶的选择原则 02 【小结】选择限制酶的基本原则: ①切割目的基因时: ； ②切割质粒时:至少保留一个完整的 ,便于筛选； 除此之外还需保留 、 、 。 ③确保目的基因和载体上有 黏性末端 (补充说明：平末端也可以，但连接平末端效率低）。 能切下目的基因且不破坏目的基因 相同 标记基因 复制原点 启动子 终止子 基因表达载体的构建·落实思维方法P63 02 3．某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　) A．质粒和目的基因都用酶3切割，常用E.coli DNA连接酶连接 B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接 C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接 D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接 C 酶3切割后得到的是平末端，E.coli DNA连接酶连接平末端效率极低，×； 酶3切割后得到的是平末端，酶1切割后得到的是黏性末端，不能连接，×； 双酶切法，合理且效率高，，√； 酶4会破坏质粒上的抗生素抗性基因，无法进行后续的筛选 ，×； 基因表达载体的构建·落实思维方法P63 02 4．用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　) A．若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同 B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因 C．若用ScaⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Tet(四环素)的培养基中能形成菌落 D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp和Tet的培养基中能形成菌落 D 若用Hind Ⅲ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，√； 重组质粒和普通质粒中都有TetR(四)，不一定有目的基因，√； (氨AmpR)被破坏，(四TetR)作为标记基因，√； (四TetR)被破坏，(氨AmpR)作为标记基因，仅在含Amp的培养基中能形成菌落，×； 基因表达载体的构建·小本P122 02 9．当目的基因和质粒都用Hind Ⅲ处理、连接后，目的基因可能正向插入载体，也可能反向插入载体，为判断目的基因的插入方向，可使用限制酶处理，并进行电泳检测(如图)。下列选项中能判断目的基因插入方向的限制酶是(　　) A．Hind Ⅲ B．EcoRⅠ C．BamHⅠ D．EcoRⅠ和HindⅢ 注：EcoRⅠ、BamHⅠ和Hind Ⅲ的识别序列、切割位点均不同， 数字表示相邻两个限制酶切点之间的碱基对数(bp)，质粒全长20 000 bp。 B 基因表达载体的构建·小本P124 02 15.某质粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶切割位点，同时还含有四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程如图1所示。 (3)在构建重组质粒时，应选用 两种酶对质粒和含抗盐基因的DNA进行切割，以保证重组DNA序列的唯一性。 SalⅠ和HindⅢ 基因表达载体的构建·小本P124 02 (4)如图2表示运用影印培养法(使一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法)检测基因表达载体是否导入了农杆菌。 培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基A和培养基B分别还含有 、 。 从检测筛选的结果分析，含有目的基因的是 (填图2中的数字)菌落中的细菌。 氨苄青霉素 四环素(或氨苄青霉素和四环素) 4和6 普通质粒：氨苄+四环 重组质粒：氨苄 3.2.3 基因工程的基本操作程序 本节聚焦： 1.基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？ 2.基因工程操作的每一步涉及的技术和方法? 基因工程的基本操作程序 ①目的基因的筛选与获取 ②基因表达载体的构建 ③将目的基因导入受体细胞 ④目的基因的检测和鉴定 00 重组DNA分子 ③将目的基因导入受体细胞 常用方法 将目的基因导入 植物细胞 将目的基因导入 动物细胞 将目的基因导入 微生物细胞 将目的基因导入受体细胞 03 Ga2+处理法 （感受态细胞法） 农杆菌转化法 花粉管通道法 显微注射法 将目的基因导入受体细胞·植物细胞 03 1.花粉管通道法：(我国科学家独创) ①方法一：用微量注射器将含目的基因的 DNA溶液直接注入 中。 ②方法二：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头， 将DNA溶液滴加在花柱切面上， 使目的基因借助 进入胚囊。 子房 花粉管通道 受体细胞： 受精卵 将目的基因导入受体细胞·植物细胞 03 【资料】我国科学家独创的花粉管通道法，是利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，将外源基因携带进入胚囊，此时的受精卵未形成细胞壁，且正在进行活跃的DNA复制，容易将外源DNA片段整合到受体基因组中。 