3.2基因工程的基本操作程序第1课时目的基因的筛选与获取和PCR技术课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

第三章 第二节 基因工程的基本操作程序 第1课时　目的基因的筛选与获取和PCR技术 本节聚焦： 1.真核生物与原核生物基因结构的不同 2.目的基因的获取方法 3.简述PCR的原理、条件及过程。 回顾旧知 基因工程的概念 基因工程的理论基础 重组DNA技术的基本操作工具 DNA的粗提取与鉴定 温故知新——快问快答 （1）基因工程的概念 ①操作对象：________。 ②操作水平：____________。 ③操作原理：____________。 ④结果：创造出更符合人们需要的新的____________和生物产品。 ⑤基因工程的优点：_________________________________。 基因 DNA分子水平 基因重组 生物类型 能够定向改变生物性状 （2）不同生物的DNA分子能拼接起来的理论基础： ①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。 ②双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。 温故知新——快问快答 （3）一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达 ①基因是控制生物性状的独立遗传单位。 ②遗传信息的传递都遵循中心法则。 ③生物界共用一套遗传密码。 （4）重组DNA技术的基本操作工具： ①限制性内切核酸酶（简称限制酶） ②DNA连接酶 ③载体 温故知新——快问快答 （5）限制性内切核酸酶（简称限制酶） ①主要来自____________ ②作用：识别双链DNA分子的__________________，使每一条链中____________的________________断开 ③结果：产生____________或平末端 ④能被限制酶特异性识别的序列一般都为____________ 原核生物 特定的核苷酸序列 特定部位 磷酸二酯键 黏性末端 回文序列 （6）DNA连接酶 ①作用：将________________连接起来，恢复被____________切开的两个核苷酸之间的______________。 双链DNA片段 磷酸二酯键 限制酶 温故知新——快问快答 （6）DNA连接酶 ②种类：来源于大肠杆菌的__________________和来源于T4噬菌体的____________ ③区别：E．coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远 ______T4 DNA连接酶 E．coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶 低于 （7）质粒作为载体所具备的条件及原因 ①稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上——能使目的基因 稳定存在且数量可扩增 ②有一个至多个限制酶切位点——可携带一个或多个外源基因 ③具有特殊的标记基因——便于重组DNA分子的筛选 ④对受体细胞无毒害作用——避免受体细胞受到损伤 知识补充 原核生物与真核生物的基因结构 原核生物与真核生物的基因结构 一、原核生物的基因结构 与RNA聚合酶的结合位点 编码区 非编码区 非编码区 编码区上游 启动子 编码区下游 终止子 原核生物的基因结构 编码区： 非编码区： 编码蛋白质，连续不间断 不编码蛋白质，调控遗传信息表达 上游有启动子， 下游有终止子 原核生物与真核生物的基因结构 二、真核生物的基因结构 与RNA聚合酶的结合位点 编码区 非编码区 非编码区 编码区上游 启动子 编码区下游 终止子 真核生物的基因结构 编码区： 非编码区： 外显子：能编码蛋白质的序列 不编码蛋白质，调控遗传信息表达 上游有启动子， 下游有终止子 外显子 内含子 内含子：不能编码蛋白质的序列 非编码序列：包括非编码 区和内含子 原核生物 真核生物 示意图 不同点 编码区是连续的 编码区是间隔的、不连续的 相同点 都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区区组成的 真核细胞VS原核细胞的基因结构 真核细胞与原核细胞转录的不同 从社会中来 1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？ 苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家通过实验，将该细菌的“杀虫基因”转到棉花里，让棉花也能产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。 培育转基因抗虫棉的简要过程 苏云金杆菌 提取 Bt基因 （目的基因） 与载体拼接 重组DNA分子 导入 棉花细胞 （受体细胞） 表达Bt基因 抗虫棉 普通棉花 （无抗虫特性） 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构建 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定 基因工程的 基本操作程序 1.