3.2基因工程的基本操作程序第2课时课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

第三章 第二节 基因工程的基本操作程序 第2课时 将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定 本节 聚焦 1.实例分析将目的基因导入受体细胞的方 法及目的基因的检测与鉴定。 2.构建基因工程的基本操作流程。 3.基于DNA片段的扩增及电泳鉴定,尝试 进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR 的产物。 知识回顾——快问快答 解旋 合成子链 形成子代DNA 1.DNA体内复制的基本步骤? 2.DNA体外复制(PCR过程)的基本步骤? 3.PCR过程如何让DNA解旋? 4.复性的目的是什么? 5.引物结合的一定是模板DNA的末端么? 6.引物的作用? 7.两种引物碱基序列一样么?互补么? 8.第几轮循环才能得到完整的目的基因? 9.PCR中的DNA聚合酶应有什么特点? 变性 复性 延伸 90 以上高温 让引物与DNA单链结合 不一定 给DNA聚合酶提供延伸子链的起点和方向(引路人) 不一样,不互补 第3轮 耐高温。一般用TaqDNA聚合酶。 知识回顾——快问快答 10.基因工程的基本操作程序? 目的基因的筛选与获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 将目的基因导入受体细胞 任务一 二、将目的基因导入受体细胞 根据受体细胞的不同,导入的方法也不尽相同。 (1)花粉管通道法——我国独创的方法 ①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。 ②在植物受粉后的一定时间内,剪去柱头,将DNA溶液滴加在花柱切面上,使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 1.导入植物细胞常用的方法 二、将目的基因导入受体细胞 (2)农杆菌转化法 ①转化:目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 ②农杆菌的特点 a.自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物,而对大多数单子叶植物没有侵染能力。 b.农杆菌细胞内含有Ti质粒,当它侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的 T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞,并将其整合到该细胞的染色体DNA上。 1.导入植物细胞常用的方法 二、将目的基因导入受体细胞 ③农杆菌转化的过程 二、将目的基因导入受体细胞 第一次拼接: 将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上 第一次导入: 将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌 第二次导入: 将农杆菌导入植物细胞(含目的基因的T-DNA整合到受体细胞) 第二次拼接: 被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上 二、将目的基因导入受体细胞 显微注射法 2.导入动物细胞常用的方法: 显微注射技术 目的基因表达载体 显微注射到受精卵中 受精卵发育 具有新性状的动物 ①体积大,易操作 ②全能性高 二、将目的基因导入受体细胞 原核生物的特点: 3.导入原核生物常用的方法: 繁殖快,多为单细胞,遗传物质相对较少。 一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA 分子的生理状态,然后再将重组的基因表达载体导入其中。 感受态 实质是:增加了细胞膜的通透性 大肠杆菌 二、将目的基因导入受体细胞 讨论: 1. 为什么培育转基因植物时,受体细胞可以是体细胞,也可以是受精卵? 因为植物的体细胞具有全能性。 2. 为什么培育转基因动物时,受体细胞选用受精卵,而不能用体细胞? 受精卵是全能性最高的,而高度分化的动物体细胞的全能性受到限制。 二、将目的基因导入受体细胞 讨论: 3. 当真核生物的基因(如胰岛素基因)导入原核生物为受体细胞时: ①若可以获得该蛋白,但是蛋白质无活性,原因可能是? 原核生物缺少内质网和高尔基体等细胞器,无法对真核生物的蛋白质进行正确的加工 ②以上情况如何解决? 人工体外再加工 或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞 目的基因的检测与鉴定 任务二 三、目的基因的检测与鉴定 目的基因进入受体细胞后,是否稳定维持和表达其遗传特性,只有通过检测与鉴定才能知道,这也是检查转基因技术是否培育成功的一步。 基因表达的过程 分子水平上的检测: ①检测目的基因是否插入 ②检测目的基因是否转录 ③检测目的基因是否翻译 DNA mRNA 蛋白质 PCR等技术 抗原—抗体杂交 个体生物学水平上的检测: 例如,通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 任务三 三、DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.实验原理 (1)DNA片段的扩增:PCR利用了DNA的热变性原理,通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。 (2)DNA片段的电泳鉴定 ①DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。 ②在电场的作用下,带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动,这个过程就是电泳。 ③在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。 ④凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。 三、DNA片段的扩增及电泳鉴定 2.PCR实验操作步骤 (1) 微量移液器 微量离心管 离心机 反应液 三、DNA片段的扩增及电泳鉴定 (2) 琼脂糖 核酸染料 加样孔 三、DNA片段的扩增及电泳鉴定 (3) 电泳缓冲液 加样孔 指示分子大小的标准参照物 指示剂 紫外灯 三、DNA片段的扩增及电泳鉴定 三、DNA片段的扩增及电泳鉴定 3.结果分析 (1)未出现扩增条带的主要原因 ①Taq DNA聚合酶失活。 ②引物出现质量问题。 ③Mg2+浓度过低。 ④变性时的温度低,变性时间短。 (2)出现非特异性扩增条带的主要原因 ①模板DNA出现污染。 ②引物特异性不强或形成引物二聚体。 ③Mg2+浓度过高。 ④复性时的温度过低等。 1.受体细胞不同,将目的基因导入受体细胞的方法也不完全相同,下列受体细胞与导入方法匹配错误的是( ) B 选项 受体细胞 导入方法 A 棉花细胞 花粉管通道法 B 大肠杆菌 农杆菌转化法 C 羊受精卵 显微注射法 D 番茄细胞 农杆菌转化法 随 堂 练 习 解析:花粉管通道法是我国科学家独创的一种方法,我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的,A正确;农杆菌转化法适用于双子叶植物和裸子植物,Ca2+处理法能使大肠杆菌细胞的生理状态发生改变,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,所以将目的基因导入大肠杆菌细胞,常采用Ca2+处理法,B错误;显微注射法的受体细胞一般为动物受精卵,则将目的基因导入羊受精卵的方法是显微注射法,C正确;在自然条件下,农杆菌能侵染双子叶植物和裸子植物,因此农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞常用的方法,但大多数单子叶植物不能用该方法,番茄是双子叶植物,可用农杆菌转化法将目的基因导入番茄细胞,D正确。 2.目的基因导入受体细胞后,是否可以稳定维持和表达其遗传特性,只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定关键步骤的是( ) A.检测受体细胞是否有目的基因 B.检测受体细胞是否有致病基因 C.检测目的基因是否转录mRNA D.检测目的基因是否翻译蛋白质 D 随 堂 练 习 解析:检测受体细胞中是否有目的基因是鉴定和检测的第一步,即便受体细胞中存在目的基因,也不能说明目的基因一定会稳定遗传并表达,A错误;目的基因不一定是致病基因,B错误;即使检测到目的基因成功转录mRNA,也不一定能否翻译成相应的所需蛋白质,所以该步不是最关键的步骤,C错误;检测目的基因是否翻译蛋白质是检测目的基因是否表达的最后步骤,如果存在该蛋白质,说明目的基因能在受体细胞内稳定存在并能表达,D正确。 3.将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因Pin 导入杨树细胞,培育成了抗虫杨树。如图表示含目的基因的DNA分子和农杆菌质粒,图中Ampr表示氨苄青霉素抗性基因,Neor表示新霉素抗性基因,箭头表示识别序列完全不同的4种限制酶的切割位点。下列叙述不正确的是( ) 随 堂 练 习 A.目的基因插入到质粒的T-DNA上,才能整合到受体细胞染色体中 B.为使目的基因与质粒高效重组,最好选用EcoR 和Pst C.成功导入重组质粒的细胞会表现为不抗氨苄青霉素、抗新霉素 D.转化了的杨树细胞在合适条件下经脱分化即可形成抗虫杨树 D 随 堂 练 习 解析:农杆菌Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞,并且整合到受体细胞染色体的DNA上,因此,目的基因插入质粒的T-DNA上,可整合到受体细胞染色体中,A正确;为保证目的基因的完整性,不能选用BamH ;为防止自身环化,应选用目的基因两侧的两种不同的限制酶;重组质粒中至少要保留一个抗性基因,Tth 1和Pst 只能选其中一个;因此可选用EcoR 和Tth 1或者EcoR 和Pst ;为保留重组质粒中的复制原点,最好选用EcoR 和Pst ,B正确;用EcoR 和Pst 切割会破坏氨苄青霉素抗性基因,但不会破坏新霉素抗性基因,因此成功导入重组质粒的细胞会表现为不抗氨苄青霉素,但能抗新霉素,C正确;转化了的杨树细胞在合适条件下经脱分化与再分化可形成抗虫杨树,D错误。 4.关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验,下列相关叙述正确的是 ( ) A.PCR仪实质上就是一台能自动调控温度的仪器,但在使用时需根据扩增的DNA片段以及引物的情况人工设定合适的温度 B.PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶,该酶主要在复性过程中起作用 C.