3.1 重组DNA技术的基本工具- 【省心备课】2024-2025学年高二生物同步教学精优课件（人教版2019选择性必修3）

第1节 重组DNA技术的基本工具 贺老师 第3章 基因工程 1 2 分子运输车 重组DNA技术的基本工具 2、怎样才能将Bt蛋白基因送入棉花细胞呢？ 1、能否直接将游离的Bt蛋白基因送入棉花细胞？ 游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。 通常是利用质粒作为载体，将基因送入细胞。 Bt蛋白基因 5’ 3’ 3’ 5’ 拟核DNA 质粒 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 细菌结构示意图 若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。这样，基因工程才有意义。 2 2 分子运输车 重组DNA技术的基本工具 将 送入 ，在受体细胞内对目的基因进行 。 外源基因 在基因工程中使用的载体包括 等。 质粒、噬菌体和动植物病毒 种类 用途 不同点 质粒、噬菌体 植物病毒 动物病毒 将外源基因导入各种受体细胞 将外源基因导入植物细胞 将外源基因导入动物细胞 它们来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别 动物病毒 噬菌体 1.作用： 2.种类： 受体细胞 大量复制 真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 3 2 分子运输车 3.运载体需具备的条件： 条件①：具有一个或多个限制酶切割位点； 条件②：能在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；使外源基因在受体细胞中稳定存在并复制，以扩增外源基因的数量 条件③：具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。 条件④：对受体细胞无害。 问题3：我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？ 问题2：要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？ 问题1：载体要与目的基因连接，需要具备什么条件？ 供外源基因插入其中 如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、荧光蛋白基因等 4 有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。 便于重组DNA筛选与鉴定 DNA复制的起始位点，并带着插入的目的基因一起复制 4、最常用的载体——质粒： 终止子: 转录的终点，在转录过程中起调控作用。 启动子: 转录的起点，在转录过程中起调控作用。 质粒DNA分子质量一般为拟核DNA的0.5%~3% 2 分子运输车 5 2 分子运输车 5、标记基因的筛选原理 导入 受体细胞 培养 加入氨苄青霉素 ①导入重组质粒的受体细胞存活并繁殖 ②导入普通载体的体细胞存活并繁殖 含有氨苄青霉素抗性基因载体（如质粒） 重组DNA导入受体细胞不是100%，而且导入率较低 目的基因一定成功重组到质粒上了吗？ 培养基中有几种类型的大肠杆菌？什么样的大肠杆菌能够在该培养基上存活并繁殖？ 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示： 6 无法存活 存活；白色 存活；蓝色 2 分子运输车 5、标记基因的筛选原理 如何提高筛选的准确性？ LacZ 基因表达产生的β-半乳糖甘酶能够分解 X-gal 产生蓝色物质，从而使菌落呈蓝色；否则菌落呈白色。 请分析下列3种大肠杆菌在含 X-gal 和青霉素的固体培养基上的存活情况及菌落颜色。 当质粒上有两个标记基因时，可将目的基因插入其中一个标记基因中，也就是重组质粒上只含一个标记基因，普通质粒上含有两个标记基因。则没有导入质粒的受体细胞不具有标记基因控制的性状，导入普通质粒的受体细胞具有两个标记基因控制的性状，导入重组质粒的受体细胞只具有一个标记基因控制的性状。这样可根据标记基因控制的性状准确筛选出含有重组质粒的受体细胞。 7 E.coli DNA连接酶 ③ 有一个至多个限制酶切割位点 质粒、噬菌体、动植物病毒 作用部位： 种类 DNA连 接酶 切开DNA分子的磷酸二酯键 主要存在于原核生物中 具有专一性（能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列） T4 DNA连接酶 ① 对受体细胞无害 ② 能自我复制或整合到宿主DNA上。 ④ 常有特殊的标记基因 运载 工具 条件 种类： 磷酸二酯键 限制酶 作用部位： 来源： 特点： 作用结果： 产生黏性末端或平末端 重组DNA技术的基本工具 8 来源 作用 差别 2 分子缝合针—— DNA连接酶 如何将目的基因和载体连接形成重组DNA？ 将 连接起来，恢复被限制酶切开的 。 1、作用： 注意：不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化） 两个DNA片段 磷酸二酯键 2、种类： E.coli DNA连接酶连接平末端时效率远低于T4 DNA连接酶 都能将双链DNA片段“缝合“起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 大肠杆菌 T4噬菌体 9 3.E·coli DNA连接酶的作用 两个DNA片段要具有互补的黏性末端才能连接起来。 2 分子缝合针——DNA连接酶 DNA连接酶→磷酸二酯键 DNA连接酶→磷酸二酯键 DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但不能连接单链DNA! DNA连接酶作用没有特异性。可以连接多种末端 10 T4 DNA连接酶还可以把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率相对较低。 