目的基因的筛选与获取 2.基因表达载体的构。、建 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定 目的基因的筛选与获取 1.目的基因：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是 目的基因。它主要是指编码蛋白质的基因。如与生物抗逆 性、生产药物、毒物降解、工业用酶等相关的基因 2.目的基因的筛选：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选 是较为有效的方法之一 苏云金杆菌 生物杀虫剂 制成 广泛用于防治棉花虫害 与Bt基因的序列信息有关 Bt抗虫蛋白 表达产物 Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因 目的基因的筛选与获取 3.筛选目的基因的技术：随着测序技术的发展，以及序列数据库（如GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，这也为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能 测序仪 序列数据库（如GenBank） 序列比对工具（如BLAST） 明确了目的基因后，该怎么获得它呢？ 目的基因的筛选与获取 4.目的基因的获取 1.从基因文库中获取目的基因 （目的基因序列未知） 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。（类比图书馆） 如果这个文库包含了某种生物的所有基因，那么，这种基因文库叫做基因组文库。如果这个文库只包含了某种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库。 2.人工合成：基因序列已知且程度不是很大的DNA片段可以通过反转录法或采用DNA合成仪人工合成。 目的基因的筛选与获取 反转录法 化学合成法 4.目的基因的获取 目的基因的筛选与获取 4.目的基因的获取 1.从基因文库中获取目的基因 （目的基因序列未知） 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。（类比图书馆） 如果这个文库包含了某种生物的所有基因，那么，这种基因文库叫做基因组文库。如果这个文库只包含了某种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库。 2.人工合成：基因序列已知且程度不是很大的DNA片段可以通过反转录法或采用DNA合成仪人工合成。 3.常用PCR特异性地快速扩增目的基因 （基因序列部分或全部已知） 目的基因的筛选与获取——PCR技术 5.PCR技术： 在体外(PCR扩增仪)提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 ①全称：聚合酶链式反应 ②原理：DNA半保留复制的原理 ③前提：一段已知目的基因的核苷酸序列。 ④条件：模板DNA 一对引物（两种） 热稳定DNA聚合酶（Taq酶) 4 种脱氧核苷酸dNTP(包括：dATP、dTTP、dCTP、 dGTP；作用：提供原料和能量) PCR扩增仪 回顾旧知：体内DNA复制过程 目的基因的筛选与获取——PCR技术 5.PCR技术： 体外模拟DNA复制所需的基本条件 参与组分 在DNA复制中的作用 DNA母链 提供DNA复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 解旋酶(体外用高温代替) 打开DNA双链(破坏氢键) DNA聚合酶 催化合成DNA子链(形成磷酸二酯键) 引物 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 DNA聚合酶特性：不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，因此，需要引物。 引物：是指能与DNA母链一段碱基序列互补配对的一小段DNA或RNA。使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。 目的基因的筛选与获取——PCR的过程 PCR的过程 当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链。 变 性 复 性 延 伸 变 性 90℃ 目的基因的筛选与获取——PCR的过程 PCR的过程 当温度下降到 50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA 结合。 变 性 复 性 延 伸 50℃ 目的基因的筛选与获取——PCR的过程 PCR的过程 变 性 复 性 延 伸 当温度上升到 72 ℃左右时，溶液中的 4 种脱氧核苷酸在耐高温的 DNA 聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA 链。 第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物。