我国科学家独创的花粉管通道法有什么优点？ 思考 操作简单、技术成本低，免去了组织培养 以及诱导再生植株的全套人工培养过程。 将目的基因导入受体细胞·植物细胞 03 2.农杆菌转化法：(常用) 【资料】转化： 是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内 和 的过程。 【资料】农杆菌的特点： 农杆菌细胞内含有 质粒， 当它侵染植物细胞后， 能将Ti质粒上的 (可转移的DNA) 转移到被侵染的细胞内， 并且将其整合到该细胞的 上。 维持稳定 表达 注：农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力； 随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。 Ti T-DNA 染色体DNA 将目的基因导入受体细胞·植物细胞 03 请根据农杆菌的特点，写出利用农杆菌进行转化的思路。 思考 Ti质粒 目的基因 植物细胞 植物 细胞 染色体DNA 农杆菌 基因表达载体 导入 插入 表达 新 性状 植株 转入 构建 两次拼接 ①第一次拼接： 将 拼接到 上； ②第二次拼接（非人工操作）： 将 拼接到 上。 将目的基因导入受体细胞·植物细胞 03 农杆菌转化法中进行了两次拼接，有什么区别？ 思考 目的基因 Ti质粒的T－DNA 被插入目的基因的T－DNA 受体细胞染色体的DNA 两次导入 ①第一次导入： 将 导入到 上； ②第二次导入（非人工操作）： 将 导入到 上。 将目的基因导入受体细胞·植物细胞 03 农杆菌转化法中进行了两次导入，有什么区别？ 思考 含目的基因的重组Ti质粒 农杆菌 含目的基因的T－DNA 受体细胞 将目的基因导入受体细胞·植物细胞 03 2.农杆菌转化法： ①方法一： 可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片 ， 然后 ，并 ； ②方法二： 可以将 直接浸没在 中一段时间， 然后培养植株并获得 ， 再进行 、 等； 受体细胞： 与农杆菌共培养 筛选转化细胞 再生成植株 体细胞 花序 含有农杆菌的溶液 种子 筛选 鉴定 受体细胞： 受精卵 对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。 将目的基因导入受体细胞·动物细胞 03 3.显微注射法： 显微注射 受精卵 受体细胞： 受精卵 构建基因表达载体并提纯 利用 将基因表达载体注入动物的 中 早期胚胎培养 胚胎移植 获得具有新性状的动物 对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。 将目的基因导入受体细胞·微生物细胞 03 单细胞、繁殖快、易于培养、遗传物质相对较少。 在基因工程操作中，常以原核生物作为受体细胞， 其中以大肠杆菌应用最为广泛。有什么优点？ 思考 大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。在生产需要加工和分泌的蛋白质时，谁更有优势？ 思考 酵母菌，因为酵母菌是真核细胞，具有多种细胞器， 内质网和高尔基体可以对翻译形成的多肽链进一步加工。 将目的基因导入受体细胞·判断正误P64 03 (1)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵 为受体细胞(　　) (2)Ti质粒上的T－DNA可转移到植物细胞内，并且与其染色体DNA整合在一起(　　) (3)常用卵细胞作为培育转基因动物的受体细胞(　　) × 导入植物细胞， 受体细胞可以是受精卵，也可以是体细胞。 √ × 受精卵 将目的基因导入受体细胞·微生物细胞 03 4.Ga2+处理法（感受态细胞法）： 大肠杆菌 感受态细胞 Ca2+ 混合 基因表达载体 缓冲液 吸收DNA 完成转化 Ca2+的作用是什么？ 思考 增加细菌细胞壁的通透性。 感受态细胞有什么特点？ 思考 细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 将目的基因导入受体细胞·落实思维方法P66 03 B 1．如图为科学家通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中，与棉花的DNA分子“结合起来”而发挥作用的过程示意图。下列相关说法不正确的是(　　) A．图中Ⅰ是质粒，步骤①需要用到限制酶和DNA连接酶 B．图中Ⅱ是含目的基因的重组质粒，步骤②是将重组质粒导入棉花细胞 C．图中Ⅲ是农杆菌，通过步骤③将目的基因导入植物细胞 D．剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因不会影响抗虫基因的表达 农杆菌，×； 基因工程的基本操作程序 00 重组DNA分子 ①目的基因的筛选与获取 ②基因表达载体的构建 ③将目的基因导入受体细胞 ④目的基因的检测和鉴定 ④目的基因的检测和鉴定 目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性， 只有通过检测与鉴定才能知道。 目的基因的检测与鉴定 04 类型 检测内容 方法 分子水平的检测 受体细胞的染色体DNA上 是否插入了 . 目的基因是否转录出了 . 目的基因是否翻译成 . 个体生物学水平的鉴定 个体是否具有相应 . 