3.2 基因工程的基本操作程序-2024-2025学年高二生物同步备课课件（人教版2019选择性必修3）

3.2 基因工程的基本操作程序 从社会中来 Bt基因 Bt抗虫蛋白 表达 与表面受体结合 细胞膜穿孔 破坏细胞渗透平衡 最终导致昆虫停止取食而死亡 昆虫肠上皮细胞 传统的杂交育种方法可以培养出抗虫棉吗？ × 导入 棉花细胞 培育 抗虫棉 基因工程 培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤? 苏云金杆菌 与载体拼接 普通棉花 （无抗虫特性） 棉花细胞 抗虫棉 提取 表达Bt基因 导入 Bt基因 重组DNA分子 培育转基因抗虫棉的简要过程 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的 检测与鉴定 一、目的基因的筛选与获取 (1)概念： 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。 (2)实例： 与生物抗逆性、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。 主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。 1.目的基因 资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。 科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。 目的基因(Bt 抗虫蛋白基因，简称: Bt 基因) 那么，如何筛选目的基因呢？ 2. 筛选合适的目的基因 （1）方法： 从相关的___________和___________的基因中进行筛选是较为有效的方法。 （2）实例： 已知结构 功能清晰 Bt抗虫蛋白基因（Bt基因）的筛选过程 用苏云金杆菌（Bt）制成的生物杀虫剂，广泛用于防治棉花虫害 对Bt基因的表达产物——Bt抗虫蛋白有较为深入的了解：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。 苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关 掌握了Bt基因的序列信息 Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因 测序技术 序列数据库 序列比对工具 随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。 DNA测序仪 核苷酸序列比对 氨基酸序列比对 美国国家生物信息中心 测定核酸和蛋白质序列 以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库 把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。 明确了目的基因后，该怎么获得它呢？ （1）人工合成目的基因。 （2）从基因文库中获取目的基因。 （3）常用PCR特异性地快速扩增目的基因。 基因文库 基因组文库：包含某生物全部基因 部分基因文库：主要是cDNA文库，包含某生物部分基因 在明确目的基因碱基序列的基础上，利用DNA合成仪自动化合成所需的DNA片段。 3.获取目的基因的方法 4.利用PCR获取和扩增目的基因 （1）概念： PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 （2）原理： DNA半保留复制 （3）操作环境： 体外复制（PCR扩增仪/PCR仪）。 （4）目的： 对目的基因的核苷酸序列进行大量复制。 （5）优点： 可以在短时间内大量扩增目的基因。 DNA复制的过程 DNA复制的条件: ③能量： 亲代DNA的两条链 4种游离的脱氧核苷酸 解旋酶、DNA聚合酶 由细胞代谢提供的ATP ①模板： ②原料： ④酶： 体外用高温代替 体外需用耐高温的DNA聚合酶（Taq酶） 4.利用PCR获取和扩增目的基因 ⑤其他条件： 引物、一定的缓冲液、控制温度 （一般会加Mg2+，激活DNA聚合酶） 在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作原料，又能提供能量。 思考讨论：什么是引物？引物的作用是什么？ （1）定义：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。（用于PCR的引物长度通常为20-30个核苷酸） （2) 作用：引物为DNA聚合酶提供了游离的3’端，使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始拼接单个的核苷酸。 解旋酶 由于DNA双链是反向平行的，所以需要2种引物。 引物结合在模板链的3’端 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 设计引物的依据是？ 已知目的基因两端（3’端）的部分核苷酸序列，以便根据该序列合成引物。 图中是PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题： （1）图2是某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理，请分别说明理由。 第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生 而失效。 第2组：引物Ⅰ′ 后会出现局部 而失效。 碱基互补配对 自身折叠 碱基互补配对 每种引物内部不能发生局部碱基互补配对 两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对 思考讨论 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶） 4种脱氧核苷酸（dNTP） 引物 待扩增的DNA片段（模板） 5’ 5’ 变性 复性 延伸 温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。 PCR反应的过程 3’ 3’ 3’ 3’ 第一轮循环的产物作为第二轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环产物。 第二轮循环的产物作为第三轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环产物。 