4.T4 DNA连接酶的缝合作用 2 分子缝合针——DNA连接酶 DNA连接酶→磷酸二酯键 DNA连接酶→磷酸二酯键 11 旁栏思考（P72）：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？ ▲ DNA复制中DNA聚合酶发挥作用 A A T T G C A A T T A A T T DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 只能将单个核苷酸连接到已有的核苷酸链上，形成磷酸二酯键。 DNA聚合酶作用示意图： 12 DNA连接酶 DNA聚合酶 相同 作用实质 化学本质 不 同 点 模板 作用对象 作用结果 用途 都能催化形成磷酸二酯键 都是蛋白质 不需要 需要DNA的一条链作模板 形成完整的重组DNA分子 形成DNA的一条链 DNA复制、基因工程 DNA复制、基因工程 在两个DNA片段间形成磷酸二酯键 将单个核苷酸连接到已有DNA片段，形成磷酸二酯键 DNA连接酶 vs DNA聚合酶 13 项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶 DNA酶 作用部位 作用对象 作用结果 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键 DNA片段 DNA 单个的脱氧 核苷酸 DNA DNA 将两个DNA片段连接成完整的DNA分子 切割双链DNA分子 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链 DNA连接酶、限制酶、 DNA聚合酶、解旋酶、DNA酶的比较 14 1.根据所学知识，完成以下填空： ①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶 b a A.切断a处的酶为_______ B.连接a处的酶为_______ C.切断b处的酶为_______ ① ③ ② a：磷酸二酯键；b：氢键 ④ 15 图甲 限制酶的选择技巧 ①不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ； ②应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择EcoRⅠ或PstⅠ 1、根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类 2、根据质粒的特点确定限制酶的种类 图乙 ①质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙不能选择SmaⅠ ②所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端 方案一： 只用PstⅠ切割目的基因和质粒 方案二： 同时用EcoRⅠ和PstⅠ切割目的基因和质粒 哪种方案更好？ ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ； ②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ； ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点) ①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端 16 一、概念检测 1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ） A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端 2.在重组DNA技术中,将外源基因送入受体细胞的载体可以是 （ ） A.大肠杆菌的质粒 B.切割DNA分子的酶 C.DNA片段的黏性末端 D.用来识别特定基因的DNA探针 C A 磷酸二酯键 DNA聚合酶的作用 T4 DNA连接酶可以连接互补的黏性末端，又可连接平末端 17 2.有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶speⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ , XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。 (1)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶speⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？ (2)不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？ 二、扩展应用 XbaⅠ。因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。 识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，扩大了切割位点的选择范围。 18 限制酶 作用部位： 种类 E.coli DNA连接酶 运载 工具 条件 ③ 有一个至多个限制酶切割位点 质粒、噬菌体、动植物病毒 DNA连 接酶 作用部位： 切开DNA分子的磷酸二酯键 来源： 主要存在于原核生物中 特点： 具有专一性（能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列） T4 DNA连接酶 ① 对受体细胞无害 ② 能自我复制或整合到宿主DNA上。 ④ 常有特殊的标记基因 种类： 磷酸二酯键 作用结果： 产生黏性末端或平末端 19 抗虫棉 Bt抗虫蛋白 苏云金杆菌 取出 转移 思考：通过本节的学习，现在你能描述如何使用这三种工具来获得抗虫棉吗？ 20 1.选用下图载体将目的基因导入细菌中并将含有目的基因的细菌 筛选出来。 （1）在培养细菌的培养基中 添加抗生素B，则应该选择的限制酶为_______。 （2）在培养细菌的培养基中添加抗生素A，则应该选择的限制酶为_____。 ①或② ① 21 Lavf56.40.101 Tencent APD MTS $$