大题05 基因工程与细胞工程类-【大题精做】冲刺2025年高考生物大题突破+限时集训（江苏专用）

大题05 基因工程与细胞工程类 通过对近年江苏高考及全国卷生物试题的分析，基因工程与细胞工程类题目知识综合性极强，并非孤立考查基因工程或细胞工程知识，而是常与其他生物学知识广泛融合。像 2020 年高考真题，既把产脂肪酶酵母的筛选这一微生物培养相关内容，与基因工程中的育种知识相联系，还涉及微生物培养里的无菌操作、计数等要点；同时，又将细胞工程范畴内的单克隆抗体制备，和免疫调节知识有机结合，这就要求考生必须构建起扎实且全面的综合知识体系。在考查形式上，这类题目极为注重实验分析与设计。以 2024 年高考真题为例，围绕超氧化物歧化酶（SOD）的纯化实验，从实验步骤的理解、结果的剖析，到实验优点的探讨，全面考查考生的实验能力；2022 年关于纤毛相关基因的研究题目，更是涵盖实验操作目的、引物选择、结果分析等多个实验环节，对考生的实验素养要求颇高。此外，图表信息丰富也是一大显著特征，常借助图表来呈现实验数据、过程或结果。例如 2020 年展示酵母菌培养结果的图、2024 年体现 SOD - ELP50 蛋白纯化效果影响的图、2023 年呈现质粒构建及电泳结果的图等，这就需要考生具备从复杂图表中精准提取有效信息，并进行深入分析、合理推理和准确判断的能力。 从命题规律看，在知识点分布方面，基因工程部分着重考查基因工程的工具酶，如限制酶、DNA 连接酶等的作用特点；基因表达载体构建过程中的关键要素，包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等的功能及相互关系；目的基因的检测与鉴定的多种方法及原理等。细胞工程部分则常聚焦于单克隆抗体制备流程中涉及的细胞融合技术、杂交瘤细胞筛选、抗体的获取与鉴定；植物组织培养的原理、过程及在作物培育等方面的应用；动物细胞培养的条件、过程及应用等内容。此外，还会巧妙结合微生物培养、酶的应用等知识进行综合命题。在能力考查上，十分注重对考生多方面能力的检验。要求考生具备扎实的理解能力，能够深入理解生物学概念、原理和规律；具备较强的实验与探究能力，熟练掌握实验操作技能，能够设计实验、分析实验现象与结果；具备高效的获取信息能力，从题干、图表等资料中精准提炼关键信息；具备良好的综合运用能力，将所学知识融会贯通，用以解决实际问题。 针对这类题目，考生可运用有效的解题技巧与方法。首先，要扎实夯实基础知识，对基因工程、细胞工程的基本概念，如基因工程中限制酶如何识别特定核苷酸序列并切割 DNA，细胞工程中植物体细胞杂交的原理等；原理方面，像基因表达载体构建依据的 DNA 重组原理，细胞培养遵循的细胞增殖原理等；操作步骤，如目的基因获取的多种方法、单克隆抗体制备的具体流程等；应用领域，如基因工程在转基因作物培育、基因诊断方面的应用，细胞工程在克隆动物、组织器官移植等方面的应用等，都要熟练掌握，构建起条理清晰、完整全面的知识体系，以便在解题时能够迅速、准确地调取相关知识。其次，务必注重实验分析。面对实验类题目，要仔细研读实验目的，明确实验想要探究的核心问题；深入理解实验原理，知晓实验设计所依据的生物学理论；精准把握实验步骤，明白每个操作环节的意义与作用；能够对实验结果进行深入分析与合理阐释，依据实验目的和呈现的结果推导出科学合理的结论。同时，要深刻领会实验设计的基本原则，如对照原则，通过设置对照组来排除无关变量干扰，凸显自变量对因变量的影响；单一变量原则，确保实验中只有一个自变量在变化，其他条件保持一致，从而准确探究自变量与因变量的关系，并且能够依据这些原则设计出简洁、科学的实验方案。再者，要学会高效解读图表。面对图表时，要认真细致地观察其中的数据变化、曲线走势、图像特征等信息，清晰明确图表所传达的生物学内涵。掌握从图表中提取关键信息的技巧，分析数据的增减趋势、波动规律等，并将图表呈现的信息与所学的基因工程和细胞工程知识紧密结合，展开合理的推理与准确的判断。然后，要着力提高综合运用能力。在复习备考过程中，不能孤立地学习基因工程与细胞工程知识，而是要注重将二者与其他生物学知识进行有机整合，构建起广泛联系的知识网络。比如将基因工程与遗传学中基因的传递与变异知识相联系，细胞工程与生态学中生物多样性保护、生态系统修复知识相结合等。此外，还要密切关注生物学知识在生产生活实际中的应用，如基因工程在制药行业中生产胰岛素等药物的应用，细胞工程在农业生产中培育无病毒植株的应用等，通过关注这些实际应用案例，提升自身综合运用知识解决实际问题的能力。最后，规范答题至关重要。在答题时，语言表达必须准确、规范，严格使用生物学专业术语，杜绝口语化表述。答案的组织要条理清晰，逻辑严谨，书写工整。对于简答题，要依据题目要求，分点作答，全面且准确地阐述要点，避免出现要点遗漏的情况。 典例一：微生物培养与应用综合 （2020·江苏·高考真题）产脂肪酶酵母可用于含油废水处理。为筛选产脂肪酶酵母菌株，科研人员开展了相关研究。请回答下列问题： （1）常规微生物实验中，下列物品及其灭菌方法错误的是 （填编号）。 编号 ① ② ③ ④ 物品 培养基 接种环 培养皿 涂布器 灭菌方法 高压蒸汽 火焰灼烧 干热 臭氧 （2）称取1．0g某土壤样品，转入99mL无菌水中，制备成菌悬液，经 后，获得细胞密度不同的菌悬液。分别取0．1mL菌悬液涂布在固体培养基上，其中10倍稀释的菌悬液培养后平均长出了46个酵母菌落，则该样本中每克土壤约含酵母菌 个。 （3）为了进一步提高酵母菌产酶能力，对分离所得的菌株，采用射线辐照进行 育种。将辐照处理后的酵母菌涂布在以 为唯一碳源的固体培养基上，培养一段时间后，按照菌落直径大小进行初筛，选择直径 的菌落，纯化后获得A、B两突变菌株。 （4）在处理含油废水的同时，可获得单细胞蛋白，实现污染物资源化。为评价A、B两菌株的相关性能，进行了培养研究，结果如图。据图分析，应选择菌株 进行后续相关研究，理由是 。 微生物的数量测定 1.微生物的数量测定方法：间接计数法——稀释涂布平板法、直接计数法——显微镜直接计数法。 2．稀释涂布平板法 ①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目。 恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。 ②计数原则：选择菌落数为30-300的平板计数；同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。 ③结果分析：统计的菌落数往往比活菌的实际数目少；这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。 ④ C代表某一稀释度下平板上生长菌落数的平均值；V代表涂布平板时吸取的稀释液体积数值(mL)；M代表稀释倍数；则每g样品中的细菌数=（C÷V）×M。 计算：将1ml水样稀释100倍，在三个平板上用涂布法分别接入0.1ml稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为(39+38+37)÷3÷0.1×100×1000。 3．显微镜直接计数法 ①原理：利用特定的细菌计数板或血细胞计数板在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。 ②计数工具：血细胞计数板常用对相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等计数； 细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。 ③优点：快速直观。 缺点：统计结果一般是活菌数和死菌数的总和，比实际值偏大。个体小的细菌在显微镜下难以观察。 1．（2025·河北唐山·一模）四甲基吡嗪（TTMP）是枯草芽孢杆菌的一种代谢产物，是影响白酒风味的重要物质。bdhA基因的表达产物是降低TTMP含量的关键酶，研究人员欲通过敲除枯草芽孢杆菌的bdhA基因提高TTMP产量。回答下列问题： (1)为获取枯草芽孢杆菌的纯净培养物E，可取少量枯草芽孢杆菌菌液接种到牛肉膏蛋白胨 （填“固体”或“液体”）培养基中，蛋白胨提供的主要营养是 。 (2)利用下图中的3对引物扩增出bdhA基因的上、下游片段和cat基因，将3种扩增产物和质粒1分别酶切后进行连接以获得质粒2。为使cat基因位于质粒2的上、下游片段之间，在设计引物5、6时，应在引物的 端分别加入限制酶 和 的识别序列。 (3)用质粒2转化菌株E时，可用 处理菌株E以提高转化的成功率。质粒2与菌株E的DNA发生同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与E中bdhA基因上、下游片段配对，并发生交换）使E的bdhA基因替换为cat基因。将转化处理的枯草芽孢杆菌置于含有 的培养基中以筛选出目的菌株E-。 (4)为检验E-的bdhA基因被成功敲除，以E-的基因组DNA为模板，选用引物 进行PCR，预期扩增只获得一种大小为 bp的DNA片段。对于PCR产物电泳结果符合预期的DNA片段，通常还需进一步通过基因测序确认，原因是 。为研究敲除bdhA基因是否影响菌株生长，可用接种环挑取E⁻后直接用 法进行接种，观察到菌落大小和形态与菌株E一致。 2．（2025·宁夏银川·一模）尿素含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥，但若不经细菌的分解，就不能更好地被植物利用，某科研小组为了将土壤中分解尿素的细菌纯化培养，进行了如下操作，请回答相关问题： 成分 KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4·7H2O 葡萄糖 尿素 琼脂 含量（g） 1.4 2.1 0.2 10.0 1.0 15.0 操作将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1000毫升 (1)上表是尿素分解菌的选择培养基配方，选择培养基是指 。本实验中有两组对照，一组是未接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板和选择培养基平板，另一组是已接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板和选择培养基平板。设置前一组的平板上如果 ，说明培养基在使用前未被杂菌污染；后一组的平板上如果 ，可以说明选择培养基具有选择作用。 (2)将5g土壤溶于45mL无菌水，再稀释倍，按图[    ] （填数字及名称）接种方式将0.1mL样品接种到3个培养基上，统计菌落数目为134、131、137，据此可得出每克土壤中的纤维素分解菌活菌数约为 个。    (3)分解尿素的细菌能合成 ，催化尿素分解产生的可以作为细菌生长的氮源。如果培养基中加入了酚红指示剂，尿素分解的产物会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，根据功能划分该培养基属于 培养基。 (4)土壤中的某些固氮菌可以利用空气中的氮气作为氮源（如圆褐固氮菌能将大气中的氮气转化为，请设计实验进一步确定平板上分离得到的细菌是否是固氮菌。（写出简要思路及预期结果） 。 3．（2025·山西·一模）维生素K2在预防骨质疏松、心血管疾病等方面具有重要作用。科研人员以解淀粉芽孢杆菌（GSA-184）为研究对象，通过优化发酵工艺，提高了维生素K2的产量。请回答下列问题： (1)从土壤中筛选芽孢杆菌时，利用的培养基成分含有酵母浸粉、蛋白胨、NaCl和水等。其中蛋白胨提供的主要营养为 和维生素等。 (2)科研人员进行了优化培养基碳源的实验，实验结果如右图所示。据图判断，若对菌株GSA-184扩大培养，所用培养基的最佳碳源是 ；若想大量获取维生素K2，所用培养基的最佳碳源是 。 (3)科研人员探究了菌株GSA-184在不控制pH和控制pH为7.0条件下的发酵情况，实验结果如图甲和图乙所示。两种条件下的溶解氧在发酵3h内从100%附近急剧下降到2%附近，说明 ；在图甲中，发酵80h后溶解氧开始从0%附近逐渐上升，可能的原因是 。对比图甲和图乙说明， 条件下有助于维持菌体的活性，从而提高维生素K2产量。 典例二：动物细胞培养与单克隆抗体制备 （2020·江苏·高考真题）新型冠状病毒可通过表面的棘突蛋白（S蛋白）与人呼吸道黏膜上皮细胞的ACE2受体结合，侵入人体，引起肺炎。图1为病毒侵入后，人体内发生的部分免疫反应示意图。单克隆抗体可阻断病毒的粘附或入侵，故抗体药物的研发已成为治疗新冠肺炎的研究热点之一。图2为筛选、制备抗S蛋白单克隆抗体的示意图。请据图回答下列问题： （1）图1中人体内抗原递呈细胞吞噬病毒，并将病毒的抗原暴露在细胞表面，被 细胞表面的受体识别后激活该细胞。 （2）B细胞识别入侵的病毒后，在淋巴因子作用下，经过细胞的 ，形成 细胞。 （3）为判断疑似患者是否为新型冠状病毒感染者，采集鼻咽拭子主要用于病原学检查，检测病毒的 ；采集血液样本主要用于血清学检查，检测 。 （4）据图2所示，研制抗S蛋白单克隆抗体，需先注射 免疫小鼠以激活小鼠的免疫细胞，再提取激活的B细胞与骨髓瘤细胞融合，用HAT培养基筛选获得 细胞。因为同一种抗原可能激活 细胞，还需继续筛选才能获得分泌单克隆抗体的细胞株。 单克隆抗体 （1）抗体：一个 B 淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯 度低、特异性差。 （2）单克隆抗体的制备过程 （3）杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产生专一的抗体。 （4）单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。 （5）单克隆抗体的作用： ① 作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合， 具有准确、高效、简易、快速的优点。 ② 用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量 用于治疗其它疾病。 注射特定抗原的目的：用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞（获得能产生特定抗体的B淋巴细胞）。 第一次筛选 （1）如何筛选（筛选方法）：用特定的选择培养基进行筛选。 （2）筛选原理：在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。 （3）获得的杂交瘤细胞的特点：既能迅速大量繁殖，又能产生抗体。此时，抗体不是所需的特定抗体。 （4）得到的该杂交瘤细胞一定是所需的吗？杂交瘤细胞并不纯，因为从脾脏获得的B淋巴细胞不纯（既有未免疫的B淋巴细胞，又有能产其他抗体的B淋巴细胞，以及能产所需抗体的B淋巴细胞），因此要进行第二次筛选。 第二次筛选 （1）如何筛选（筛选方法）：用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下，进行克隆化培养和抗体检测（一般进行多次筛选）。 （2）获得的杂交瘤细胞的特点：既能迅速大量繁殖，又能分泌所需抗体。 （3）选择抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞，即分泌的抗体能与特定的抗原结合。 （4）抗体检测原理：抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的检测）。 1．