3.1 重组DNA技术的基本工具 课件 2024—2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

该高中生物学课件聚焦基因工程的理论基础与重组DNA技术的基本工具，课堂导入以普通棉花到抗虫棉花的实例切入，逐步展开基因工程概念、理论基础（DNA结构相似、共用遗传密码）、发展历程，最终聚焦限制酶、DNA连接酶和载体三大工具，构建“实例导入-理论铺垫-工具解析”的学习支架。 其亮点在于融合科学思维与探究实践，通过模拟限制酶切割、DNA连接酶连接的操作活动培养建模能力，结合抗虫基因获取等问题链引导探究，“DNA的粗提取与鉴定”实验强化动手与问题解决，体现结构与功能观的生命观念。练习题巩固核心知识，助力学生深化理解，教师可高效实现理论与实践结合的教学目标。

棉花细胞 普通棉花 (无抗虫特征) (含抗虫基因) 棉花植株 (有抗虫特征) 基因工程 抗虫基因 提取 课堂导入 基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。 （1）原理： （2）操作水平： （3）操作环境： （4）操作对象： （5）结果： 基因工程的概念 基因重组 分子水平 生物体外 基因 赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。 （6）特点（优点）：定向改造生物（遗传性状），克服远缘杂交不亲和障碍 1. 为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？ 2. 为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达成功？ ①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。 ②双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。 ③所有生物DNA碱基对均遵循严格的“互补配对”原则，不同DNA分子得以连接在一起。 ①基因是控制生物性状的独立遗传单位。 ②遗传信息的传递都遵循中心法则。 ③生物界共用一套遗传密码。 DNA分子结构相似 生物界共用一套遗传密码 基因工程得以成功的原因 基因工程发展历程 1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了 ，还证明了DNA可以在 。 1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至1966年，64个密码子均被破译成功。 1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性核酸内切酶（简称限制酶） 1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。 1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。 1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。 1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。 20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。 1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。 遗传物质是DNA 同种生物个体间转移 1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。 抗虫基因 普通棉花(无抗虫特性) 苏云金芽孢杆菌 问题一：如何获取Bt抗虫基因? 问题二：剪下来的抗虫基因怎样 把它导入到棉花体内？ 需要用到什么工具？又是怎么操作的呢？ 3.1 重组DNA技术的基本工具 学习目标 1.通过资料分析，阐明基因工程的理论基础。 2.通过模拟制作活动，阐明限制酶、DNA连接酶和载体的作用。 3.通过了解基因工程的发展历程，认同基因工程的诞生和发展离不开多个学科的理论研究和技术创新。 目录 一.限制性内切核酸酶——“分子手术刀” 二.DNA连接酶——“分子缝合针” 三.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 四.探究实践：DNA的粗提取与鉴定 一.限制性内切核酸酶——“分子手术刀” “分子手术刀”——限制性内切核酸酶（限制酶） 1 1、来源： 2、种类： 主要来自 。 3、特点： 数千种 能够识别 ，并且使每一条链中特定部位的 断开，因此具有 。 （限制酶不是一种酶，而是一类酶） 原核生物 双链DNA分子的特定核苷酸序列 磷酸二酯键 ①识别序列长度： ②结果： 大多数是 ，也有少数是 、 ，或其他数量。 产生 或 。 6个核苷酸序列 4个 8个 黏性末端 平末端 专一性 （1） 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。 中轴线 （2）中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的，称为回文序列。 观察右侧限制酶所识别的序列有什么特点？ 5' 3' 5' 3' T A G G T A T C C A DNA的结构 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ G 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 碱基 磷酸 脱氧核糖 —腺嘌呤 —胸腺嘧啶 —胞嘧啶 —鸟嘌呤 A T C G 磷酸二酯键 DNA的双螺旋结构 “分子手术刀”——限制性内切核酸酶（限制酶） EcoR I (在G与A之间切割) Sma I (在G与C之间切割) 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 黏性末端 平末端 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。 【练习】(P75拓展应用2 改编) 1.