为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水和移液器等在使用前都必须进行高压灭菌处理 D.电泳时,电泳缓冲液不能没过凝胶,以免凝胶加样孔中的电泳样液流出 A 随 堂 练 习 解析:PCR仪实质上就是一台能自动调控温度的仪器,但在使用时需根据扩增的DNA片段以及引物的情况人工设定合适的温度,A正确;PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶,该酶主要在延伸过程中起作用,B错误;为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前都必须进行高压灭菌处理,移液器不需要高压灭菌,C错误;电泳时,电泳缓冲液以没过凝胶1 mm为宜,D错误。 5.科研人员拟将细菌的磷酸甘露醇脱氢酶基因(mtlD)转入烟草的核基因组中,研究mtlD基因表达对烟草耐盐性的影响。如图为实验中所用的载体。请回答下列问题。 随 堂 练 习 (1)将重组质粒导入农杆菌后,需要在YEB培养基(农杆菌培养基)添加_以筛选含目的基因的农杆菌。 (2)将无菌烟草叶片_后,浸泡在含目的基因的农杆菌菌液中,由于农杆菌菌液会导致外植体缺氧,所以浸泡时应控制_(答出两点),并且在浸泡后使用_吸干外植体非伤口面的菌液,再进行共培养。 潮霉素 切伤 浸泡时间和菌液浓度 无菌滤纸 随 堂 练 习 (3)共培养后应在培养基中加入抗生素抑制或杀死农杆菌,并筛选出完成转化的细胞。由于抗生素对植物细胞也会产生一定的生物效应,因此,在保证抑制农杆菌生长的前提下,应_。 (4)若要分离mtlD基因表达产物可用电泳法,其原理是根据蛋白质分子的电荷、_及形状不同,在电场中的_不同而实现分离。 选择合适的抑菌抗生素和浓度 分子本身的大小 迁移速度 随 堂 练 习 解析:(1)分析题意,目的基因的导入方法是农杆菌转化法,该技术中农杆菌中的Ti质粒可进入受体细胞,其上的T-DNA可以整合到受体细胞染色体DNA上,据图可知,T-DNA片段所含的标记基因是潮霉素抗性基因,故在培养基中需要添加潮霉素以筛选出含目的基因的农杆菌。 (2)由于伤口部位细胞能分泌酚类物质,吸引农杆菌移向受伤细胞并将T-DNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上,故应将无菌烟草叶片切伤后,浸泡在含目的基因的农杆菌菌液中;由于农杆菌菌液会导致外植体缺氧,为避免外植体缺氧死亡,所以浸泡时应控制浸泡时间和菌液浓度;培养过程中应避免杂菌污染,故浸泡后使用无菌滤纸吸干外植体非伤口面的菌液,再进行共培养。 (3)植物细胞和农杆菌共培养结束后,转化的细胞需要脱菌培养,需要用抑菌类抗生素抑制农杆菌的生长,以防止农杆菌过度生长对植物细胞产生毒害作用,该过程需要选择合适的抑菌抗生素和浓度,以保证抑制农杆菌生长,实现成功转化细胞的筛选(或检测目的基因是否导入受体细胞)。 (4)电泳法的原理是根据蛋白质分子的带电性质差异(带电情况)、分子本身的大小以及形状不同,在电场中的迁移速度不同而实现分离。 (4) —取出凝胶置于_下观察和照相 Lavf58.20.100 $$大家好，我们是第八实验小组，下面我们将为大家讲解琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。第一步，实验准备。本次实验我们需要的仪器主要有电泳槽及盖子稳压电源、制胶模具等。需要的实验试剂主要有经高温熔化浓度为1%的琼脂糖溶液，一倍TAE缓冲液，含有200倍荧光染料的上样缓冲液mark以及待测实验样品。第二步，实验操作。电泳仪简介。电泳仪主要由电泳槽和稳压电源组成，电泳槽的两端底部各有一条裸露的电线。裸线分别连接红黑电极柱，红色电极柱为正极，黑色电极柱为负极。在通电过程中，裸线向电泳槽内提供单相电流，使不同分子量的带负电的样品DNA可以在凝胶中得到分离。琼脂糖水凝胶的制备。带高温溶解的琼脂糖溶液冷却到50至60摄氏度。准备好制胶板并确认好梳子的位置。将琼脂糖溶液从制胶板的一侧缓慢倒入，防止到溶液的过程中产生气泡。如果胶内产生气泡，应及时用无菌针头扎破。另外注意不要让淑子与溶液接触的地方产生气泡。溶液静置约1小时即可成交。上样待溶液成交后，小心取下梳子，可以看到上样孔已经成型，取下制胶板两侧的挡板。将凝胶及制胶板放置到电泳槽内上，样孔靠近负极。缓慢的向电泳槽的一个集市内加7AE缓冲液，在缓冲液自然流过凝胶上表面，可向另一集市不加缓冲液。当缓冲液填满两极时，且液面超过凝胶5毫米左右时，停止加液，此时可在上样孔正下方垫一纯色板，方便观察上样孔。仔细观察上样孔是否有气泡，如有则会严重影响后续加样，必须用无菌针及时挑出，取一块封口胶，在封口胶上将PCR回收液基因组DNA marker分别与上样缓冲液混匀。用分子枪头吸取封口胶上的样品，分别加入到不同上样孔，加样期间要细致，防止样品外溢。跑电泳上样后应及时跑电泳，防止DNA片段在凝胶中扩散。将电极插入稳压电源，打开电源，将电压设置为110伏左右，电流设置为180毫安左右，电压过低则操作效率低电压过高则易损坏d na片段。接通电源后，可以看到电泳槽内的裸线开始冒泡，并且负极的气泡明显比正极多，说明电泳槽内有电流。通过观察凝胶可以发现样品正在由负极向正极缓慢移动。带袖芬兰指示带即将要跑出凝胶时，可结束电泳。第三步，电泳分析。我们小组采用bio red的quantity one软件进行凝胶图谱的处理分析。其主要步骤为，图像去噪。确定有甬道。去除甬道原有光密度。确定样品点。建立模型。确定样品点的光密度与marker特定位置的光密度。由于光密度与浓度成正比，故可以根据marker的浓度估计样品浓度。另外，通过与marker比对，可以确定样品片段的分子量。 null