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。 PCR反应的过程 PCR技术获取目的基因时要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？ 至少3次 3’ 5’ 第 一 次 循 环 90℃以上，DNA双链解开 50℃左右，引物与DNA结合 72℃左右，新DNA合成 3’ 5’ 5’ 3’ A 5’ B 5’ A B 3’ 5’ 5’ 5’ 第 二次 循 环 A B 5’ 3’ 5’ 5’ A B A B A B 3’ 5’ 高温（90℃以上）变性、低温（50℃左右）复性 中温延伸(72℃左右） 第 二次 循 环 A B A B A B 3’ 5’ 高温变性、低温复性 A B A B A B A B 第 三次 循 环 A B A A B B 3’ 5’ 中温延伸 第 三次 循 环 A B A B A B A B B A A B A 3’ B 5’ 一个DNA，一对引物（A与B），通过PCR扩增n次后： ①DNA分子有：___个 ②DNA链有：_____条 ③子代等长链DNA分子（目的基因）数目：______个 ④子代DNA分子中含引物的DNA分子数为____个; ⑤含引物A（或B）的DNA分子数为：______个, ⑥同时含两种引物的DNA分子数________个; ⑦复制过程中共需引物_________个 ⑧第n次复制需要引物______个 2n 2n+1 2n-1 2n＋1 - 2 2n 2n-2n PCR扩增DNA规律 2n－2 2n 用PCR可以扩增mRNA吗？ mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。 ①逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子； ②核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA； ③以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA。 5.PCR产物鉴定 PCR过程可以在 中自动完成，完成以后，常采用 来鉴定PCR的产物 琼脂糖凝胶电泳 PCR扩增仪 (1)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应 （　 　） (2)PCR扩增技术中，需用解旋酶使双链DNA解聚 （　 　） (3)PCR过程使用的DNA聚合酶的特点是耐高温 （　 　） (4)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性的温度就越高 （　 ） (5)PCR扩增过程中，需要添加ATP为新链合成提供能量（ ） (6)PCR扩增过程中，通过温度变化的控制为变性、复性和延伸等过程提供能量（ ） 1.判断常考语句，澄清易混易错 温度不能为变性、复性和延伸等过程提供能量 PCR技术扩增时需要能量，所需要的能量可由dNTP提供 【现学现用】 2.下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是（ ) A.二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端 B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋 C.体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量 D.二者遵循的碱基互补配对原则相同 PCR无需解旋酶，用高温代替 C 7/8 3.下图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列叙述错误的是( ) A.耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3′端 B.在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段 C.引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因 D.从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4 D 4.请为下列目的基因选择引物序列，并标出子链的方向。 TTAGCCGGAAT 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ GGGCCTTAATC 3’ 5’ 引物1 引物2 AATCGGCCTTA 3’ 5’ AATCGGCCTTA CCCGGAATTAG TTAGCCGGAAT GGGCCTTAATC CCCGGAATTAG 3’ 5’ 引物3 引物2 引物3 引物4 二、基因表达载体的构建 Bt基因 导入 棉花细胞 获得了足量的Bt基因后，是否能直接将Bt基因导入棉花细胞呢？ 游离的DNA进入细胞内，一般会直接被分解，就算可以进行转录——翻译成蛋白，游离DNA也无法跟着细胞分裂进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。 ⭐基因表达载体的构建——核心 构建的目的： 1.使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。 2.使目的基因能够表达和发挥作用。 知识拓展：基因的结构 基因1 基因2 基因3 DNA片段 放大 基因通常是有遗传效应的DNA片段； 能编码特定的蛋白质 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 能转录相应的mRNA，进一步编码（翻译）出蛋白质的DNA区段 不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段 不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段 获取目的基因一般获取哪一部分的DNA片段？ 基因编码区 与RNA聚合酶结合位点 RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA 启动子 终止子 本质： 位置： 作用： 是一段有特殊序列结构的DNA片段； 位于基因上游； 也是一段有特殊序列结构的DNA片段； 位于基因下游； 终止转录 本质： 位置： 作用： 启动子 终止子 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 原核细胞的基因结构 编码区 非编码区 非编码区 内含子 外显子 启动子 终止子 外显子： 内含子： 能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列。 