（2025·云南玉溪·模拟预测）为了培育既抗除草剂（草甘膦），又抗冻的烟草植株，科学家将抗草甘膦基因（Aro基因，存在EcoRI酶切位点）和抗冻基因（Cor基因，存在Bell酶切位点）采用融合PCR技术（原理如下图所示）连接起来构建为Aro-Cor融合基因并进行了扩增，再将融合基因导入烟草细胞培育既抗除草剂又抗冻的转基因烟草，过程如下。请分析回答： (1)在将Aro基因和Cor基因融合的过程中，起到搭桥作用的引物2和引物3的碱基序列 （填“相同”或“不相同”），变性后形成的杂交分子在补齐为双链等长的融合基因时的延伸过程，不需要添加引物，其原因是 。为保证构建的Aro-Cor融合基因能正确插入载体中，应该分别在引物1和引物4侧连接 的限制酶识别序列。 (2)上述培育转基因烟草过程中将目的基因导入烟草细胞采用的方法是 ，将农杆菌和烟草细胞按比例充分混匀，3天后转入含有潮霉素而不是四环素抗性基因的选择培养基筛选抗性愈伤组织，原因是 。 (3)在培育转基因烟草植株的过程中，培养基中添加的生长素和细胞分裂素会影响植物细胞的发育方向，据此分析，在初次进行实验时，可以尝试调整生长素和细胞分裂素的 来观察其对细胞发育的影响。 2．（2025·浙江温州·二模）帕金森病是常见的中枢神经系统疾病。酪氨酸羟化酶在帕金森病中起着关键作用，其表达水平的下降与帕金森病的病理过程密切相关。当前研究发现由干细胞分泌的外泌体对该病有一定的治疗作用，回答下列问题。    (1)如图所示，外泌体是一类包含有复杂成分的小膜泡，干细胞分泌外泌体的方式为 ，这种方式体现了细胞膜具有 的结构特点。外泌体与其他细胞膜上的 结合后，将信息传递给靶细胞，发挥调节作用。 (2)为验证干细胞分泌的外泌体对帕金森病有一定的治疗作用，根据以下材料和用具，完善实验思路，设计实验记录表。 材料和用具：正常小鼠若干只，生理盐水配制的MPTP溶液（腹腔注射，用于制备急性帕金森小鼠模型），缓冲液配制的外泌体溶液（静脉注射），生理盐水，缓冲液等。 （要求与说明：实验中涉及的剂量不作具体要求。旋转试验可用于评估小鼠神经系统的功能，其结果可用转圈数进行表示。） ①完善实验思路： 将45只正常小鼠随机分为A、B、C三组，每组15只，其中B、C两组 ，制备成急性帕金森病小鼠模型； A组、B组 ，C组 。 将小鼠置于相同且适宜的条件下饲养，并在T1、T2、T3天， 。 进行数据的统计与分析。 ②设计一张表格，用于记录实验数据。 。 ③实验结果表明，使用外泌体治疗后，在一定时间范围内帕金森病小鼠转圈数明显减少，说明外泌体对帕金森病有一定的治疗作用。请结合信息预测A、B、C三组小鼠体内酪氨酸羟化酶的表达量大小： 。结合上述研究，除注射外泌体外，请再提出1种可能的治疗帕金森病的思路： 。 典例三：基因工程综合 （2024·江苏·高考真题）为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列-（GTTCCTGGTGTTGGC）50-限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题：    (1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是 。 (2)步骤②转化时，科研人员常用 处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有 的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是 。 (3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与 结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是 （从图2的“A~D”中选填）。    (4)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。    （ⅰ）20℃时，加入NaCl后实验结果是 。 （ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是 。 （ⅲ）据图分析，融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有 。 （2023·江苏·高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：    (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要的不同是 。 (2)有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用______。    A．ATGGTG------CAACCA B．TGGTTG------CACCAT C．GACGAG------CTGCAG D．CTGCAG------CTCGTC’ (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。 (4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。 A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落 B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 (5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。    (6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。 （2022·江苏·高考真题）纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。 (1)纤毛结构如图1所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是 。 (2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaC1至2．0mol/L的目的是 。PCR扩增时，需在 催化下，在引物 端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。 (3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y-M重组质粒（在EcoRⅤ位点插入片段）。请完成下表。 分步实验目标 简易操作、结果、分析 PCR鉴定正向重组质粒Y-M（图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头，代表方向） ①选择图Ⅱ引物 ； ②PCR目的产物约为 bp。 确保M及连接处序列正确，Y-M的连接处上游含有Hind III+EcoR V的识别序列，下游含有EcoR V+BamH I的识别序列 ③质粒测序，图Ⅲ中正确的是 （选填序列编号） 检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明 。 (4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经 形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数）。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的 倍。 （2021·江苏·高考真题）某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒，请结合实验流程回答下列问题： (1)目的基因的扩增 ①提取真菌细胞 ，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。 ②为了获得融合tag标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序列，否则将导致 。 ③热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除TaqDNA聚合酶（Taq酶）以外的各成分混合后，加热到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增，下列叙述正确的有 A．Taq酶最适催化温度范围为50～60℃ B．与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物 C．两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸 D．PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性 (2)重组质粒的构建 ①将Sma I切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进 ，形成A-m结合体。将A-m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及 酶等，完成质粒的环化。 ②若正确构建的重组质粒A—m仍能被Sma I切开，则Sma I的酶切位点可能在 。 (3)融合蛋白的表达 ①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A-m，然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是 。 ②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，说明 ，后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。 基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的获取 1.目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因 。 2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反 转录法_和化学合成法_。 3.PCR 技术扩增目的基因 （1）原理：DNA 双链复制 （2）过程：第一步：加热至 90～95℃DNA 解链；第二步：冷却到 55～60℃，引物结合到互补 DNA 链；第三步：加热至 70～75℃，热稳定 DNA 聚合酶从引物起始互补链的合成。 PCR解旋条件为90℃以上高温。PCR的扩增缓冲液中一般含有Mg2+作用为激活DNA聚合酶。PCR中复制的原料实际为dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）除作为原料，还可以水解产生能量为合成DNA子链提供能量。因此，PCR反应体系中不需要添加ATP。 第二步：基因表达载体的构建 1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表 达和发挥作用。 2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因 （1）启动子：是一段有特殊结构的 DNA 片段，位于基因的首端，是 RNA 聚合酶识别和结 合的部位，能驱动基因转录出 mRNA，最终获得所需的蛋白质。 （2）终止子：也是一段有特殊结构的 DNA 片段 ，位于基因的尾端。 （3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因 的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。 第三步：将目的基因导入受体细胞_ 1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2.常用的转化方法： 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是 农杆菌转化法，其次还有 基因枪法和 花 粉管通道法等。 将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 显微注射技术。此方法的受体细胞多是 受精 卵。 将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是 繁殖快、多为单细胞、遗 传物质相对较少 ，最常用的原核细胞是 大肠杆菌 ，其转化方法是：先用 Ca 2+ 处理细胞， 使其成为 感受态细胞 ，再将 重组表达载体 DNA 分子 溶于缓冲液中与感受态细胞混合， 在一定的温度下促进感受态细胞吸收 DNA 分子，完成转化过程。 3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。 第四步：目的基因的检测和表达 1.首先要检测 转基因生物的染色体 DNA 上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA 分子杂 交技术。 2.其次还要检测 目的基因是否转录出了 mRNA，方法是采用 用标记的目的基因作探针与 mRNA 杂交。 3.最后检测 目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取 蛋白质，用相应的 抗体进行抗原－抗体杂交。 4.有时还需进行 个体生物学水平的鉴定。如：转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。 1．（2025·黑龙江·一模）研究人员通过基因工程制备了能生产乙肝病毒抗原蛋白的酿酒酵母。抗原蛋白基因转录的模板链碱基序列为5'-GATTCG-3',5'-CCATGC-3'。如图表示育种过程利用的载体及限制酶的识别序列（注：假设目的基因内不含有相应酶的识别序列）。    (1)在通过PCR扩增目的基因片段的反应条件中，预变性的目的是 。在实际PCR反应中，扩增效率通常低于100%。若某次PCR反应的扩增效率为80%（PCR扩增效率是指在PCR反应中，每个循环中目标DNA分子的实际增加倍数与理论增加倍数的比值），初始模板DNA的量为10ng，经过25个循环后，实际获得的PCR产物量为 ng。 (2)据图分析，为了构建基因表达载体，我们应选择 来切割载体。由于抗原蛋白基因无法直接插入载体中，因此需要通过设计特定的引物，这些引物不仅包含与目的基因两端匹配的序列，还需包含特定的酶切位点，以便在扩增后能够与载体进行连接。引物的碱基序列从5'端到3'端依次 、 。 (3)真核生物的基本启动子没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列，可增强一个或多个基因的转录水平（如图）。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。    ①对文中“增强子”的理解，错误的是 A．增强子是含有特定碱基序列的DNA片段 B．一个增强子只能作用于一个基本启动子 C．增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上 D．很多增强子在不同组织中的活性不同 ②科学家鉴定出小鼠某胚胎细胞内一个增强子附近有两个基因A和B，为了确定这两个基因是否为特异表达的基因，他们应该检测 。 (4)检测受体细胞是否成功导入了重组载体，除了利用利用抗生素抗性筛选，还可以利用 方法。 2．（2025·山东聊城·一模）水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因（如图1所示）的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将斑马鱼的vtg基因，与人工构建的含萤火虫荧光素酶基因（无启动子）的载体（如图2所示）连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼。图2中Luc表示萤火虫荧光素酶基因，可以催化荧光素氧化产生荧光；为氨苄青霉素抗性基因，表示四环素抗性基因，BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、BsrGⅠ为限制酶。 (1)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体并降低“空载”概率，可选用限制酶 进行双酶切Luc基因载体，其优点是 。 (2)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，通过PCR技术扩增vtg基因时，需设计合适的加端引物。依据图1、图2信息推测引物2包含的碱基序列为 。一个vtg基因经过4轮循环后，得到的子代DNA分子中，只含有1种引物的DNA分子所占的比例为 。 (3)若筛选导入vtg-Luc基因重组载体的大肠杆菌，可将大肠杆菌依次放在含有氨苄青霉素、四环素的培养基中培养，筛选 的大肠杆菌即为目的菌；若要判断斑马鱼转基因是否成功，可在水体中添加 进行检测。 3．（2025·天津蓟州·一模）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： (1)进行PCR扩增时需要耐高温的DNA聚合酶，为使其活化应在PCR反应缓冲液中加入 （填“Ca2+”或“Mg2+”）。 (2)有关基因序列如图2，引物F2-F、F1-R应在下列选项中分别选用 。 A．5'-ATGGTG……CAACCA-3' B．5'-TGGTTG……CACCAT-3' C．5'-GACGAG……CTGCAG-3' D．5'-CTGCAG……CTCGTC-3' (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在酶的作用下可形成环形质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要是 。 (4)构建好的重组质粒除了含有目的基因、标记基因，还要有 ，用以控制目的基因的表达。 (5)如何将重组质粒导入大肠杆菌？ 。 (6)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3.根据图中结果判断，符合要求的质粒为 。 1．（2024·广西·高考真题）β-地中海贫血是人11号染色体上β-珠蛋白基因HBB突变所造成的遗传病。如图为HBB几种常见的基因突变位点及功能区域示意图。回答下列问题：    注：-28A→C中，“-”表示转录起始位点前，数值表示碱基位点，A→C表示碱基A突变为C；仅标示了非模板链上的变化，模板链也发生对应变化，但没有标示出来。 (1)654C→T突变， （选填“会”或“不会”）增加该基因嘌呤碱基总数量。-28A→C突变，会导致β-珠蛋白的表达异常，其原因是 。 (2)HBB在转录形成mRNA的过程中，细胞核内特定RNA复合物能特异性识别初级转录产物（mRNA前体），并将内含子对应区域剪切以及拼接外显子对应区域，这表明上述RNA复合物是一种 。 (3)含有17A→T突变的HBB转录出的mRNA，对应位点的碱基是 。 (4)某男性一条染色体上的HBB存在突变位点W，其配偶无W突变，他们生育的孩子 （选填“一定”或“不一定”）存在该突变，从遗传概率角度分析，其原因是 。为有效降低人群中β-地中海贫血的发病率，可以采取 和 等措施。 2．（2024·广西·高考真题）M蛋白与“记忆”的形成密切相关。科研人员制备了M基因表达可控的实验模型小鼠，主要制作流程见下图，实验模型小鼠通过特异性表达Cre重组酶来敲除两个LoxP位点间的序列，同时利用体内表达的蛋白A激活诱导型T启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M基因（M-GFP）的表达，恢复小鼠自身被敲除的M基因功能，同时便于示踪。回答下列问题： 注：基因型A/+指的是A基因被嵌合在细胞同源染色体中的一条，即可表示为Aa；两端添加上LoxP位点的M基因称为floxM。 (1)在PCR扩增片段①和②时，通常会在所用引物的一端添加被限制酶识别的序列，该序列添加的位置位于引物 （选填“3'端”或“5'端”）。在构建载体1时，为了阻断A基因的表达，从转录水平考虑，连接的片段可以是 ；而从翻译水平考虑，连接的片段可以是 。为了鉴定载体2是否构建成功，需要限制酶切割载体后，再进行 。 (2)培养小鼠胚胎干细胞需定时更换培养液，其目的是 （至少答2方面）。 (3)为了快速高效繁育出含有4对基因（遵循自由组合定律）的实验模型小鼠，应将培育出的基因型Cre/+A/+小鼠和M-GFP/+floxM/+小鼠分别与基因型floxM/floxM小鼠杂交，杂交获得的子代，再进行一代杂交后最终获得基因型为 实验模型小鼠。 (4)为了实现M基因的表达可控，在实验模型小鼠喂食时，可添加竞争性结合A蛋白的四环素，抑制T启动子的活性。添加四环素与未添加相比，目的是 。 3．（2025·浙江·高考真题）3-磷酸甘油脱氢酶（GPD）是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝酵母菌株为材料，克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因（Gpd）。采用的方案是：先通过第1次PCR扩增出该基因的中间部分，再通过第2次PCR分别扩增出该基因的两侧，经拼接获得完整基因的序列，如图所示，回答下列问题：    (1)分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的 ，确定DNA序列，进而设计1对引物。以该菌株基因组DNA为模板进行第1次PCR，利用 凝胶电泳分离并纯化DNA片段，进一步测定PCR产物的序列。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要确认或调整刻度和量程，还需要 。 (2)若在上述PCR扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是__________。 A．DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染 B．每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点 C．在基因组中Gpd基因有2个拷贝 D．在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因 (3)为获得完整的Gpd基因，分别用限制性核酸内切酶PstⅠ和SalⅠ单酶切基因组DNA后，各自用DNA连接酶连接形成环形DNA，再用苯酚-氯仿抽提除去杂质，最后加入 沉淀环形DNA。根据第一次PCR产物测定获得的序列，重新设计一对引物，以环形DNA为模板进行第二次PCR，最后进行测序。用于第二次PCR的一对引物，其序列应是DNA链上的 （A．P1和P2  B．P3和P4 C．P1和P4 D．P2和P3）。根据测序结果拼接获得完整的Gpd基因序列，其中的启动子和终止子具有 功能。 (4)为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的 进行比对。将Gpd基因的编码区与 连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。 4．（2024·天津·高考真题）金黄色葡萄球菌（简称Sa）是人体重要致病细菌、不规范使用抗生素易出现多重抗药性Sa。 (1)Sa产生抗药性可遗传变异的来源有 （至少答出2点）。 (2)推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测，以图1中R基因的上、下游片段和质粒1构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换）敲除Sa的R基因。    ①根据图1信息，简述质粒2的构建过程（需包含所选引物和限制酶）： ，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含 的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落。 ③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含 的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含 的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。 ④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是 。    5．（2024·福建·高考真题）病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR来应对感染。麻疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46（hCD46）是麻疹病毒入侵细胞的主要受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。 回答下列问题： (1)利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是 。 (2)将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是 。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用 限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。 (3)为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其 。将胚胎移植到小鼠c的子宫中，应选用桑葚胚的原因是 。 (4)利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组，目的是 。 (5)若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性，原因是 。 6．（2024·海南·高考真题）酿酒酵母是重要的发酵菌种，广泛应用于酿酒、食品加工及生物燃料生产等。研究人员对酿酒酵母菌株A进行基因工程改造以提高发酵中的乙醇产量。回答下列问题： (1)酿酒酵母在有氧和无氧的条件下都能生存，属于 微生物，在无氧条件下能进行 发酵，可用于制作果酒等。 (2)传统发酵中，新鲜水果不接种酿酒酵母也能制备果酒，原因是 。 (3)工业上常采用单一菌种发酵生产食品。菌株A存在于环境中，实验室获得该单一菌种的分离方法有 和 。 (4)菌株A含有1个FLO基因，其表达的FLO蛋白可提高发酵中乙醇产量，且FLO蛋白量与乙醇产量成正相关，研究人员基于菌株A构建得到菌株B、C、D（如图）。该实验中，构建菌株B的目的是 ，预期菌株A、B、C、D发酵中乙醇产量的高低为 。 (5)菌株A中，X和Y基因的表达均可以提高发酵中乙醇产量。研究人员将X和Y基因融合在一起，构建了XY融合基因能表达的菌株E（如图），其在发酵中具有更高的乙醇产量。菌株E中无单独的X和Y基因，且其他基因未被破坏。简要写出由菌株A到菌株E的构建思路 。 7．（2024·重庆·高考真题）有研究者构建了H基因条件敲除小鼠用于相关疾病的研究，原理如图。构建过程如下：在H基因前后均插入LX序列突变成h基因（仍正常表达H蛋白），获得Hh雌性小鼠；将噬菌体的G酶基因插入6号染色体上，获得G+G-雄鼠（G+表示插入，G_表示未插入G酶基因） (1)以上述雌雄小鼠为亲本，最快繁殖两代就可以获得H基因条件敲除小鼠（hhG+G-和hhG+G+）。在该过程中，用于繁殖F1的基因型是 。长期采用近亲交配，会导致小鼠后代生存和生育能力下降，诱发这种情况的遗传学原因是 。在繁殖时，研究人员偶然发现一只G+G-不表达G酶的小鼠，经检测发现在6号和8号染色体上含有部分G酶基因序列，该异常结果形成的原因是 。 (2)部分小鼠的基因型鉴定结果如图2，③的基因型为 。结合图1的原理，若将图2中所有基因型的小鼠都喂食TM试剂一段时间后，检测H蛋白水平为0的是 （填序号）。 (3)某种病的患者在一定年龄会表现出智力障碍，该病与H蛋白表达下降有关（小鼠H蛋白与人的功能相同）。现有H基因完全敲除鼠甲和H基因条件敲除鼠乙用于研究缺失H蛋白导致该病发生的机制，更适合的小鼠是 （“甲”或“乙”），原因是 。 8．（2024·重庆·高考真题）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 (1)基因S启动子的基本组成单位是 。 (2)通过基因工程方法,将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题19图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是 ；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是 。 (3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有 。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是 。 (4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是 。 9．（2024·贵州·高考真题）研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A的野生型（含NV基因）、突变体（NV基因突变）和转基因菌株（转入NV基因），检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量，结果如表所示（表中“+”表示有，“—”表示无）。 检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖（培养液中） 野生型 + + + 野生型 — — — 突变体 + — — 转基因菌株 + + + 回答下列问题。 (1)据表可推测 诱导了NV基因表达。NV酶的作用是 。检测NV酶活性时，需测定的指标是 （答出1点即可）。 (2)表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板，用与 （选填“T-DNA”或“NV基因”）配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度 （选填“>”“=”或“<”）野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功，从基因序列分析其原因是 。 (3)为进一步验证NV基因的功能，表中的转基因菌株是将NV基因导入 细胞获得的。在构建NV基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是 。 10．（2024·江西·高考真题）植物体表蜡质对耐干旱有重要作用，研究人员通过诱变获得一个大麦突变体Cer1（纯合体），其颖壳蜡质合成有缺陷（本题假设完全无蜡质）。初步研究表明，突变表型是因为C基因突变为c，使棕榈酸转化为16-羟基棕榈酸受阻所致（本题假设完全阻断），符合孟德尔遗传规律，回答下列问题： (1)在C基因两侧设计引物，PCR扩增，电泳检测PCR产物。如图泳道1和2分别是突变体Cer1与野生型（WT，纯合体）。据图判断，突变体Cer1中c基因的突变类型是 。    (2)将突变体Cer1与纯合野生型杂交．F1全为野生型，F1与突变体Cer1杂交，获得若干个后代，利用上述引物PCR扩增这些后代的基因组DNA，电泳检测PCR产物，可以分别得到与如图泳道 和泳道 （从1~5中选择）中相同的带型，两种类型的电泳带型比例为 。 (3)进一步研究意外发现，16-羟基棕榈酸合成蜡质过程中必需的D基因（位于另一条染色体上）也发生了突变，产生了基因d1，其编码多肽链的DNA序列中有1个碱基由G变为T，但氨基酸序列没有发生变化，原因是 。 (4)假设诱变过程中突变体Cer1中的D基因发生了使其丧失功能的突变，产生基因d2。CCDD与ccd2d2个体杂交，F1的表型为野生型，F1自交，F2野生型与突变型的比例为 ；完善以下表格： F2部分个体基因型 棕榈酸（填“有”或“无”） 16-羟基棕榈酸（填“有”或“无”） 颖壳蜡质（填“有”或“无”） Ccd2d2 有 ① 无 CCDd2 有 有 ② 11．（2024·江西·高考真题）聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是一种聚酯塑料，会造成环境污染。磷脂酶可催化PET降解。为获得高产磷脂酶的微生物，研究人员试验了2种方法。回答下列问题： (1)方法1从土壤等环境样品中筛选高产磷脂酶的微生物。以磷脂酰乙醇酯（一种磷脂类物质）为唯一碳源制备 培养基，可提高该方法的筛选效率。除碳源外，该培养基中至少还应该有 、 、 等营养物质。 (2)方法2采用 技术定向改造现有微生物，以获得高产磷脂酶的微生物。除了编码磷脂酶的基因外，该技术还需要 、 、 等“分子工具”。 (3)除了上述2种方法之外，还可以通过 技术非定向改造现有微生物，筛选获得能够高产磷脂酶的微生物。 (4)将以上获得的微生物接种到鉴别培养基（在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加2%的琼脂粉和适量的卵黄磷脂）平板上培养，可以通过观察卵黄磷脂水解圈的大小，初步判断微生物产磷脂酶的能力，但不能以水解圈大小作为判断微生物产磷脂酶能力的唯一依据。从平板制作的角度分析，其原因可能是 。 12．（2024·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）～（4）题。 筛选组织特异表达的基因 筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。 真核生物的基本启动子位于基因5'端附近，没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。 很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定组织中表达（图A）。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”（图B），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活报告基因的表达（图C）。 获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组DNA，通过PCR扩增含有捕获载体序列的DNA片段。对PCR产物进行测序后，与相应的基因组序列比对，即可确定载体的插入位点，进而鉴定出相应的基因。 研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，研究其在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。 (1)在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生 的过程称为细胞分化，分化是基因 的结果。 (2)对文中“增强子”的理解，错误的是________。 A．增强子是含有特定碱基序列的DNA片段 B．增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上 C．一个增强子只能作用于一个基本启动子 D．很多增强子在不同组织中的活性不同 (3)研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应检测 。 (4)真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B所示载体进行了改造，期望改造后的载体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突变，以研究基因功能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称 （略）。 13．（2024·北京·高考真题）啤酒经酵母菌发酵酿制而成。生产中，需从密闭的发酵罐中采集酵母菌用于再发酵，而直接开罐采集的传统方式会损失一些占比很低的独特菌种。研究者探究了不同氧气含量下酵母菌的生长繁殖及相关调控，以优化采集条件。 (1)酵母菌是兼性厌氧微生物，在密闭发酵罐中会产生 和CO2。有氧培养时，酵母菌增殖速度明显快于无氧培养，原因是酵母菌进行有氧呼吸，产生大量 。 (2)本实验中，采集是指取样并培养4天。在不同的气体条件下从发酵罐中采集酵母菌，统计菌落数（图甲）。由结果可知，有利于保留占比很低菌种的采集条件是 。 (3)根据上述实验结果可知，采集酵母菌时O2浓度的陡然变化会导致部分菌体死亡。研究者推测，酵母菌接触O2的最初阶段，细胞产生的过氧化氢（H2O2）浓度会持续上升，使酵母菌受损。已知H2O2能扩散进出细胞。研究者在无氧条件下从发酵罐中取出酵母菌，分别接种至含不同浓度H2O2的培养基上，无氧培养后得到如图乙所示结果。请判断该实验能否完全证实上述推测，并说明理由 。 (4)上述推测经证实后，研究者在有氧条件下从发酵罐中取样并分为两组，A组菌液直接滴加到H2O2溶液中，无气泡产生；B组菌液有氧培养4天后，取与A组活菌数相同的菌液，滴加到H2O2溶液中，出现明显气泡。结果说明，酵母菌可通过产生 以抵抗H2O2的伤害。 14．（2024·湖南·高考真题）百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题： (1)体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前，先用 去除细胞壁获得原生质体，使原生质体融合，得到杂种细胞后，继续培养，常用 （填植物激素名称）诱导愈伤组织形成和分化，获得完整的杂种植株。 (2)单倍体育种。常用 的方法来获得单倍体植株，鉴定百合单倍体植株的方法是 。 (3)基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。 ①研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取pL，首先选用 酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草（P1、P2和P3）进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中 的诱导作用最强。 ②现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路 。 15．（2024·湖南·高考真题）色盲可分为红色盲、绿色盲和蓝色盲等。红色盲和绿色盲都为伴X染色体隐性遗传，分别由基因L、M突变所致；蓝色盲属常染色体显性遗传，由基因s突变所致。回答下列问题： (1)一绿色盲男性与一红色盲女性婚配，其后代的表型及比例为 或 ；其表型正常后代与蓝色盲患者（Ss）婚配，其男性后代可能的表型及比例为 （不考虑突变和基因重组等因素）。 (2)1个L与1个或多个M串联在一起，Z是L上游的一段基因间序列，它们在X染色体上的相对位置如图a。为阐明红绿色盲的遗传病因，研究人员将男性红绿色盲患者及对照个体的DNA酶切产物与相应探针杂交，酶切产物Z的结果如图b，酶切产物BL，CL、DL、BM、CM和DM的结果见下表，表中数字表示酶切产物的量。 BL CL DL BM CM DM 对照 15.1 18.1 33.6 45.5 21.3 66.1 甲 0 0 0 21.9 10.9 61.4 乙 15.0 18.5 0 0 0 33.1 丙 15.9 18.0 33.0 45.0 21.0 64.0 丁 16.0 18.5 33.0 45.0 21.0 65.0 ①若对照个体在图a所示区域的序列组成为“Z+L+M+M”则患者甲最可能的组成为 （用Z、部分Z，L、部分L，M、部分M表示）。 ②对患者丙、丁的酶切产物Z测序后，发现缺失Z1或Z2，这两名患者患红绿色盲的原因是 。 ③本研究表明：红绿色盲的遗传病因是 。 1．（2025·广东深圳·一模）苦草是一种适应能力强的沉水植物，可以有效修复受多环芳烃（PAHs）污染的沉积物，回答下列问题： (1)苦草富集的内生菌能促进PAHs的分解，降低PAHs对苦草的毒害，而苦草可以向内生菌提供养料，推测内生菌与苦草之间的种间关系是 ，二者相互作用并不断演化的过程称为 。 (2)为研究苦草分解PAHs的机制，研究人员开展了如下实验。 ①选取多株长势优良的苦草，并重点检查苦草的 （填部位），避免采集过程的影响。 ②将处理后的苦草分成三组，对苦草根表面和沉积物进行下表中的处理，根据整个实验分析，推断表格中a和b的处理分别是 。 处理组 苦草根表面 沉积物 Ⅰ 不灭菌 灭菌 Ⅱ 灭菌 不灭菌 Ⅲ a b ③在三种处理条件下分别进行PAHs分解的模拟实验，15天后所测得结果如图，据图分析， （填“苦草根表面”或“沉积物”）的微生物在PAHs降解过程中发挥着更大的作用。根据实验结果，从种间关系的角度提出进一步研究的假说 。 (3)综合上述分析，从生态学的角度就增强PAHs污染修复效果提出合理方案 。 2．（2025·河南驻马店·一模）αl-抗胰蛋白酶（AAT）是一种主要由肝细胞合成的血浆蛋白。AAT缺乏症患者的体内正常AAT浓度低，常表现为肺气肿和严重的肝脏疾病。PiM是正常基因，PiS基因导致血浆中AAT轻度缺乏，PiZ基因导致血浆中AAT重度缺乏。PiM对PiS、PiZ为显性，PiS对PiZ为显性。图1是AAT缺乏症患者家系的遗传系谱图，对部分个体的PiM、PiZ和PiS基因进行PCR，结果如图2所示。回答下列问题。    (1)AAT缺乏症为 染色体 遗传病。PiM、PiZ和PiS互为复等位基因，产生的根本原因是 ，Ⅱ4的基因型是 。 (2)若Ⅲ3和与其基因型相同的女性结婚，所生的正常孩子中含有PiZ基因的概率是 。 (3)图2的上方为加样孔，根据电泳条带的分布推测，AAT缺乏症的根本原因是编码AAT的基因发生了碱基对的 。 (4)遗传咨询中医生初步推测某人是否为患者，主要依据是 （填序号）。 ①血型②家族病史③观察症状 临床上常通过测定血清的AAT浓度诊断该病，也可以通过 测序，准确检测。 3．（2025·黑龙江吉林·一模）实验室某小组新发现一个调控水稻种子活力的基因Oshipll，并通过基因编辑获得含有其突变基因a、b、c的三种水稻，来鉴定该基因作用机制。利用CRISPR/Cas9复合体进行基因编辑时，复合体首先会定位目标序列（非模板链）的5´-NGG-3´位点（N表示任意一种碱基），然后利用自身所含的一段20bp长度的向导RNA，与该位点5´端相连的序列互补配对，若能够互补，复合物会切割互补序列某位点，使该位点插入或丢失部分碱基，可能导致基因突变失活。下图表示相应基因的非模板链部分序列和编码的肽链的部分氨基酸序列。回答下列问题。    相应基因合成的肽链的氨基酸序列为 Oshipll         MANSKSLLLCWCSLLLL……*73    a           MANSKSLLLLLVLAPPP……*64    b            MANSKSLLL*9    c            MANSKSLLLLAAAAPPAL……*85 注：各个英文大写字母表示不同的氨基酸；*后面的数字表示肽链氨基酸个数；终止密码子为UAA、UAG、UGA (1)该复合物与基因工程基本操作工具中 酶作用相似，作用的化学键为 。 (2)若分析基因a、b、c的突变位点，应设计 ，扩增相应基因，然后测序，并利用 分析比较得出突变位点。 (3)该复合物所含的向导RNA的序列为5´- ...-3´（只填5´端前6个碱基），b基因所编码肽链的氨基酸数目比Oshipll减少的原因是 。 (4)下图图1为携带基因Oshipll及突变基因a、b、c的水稻萌发处理后发芽率比较。图2为用不同浓度ABA浸泡5天后，携带基因Oshipll及突变基因a、b的水稻发芽指数（发芽指数可反映种子萌发的速度，发芽指数越高种子萌发速度越快）比较。从图中数据可以得出基因Oshipll对于水稻萌发的作用为 ；出现图2结果的作用机制可能是 。    4．（2025·安徽·一模）某些植物凝集素如雪花莲凝集素和尾穗苋凝集素对一部分昆虫有毒性，可用作抗虫转基因植物的目的基因。研究人员将雪花莲凝集素基因（GNA）和尾穗苋凝集素基因（ACA）与载体（pBI121）结合，然后导入棉花细胞，获得转基因抗虫棉。部分过程如图所示，图中KpnⅠ及XhoⅠ为载体上限制酶的识别位点。回答下列问题： (1)限制酶SmaⅠ的识别序列为，可使用SmaⅠ处理GNA及ACA，然后用 DNA连接酶处理可获得二者的融合基因。若图1中融合基因的①链为模板链，使用限制酶KpnⅠ及XhoⅠ构建基因表达载体时，需在融合基因的ACA侧添加限制酶 的识别序列。 (2)将基因表达载体导入植物细胞常用的方法是 （答出两种）。取一部分在添加了卡那霉素的培养基上正常生长的棉花细胞，通过 技术获得的棉花植株不一定具有抗虫性状的原因是 （答出两点）。 (3)图2是重组质粒的部分结构放大示意图，对单独使用KpnⅠ处理融合基因和载体得到的转基因棉花细胞需要进行进一步鉴定：获得棉花细胞的DNA，再用图2中的引物 进行PCR，并利用 技术对PCR产物进行鉴定。 5．（2025·山东济宁·一模）为筛选出能与SARS病毒的S蛋白特异性结合的受体蛋白，研究人员利用基因工程技术，在S蛋白末端添加TAP标签（能特异性地与人和哺乳动物体内IgG类抗体结合）形成S-TAP融合蛋白，再利用该标签在病毒敏感细胞中纯化出S蛋白及其相互作用的蛋白质，部分过程如图。回答下列问题。    注：XhoI、SmaI、EcoRI、BamHI表示限制酶识别序列，各限制酶识别序列及切割后产生的DNA末端均不同；F、R表示引物；T7表示启动子；Kozak序列是调控基因表达的重要序列且不含限制酶识别序列。 (1)为成功构建重组质粒pcDNA3．