请写出限制酶SpeⅠ、HindⅢ、XbaⅠ和XhoⅠ切割形成的黏性末端。 SpeⅠ：　　 　 　HindⅢ：　 　 XbaⅠ：　　　 　XhoⅠ： 2.同种限制酶切割形成的黏性末端相同吗？ 相同 3.哪种限制酶切割产生的片段能与SpeⅠ切割产生的片段相连接?为什么？ 两者切割产生了相同的黏性末端 4.（拓展2第2问）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？ 切割位点的选择范围扩大 XbaⅠ　　　 　 同尾酶 14 1.推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么? P71 含某种限制酶的细菌DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。 2.为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？ P74 限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。 思考与讨论 活动1：大脑模拟EcoRI的识别序列和切割位点将目的基因“切割”下来。 识别GAATTC序列，并在G和A之间切开 --ATGCATGCAT……CCAGAATTCCCA ……TCCCTAAGAATTC CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC--- --TACGTACGTA……GGTCTTAAGGGT……AGGGATTCTTAAGGGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG--- 苏-基因2 Bt基因 苏云金杆菌DNA片段中的部分基因 3’ 5’ 5’ 3’ 思考1：要想获得某个特定性状的目的基因必须要用限制酶切几个切口？ 可产生几个黏性(平)末端？ 要切2个切口， 产生4个黏性(平)末端。 思考2：目的基因（Bt基因）是否可以直接导入到受体细胞？为什么？ 否。目的基因直接导入受体细胞，可能会被细胞中的酶降解或不能复制、表达。 思考3：有没有什么DNA分子可以进入宿主细胞并负责表达？ 识别GAATTC序列，并在G和A之间切开 --ATGCATGCAT……CCAGAATTCCCA ……TCCCTAAGAATTC CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC--- --TACGTACGTA……GGTCTTAAGGGT……AGGGATTCTTAAGGGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG--- 苏-基因2 Bt基因 苏云金杆菌DNA片段中的部分基因 3’ 5’ 5’ 3’ 二.DNA连接酶——“分子缝合针” 将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 作用： 作用部位： 磷酸二脂键 不同生物的DNA分子能拼接起来的原因是____________________________________________________。 DNA的基本组成单位、空间结构和碱基互补配对方式相同 资料2]1967年，科学家们发现了一种能够将两个DNA片段连接起来的酶，可以用它来修复DNA链的断裂口，并把这种酶叫做DNA连接酶。1970年，科学家们又提取了一种具有更高活性的T4 DNA连接酶。当两个DNA片段的黏性末端彼此相临，而且它们的碱基能够互补配对时，DNA连接酶就能把它们之间的缝隙“缝合”起来 [资料3] 1972年，美国的伯格（P.Berg)等人用一种限制性内切酶在体外分别将猿猴体内的一种病毒的DNA和λ噬菌体的DNA进行酶切，然后分离出各自的酶切片段，又用T4DNA连接酶将它们连接起来，构建了世界上首例体外重组的杂合DNA分子。 种类： ①E.coli DNA连接酶 ②T4 DNA连接酶 从大肠杆菌中分离得到 只能连接互补黏性末端的DNA片段 从T4噬菌体中分离得到 黏性末端和平末端均能连接，但连接平末端的效率相对较低。 平末端 黏性末端 G A A T T C G A T T C A 由于黏性末端的碱基是互补的，在连接时，黏性末端可以通过碱基互补配对形成氢键，加快DNA连接酶的连接速度，而平末端则不能，所以T4 DNA连接酶黏性末端的连接速度比平末端的连接速度更快 3.作用部位: 磷酸二脂键 DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？ DNA聚合酶 相同点：都是催化磷酸二酯键形成的酶。 不同点：DNA聚合酶连接的是游离的脱氧核苷酸，需要模板； DNA连接酶连接的是DNA片段，不需要模板。 DNA连接酶 提示：DNA连接酶与DNA聚合酶的比较 比较项目 DNA连接酶 DNA聚合酶 相同点 不同点 是否需要模板 接DNA链 作用过程 作用结果 用途 作用实质相同，都是催化磷酸二酯键的形成 不需要 需要 双链 单链 在两个DNA片段间形成磷酸二酯键 将单个核苷酸加到已存在的DNA单链片段上，形成磷酸二酯键 将已存在的DNA片段连接 合成新的DNA分子 基因工程 DNA复制 总结归纳 几种相关酶的比较 名称 作用部位 作用结果 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA(水解)酶 解旋酶 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 碱基对之间 的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链， 形成两条长链 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 将DNA切成两个片段 几 种 相 关 酶 的 比 较 作用底物 作用部位 作用结果 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 解旋酶 DNA水解酶 DNA分子 磷酸二酯键 黏性末端或平末端 DNA分子片段 磷酸二酯键 重组DNA分子 脱氧核苷酸 磷酸二酯键 新的DNA分子 DNA分子 氢键 单链DNA DNA分子 磷酸二酯键 脱氧核苷酸 三.