能转录相应的mRNA，但却不能编码蛋白质的DNA序列，然后在翻译前就被剪切掉。 真核细胞的基因结构 【总结】原核细胞与真核细胞的基因结构比较 原核细胞 真核细胞 示意图 不同点 编码区是______的 编码区是间隔的、________的 相同点 都由能够编码蛋白质的_________和 具有调控作用的_________区组成的 连续 不连续 编码区 非编码 目的基因：能控制表达所需要的特殊性状 启动子： 位置：基因的上游 功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。 复制原点： DNA复制的起始位点 终止子： 位置：基因的下游 功能：终止转录 标记基因：便于重组DNA分子的筛选和鉴定。 1.基因表达载体的组成： （启动子=起始密码?） （终止子=终止密码?） 二、基因表达载体的构建 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 本质 位置 功能 DNA片段 DNA片段 mRNA上三个相邻的碱基 mRNA上三个相邻的碱基 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号（编码氨基酸） 翻译的结束信号（不编码氨基酸） 启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别 目的基因应该插入什么位置？ 目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。 启动子和终止子之间的部位 诱导型启动子： 诱导型启动子 诱导物 作用 激活或抑制 目的基因表达 重组DNA分子 限制酶 目的基因 限制酶切割位点 获取目的基因 DNA连接酶 限制酶 启动子 限制酶切割位点 终止子 标记基因 复制原点 质粒 同种限制酶或能产生相同末端的限制酶 2.基因表达载体的构建过程: 一般用同一种 酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段，再用 酶把两者连接(如图)。 （1）单酶切 限制 DNA连接 A B A B A G C T T A A B G A A T T C A B G A A T T C G C T T A A A—B G C T T A A G A A T T C A—B G A A T T C G C T T A A 目的基因及质粒自身环化 A—B B—A A-A B-B 目的基因和质粒反向连接 ①防止目的基因及质粒自身环化②防止目的基因与质粒反向连接 （2）双酶切 1.下列关于基因表达载体构建的叙述，错误的是（ ） A.启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，组成它的基本单位是脱氧核 苷酸 B.基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止密码子、标记基因 等组件 C.人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因 的表达 D.由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也有所差别 不需要终止密码子 【课堂练习】 B A.卡那霉素抗性基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来 B.表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ C.图示过程是基因工程的核心步骤 D.除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构 2.如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是(　　 ) B 会破坏目的基因 A.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和Hind Ⅲ 切割质粒和外源DNA B.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因 C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反 向连接 D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长 3.图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述不正确的是（ ） D 被PstⅠ切割后，氨苄青霉素抗性基因被破坏了 将目的基因导入受体细胞的方法，因为受体细胞的不同而有所区别。 导入方法： 导入植物细胞 导入动物细胞 导入微生物细胞 显微注射法 Ca2+ 处理法 花粉管通道法（我国科学家独创） 农杆菌转化法（常用） 三、将目的基因导入受体细胞 1.导入植物细胞——花粉管通道法（我国科学家独创的一种方法） 子房 花粉 柱头 花粉管 精子 卵细胞 胚囊 方法一：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中； 方法二：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 受体细胞为？ 受精卵 2.导入植物细胞——农杆菌转化法 （2）特点： ①农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。 （1）转化的概念：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。 ②农杆菌细胞内含有的Ti质粒，能将Ti质粒上的T - DNA 转移至受体细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。 方法一：将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株。 方法二：将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。 （3）农杆菌转化的具体方法： 体细胞 受精卵 受体细胞为？ 受体细胞为？ 2.