1-S-TAP，在利用PCR扩增S基因时，需在F引物的5'端外侧依次添加 序列。PCR时新合成链的延伸方向是 （填“5′→3′”或“3′→5′”）。 (2)使用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，DNA分子的迁移速率与 有关。 (3)在该重组质粒pcDNA3.1-S-TAP中，T7的作用是 ，重组质粒中还应该有的结构有 。 (4)为检测转染细胞中是否表达出了S-TAP融合蛋白，科研人员将转染细胞置于载玻片，洗涤、固定后，滴加带有荧光标记的 稀释液，荧光显微镜下观察，若出现荧光标记，则说明转染细胞中表达出了S-TAP融合蛋白。 6．（2025·山东聊城·一模）现发现一株叶色为黄绿色且雄性不育的双突变体两性植物（既可以自花传粉又可以异花传粉），其野生型表型为叶色绿色且雄性可育。已知叶色和雄蕊的育性分别受A/a和B/b控制。科研人员以该突变株（）和野生型（）进行了杂交，50%为绿色雄性可育，50%为黄绿色雄性可育，选取中黄绿色雄性可育植株自交，所得中绿色雄性可育：黄绿色雄性可育：绿色雄性不育：黄绿色雄性不育=3：6：1：2．回答下列问题： (1)结合实验分析，亲本和的基因型分别为 。 (2)中绿色雄性可育中纯合子所占的比例为 ，让中所有的黄绿色雄性可育植株间随机受粉，获得的子代中绿色雄性不育植株的概率为 (3)如果将中所有的绿色雄性可育株与绿色雄性不育株间行种植，则在绿色雄性不育株上收获的种子将来发育成绿色雄性不育株的概率为 ，绿色雄性可育株上收获的种子将来发育成绿色雄性不育株的概率为 (4)SSR是DNA中的简单重复序列，非同源染色体上、不同品种的同源染色体上的SSR重复次数不同，故常用于染色体特异性标记。科研人员提取出亲本、亲本及中50株雄性不育株叶肉细胞的核DNA，利用6号、8号染色体上特异的SSR进行PCR扩增，电泳结果如图2。 ①据图分析，控制雄性不育性状的基因可能位于 号染色体上。 ②2号不育株6号染色体SSR扩增结果出现的原因是 。 ③请在图3中画出植株8号染色体SSR扩增后的电泳结果 。 7．（2025·河北沧州·一模）我国科学家利用分子生物学技术和体细胞核移植技术获得了世界首例高产赖氨酸转基因克隆牛，标志着国际克隆技术的又一次重大突破，过程如下图。回答下列问题：    (1)过程①的核心步骤是 。从序列数据库中检索获取了高产赖氨酸基因的碱基序列后，可以通过 的方法获得目的基因。在用PCR扩增目的基因时，需要在其两端加上两种限制酶的识别序列，限制酶识别序列应添加到引物的 （填“3′”或“5′”）端，不能添加到另一端的原因是 。 (2)为使高产赖氨酸基因只在克隆牛的乳腺细胞中表达，上述方法获得的目的基因片段需要和质粒上 等调控元件相连接。 (3)过程④必需利用 技术。最终黄白花母牛生下高产赖氨酸转基因克隆牛犊的性别及体色为 。在个体生物学水平上，高产赖氨酸转基因克隆牛培育成功的表现为 。 8．（2025·宁夏石嘴山·一模）亚洲玉米螟、黏虫是造成我国玉米减产的主要害虫。我国科研人员通过图示过程将Bt基因（能够控制合成Bt毒蛋白）转入玉米细胞培育出了抗虫转基因玉米。回答下列问题： (1)用PCR扩增下面的Bt基因的DNA片段：5'-GACCTGTGGAAGC．.....CATACGGGATTG-3' 3'-CTGGACACCTTCG......GTATGCCCTAAC-5'供选择的引物有：①5'-GACCTGTGGAAGC-3'  ②5'-CTGGACACCTTCG-3'  ③5'-GTTAGGCATAC-3'④5'-CAATCCCGTATG-3'共四种，应选择________（填字母）。 A．①② B．②③ C．③④ D．①④ (2)据图分析，为确保目的基因能够与Ti质粒正确连接，形成含有目的基因的重组Ti质粒，科研人员应选用限制酶 切割Ti质粒和含Bt基因的DNA片段。在获得重组Ti质粒后，可将其加入经 处理的农杆菌；导入重组质粒的玉米细胞经 成为转基因玉米植株。    (3)为检测转基因玉米是否培育成功，科研人员首先利用 法检测Bt基因是否成功翻译：在进行个体生物学水平的鉴定时，科研人员将获得的多株转基因玉米进行自交，发现除少数植株的子代均抗虫外，多数植株的子代中均出现了不抗虫植株，统计这些植株的子代中抗虫与不抗虫的比例，发现有3:1和15:1两种情况。出现15:1的原因是 。 (4)某科研小组在做抗虫棉试验时，虽已经检测出棉花植株中含有抗虫基因，但让棉铃虫食用棉花叶片时，棉铃虫并没有被杀死，这说明 ，为此，科学家对棉花植株中的Bt毒蛋白基因进行了修饰，结果食用了棉叶的棉铃虫中毒死亡了，从变异类型分析，这种对Bt毒蛋白基因的修饰属于 。 9．（2025·福建龙岩·一模）油菜花是两性花，其雄蕊的育性由位于同源染色体相同位置上的3个基因（、、）决定。研究人员为培育具有杂种优势的油菜新品种，利用品系1（，雄性不育）、品系2（，育性正常）、品系3（，育性正常），进行如下实验： 实验一：将品系1与品系2杂交，均为雄性不育植株，将与亲本回交获得； 实验二：将品系1与品系3杂交，均育性正常，将与品系1回交获得． (1)上述杂交实验中，在授粉前必须对品系1采取的操作是 。 (2)若、、基因中碱基数目不同，原因是基因突变时发生了 。根据杂交一、二的结果判断、、之间的显隐性关系是 。 (3)SNP是指基因组中由单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性。当SNP位点与某基因非常接近时，它们在后代中往往保持连锁状态，使得SNP可以作为特定基因的遗传标记。研究人员提取实验一中亲本、、若干植株DNA，利用PCR扩增不同样本的SNP遗传标记，电泳结果如下图：    ①染色体互换通常发生在 时期，其引起的变异属于 。 ②据图推测， 序列与雄性不育基因紧密连锁，可作为雄性不育基因的分子标记，理由是 。 ③为进一步验证上述结论，研究人员提取实验二中亲本、、各植株DNA，并将表现型一致的植株DNA混合，利用PCR扩增不同样本的SNP遗传标记，请在下图画出支持上述结论的电泳结果 。    10．（2025·山东青岛·一模）水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将图1中的vtg基因与图2中Luc基因载体连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼，当极微量雌激素污染水体，斑马鱼的肝脏就发出荧光。Luc表示荧光素酶基因（无启动子），Kanr为卡那霉素抗性基因，ori为复制起点，BamHI、BclI、HindIII、BsrGI为限制酶，→表示转录方向。 注：图1DNA片段不含有图2所示限制酶的识别序列 (1)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，选用限制酶 切割Luc基因载体可降低“空载”概率。通过PCR技术获取vtg基因时，需设计合适的引物。依据图示信息，推测引物1包含的碱基序列为5′ 3′。（写出已知的所有碱基序列） (2)将“vtg-Luc基因重组载体”导入大肠杆菌中进行扩增，为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含 的培养基中，转基因成功的斑马鱼只在肝脏中发出荧光指示污染，其原因是 。 (3)Luc基因载体上有一段P2A序列，其功能如图所示，据此推测P2A的作用 。 (4)进一步研究发现，E蛋白能与vtg基因启动子的特定序列结合，启动该基因的表达。已知vtg基因启动子含区域1和区域2，为研究E蛋白的结合位点，设计如下实验：用限制酶将启动子切割成含区域1和区域2的两个片段，将两个酶切片段分别与Luc基因载体连接，连接位点位于Luc基因的上游，形成两种重组载体。将重组载体分别导入斑马鱼的 ，待发育成熟后，往水体中添加 进行检测。 11．（2025·内蒙古阿拉善盟·一模）双乙酰是啤酒中的主要风味物质，含量过高会影响啤酒的品质；谷胱甘肽可以提高啤酒的抗老化能力。研究发现，ILV2基因编码双乙酰合成中的关键酶，GSH1基因编码谷胱甘肽合成中的关键酶。为生产低双乙酰且抗老化的啤酒，科研人员运用基因工程技术制备啤酒酵母工程菌，过程如图，其中CUPI基因的表达产物可使细胞对一定浓度的硫酸铜产生抗性。请分析回答： SalⅠ 5'-G↓TCGAC-3' Kpn Ⅰ 5'-G↓GTACC-3' Sph Ⅰ 5' -GCATG↓C -3 Xba Ⅰ 5'-T↓CTAGA-3'' Bgl Ⅱ 5'-A↓GATCT-3' Pst Ⅰ 5'-CTCC↓AG-3' (1)分析图1可知，需用 （填限制酶名称）切割质粒1以获取CUPI基因。 (2)转化后的啤酒酵母应置于含 的培养基中进行初步筛选。 (3)进一步鉴定需要以转化后啤酒酵母的 为模板，用图示两种引物进行PCR扩增。若扩增产物的大小约为1300bp，则说明 基因已整合到啤酒酵母的染色体上。 (4)将啤酒酵母工程菌与未转化的受体菌分别置于麦芽汁培养基中培养，定期取样检测，结果如图2。    据图2分析，啤酒酵母工程菌抗老化能力 。啤酒酵母工程菌的双乙酰合成量明显 未转化的受体菌，原因是 。 12．（2025·河北保定·一模）由P基因编码的P蛋白是一种水通道蛋白，该蛋白在植物调节水分吸收方面发挥着 重要作用。科研人员利用基因工程技术培育出了高表达P蛋白的转基因玉米，图1表示P 基因片段和农杆菌的Ti质粒及几种限制酶的识别序列和切割位点。回答下列问题： (1)若b链为P基因转录的模板链，则扩增P 基因时，应选择的引物是 。构建基因 表达载体时，切割Ti质粒应选用的两种酶为 。 (2)用含重组 Ti质粒的农杆菌侵染玉米后，应在含 的培养基中进行筛选。科研人 员进一步用PCR 验证P基因是否成功导入玉米细胞，电泳结果如图2所示。其中①为 P 基因，作为阳性对照，②为阴性对照，③为检测结果，由此可验证 。 (3)为了验证玉米植株中是否成功表达出P 蛋白，可用 技术进行检测。 (4)侵染后的玉米外植体需要先进行脱分化，然后在含有 （填植物激素）的培养基上诱导生根和生芽。从遗传学的角度看，玉米外植体能形成完整植株的原因是 。 13．（2025·河北邯郸·一模）逆转录转座子是真核生物基因组中最丰富的一类可移动基因元件。逆转录转座子经过转录和逆转录后可整合进基因组中达到复制自身的目的，且插入基因组中时表现出精细的插入位点特异性。某研究团队为了研究4.5SRNA逆转录转座子的生物学作用，对4.5SRNA逆转录转座子DNA进行了克隆，部分过程如图1所示。回答下列问题： (1)获取鼠肝细胞总RNA时，使用异硫氰酸胍法提取，从保护RNA完整性的角度推测，异硫氰酸胍的作用是 。过程①和②中需要使用的酶分别是 、 。 (2)过程②获得的DNA补平且磷酸化后形成平末端，电泳鉴定结果如图2所示，优先使用 酶将DNA与pGEM3Zf连接形成重组质粒pGEM3Zf—4.5S．将重组质粒导入大肠杆菌中进行克隆。从大肠杆菌中提取质粒，选择限制酶 和 进行双酶切，酶切产物经过电泳鉴定，出现大小为139bp的条带，说明克隆成功。 (3)将4.5SRNA逆转录转座子DNA接入表达载体的SV40启动子的上游后，脂质体转染法将表达载体导入小鼠骨髓瘤细胞NS—1、SP2/0和人乳腺癌细胞Bca61中，研究4.5SRNA逆转录转座子对荧光素酶基因表达的影响，结果如图3所示，说明 。 (4)请你提出逆转录转座子在基因工程中的应用前景，逆转录转座子可作为 （写出1点即可）。 14．（2025·河北承德·一模）为解决猪肉中多不饱和脂肪酸（PUFAs）含量不足的问题，研究人员获取了控制PUFAs合成的两个必需酶基因fat2和fat1，并构建pCAG-fat1-fat2融合表达质粒（如图所示），该质粒全长15300 bp（碱基对），CMV启动子启动EGFP基因表达绿色荧光蛋白，CAG启动子启动融合基因fatl-fat2的表达，AflⅡ和DraⅢ为两种限制酶的酶切位点。科研人员将构建好的质粒导入猪胎儿成纤维细胞，并最终获得转fatl-fat2融合基因的转基因猪。请回答下列问题：    (1)启动子是 识别和结合的部位，其作用是 。图中的EGFP起到了 的作用，便于重组DNA分子的筛选。 (2)用DraⅢ酶切如图所示质粒时，可断裂 个磷酸二酯键，且酶切产物是 bp和1700 bp两个片段。 (3)科研人员通过 法将构建好的质粒导入猪胎儿成纤维细胞，可通过 等技术检测目的基因是否进入受体细胞，该技术的原理是 。 (4)将含目的基因的猪胎儿成纤维细胞的细胞核移入 中，通过 法使两细胞融合形成重构胚，并用特定方法激活重构胚，使其发育为转基因猪，该技术属于 （填“有性”或“无性”）繁殖技术。 15．（2025·河北石家庄·一模）草甘膦是一种广泛使用的除草剂，对大多数植物都具有杀灭作用。为在作物生长期间定向除草，研究人员改变芥菜EPSPS基因特定位点，将其导入芥菜，培育出了抗草甘膦的新品种，操作流程如图。回答下列问题：    (1)过程①为 ，其需要在缓冲液中进行，缓冲液的作用是 ；①与②（PCR）的反应体系相比不同点有 （答出两点即可）。 (2)以cDNA为模板扩增EPSPS基因后一般通过 鉴定产物，并置于 下观察结果。 (3)芥菜EPSPS基因定点突变原理如图2所示，引物2的部分核苷酸序列为5'－GAATAGTCATGCGTTCACTC…－3'，请据此补充引物3的核苷酸序列5'－GTGAACGCATGA …－3'，引物3与反义链相应的核苷酸序列 （填“相同”或“不同”）。    (4)研究人员将突变基因插入T－DNA的绿色荧光蛋白基因上游，如图3。为使两个基因融合表达以确定EPSPS在细胞的位置，需要去除突变基因的 序列。 1 / 18 学科网（北京）股份有限公司 $$ 大题05 基因工程与细胞工程类 通过对近年江苏高考及全国卷生物试题的分析，基因工程与细胞工程类题目知识综合性极强，并非孤立考查基因工程或细胞工程知识，而是常与其他生物学知识广泛融合。像 2020 年高考真题，既把产脂肪酶酵母的筛选这一微生物培养相关内容，与基因工程中的育种知识相联系，还涉及微生物培养里的无菌操作、计数等要点；同时，又将细胞工程范畴内的单克隆抗体制备，和免疫调节知识有机结合，这就要求考生必须构建起扎实且全面的综合知识体系。在考查形式上，这类题目极为注重实验分析与设计。以 2024 年高考真题为例，围绕超氧化物歧化酶（SOD）的纯化实验，从实验步骤的理解、结果的剖析，到实验优点的探讨，全面考查考生的实验能力；2022 年关于纤毛相关基因的研究题目，更是涵盖实验操作目的、引物选择、结果分析等多个实验环节，对考生的实验素养要求颇高。此外，图表信息丰富也是一大显著特征，常借助图表来呈现实验数据、过程或结果。例如 2020 年展示酵母菌培养结果的图、2024 年体现 SOD - ELP50 蛋白纯化效果影响的图、2023 年呈现质粒构建及电泳结果的图等，这就需要考生具备从复杂图表中精准提取有效信息，并进行深入分析、合理推理和准确判断的能力。 从命题规律看，在知识点分布方面，基因工程部分着重考查基因工程的工具酶，如限制酶、DNA 连接酶等的作用特点；基因表达载体构建过程中的关键要素，包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等的功能及相互关系；目的基因的检测与鉴定的多种方法及原理等。细胞工程部分则常聚焦于单克隆抗体制备流程中涉及的细胞融合技术、杂交瘤细胞筛选、抗体的获取与鉴定；植物组织培养的原理、过程及在作物培育等方面的应用；动物细胞培养的条件、过程及应用等内容。此外，还会巧妙结合微生物培养、酶的应用等知识进行综合命题。在能力考查上，十分注重对考生多方面能力的检验。