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 03 质粒 将外源基因送入受体细胞, 在受体细胞内对目的基因进行大量复制. 1.作用： 动植物病毒 噬菌体 2.种类： 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 27 思考： 噬菌体或某些动植物病毒作为载体，其原理是 。 病毒对宿主细胞的侵染具有一定的 。 利用病毒对宿主细胞的侵染性 物种（组织）特异性 若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，其原因是 。 噬菌体 噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕 种类 用途 不同点 质粒 噬菌体 植物病毒 动物病毒 将外源基因导入细菌等受体细胞 将外源基因导入植物细胞 将外源基因导入动物细胞 来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别 2.种类： 03 29 03 3.载体需具备的条件 ——供外源DNA片段（目的基因）插入其中 ✭真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 ②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。 ①有一个至多个限制酶切割位点 ③具有标记基因 ④对受体细胞无害，易分离。 ——便于重组DNA分子的筛选 如何利用标记基因的筛选呢？ 普通培养基 不含抗生素 选择培养基 50µg/ml氨苄青霉素 03 30 质粒 人的DNA分子 用EcoRⅠ限制酶切割 用EcoRⅠ限制酶切割 用DNA连接酶粘合 计划让大肠杆菌表达人类生长激素？ 31 请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRI的识别序列和切割位点。然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。 请在两张纸上分别写上下面两段DNA序列： 实例：重组DNA分子的模拟操作 AATTCGGCATAC… …TATCGTACGATAGGTACTTAA …ATAGCATGCTATCCATG GCCGTATG… 目的基因 … TCCTAG … AGGATCTTAA AATTCCATAC … GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG GGTATG … 运载体 分子运输车 …TATCGTACGATAGGTACTTAA …ATAGCATGCTATCCATG 目的基因 … TCCTAG … AGGATCTTAA AATTCCATAC … GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG GGTATG … AATTCGGCATAC… GCCGTATG… 实例：重组DNA分子的模拟操作 DNA连接酶 分子运输车 …TATCGTACGATAGGTACTTAA …ATAGCATGCTATCCATG GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG AATTCGGCATAC… GCCGTATG… …TATCGTACGATAGGTACTTAA …ATAGCATGCTATCCATG AATTCGGCATAC… GCCGTATG… GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG DNA连接酶 实例：重组DNA分子的模拟操作 分子运输车 …TATCGTACGATAGGTACTTAA …ATAGCATGCTATCCATG AATTCGGCATAC… GCCGTATG… …TATCGTACGATAGGTACTTAA …ATAGCATGCTATCCATG AATTCGGCATAC… GCCGTATG… GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG GAGCCATACTTAA AATTCTCGGTATG DNA连接酶 通常用两种不同限制酶同时切割目的基因和运载体（双酶切法）： 防止载体自身连接、目的基因自身环化和反向拼接 实例：重组DNA分子的模拟操作 1. 剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具” ？ 剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。 2. 你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？ 如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。 3. 你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？ 不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。 四.探究实践：DNA的粗提取与鉴定 一、实验原理 0 0.14 NaCI浓度（mol/L） DNA溶解度 1.DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同 观察左图，尝试描述DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线。 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？ 用高浓度的盐溶液（2mol/L的NaCl溶液）溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质； 用低浓度的盐溶液（0.14mol/L的NaCl溶液）使DNA析出，能除去溶解在低盐中的杂质。 取过滤液 取过滤物 2.DNA在酒精溶液中的溶解性 DNA不溶于酒精，但是某些蛋白质能溶于酒精。 3.