导入植物细胞——农杆菌转化法 表现出新性状的植株 植物组织培养 第一次导入 第二次导入 第一次拼接 第二次拼接 将目的基因拼接到 Ti 质粒的 T-DNA上。 (非人工操作)是指含目的基因的 T-DNA 被拼接到受体细胞的染色体DNA上。 (非人工操作)含目的基因的 T-DNA 导入受体细胞。 将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌。 Ti质粒 T—DNA 目的基因 构建基因表达载体 重组 Ti质粒 转入农杆菌 导入植物细胞 （4）过程： 2.导入植物细胞——农杆菌转化法 3.导入动物细胞——显微注射法 利用显微镜将目的基因注入受精卵中，这个受精卵将发育成具有新性状的动物。 ——受体细胞是受精卵 思考： 为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？ 1.体积大，易操作。 2.全能性高，易培养成完整个体。 4.导入微生物细胞——Ca2+处理法 （1）常用方法： Ca2+处理 目的： 可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 （3）过程： （2）受体细胞： 原核细胞（常选择大肠杆菌） 一般先用Ca2+处理大肠杆菌 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 再将重组的基因表达载体导入其中 Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性 这种细胞称为感受态细胞 1.我国科学家独创的花粉管通道法，可以使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞，是一种十分简便经济的方法，对此认识正确的是( ) A.不必构建表达载体就可以直接导入 B.此方法可用于转基因动物 C.受体细胞只能是植物的卵细胞 D.有时可以取代农杆菌转化法 D 都需要构建 只适用于植物 体细胞 【现学现用】 2.如图表示转基因动、植物的培育过程。下列有关叙述错误的是( ) A.受体细胞A只能是绵羊的体细胞 B.②过程中需要进行胚胎移植操作 C.可采用花粉管通道法将目的基因导入受体细胞B D.③过程中一般需要生长素和细胞分裂素 A 受体细胞A一般是该种动物的受精卵 3.采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的方法正确的是（ ） ①将毒素蛋白注射到棉受精卵中； ②将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中； ③将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导入农杆菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养 ④将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，借助花粉管通道进入受精卵。 A.①② B.③④ C.②③ D.①④ B 4.(某质粒上有Sal Ⅰ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程，如下图所示。请回答下列问题： (1)将目的基因导入植物细胞，采用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是　　　　；该质粒含有一段特殊的DNA片段，称为　　　　。该方法中农杆菌的作用是_____________________________________________________。 Ti质粒 T­-DNA 感染烟草细胞，把目的基因插入到烟草细胞的染色体DNA上 (2)在构建重组质粒时，和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用Hind Ⅲ和Sal Ⅰ两种酶的好处是________________________________________ ____________________________________________________________。 (3)含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖，农杆菌中是否已含有目的基因？ ______(填“是”或“否”)。为什么？____________________________________。 防止目的基因自连和质粒自连，以提高带 有目的基因的重组质粒的合成效率；防止目的基因与质粒反向连接 否 含有目的基因的质粒中抗四环素基因被破坏 将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功，标记基因（如抗生素抗性基因）筛选呈阳性一定能确定转基因生物培育成功了吗？ 若导入的是空载体、载体-载体连接物，标记基因筛选也是呈阳性，因此仅凭标记基因筛选呈阳性无法完全确定目的基因是否导入。 此外，即便导入了基因表达载体（目的基因成功导入），但是仍然不知道目的基因插入的位置、方向等是否正确，能否正确表达，因此也需要在转录和翻译以及个体水平上进行检测和鉴定。 四、目的基因的检测与鉴定 Bt 基因 mRNA Bt 蛋白 抗虫棉 PCR等技术检测 抗原-抗体杂交技术 分子水平的检测 抗虫接种实验 个体生物学水平的鉴定 以检测 Bt 基因是否导入棉花体内并表达为例： 四、目的基因的检测与鉴定 1. 分子水平的检测 提取 DNA 转基因棉花 PCR 是否扩增出目的基因 利用 Bt 基因的核苷酸序列设计引物 M： marker 1-6：转基因棉花 7： 非转基因棉花 8： 阴性对照 电泳 （1）检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因——DNA分子杂交技术 四、目的基因的检测与鉴定 1. 分子水平的检测 基因探针：是一段带有检测标记（荧光或同位素标记），且顺序已知的，与目的基因能互补的核酸序列。它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转而来的RNA。 15N 15N 变性 变性 杂交DNA分子 （可检测） 探针 受体细胞的DNA DNA分子杂交技术： 碱基互补配对原则 原理？ （1）检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因——DNA分子杂交技术 基本思路： 步骤一：制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段（基因探针），并用PCR扩增。 