要求考生具备扎实的理解能力，能够深入理解生物学概念、原理和规律；具备较强的实验与探究能力，熟练掌握实验操作技能，能够设计实验、分析实验现象与结果；具备高效的获取信息能力，从题干、图表等资料中精准提炼关键信息；具备良好的综合运用能力，将所学知识融会贯通，用以解决实际问题。 针对这类题目，考生可运用有效的解题技巧与方法。首先，要扎实夯实基础知识，对基因工程、细胞工程的基本概念，如基因工程中限制酶如何识别特定核苷酸序列并切割 DNA，细胞工程中植物体细胞杂交的原理等；原理方面，像基因表达载体构建依据的 DNA 重组原理，细胞培养遵循的细胞增殖原理等；操作步骤，如目的基因获取的多种方法、单克隆抗体制备的具体流程等；应用领域，如基因工程在转基因作物培育、基因诊断方面的应用，细胞工程在克隆动物、组织器官移植等方面的应用等，都要熟练掌握，构建起条理清晰、完整全面的知识体系，以便在解题时能够迅速、准确地调取相关知识。其次，务必注重实验分析。面对实验类题目，要仔细研读实验目的，明确实验想要探究的核心问题；深入理解实验原理，知晓实验设计所依据的生物学理论；精准把握实验步骤，明白每个操作环节的意义与作用；能够对实验结果进行深入分析与合理阐释，依据实验目的和呈现的结果推导出科学合理的结论。同时，要深刻领会实验设计的基本原则，如对照原则，通过设置对照组来排除无关变量干扰，凸显自变量对因变量的影响；单一变量原则，确保实验中只有一个自变量在变化，其他条件保持一致，从而准确探究自变量与因变量的关系，并且能够依据这些原则设计出简洁、科学的实验方案。再者，要学会高效解读图表。面对图表时，要认真细致地观察其中的数据变化、曲线走势、图像特征等信息，清晰明确图表所传达的生物学内涵。掌握从图表中提取关键信息的技巧，分析数据的增减趋势、波动规律等，并将图表呈现的信息与所学的基因工程和细胞工程知识紧密结合，展开合理的推理与准确的判断。然后，要着力提高综合运用能力。在复习备考过程中，不能孤立地学习基因工程与细胞工程知识，而是要注重将二者与其他生物学知识进行有机整合，构建起广泛联系的知识网络。比如将基因工程与遗传学中基因的传递与变异知识相联系，细胞工程与生态学中生物多样性保护、生态系统修复知识相结合等。此外，还要密切关注生物学知识在生产生活实际中的应用，如基因工程在制药行业中生产胰岛素等药物的应用，细胞工程在农业生产中培育无病毒植株的应用等，通过关注这些实际应用案例，提升自身综合运用知识解决实际问题的能力。最后，规范答题至关重要。在答题时，语言表达必须准确、规范，严格使用生物学专业术语，杜绝口语化表述。答案的组织要条理清晰，逻辑严谨，书写工整。对于简答题，要依据题目要求，分点作答，全面且准确地阐述要点，避免出现要点遗漏的情况。 典例一：微生物培养与应用综合 （2020·江苏·高考真题）产脂肪酶酵母可用于含油废水处理。为筛选产脂肪酶酵母菌株，科研人员开展了相关研究。请回答下列问题： （1）常规微生物实验中，下列物品及其灭菌方法错误的是 （填编号）。 编号 ① ② ③ ④ 物品 培养基 接种环 培养皿 涂布器 灭菌方法 高压蒸汽 火焰灼烧 干热 臭氧 （2）称取1．0g某土壤样品，转入99mL无菌水中，制备成菌悬液，经 后，获得细胞密度不同的菌悬液。分别取0．1mL菌悬液涂布在固体培养基上，其中10倍稀释的菌悬液培养后平均长出了46个酵母菌落，则该样本中每克土壤约含酵母菌 个。 （3）为了进一步提高酵母菌产酶能力，对分离所得的菌株，采用射线辐照进行 育种。将辐照处理后的酵母菌涂布在以 为唯一碳源的固体培养基上，培养一段时间后，按照菌落直径大小进行初筛，选择直径 的菌落，纯化后获得A、B两突变菌株。 （4）在处理含油废水的同时，可获得单细胞蛋白，实现污染物资源化。为评价A、B两菌株的相关性能，进行了培养研究，结果如图。据图分析，应选择菌株 进行后续相关研究，理由是 。 【答案】（1）④ （2）梯度稀释 4．6×105（或460000） （3）诱变 脂肪（或油脂） 较大 （4）B 该菌株增殖速度快，单细胞蛋白产量高；降解脂肪能力强，净化效果好 【思路分析】灭菌指用强烈的物理或化学方法杀灭所有微生物，包括致病的和非致病的，以及细菌的芽孢．常用灭菌方法：灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌法。高压蒸汽灭菌适用于对一般培养基和玻璃器皿的灭菌，干热灭菌适用于空玻璃器皿的灭菌，微生物接种时的金属接种工具和试管口可以用灼烧灭菌。稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，使其均匀分布于平板中的培养基内，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。 （1）培养基一般进行高压蒸汽灭菌，接种环可用火焰灼烧灭菌，培养皿一般通过干热灭菌，涂布器应该用酒精引燃灭菌；故①②③正确，错误的是④。 （2）稀释涂布平板法是将样品进行一系列梯度稀释后，获得细胞密度不同的菌悬液，然后涂布到平板上。根据题意，1.0g土壤样品转入99mL无菌水中，制备成菌悬液，经系列梯度稀释后，分别取0.1mL菌悬液涂布在固体培养基上，则稀释的倍数为1000倍，其中10倍稀释的菌悬液培养后长出了46个酵母菌落，则总的稀释倍数为10000倍，故每克土壤中含酵母菌数为46×10000=4.6×105个。 （3）根据题意，欲提高酵母菌产酶能力，可对分离得到的产脂肪酶酵母菌菌株进行射线辐射，该育种方式为诱变育种。为了能筛选出符合要求的产脂肪酶酵母菌突变株，可配制以脂肪为唯一碳源的培养基，将辐射处理的酵母菌涂布在该固体培养基上，形成单菌落；产脂肪酶能力越强的酵母菌，分解利用脂肪的能力越强，菌落生长越好，一段时间后，按照菌落直径大小进行初筛，选取直径较大的菌落即可。 （4）据题图分析可知，相同时间内，菌株B的细胞密度高于菌株A，而菌株B的脂肪剩余量低于菌株A的脂肪剩余量，故进行相关研究可选择菌株B，原因是菌株B增殖速度快，单细胞蛋白的产量也高，同时降解脂肪的能力强，净化效果更好。 微生物的数量测定 1.微生物的数量测定方法：间接计数法——稀释涂布平板法、直接计数法——显微镜直接计数法。 2．稀释涂布平板法 ①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目。 恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。 ②计数原则：选择菌落数为30-300的平板计数；同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。 ③结果分析：统计的菌落数往往比活菌的实际数目少；这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。 ④ C代表某一稀释度下平板上生长菌落数的平均值；V代表涂布平板时吸取的稀释液体积数值(mL)；M代表稀释倍数；则每g样品中的细菌数=（C÷V）×M。 计算：将1ml水样稀释100倍，在三个平板上用涂布法分别接入0.1ml稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为(39+38+37)÷3÷0.1×100×1000。 3．显微镜直接计数法 ①原理：利用特定的细菌计数板或血细胞计数板在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。 ②计数工具：血细胞计数板常用对相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等计数； 细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。 ③优点：快速直观。 缺点：统计结果一般是活菌数和死菌数的总和，比实际值偏大。个体小的细菌在显微镜下难以观察。 1．（2025·河北唐山·一模）四甲基吡嗪（TTMP）是枯草芽孢杆菌的一种代谢产物，是影响白酒风味的重要物质。bdhA基因的表达产物是降低TTMP含量的关键酶，研究人员欲通过敲除枯草芽孢杆菌的bdhA基因提高TTMP产量。回答下列问题： (1)为获取枯草芽孢杆菌的纯净培养物E，可取少量枯草芽孢杆菌菌液接种到牛肉膏蛋白胨 （填“固体”或“液体”）培养基中，蛋白胨提供的主要营养是 。 (2)利用下图中的3对引物扩增出bdhA基因的上、下游片段和cat基因，将3种扩增产物和质粒1分别酶切后进行连接以获得质粒2。为使cat基因位于质粒2的上、下游片段之间，在设计引物5、6时，应在引物的 端分别加入限制酶 和 的识别序列。 (3)用质粒2转化菌株E时，可用 处理菌株E以提高转化的成功率。质粒2与菌株E的DNA发生同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与E中bdhA基因上、下游片段配对，并发生交换）使E的bdhA基因替换为cat基因。将转化处理的枯草芽孢杆菌置于含有 的培养基中以筛选出目的菌株E-。 (4)为检验E-的bdhA基因被成功敲除，以E-的基因组DNA为模板，选用引物 进行PCR，预期扩增只获得一种大小为 bp的DNA片段。对于PCR产物电泳结果符合预期的DNA片段，通常还需进一步通过基因测序确认，原因是 。为研究敲除bdhA基因是否影响菌株生长，可用接种环挑取E⁻后直接用 法进行接种，观察到菌落大小和形态与菌株E一致。 【答案】(1) 固体 碳源、氮源、维生素 (2) 5' BamHI XbaI (3) CaCl2 氯霉素 (4) 1和4 3117 电泳条带仅能显示扩增片段的大致长度，不能呈现碱基序列 平板划线 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。 【详解】（1）取少量枯草芽孢杆菌菌液接种到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，挑选单菌落，获得纯培养物；蛋白胨是将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外观呈淡黄色的粉剂，能为微生物提供碳源、氮源、维生素。 （2）为了在目的基因两侧加上限制酶识别序列，应在引物的5，端加上限制酶序列；结合图示可知，引物5、6扩增出的cat基因，同源替换到引物1、3扩增出的基因，需要相同的限制酶，引物1、3的两侧加入限制酶BamHI、XbaI的识别序列，因此引物5、6两侧应加入限制酶BamHI、XbaI的识别序列。 （3）CaCl2可以增加细胞膜的通透性，提高转化的成功率；E的bdhA基因替换为cat基因（氨苄青霉素抗性基因），将转化处理的枯草芽孢杆菌置于含有氨苄青霉素的培养基中以筛选出目的菌株E-（目的基因被破坏，替换成氨苄青霉素抗性基因）。 （4）选用引物1、4进行PCR，如果cat基因替换基因被敲除，则扩增出两边的序列长度为839+1540+738=3117；由于引物可能与其它地方发生配对，可能存在非特异性扩增，因此通常还需进一步通过基因测序确认；平板划线法是指用接种环在固体培养基表面连续划线，逐步使接种物随所划之线分散，便于形成单个菌落的操作。 2．（2025·宁夏银川·一模）尿素含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥，但若不经细菌的分解，就不能更好地被植物利用，某科研小组为了将土壤中分解尿素的细菌纯化培养，进行了如下操作，请回答相关问题： 成分 KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4·7H2O 葡萄糖 尿素 琼脂 含量（g） 1.4 2.1 0.2 10.0 1.0 15.0 操作将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1000毫升 (1)上表是尿素分解菌的选择培养基配方，选择培养基是指 。本实验中有两组对照，一组是未接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板和选择培养基平板，另一组是已接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板和选择培养基平板。设置前一组的平板上如果 ，说明培养基在使用前未被杂菌污染；后一组的平板上如果 ，可以说明选择培养基具有选择作用。 (2)将5g土壤溶于45mL无菌水，再稀释倍，按图[    ] （填数字及名称）接种方式将0.1mL样品接种到3个培养基上，统计菌落数目为134、131、137，据此可得出每克土壤中的纤维素分解菌活菌数约为 个。    (3)分解尿素的细菌能合成 ，催化尿素分解产生的可以作为细菌生长的氮源。如果培养基中加入了酚红指示剂，尿素分解的产物会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，根据功能划分该培养基属于 培养基。 (4)土壤中的某些固氮菌可以利用空气中的氮气作为氮源（如圆褐固氮菌能将大气中的氮气转化为，请设计实验进一步确定平板上分离得到的细菌是否是固氮菌。（写出简要思路及预期结果） 。 【答案】(1) 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基 没有菌落生长 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数显著多于选择培养基 (2) 1稀释涂布平板法 (3) 脲酶 鉴别 (4)将平板上分离得到的细菌接种到无氮源的培养基上培养一段时间后，观察是否有出现菌落。若能长出菌落，说明该菌为固氮菌，否则不是固氮菌 【分析】1、实验室的培养基按照功能划分，可以分为选择培养基和鉴别培养基。选择培养基是在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。 2、微生物常见的接种的方法：①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养.在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。 【详解】（1）根据分析，选择培养基是指在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。本实验中有两组对照，一组是未接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板和选择培养基平板，可证明灭菌是否彻底；另一组是已接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板。前一组的平板上如果没有菌落生长，可以说明培养基在使用前未被杂菌污染；后一组的平板上如果菌落数显著多于同一稀释度的选择培养基平板上的，可以说明选择培养基具有选择作用。 （2）统计菌落数目一般使用稀释涂布平板法，将5g土壤溶于45mL无菌水，再稀释105倍，按图[1]稀释涂布平板法接种方式，将0.1mL样品接种到3个培养基上，统计菌落数目为134、131、137，据此可得出每克土壤中的纤维素分解菌活菌数约为（ 134+131+137）÷3÷0.1×10×105=1.34×109 个。 （3）分解尿素的细菌能合成脲酶，催化尿素分解产生的 NH3 可以作为细菌生长的氮源。如果培养基中加入了酚红指示剂，尿素分解的产物 NH3 会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，根据功能划分该培养基属于鉴别培养基。 （4）土壤中的某些固氮菌可以利用空气中的氮气作为氮源，设计实验时用到的是无氮源培养基，然后检测是否有固氮菌即可。