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 酶——蛋白酶 高温——大多数蛋白质不能忍受60-80℃的高温，但DNA在 80℃以上才会变性 洗涤剂——能瓦解细胞膜，但对DNA没有影响 4.DNA的鉴定 DNA+二苯胺 蓝色物质 沸水浴 对照组 实验组 二、实验设计 （一）实验材料的选取 那么应该选择什么样的材料呢？ 思考：上述材料中哪些不能进行选择？为什么？ 凡是含有DNA的生物材料都可，但是选用富含DNA的材料成功率会更高。 材料用具： 新鲜洋葱、研磨液、体积分数为95%的酒精、2mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等 （二）实验步骤 1.破碎细胞，获取DNA的滤液 称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。 研磨 注意事项：研磨时间不宜太长，防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量；有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶，研磨效果好（有利于充分研磨）；研磨不宜太用力 思考：若是动物细胞，该如何获取DNA滤液？ 吸水涨破 2.去除滤液中的杂质 a.漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液； b.也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。 （核蛋白、脂质、多糖和RNA等杂质） 3.DNA的析出 减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子。 4.DNA的鉴定 DNA滤液+同体积冷却的95%酒精 静置2~3min 白色絮状物 用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物； 或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。 思考：为什么要沿一个方向搅拌？ 丝状物或沉淀物+2mol/L的NaCl溶液5mL 二苯胺 加热 冷却后观察颜色变化 实验组 对照组 水浴加热 加入4mL二苯胺试剂 加入2mol/L氯化钠溶液 加入丝状物 加入2mol/L氯化钠溶液 不加入丝状物 加入4mL二苯胺试剂 合作探究 1.为什么要提取出白色丝状物？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？ 2.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。 如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。 鉴定结果呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。 ①材料中的核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够。 ②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。 ③二苯胺最好现用现配，否则二苯胺变成浅蓝色，影响鉴定效果。 课堂小结 限制酶 DNA连接酶 载体 ①对受体细胞无害； ②有一个至多个限制酶切割位点； ③有特殊的标记基因； ④能自我复制或能整合到宿主DNA上。 质粒、噬菌体 、动植物病毒 基因工程的基本工具 作为载体的条件 种类： 磷酸二酯键 来源 ： 主要来源于原核生物 特点： 作用部位： 具有专一性 结果： 形成黏性末端或平末端 连接部位：磷酸二酯键 种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶 作用： 把两条双链DNA片段拼接起来 1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶，以下说法正确的是 ( 　) A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端 C 2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（ ） A.大肠杆菌的质粒 B.切割DNA分子的酶 C.DNA片段的黏性末端 D.用来识别特基因的DNA探针 A 3.图1为某种质粒结构简图，图2表示某外源DNA上的目的基因，小箭头所指分别为限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ的酶切位点。下列有关叙述错误的是(   ) A.在基因工程中若只用一种限制酶 完成对质粒和外源DNA的切割，则可选 EcoRⅠ B.如果将一个外源DNA分子和一个 质粒分别用 EcoRⅠ酶切后，再用DNA连接酶连接，形成一个含有目的基因的重组DNA，此重组DNA中 EcoRⅠ酶切点有1个 C.为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，酶切时可使用BamHⅠ和Hind Ⅲ 两种限制酶同时处理 D.质粒是一种结构很小的、能自主复制的环状DNA，是基因工程中最常用的载体 B 4．下列有关限制酶和DNA连接酶的叙述正确的是(　　) A．用限制酶剪切获得一个目的基因时产生两个切口，有四个磷酸二酯键被断开 B．在使用限制酶的同时，必须用解旋酶解开DNA的双螺旋结构 C．DNA连接酶可以连接两个肽链片段 D．T4 DNA连接酶和E.coli DNA连接酶都能催化平末端和黏性末端的连接 　 A 5．质粒是基因工程中最常用的载体，它的主要特点是(　　) ①能自主复制　②不能自主复制　③结构很小  ④成分为蛋白质　⑤环状RNA　⑥环状DNA  ⑦能“友好”地“借居” A．①③⑤⑦    B．②④⑥ C．①③⑥⑦    D．②③⑥⑦ C 6．从目标生物提取分离DNA是进行基因工程操作的基础。以洋葱为材料进行“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是(　　) A．将蒸馏水加入切碎的洋葱中充分研磨以释放核DNA B．洋葱研磨后应该使用垫有滤纸的漏斗进行过滤 C．将滤液静置后，取下层溶液加入95%的冷酒精 D．将粗提取的DNA用二苯胺试剂鉴定会呈现蓝色 D $