步骤二：提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液。 步骤三：高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。 四、目的基因的检测与鉴定 1. 分子水平的检测 （2）检测目的基因是否转录出了mRNA——PCR扩增+电泳 提取棉花细胞 mRNA 逆转录 得到 cDNA 用以 Bt 基因序列设计的 引物进行 PCR 扩增 电泳 检测 Bt M3 C0 T-9 T-2 T-51 T-5 T-23 T-11 T-20 T-21 T-34 T-10 10个 PCR 阳性棉花植株中，有四株 Bt 基因发生转录 四、目的基因的检测与鉴定 1. 分子水平的检测 （2）检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术 15N 15N 变性 探针 受体细胞的mRNA 杂交分子（可检测） 步骤一：制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段（基因探针），并用PCR扩增。 步骤二：提取受体细胞全部RNA，与基因探针置于同一培养液。 步骤三：高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现分子杂交片段。 基本思路： 四、目的基因的检测与鉴定 1. 分子水平的检测 （3）检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术 ①原理： 抗原抗体的特异性结合 ②过程： 苏云金杆菌 提取 Bt 毒蛋白 注射 抗体 标记抗体 转基因棉花 提取蛋白 电泳分离 抗原-抗体杂交 2. 个体生物学水平的鉴定 四、目的基因的检测与鉴定 ——基因工程产品与天然产品的功能活性比较 没有抗虫基因的棉花植株 有抗虫基因的棉花植株 棉铃虫没有死亡 棉铃虫死亡 饲喂 棉铃虫 转Bt基因 非转基因 采摘抗虫棉叶片 饲喂 棉铃虫 观察棉铃虫存活情况 思路： 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等 转基因生物 鉴定方法 成功标志 抗虫植物 抗病毒（菌）植物 抗盐植物 抗除草剂植物 获取目的基因产物的转基因生物 饲喂害虫（抗虫接种实验） 害虫死亡 病毒（菌）感染（抗病接种实验） 未出现病斑 盐水浇灌 正常生长 喷洒除草剂 正常生长 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 功能、活性正常 个体生物学水平的鉴定具体方法举例 【现学现用】 1.下列有关基因工程中目的基因的检测与鉴定的说法错误的是( ) A.检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因用DNA分子杂交的方法 B. 检测目的基因是否转录用分子杂交的方法 C. 检测目的基因是否表达用抗原-抗体杂交的方法 D. 目的基因的检测与鉴定是基因工程的核心步骤 D 2.PCR在生物学实验中具有非常广泛的用途，下列不属于PCR的应用范畴的是(　　) A.检测受体细胞是否有目的基因 B.检测受体细胞是否有致病基因 C.检测目的基因是否转录mRNA D.检测目的基因是否翻译蛋白质 D 探究•实践——DNA片段的扩增及电泳鉴定 一、实验原理（阅读书本P84-85下列问题） 1.PCR在体外进行DNA片段的扩增原理： ①PCR利用了 和 的原理。 ②一次PCR一般要经历 循环。 2.DNA片段电泳鉴定的原理： ①DNA分子具有 ，在一定的 下，这些基团可以带上 ，在_____的作用下，这些_____________会向着___________________的电极移动，这个过程就是________。 DNA的热变性原理 DNA半保留复制 可解离的基团 pH 正电荷或负电荷 带电分子 电泳 与它所带电荷相反 电场 ②PCR的产物一般通过 来鉴定； ③在凝胶中DNA分子的迁移速率与_______________、__________________和_____等有关 ④ 凝胶中的DNA分子通过______，可以在波长为________的________下被检测出来。 凝胶的浓度 染色 300nm 紫外灯 DNA分子的大小 构象 30次 琼脂糖凝胶电泳 ①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增） ②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所） ③电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等） ④微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体） ⑤一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头） PCR仪 微量离心管 微量移液器 电泳装置 二、材料用具 1.仪器: 二、材料用具 2.试剂: 4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等 PCR 反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液 5 μL 20 mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1 μL 20 μmol/L的引物Ⅰ 2.5 μL 20 μmol/L的引物Ⅱ 2.5 μL H2O 28～33 μL 1～5 U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2 U 模板DNA（用量为1pg-1μg） 5～10 μL 总体积 50 μL 为保证加入反应体系中的各试剂体积的准确性，建议按照加入体积的大小，由大到小依次加入各试剂，即先加入无菌水。为保护酶的活性，一般最后加入DNA聚合酶。 三、方法步骤 （一）DNA片段的扩增 1．移液：用微量移液器按照配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。 2．混合：待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。 3．离心：将微量离心管放在离心机上，离心约10 s，使反应液集中在管的底部。 4．