3.1 重组DNA技术的基本工具课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

普通棉花不抗虫 苏云金芽孢杆菌可以合成抗虫毒素——Bt蛋白 思考：如何生产抗虫棉？ 抗虫棉 普通棉花 杂交育种？ 同种生物之间进行 诱变育种？ 在原有基因上发生基因突变，产生新基因——等位基因 不定向 第3章 基因工程 按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNA技术。 1、原理： 基因重组 2、操作水平： DNA分子水平 3、优点： ①能克服远缘杂交不亲和的障碍； ②定向改造生物的遗传特性。 基因工程发展历程 1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。 1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至19666年，64个密码子均被破译成功。 1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性核酸内切酶（简称限制酶） 1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。 1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。 1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。 1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。 20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。 1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。 1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。 1.为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？ 2.为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？ ①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸； ②都遵循碱基互补配对原则； ③双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。 ①基因是控制生物性状的独立遗传单位； ②遗传信息的传递都遵循中心法则； ③生物界共用一套遗传密码。 思考讨论 基因工程诞生的理论基础 3.1 重组DNA技术的基本工具 导入 扩增 第3章 基因工程 番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵害。当番木瓜受到这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。 DNA双螺旋的直径只有2nm。 非转基因番木瓜 转基因番木瓜 从社会中来 科学家用到了哪些“分子工具”？ 这些“分子工具”各具有什么特征呢？ 准确切割DNA分子 “分子手术刀” 将DNA片段 连接起来 “分子缝合针” 将体外重组好的DNA分子导入受体细胞 “分子运输车” 重组DNA技术的基本工具 一、限制性内切核酸酶（限制酶）——“分子手术刀” 1、来源： 主要从原核生物中分离纯化出来，也有少部分来自真核生物 2、种类： 数千种 （限制酶不是一种酶，而是一类酶） 3、作用 : 生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。例如，一种限制酶是从大肠杆菌（ Escherichia coli）的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶，则进一步表示成EcoR I。 粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens）中分离的第一种限制酶即_______； Sma Ⅰ 流感嗜血杆菌的d菌株（Haemophilus influenzaed）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:____________________________。 Hind Ⅰ、Hind Ⅱ、 Hind Ⅲ 一、限制性内切核酸酶（限制酶）——“分子手术刀” ※命名（P72资料卡） 识别序列： 大多数由6个核苷酸组成；少数由4个、8个或其他数量组成。 1.都可以找到一条中（心）轴线； 特点： 2.中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列。 两条链5’- 3’读取的碱基顺序是完全一样的。 一、限制性内切核酸酶（限制酶）——“分子手术刀” 　 黏性末端　　　　 黏性末端 一、限制性内切核酸酶（限制酶）——“分子手术刀” 4、结果 实例1——EcoR I 限制酶 识别特定序列为GAATTC ；切割特定部位为G、A之间的磷酸二酯键 当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时。 （1）黏性末端： 11 4、结果 实例2——Sma I 限制酶 识别特定序列为CCCGGG ；切割特定部位为C、G之间的磷酸二酯键 当限制酶在它识别序列的中轴线处将DNA分子的两条链分别切开时。 （2）平末端： 平末端　 平末端 一、限制性内切核酸酶（限制酶）——“分子手术刀” 12 4、结果 一、限制性内切核酸酶（限制酶）——“分子手术刀” 产生黏性末端或平末端 推断限制酶切一次： 断开 个磷酸二酯键，产生 个游离的磷酸基团，产生 个黏性/平末端， 消耗 分子水。 两 2 2 两 13 即时训练 写出下列限制酶切割形成的末端序列 BamH Ⅰ________ EcoR Ⅰ________ HindⅢ________ Bgl Ⅱ ________ 思考：从中你发现了什么？ 不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端。 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 5' 5' 3' 3' 同种限制酶切割产生的黏性末端相同；不同限制酶切割，产生的黏性末端可能相同，也可能不同。 -G -CCTAG -A -TCTAG -A -TTCGA -G -CTTAA 1.要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？ 可产生几个末端？ 要切两个切口，产生四个末端。 2.如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？ 会产生相同的末端 深度思考 3.请判断：以下黏性末端是由 种限制酶作用产生的。 三 4、你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？ 原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。 限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。 深度思考 5、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？ 通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。 深度思考 G A A T T C C T T A A G G A A T T C C T T A A G G C T T A A A A T T C G G C T T A A A A T T C G 用同种限制酶切割(EcoR Ⅰ) 6、把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？ 深度思考 缺口怎么办？ G C T T A A A A T T C G G C T T A A A A T T C G 1. 作用： 将两个 DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。 二、DNA连接酶——“分子缝合针” 注意：不是连接氢键！（氢键的形成不需要酶的催化） E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 来源 连接的 末端类型 相同点 大肠杆菌 T4 噬菌体 黏性末端和平末端 （连接平末端效率远低于T4 DNA连接酶） 黏性末端 和平末端 2. 种类： 恢复被限制酶切开的磷酸二酯键 两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来 3、例：E·coli DNA连接酶——连接黏性末端 二、DNA连接酶——“分子缝合针” 4、例：T4 DNA连接酶——连接平末端 思考：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？ 二、DNA连接酶——“分子缝合针” A A T T G C A A T T A A T T DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 相同点 作用实质 化学本质 不 同 点 模板 作用对象 作用结果 用途 都能催化形成磷酸二酯键 都是蛋白质 不需要 需要DNA的一条链作模板 形成完整的重组DNA分子 形成DNA的一条链 基因工程 DNA复制 在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键 5.DNA连接酶与DNA聚合酶的比较 只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键 二、DNA连接酶——“分子缝合针” 深度思考 与DNA相关的五种酶的比较 名称 作用部位 作用结果 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA(水解)酶 解旋酶 磷酸二酯键 将DNA切成两个片段 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 碱基对之间 的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链 我们每天吃很多动植物食材，也摄入了它们的DNA，但是我们并没有因此就被这些DNA操控。 这是因为外源DNA片段难以进入细胞内，即使进入也很难稳定存在并表达。如何将目的基因运送到特定细胞呢？ 思考： 1.载体的种类？ 2.载体应该具备哪些特点？ 深度思考 “分子运输车”---载体 将外源基因送入受体细胞，在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 1.作用： 三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别。 2.种类： 质粒（最常用） 动植物病毒 噬菌体 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 3、运载体需具备的条件 条件③：无毒害作用，不影响受体细胞正常生命活动 条件②：能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制 条件①：有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入 条件④：常有特殊的标记基因 三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 【问题1】载体要与外源基因连接，需要具备什么条件？ 【问题2】要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？ 【问题3】我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？ 深度思考 1、载体上标记基因的标记原理？ 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。 【问题4】根据标记基因的作用， 有同学认为在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞不一定是导入目的基因的受体细胞， 这种说法是否合理？ 并说明理由。 合理； 因为仅导入载体的和导入目的基因的受体细胞均能在该培养基中存活。 深度思考 2、目的基因是要与运载体结合的，那如何处理质粒？ ★重组质粒的形成： 用相同的限制酶处理目的基因和运载体，获得相同的末端，然后用DNA连接酶对其进行连接。 1、选目的基因两端和运载体都有的酶切位点； 2、所选酶切位点不能破坏目的基因以及标记基因。 选择酶切位点的原则： Hind III 和 BamH I 1.用图中外源DNA和质粒构建重组质粒，不能使用Sma Ⅰ切割， 原因是 。 