第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环的产物。 72℃ 目的基因的筛选与获取——PCR的过程 归纳 PCR技术 VS DNA复制 PCR DNA复制 相同点 原理 原料 条件 不同点 解旋方式 场所 酶 结果 半保留复制；碱基互补配对 四种脱氧核苷酸 模板、能量、酶 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化 体外复制 细胞核内 热稳定的DNA聚合酶 细胞内的DNA聚合酶 大量的DNA片段 形成2个完整的DNA分子 目的基因以指数形式在短时间内大量扩增。 1．下列有关获取目的基因的叙述，错误的是(　　) A．目的基因就是编码蛋白质的基因 B．获取目的基因是基因工程的第一步 C．来自苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因可作为转基因抗虫棉的目的基因 D．序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会 解析：目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子，A错误。 A 随堂练习 2．下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是(　　) A．二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端 B．二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋 C．体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量 D．二者遵循的碱基互补配对原则相同 B 随堂练习 解析： DNA体内复制与利用PCR技术扩增DNA时，子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端，A正确； PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，氢键在高温条件下断裂，B错误； DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时都需要能量，但两者所需能量来源不同，C正确； DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时，遵循的碱基互补配对原则相同，D正确。 随堂练习 3．下列关于基因表达载体构建的叙述，错误的是(　　) A．启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，组成它的基本单位是脱氧核苷酸 B．基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止密码子、标记基因等组件 C．人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表达 D．由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也有所差别 B 随堂练习 解析： 启动子在基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，组成它的基本单位是脱氧核苷酸，A正确； 基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点等，B错误； 人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表达，C正确； 由于受体细胞有植物、动物以及微生物之分，因此基因表达载体的构建是不完全相同的，D正确。 随堂练习 4．某人利用如图所示的载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组表达载体。有关叙述不正确的是(　　) A．这三种重组表达载体中，不能在宿主细 胞中表达目的基因产物的是甲、丙 B．启动子是DNA片段，是RNA连接酶识别 和结合的部位 C．抗生素抗性基因便于重组DNA分子的筛选 D．复制原点可以让重组表达载体拥有自我复制的能力，从而可以遗传给下一代 B 随堂练习 解析：在基因表达载体中，启动子位于目的基因 的上游，终止子位于目的基因的下游，这样的基 因才能表达，图中甲和丙均不符合，所以甲、丙 均不能在宿主细胞中表达目的基因产物，A正确； 启动子是一段有特殊结构的DNA片段，是RNA聚 合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，B错误；载体上的标记基因便于重组DNA分子的筛选，常用的标记基因是抗生素抗性基因，C正确；复制原点可以让重组表达载体拥有自我复制的能力，并且可以遗传给下一代，D正确。 随堂练习 5．如图1表示限制酶EcoR Ⅰ的识别序列，图2表示目的基因及限制酶切点，图3表示目的基因上的DNA片段，图4表示质粒。请回答下列问题。 随堂练习 (1)获得图2中目的基因的方法除PCR技术外，还有________________。 (2)采用PCR扩增目的基因的原理是____________________，图2中A、B、C、D 4种单链DNA片段，应选取________两种作为引物(DNA复制方向由5′→3′)。 (3)图3为目的基因中的某一片段，下列有关叙述错误的是________(填下列字母，不定项)。 a．该片段的基本骨架由脱氧核糖与磷酸交替连接而成 b．该片段含A－T碱基对比较多，故其结构比较稳定 c．若利用PCR扩增该片段，则需解旋酶将①氢键全部解开 d．若该目的基因复制6次，则需要碱基A的数量是252个 从基因文库中获取、人工合成 DNA半保留复制 B、C bcd 随堂练习 (4)在构建目的基因表达载体时，用PstⅠ、EcoR Ⅰ两种酶同时切割目的基因和质粒，是为了防止一种酶切割时发生_______________，从图2切割下目的基因需要消耗________个水分子。由图4可知，不选用限制酶PstⅠ和Hind Ⅲ同时对质粒和目的基因进行切割的原因是_______________________________________。 目的基因与载体自身环化和反向连接 4 会破坏质粒上所有的标记基因 随堂练习 解析： (1)获得目的基因的方法有PCR技术、从基因文库中获取、人工合成。 (2)采用PCR扩增目的基因的原理是DNA半保留复制，由图2可知，DNA复制只能从5′到3′，因此构建前利用PCR技术扩增基因时，A、B、C、D四种单链DNA片段中应选取B和C作为引物。 (3)DNA的基本骨架由脱氧核糖与磷酸交替连接而成，a正确；其结构中G－C碱基对越多，分子结构越稳定，b错误；PCR技术利用高温解开氢键，不需要解旋酶，c错误；由图3可知，目的基因碱基A有2个，复制6次需要碱基A的数量为26×2－2＝126个，d错误。故选b、c、d。 随堂练习 (4)在构建目的基因表达载体时，用PstⅠ、EcoRⅠ两种酶同时切割目的基因和质粒，是为了防止一种酶切割时发生目的基因与载体自身环化和反向连接。限制酶破坏的是磷酸二酯键，图中目的基因切割需要破坏4个磷酸二酯键，因此需要消耗4个水分子。由图4可知，不选用限制酶PstⅠ和Hind Ⅲ同时对质粒和目的基因进行切割的原因是会破坏质粒上所有的标记基因。 随堂练习 Lavf57.62.100 Lavf57.62.100 $$或对已知基因的研究筛选、测序比对后，我们可以明确所需的目的基因，包括它的序列。然而该怎么获得它呢？聚合酶链式反应也被称为PCR，是一项在体外迅速扩增da片段的技术。它能以极少量的DNA为模板，在几小时内扩增出上百万份的DNA拷贝pcr可以用于表达载体的构建病原体以及形成中微量遗传物质的放大检测等等。为了获得庞大的拷贝量，PCR1般需要经历三十多轮循环。我们这里用N表示当前的轮数，在每轮循环过程中都需要经历变性、复性、延伸三个步骤。每个步骤分别需要温控DNA母链20至30个核苷酸长度的引物，耐高温的DNA聚合酶TAQ酶以及4种脱氧核苷酸ATCG这五大要素。首先是变形阶段，当温度上升到90度时，双链DNA解决为单链，温度下降到50度左右时进入复习阶段。我们需要使用两种引物，通过剪辑互补配对与两条单链DNA结合。此时需要大家提前留意各个单链以及引物的方向。5撇至3撇是DNA复制始终遵循的正方向，因此三撇至5撇的DNA单链与5撇至3撇的引物相结合，也称正向引物，反之，5撇至3撇的DNA单链与3撇至5撇的引物相结合，也称反向引物。最后延伸开始温度上升到72度左右时，耐高温的TAQ酶将4种脱氧核苷酸添加到有的3撇端。请大家务必牢记，在pcr中影物之所以被称之为引物，是因为它规定和引导了复制开始的方向。也就是说DNA每次的复制都必须从引物的3撇端开始，沿着引物自身五撇这3撇的方向进行延伸。有趣的是因为引物是从模板中间的某个部位开始引导复制的，所以在第一轮结束时，一对新产生的DNA双链中存在着不同长度的单链。至此本轮反应结束，接下来第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，在经过之前三个步骤产生第二轮循环的产物，同样的DNA依然能够从引物的3撇端开始复制，又形成了新的不同程度的单链。我们发现进入第三轮反应后，在前两次正向反向引物的夹击复制下，第一次形成了两对等长的短双链DNA及两端仅带引物序列的目的基因片段。接下来依据DNA半保留复制的原则，这样的短双链DNA呈指数扩增。在上述过程中，大家或许有留意到，随着轮数N的变化，DNA的总数以及不同长度的片段数量等等参数也在随之改变。我们将在下期为大家详细讲解其中的数学关系和计算方式。 DNA的复制是指以清代DNA为模板合成子代DNA的过程。DNA复制的过程遵循碱基互补配对原则。复制开始时，在细胞提供的能量的驱动下，解旋酶将DNA双螺旋的两条链解开，这个过程叫做解旋。然后DNA聚合酶等以解开的每一条母链为模板，以细胞中游离的4种脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则，各自合成与母链互补的一条子链。随着模板链解旋过程的进行，新合成的子链也在不断延伸，同时每条新链与其对应的模板链盘绕成双螺旋结构，复制结束后一个DNA分子就形成了两个完全相同的DNA分子式。DNA复制是一个边解旋边复制的过程，需要模板原料、能量和酶等基本条件。DNA独特的双螺旋结构为复制提供了精确的模板，通过碱基互补配对保证了复制能够准确的进行。