反应：将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应。 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃,5min / / 30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min 最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min 预变性使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合 PCR扩增DNA片段 1.制备凝胶 （1）融化 （2）倒模 （3）凝固 用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。 将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 （二）DNA片段的电泳鉴定 梳子孔为加样孔，加样孔侧连电极负极 （1）加液 （2）加样 （3）电泳 将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。 2.进行电泳 （二）DNA片段的电泳鉴定 3.观察鉴定 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 ①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 ②实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在 -20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 ③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 注意事项 ④在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 ⑤PCR扩增不能随意加大试剂用量。 （二）DNA片段的电泳鉴定 1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ 可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。 0次 12次 12次 30次 30次 Marker 2.本实验进行电泳鉴定的结果应该是几条条带？ 进行电泳鉴定的结果应该是一条条带。 3.如图所示，该片段大小约为 。 750bp （三）结果分析与评价 4.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果无条带或不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 ① 引物设计不合理，它们与非目的序列结合（非特异性结合）； ② 复性温度过低； ③ DNA聚合酶的质量不好，模板DNA出现污染，Mg2+浓度过高等。 ①漏加了PCR的反应成分； ②耐高温的DNA聚合酶失活，Mg2＋浓度过低 ③PCR程序设置不当等。 （1）如果扩增不成功（没有条带），可能的原因有： （2）如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有： 1.PCR扩增时需考虑高质量的基因组DNA模板以及反应体系中各种组分的优化组合，下列相关叙述错误的是(　 　) A.反应体系中模板DNA的量和纯度影响PCR的成功与否 B.设计引物时需考虑引物的长度、碱基序列和G—C含量 C.TaqDNA聚合酶的浓度过低会引起非特异性扩增产物的增多 D.目标DNA的获得取决于引物在模板DNA上的结合位置 C 【现学现用】 2.用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是(　　) A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间 B.3号样品为不含目的基因的载体DNA C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株 D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰 B 3.为优化目的基因(700 bp)的PCR条件，研究者设计不同的复性温度进行实验，产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图所示。据图分析，下列表述错误的是(　 　) A.对照组可用无菌蒸馏水代替模板，其他成分相同 B.电泳条带的宽度、亮度与扩增产物大小呈正相关 C.复性温度的高低会影响PCR扩增产物的纯度 D.58 ℃是本实验中扩增该基因的最佳复性温度 B 一、概念检测 1. 研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp加整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。 （1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因 （ ） （2） 构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶（ ） （3） 只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功（ ） 2. 利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ） A. PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶 B. 变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶 C. 复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则 D. 延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸 D √ × × Lavf58.20.100 Lavf57.83.100 Multimedia Cloud Transcode (cloud.baidu.com) Lavf58.29.100 Packed by Bilibili XCoder v2.0.2 $$