2.使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制酶切割，而不用EcoR Ⅰ一种限制酶切割，是为了防止 。 Sma Ⅰ会破坏抗性基因和外源DNA中的目的基因 目的基因、质粒自身环化及反向连接 下列操作中选用哪种限制酶切割来构建重组质粒？ 即时训练 三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 在基因工程操作中，天然的载体很难满足上述全部要求，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 大肠杆菌及质粒结构模式图 【问题5】若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞， 在噬菌体和昆虫病毒两种载体中， 不选用噬菌体作为载体，其原因是什么？ 噬菌体的宿主细胞是细菌，不能侵染家蚕细胞，无法将目的基因导入家蚕体细胞中并使其表达； 而昆虫病毒可以特异性地侵染昆虫细胞，能将目的基因导入家蚕细胞并实现基因表达。 …TATCGTACGATAGGTACTTAA …ATAGCATGCTATCCATG AATTCGGCATAC… GCCGTATG… … TCCTAG … AGGATCTTAA GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG AATTCCATAC … GGTATG … 重组DNA分子的模拟操作 思考讨论 重组DNA分子的模拟操作 思考讨论 1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？ 剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。 2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对?如果不能，可能是什么 原因造成的？ 如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。 3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？ 不能。 因为基因的长度一般在100个碱基对以上。 限制酶 DNA连接酶 载体 ①能自我复制或能整合到宿主DNA上 ②有一个至多个限制酶切割位点 ③有特殊的标记基因 ④对受体细胞无害 质粒、 噬菌体 、动植物病毒 基因工程的基本工具 作为载体的条件 种类: 磷酸二酯键 来源： 主要来源于原核生物 特点： 作用部位： 具有专一性 结果： 形成黏性末端或平末端 连接部位：磷酸二酯键 种类： E.coli DNA连接酶、T4 DNA连接酶 作用： 把两条双链DNA片段拼接起来 课堂小结 探究.实践---DNA的粗提取与鉴定 一、实验原理 可以利用DNA、RNA、蛋白质和脂质在理化性质方面的差异， 对它们进行提取 DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精 DNA在不同NaCl溶液中的溶解度不同，可溶于2mol/L的NaCl溶液 2. 在一定的温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色， 因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂 【自主学习】阅读课本74和75页的探究实践“DNA的粗提取与鉴定”，明确该实验的实验原理及步骤。 二、 材料用具 DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。 1.选材： 2.试剂： ①研磨液 ②体积分数为95%的酒精 ③2mol/L 的NaCl溶液 ④二苯胺试剂 ⑤蒸馏水 ——溶解并提取DNA ——析出DNA ——溶解DNA ——鉴定DNA，要现配现用 研磨液成分 作用 SDS 使蛋白质变性 EDTA 抑制DNA酶 Tris-HCl缓冲液 稳定DNA 1．30g洋葱切碎＋10mL研磨液，充分研磨。 三、 实验步骤 破碎细胞 过滤 目的：裂解细胞，释放DNA 2．在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取上清液；或1500r/min离心5min，取上清液。 问题1:过滤能否用滤纸代替纱布？ 不可以。因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。 问题2:此步骤获得的上清液中可能含有哪些细胞成分？ 可能含有DNA、RNA以及蛋白质、脂质、糖类等。 三、 实验步骤 破碎细胞 过滤 DNA的析出 问题3:此步骤的目的是？ 使蛋白质等溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。 问题4：酒精预冷的作用？ ①可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解； ②抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出； ③低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。 3．在上清液中加入体积相等的预冷的95%酒精溶液, 静置2~3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA 。 三、 实验步骤 破碎细胞 过滤 DNA的析出 4．用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。 问题5：搅拌时应轻缓、并沿一个方向目的？ 减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子 析出DNA 5．将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加入 试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min 三、 实验步骤 实验组 对照组 水浴加热 破碎细胞 过滤 DNA的析出 DNA的鉴定 二苯胺 2mol/L的NaCl 空白对照： 在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。 评价结果： （1）DNA纯度 看提取物颜色 （2）DNA的量 看与二苯胺反应颜色的深浅 现配现用！ $$