目的基因(DNA) mRNA PCR等技术 蛋白质 抗原-抗体杂交技术 性状 抗虫接种实验、 抗病接种实验等 检测内容及方法 是否成功表达，检测蛋白质 逆转录 目的基因的检测与鉴定·①PCR等技术检测 04 提取 待测DNA 转基因 生物 PCR 通过电泳检测是否扩增出目的基因 提取 待测mRNA 转基因 生物 PCR 利用目的基因的核苷酸序列设计引物。 PCR中的引物应该根据什么进行设计？ 思考 目的基因的检测与鉴定·②DNA分子杂交技术 04 1.检测工具： 。 带有标记(放射性同位素标记或荧光分子标记等) 的单链核酸片段(DNA或RNA)， 能与目的基因的一条链发生碱基互补配对。 基因探针 利用基因探针检测目的基因是否导入的原理是？ 思考 碱基互补配对原则。 带标记的基因探针（可以是DNA或RNA），与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。 目的基因的检测与鉴定·②DNA分子杂交技术 04 2.基本思路： ①制作基因探针,并用 扩增; ②提取受体细胞全部DNA并用 扩增，与基因探针置于同一培养液； ③ 处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。 ④如果显示出 ，就表明目的基因已插入染色体DNA中。 PCR PCR 高温变性 杂交带 带标记的基因探针（可以是DNA或RNA），与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。 目的基因的检测与鉴定·②DNA分子杂交技术 04 3.检测受体细胞是否含目的基因的具体过程： 提取DNA 样本 基因组DNA 酶切 DNA片段 电泳 转膜 硝酸纤维素膜 基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩瀚的基因组中把目的基因显示出来。 待测DNA 目的基因 目的基因的检测与鉴定·③抗原-抗体杂交技术 04 1.检测对象： ，即检测目的基因是否翻译/成功表达。 2.基本思路： 蛋白质 从转基因生物中提取出 . 用相应的抗体进行 杂交 若出现 , 则表明目的基因已形成蛋白质产品。 待检测蛋白质 抗原－抗体 杂交带 抗原-抗体技术的原理是？ 思考 抗原与抗体的特异性结合。 目的基因的检测与鉴定·个体生物学水平的鉴定实例 04 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 饲喂害虫 害虫死亡 病毒（菌）感染 未染病 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行 功能活性比较 功能、活性正常 目的基因的检测与鉴定 04 是否成功表达，检测蛋白质 目的基因的检测与鉴定·判断正误P64 04 (4)检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术(　　) (5)用PCR技术检测目的基因是否转录出mRNA，利用了碱基互补配对原则(　　) (6)基因工程是否成功需进行个体生物学水平的鉴定(　　) √ √ √ 目的基因的检测与鉴定·落实思维方法P66 04 2．科学家将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因(抗虫基因)导入棉花的愈伤组织细胞并进行组织培养获得棉花植株。经棉铃虫饲喂实验，发现棉花植株并无抗虫性状，科学家提取棉花叶片细胞中的有关成分进行了如下操作。 下列有关分析错误的是(　　) A．提取细胞中的蛋白质，采用抗原—抗体杂交技术进行检测，若检测到细胞中无Bt抗虫蛋白，则说明抗虫基因不能表达 B．若经A检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白，可采用PCR等技术检测细胞中的RNA，若检测到Bt抗虫蛋白的mRNA，则说明抗虫基因能正常转录和翻译 C．若经B检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白的mRNA，可采用PCR等技术检测细胞中的DNA，若能检测到抗虫基因，则可能是抗虫基因反向插入载体中或抗虫基因不能正常转录 D．若经C检测确定细胞中无抗虫基因，则可能是将没有目的基因的载体DNA分子导入了受体细胞 B 练习与应用·书本P83 1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。 (1)afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。（ ） (2)构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。（ ） (3)只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。（ ） 2.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是（ ） A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶 B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶 C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则 D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸 √ × × D Lavf58.12.100 $$