简要思路、预期结果和结论：将平板上分离得到的细菌接种到无氮源的培养基上培养，若能生长，说明该菌为固氮菌，否则不是固氮菌，进一步确定平板上分离得到的细菌是否是固氮菌。 3．（2025·山西·一模）维生素K2在预防骨质疏松、心血管疾病等方面具有重要作用。科研人员以解淀粉芽孢杆菌（GSA-184）为研究对象，通过优化发酵工艺，提高了维生素K2的产量。请回答下列问题： (1)从土壤中筛选芽孢杆菌时，利用的培养基成分含有酵母浸粉、蛋白胨、NaCl和水等。其中蛋白胨提供的主要营养为 和维生素等。 (2)科研人员进行了优化培养基碳源的实验，实验结果如右图所示。据图判断，若对菌株GSA-184扩大培养，所用培养基的最佳碳源是 ；若想大量获取维生素K2，所用培养基的最佳碳源是 。 (3)科研人员探究了菌株GSA-184在不控制pH和控制pH为7.0条件下的发酵情况，实验结果如图甲和图乙所示。两种条件下的溶解氧在发酵3h内从100%附近急剧下降到2%附近，说明 ；在图甲中，发酵80h后溶解氧开始从0%附近逐渐上升，可能的原因是 。对比图甲和图乙说明， 条件下有助于维持菌体的活性，从而提高维生素K2产量。 【答案】(1)碳源、氮源 (2) L-阿拉伯糖 甘油 (3) 该菌株为需氧型，发酵初期菌体繁殖耗氧量很大 发酵罐内的pH较高，菌体活性降低且菌体数量下降，耗氧量逐渐减少 稳定而合理的pH（或“控制pH为7.0”） 【分析】培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质；根据物理性质分为固体培养基和液体培养基，培养基中一般含有水、碳源、氮源和无机盐。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质和氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时需将培养基的pH调至酸性，培养细菌时需将pH调至中性或微碱性，培养厌氧微生物时则需要提供无氧的条件。 【详解】（1）在微生物培养基中，蛋白胨含有丰富的营养成分，其主要为微生物生长提供氮源、碳源和维生素等。因为蛋白胨是将蛋白质经过酶解等处理得到的，其中的含氮有机物可作为氮源，同时其中的碳元素也可为微生物提供碳源等； （2）扩大培养菌株GSA-184，目的是让菌株数量增多，也就是要使活菌生物量达到最大。从图中可以看出，在以L-阿拉伯糖为碳源时，活菌生物量的数值最高。所以若对菌株GSA-184扩大培养，所用培养基的最佳碳源是L-阿拉伯糖；若想大量获取维生素K2，就要找使维生素K2产量最高的碳源。从图中可知，当以甘油为碳源时，维生素K2产量的数值最大。所以若想大量获取维生素K2，所用培养基的最佳碳源是甘油； （3）两种条件下的溶解氧在发酵3h内从100%附近急剧下降到2%附近，这说明该菌株为需氧型，发酵初期菌体繁殖耗氧量很大；在图甲中，发酵80h后溶解氧开始从0%附近逐渐上升，可能的原因发酵罐内的pH较高，菌体活性降低且菌体数量减少，耗氧量逐渐减少；对比图甲（不控制pH）和图乙（控制pH为7.0），可以发现控制pH为7.0时，维生素K2产量更高，活菌生物量在后期也能维持相对较好的水平，这说明控制pH为7.0条件下有助于维持菌体的活性，从而提高维生素K2产量。 典例二：动物细胞培养与单克隆抗体制备 （2020·江苏·高考真题）新型冠状病毒可通过表面的棘突蛋白（S蛋白）与人呼吸道黏膜上皮细胞的ACE2受体结合，侵入人体，引起肺炎。图1为病毒侵入后，人体内发生的部分免疫反应示意图。单克隆抗体可阻断病毒的粘附或入侵，故抗体药物的研发已成为治疗新冠肺炎的研究热点之一。图2为筛选、制备抗S蛋白单克隆抗体的示意图。请据图回答下列问题： （1）图1中人体内抗原递呈细胞吞噬病毒，并将病毒的抗原暴露在细胞表面，被 细胞表面的受体识别后激活该细胞。 （2）B细胞识别入侵的病毒后，在淋巴因子作用下，经过细胞的 ，形成 细胞。 （3）为判断疑似患者是否为新型冠状病毒感染者，采集鼻咽拭子主要用于病原学检查，检测病毒的 ；采集血液样本主要用于血清学检查，检测 。 （4）据图2所示，研制抗S蛋白单克隆抗体，需先注射 免疫小鼠以激活小鼠的免疫细胞，再提取激活的B细胞与骨髓瘤细胞融合，用HAT培养基筛选获得 细胞。因为同一种抗原可能激活 细胞，还需继续筛选才能获得分泌单克隆抗体的细胞株。 【答案】（1）T （2）增殖、分化 浆细胞和记忆 （3）核酸 抗新型冠状病毒抗体 （4）棘突蛋白（或S蛋白） 杂交瘤 多种B 【思路分析】本题以新冠病毒为载体考查体液免疫、核酸检测和单克隆抗体的有关知识。体液免疫包括三个阶段：（1）感应阶段：除少数抗原可以直接刺激B细胞外，大多数抗原被吞噬细胞摄取和处理，并暴露出其抗原决定簇；吞噬细胞将抗原呈递给T细胞，再由T细胞呈递给B细胞；（2）反应阶段：B细胞接受抗原刺激后，开始进行一系列的增殖、分化，形成记忆细胞和浆细胞；（3）效应阶段：浆细胞分泌抗体与相应的抗原特异性结合，发挥免疫效应。制备单克隆抗体的具体过程：1、用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞；2 、将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞；3、在HAT选择性培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。 未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖；4、在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增；5、单克隆抗体的大量制备 单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。（1）据题图1可知，人体内抗原递呈细胞吞噬新冠病毒，并将新冠病毒的抗原暴露，呈递给T细胞，被T细胞表面的受体识别后激活T细胞； （2）激活的T细胞释放淋巴因子，并将抗原呈递给B细胞，B细胞识别入侵的病毒后，迅速增殖分化成浆细胞和记忆细胞； （3）临床上为判断疑似患者是否为新型冠状病毒感染者，采集鼻咽拭子主要用于病原学检查，检测疑似患者的呼吸道是否有新冠病毒的核酸，采集血液样本主要用于血清学检查，检测血清中是否产生抗新型冠状病毒的抗体； （4）据题中图2所示，结合单克隆抗体制备方法，要研制抗棘突蛋白单克隆抗体，需先注射新冠病毒的棘突蛋白（或S蛋白），以激活小鼠的免疫细胞，再提取激活的B细胞与骨髓瘤细胞融合，获得融合的、未融合的细胞，用HAT筛选培养基培养，未融合的B细胞不能长期生存而死亡，未融合的骨髓瘤细胞不能合成DNA而死亡，只有杂交瘤细胞能成活；由于同一种抗原可能激活多种B细胞，筛选出的融合的骨髓瘤细胞就可能分泌多种抗体，还需继续筛选才能获得分泌单克隆抗体的细胞。 单克隆抗体 （1）抗体：一个 B 淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯 度低、特异性差。 （2）单克隆抗体的制备过程 （3）杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产生专一的抗体。 （4）单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。 （5）单克隆抗体的作用： ① 作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合， 具有准确、高效、简易、快速的优点。 ② 用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量 用于治疗其它疾病。 注射特定抗原的目的：用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞（获得能产生特定抗体的B淋巴细胞）。 第一次筛选 （1）如何筛选（筛选方法）：用特定的选择培养基进行筛选。 （2）筛选原理：在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。 （3）获得的杂交瘤细胞的特点：既能迅速大量繁殖，又能产生抗体。此时，抗体不是所需的特定抗体。 （4）得到的该杂交瘤细胞一定是所需的吗？杂交瘤细胞并不纯，因为从脾脏获得的B淋巴细胞不纯（既有未免疫的B淋巴细胞，又有能产其他抗体的B淋巴细胞，以及能产所需抗体的B淋巴细胞），因此要进行第二次筛选。 第二次筛选 （1）如何筛选（筛选方法）：用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下，进行克隆化培养和抗体检测（一般进行多次筛选）。 （2）获得的杂交瘤细胞的特点：既能迅速大量繁殖，又能分泌所需抗体。 （3）选择抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞，即分泌的抗体能与特定的抗原结合。 （4）抗体检测原理：抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的检测）。 1．（2025·云南玉溪·模拟预测）为了培育既抗除草剂（草甘膦），又抗冻的烟草植株，科学家将抗草甘膦基因（Aro基因，存在EcoRI酶切位点）和抗冻基因（Cor基因，存在Bell酶切位点）采用融合PCR技术（原理如下图所示）连接起来构建为Aro-Cor融合基因并进行了扩增，再将融合基因导入烟草细胞培育既抗除草剂又抗冻的转基因烟草，过程如下。请分析回答： (1)在将Aro基因和Cor基因融合的过程中，起到搭桥作用的引物2和引物3的碱基序列 （填“相同”或“不相同”），变性后形成的杂交分子在补齐为双链等长的融合基因时的延伸过程，不需要添加引物，其原因是 。为保证构建的Aro-Cor融合基因能正确插入载体中，应该分别在引物1和引物4侧连接 的限制酶识别序列。 (2)上述培育转基因烟草过程中将目的基因导入烟草细胞采用的方法是 ，将农杆菌和烟草细胞按比例充分混匀，3天后转入含有潮霉素而不是四环素抗性基因的选择培养基筛选抗性愈伤组织，原因是 。 (3)在培育转基因烟草植株的过程中，培养基中添加的生长素和细胞分裂素会影响植物细胞的发育方向，据此分析，在初次进行实验时，可以尝试调整生长素和细胞分裂素的 来观察其对细胞发育的影响。 【答案】(1) 不相同 两条母链均存在3´端，使DNA聚合酶能从母链的3´端开始连接脱氧核苷酸 BamHⅠ和MunⅠ (2) 农杆菌转化法 潮霉素抗性基因随农杆菌的T-DNA进入并整合到植物细胞的染色体DNA上，所以只有选择潮霉素筛选抗性愈伤组织才能筛出成功导入目的基因的植物细胞 (3)浓度和比例 【分析】PCR原理：在高温作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 【详解】（1）在将Aro基因和Cor基因融合的过程中，起到搭桥作用的引物2和引物3的碱基序列不相同。因为引物2要结合Aro基因的特定序列，引物3要结合Cor基因的特定序列，它们的结合位点不同，所以碱基序列不同；变性后形成的杂交分子在补齐为双链等长的融合基因时的延伸过程，不需要添加引物，其原因是融合基因的两端序列是已知的，可以根据已知序列合成与两端互补的引物，在第一次延伸反应后产生的新的DNA链两端就可以作为后续延伸反应的模板，不需要额外添加引物，即两条母链均存在3，端，使DNA聚合酶能从母链的3，端开始连接脱氧核苷酸；为保证构建的Aro-Cor融合基因能正确插入载体中，由图可以看出，Aro-Cor融合基因两端有EcoR Bcl I，为保证构建的Aro-Cor融合基因能正确插入载体中，应该分别在引物1和引物4侧连接，引物1一端应该链接BamH Ⅰ，引物4一端应该链接Mun Ⅰ。 （2） 图中将目的基因导入烟草细胞采用的方法是农杆菌转化法；转入含有潮霉素而不是四环素抗性基因的选择培养基筛选抗性愈伤组织，原因是潮霉素抗性基因随农杆菌的T-DNA进入并整合到植物细胞的染色体DNA上，所以只有选择潮霉素筛选抗性愈伤组织才能筛出成功导入目的基因的植物细胞。 （3）植物激素是植物体内产生，能从产生部位运送到作用部位，对植物的生长发育有显著影响的微量有机物。 在培育转基因烟草植株的过程中，培养基中添加的生长素和细胞分裂素会影响植物细胞的发育方向，据此分析，在初次进行实验时，可以尝试调整生长素和细胞分裂素的浓度或比例来观察其对细胞发育的影响。 2．（2025·浙江温州·二模）帕金森病是常见的中枢神经系统疾病。酪氨酸羟化酶在帕金森病中起着关键作用，其表达水平的下降与帕金森病的病理过程密切相关。当前研究发现由干细胞分泌的外泌体对该病有一定的治疗作用，回答下列问题。    (1)如图所示，外泌体是一类包含有复杂成分的小膜泡，干细胞分泌外泌体的方式为 ，这种方式体现了细胞膜具有 的结构特点。外泌体与其他细胞膜上的 结合后，将信息传递给靶细胞，发挥调节作用。 (2)为验证干细胞分泌的外泌体对帕金森病有一定的治疗作用，根据以下材料和用具，完善实验思路，设计实验记录表。 材料和用具：正常小鼠若干只，生理盐水配制的MPTP溶液（腹腔注射，用于制备急性帕金森小鼠模型），缓冲液配制的外泌体溶液（静脉注射），生理盐水，缓冲液等。 （要求与说明：实验中涉及的剂量不作具体要求。旋转试验可用于评估小鼠神经系统的功能，其结果可用转圈数进行表示。） ①完善实验思路： 将45只正常小鼠随机分为A、B、C三组，每组15只，其中B、C两组 ，制备成急性帕金森病小鼠模型； A组、B组 ，C组 。 将小鼠置于相同且适宜的条件下饲养，并在T1、T2、T3天， 。 进行数据的统计与分析。 ②设计一张表格，用于记录实验数据。 。 ③实验结果表明，使用外泌体治疗后，在一定时间范围内帕金森病小鼠转圈数明显减少，说明外泌体对帕金森病有一定的治疗作用。请结合信息预测A、B、C三组小鼠体内酪氨酸羟化酶的表达量大小： 。结合上述研究，除注射外泌体外，请再提出1种可能的治疗帕金森病的思路： 。 【答案】(1) 胞吐 一定的流动性 受体 (2) 腹腔注射MPTP溶液 腹腔注射生理盐水 静脉注射外泌体溶液 对每组小鼠进行旋转实验，记录转圈数 A组 > C组 > B组 通过基因治疗提高酪氨酸羟化酶基因的表达量 【分析】一些大分子的物质可以通过胞吞、胞吐的方式进出细胞，体现了细胞膜的流动性。 【详解】（1）外泌体是一类包含有复杂成分的小膜泡，外泌体通过胞吐释放，体现细胞膜具有一定的流动性；外泌体通过膜表面配体与靶细胞受体结合传递信息，发挥调节作用。 （2）①根据题意信息可知，为了验证干细胞分泌的外泌体对帕金森病有一定的治疗作用，可以将45只正常小鼠随机分为A、B、C三组，每组15只，其中B、C两组腹腔注射MPTP溶液，制备成急性帕金森病小鼠模型。 ②A组腹腔注射生理盐水（正常对照），B组腹腔注射生理盐水（模型对照），C组腹腔注射缓冲液配制的外泌体溶液（治疗组）。将小鼠置于相同且适宜条件下饲养，并在T1、T2、T3天进行旋转试验，记录各组小鼠的转圈数。由此设计表格可以记录实验数据， 。 ③因为帕金森模型（B组）酶表达下降，外泌体治疗（C组）部分恢复，正常组（A组）最高。所以预测酪氨酸羟化酶表达量为A组 > C组 > B组 。通过基因治疗提高酪氨酸羟化酶基因的表达量可治疗帕金森病。 典例三：基因工程综合 （2024·江苏·高考真题）为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列-（GTTCCTGGTGTTGGC）50-限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题：    (1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是 。 (2)步骤②转化时，科研人员常用 处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有 的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是 。 (3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与 结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是 （从图2的“A~D”中选填）。    (4)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。    （ⅰ）20℃时，加入NaCl后实验结果是 。 （ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是 。 （ⅲ）据图分析，融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有 。 【答案】(1)EcoR I、Hind Ⅲ (2) CaCl2 卡那霉素 S-F和P-R (3) 启动子 C (4) SOD-ELP50组纯化蛋白数量更多 高温使蛋白变性 低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持 【分析】将目的基因插入载体时，应保证目的基因插入启动子和终止子之间，以便目的基因的表达。由图可知，PCR扩增SOD-ELP50时，应选择引物S-F和E-R。 【详解】（1）目的基因应插入启动子和终止子之间，结合题意可知，ELP50应插入pET-SOD之后，由图可知，限制酶a和限制酶b分别是EcoR I、Hind Ⅲ。 （2）将目的基因导入细菌时常用CaCl2处理细菌，使其处于容易吸收外来DNA分子的状态。由图可知，重组DNA含有标记基因卡那霉素抗性基因，所以转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。成功导入pET-SOD-ELP50同时含有pET-SOD和ELP50，结合图示可知，引物S-F和P-R对应序列包含SOD和ELP50的相应序列，可特异性对pET-SOD-ELP50进行扩增，根据扩增产物相对的分子质量的大小判断大肠杆菌中是否导入pET-SOD-ELP50。由于ELP50中含有重复序列，使用E-F或E-R对导入普通质粒和重组质粒的大肠杆菌进行PCR扩增，得到的产物可能无法区分。 （3）RNA聚合酶与启动子结合后，启动转录。由图可知，决定SOD-ELP50融合蛋白的基因长度为462+750=1212bp，编码1212÷3=404个氨基酸，已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，融合蛋白的相对分子质量约为404×0.11kDa=44.44kDa，电泳后应该为条带C。 （4）（ⅰ）由图可知，20℃时，较不加NaCl，加入NaCl后纯化蛋白数量更多。 （ⅱ）100℃时，温度过高，导致蛋白质变性而沉淀。 （ⅲ）20℃，加入NaCl时，较SOD，SOD-ELP50组沉淀中蛋白质相对含量较高，说明低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持。 （2023·江苏·高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：    (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要的不同是 。 (2)有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用______。    A．ATGGTG------CAACCA B．TGGTTG------CACCAT C．GACGAG------CTGCAG D．CTGCAG------CTCGTC’ (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。 (4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。 A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落 B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 (5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。    (6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。 【答案】(1) 模板（片段F1、片段F2）、引物 退火温度 (2)CD (3)限制性内切核酸酶（限制酶） (4)ABC (5)P3、P4 (6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列 【思路分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等，标记基因可便于目的基因的鉴定和筛选。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 （1）PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时， 配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。不同的PCR反应体系中，模板和引物是不同的：扩增 程序中依据不同引物设置不同的退火温度是最重要的环节，恰当地选择退火温度，尽量避免引物与 模板的非特异性结合，以保证目的产物的有效扩增。而对于延伸时间而言，以常用的Taq DNA聚 133 合酶为例，催化DNA延伸的速度为1000~2000 bp/min，通常在实验室中可根据目的片段大小在 30s~2min的时长内大致设置廷伸时间，一般不雪要精确控制。 （2）由图1可知，引物F2-F用于扩增F2片段，引物F1-R用于扩增F1片段，C选项中5'-GACGAG-3'能与AnBI中左侧部分碱基进行碱基互补配对，因此引物F2-F选用C。D选项中5'-CTGCAG-3'能与EGFP中的右侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物F1-R选用D。 （3）传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，由于PCR产物片段和线性质粒载体具有同源序列，可通过重组酶形成环化质粒。不需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）和DNA连接酶。 （4）A、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，用稀释涂布平板法筛选时，菌落数可能低于30，A错误； B、培养基冷却后才能接种，抗性平板上未长出菌落，一般不是培养基温度太高所致，B错误； C、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误； D、稀释涂布平板和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D正确。 故选ABC。 （5）EGFP为720bp，AnBI为390bp，二者的总大小为720bp+390bp=1100bp，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。 （6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。 （2022·江苏·高考真题）纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。 (1)纤毛结构如图1所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是 。 (2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaC1至2．0mol/L的目的是 。PCR扩增时，需在 催化下，在引物 端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。 (3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y-M重组质粒（在EcoRⅤ位点插入片段）。请完成下表。 分步实验目标 简易操作、结果、分析 PCR鉴定正向重组质粒Y-M（图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头，代表方向） ①选择图Ⅱ引物 ； ②PCR目的产物约为 bp。 确保M及连接处序列正确，Y-M的连接处上游含有Hind III+EcoR V的识别序列，下游含有EcoR V+BamH I的识别序列 ③质粒测序，图Ⅲ中正确的是 （选填序列编号） 检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明 。 (4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经 形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数）。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的 倍。 【答案】(1)与有丝分裂有关（参与纺锤体的形成，是纺锤体形成中心） (2) 溶解DNA 耐高温DNA聚合酶（Taq酶） 3' (3) a、b 1100 Q4 X蛋白参与中心体的形成 (4) 逆转录 32 【思路分析】PCR技术的条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；PCR的操作过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。 （1）中心体与有丝分裂有关，是纺锤体的组织中心。 （2）从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，DNA在2．0mol/L的NaC1溶液中的浓度最大，高于或低于这一浓度，DNA的溶解度均会下降，因此实验过程中添加NaC1至2．0mol/L的目的是溶解DNA。PCR扩增时，需在耐高温的DNA聚合酶（即Taq聚合酶）的催化下，在引物的3’端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。 （3）PCR扩增目的DNA片段时，在引物的3’端进行DNA链的延伸，据图可知，应选择图II中的引物a和引物b，PCR目的产物约为300+800=1100bp。确保M及连接处序列正确，Y-M的连接处上游含有Hind III+EcoR V的识别序列，下游含有EcoR V+BamH I的识别序列，根据题干信息构建Y-M重组质粒（在EcoRⅤ位点插入片段），Y-M的连接处测序后部分序列应含有EcoR V+BamH I的识别序列，根据EcoR V识别位点，应选择序列Q4。对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明蛋白质X参与中心体的组成。 （4）研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经逆转录形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数），说明病人基因Z表达较弱，设健康人Z基因的cDNA数为x，病人Z基因的cDNA数为y，则有x×215=y×220，从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的25=32倍。 （2021·江苏·高考真题）某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒，请结合实验流程回答下列问题： (1)目的基因的扩增 ①提取真菌细胞 ，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。 ②为了获得融合tag标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序列，否则将导致 。 ③热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除TaqDNA聚合酶（Taq酶）以外的各成分混合后，加热到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增，下列叙述正确的有 A．Taq酶最适催化温度范围为50～60℃ B．与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物 C．两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸 D．PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性 (2)重组质粒的构建 ①将Sma I切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进 ，形成A-m结合体。将A-m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及 酶等，完成质粒的环化。 ②若正确构建的重组质粒A—m仍能被Sma I切开，则Sma I的酶切位点可能在 。 (3)融合蛋白的表达 ①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A-m，然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是 。 ②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，说明 ，后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。 【答案】(1) mRNA 蛋白M上不含tag标签 BC (2) 黏性末端碱基配对 DNA连接 基因m的连接处或基因m的内部 (3) 受体菌在无尿嘧啶的培养基上无法生长，导入重组质粒的受体菌含有URA3基因可以长成菌落 融合基因表达（或融合基因正确解码） 【思路分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 （1）①以逆转录获得cDNA的方式，要先从真菌细胞中提取基因m转录出来的mRNA。 ②从构建好的重组质粒上看，tag序列位于目的基因下游，若m基因的转录产物mRNA上有终止密码子，核糖体移动到终止密码子多肽链就断开，则不会对tag序列的转录产物继续进行翻译，蛋白M上就不含tag标签。 ③A、从题干信息可知，“80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增”，故Taq酶最适催化温度范围为94℃左右，A错误； B、PCR 反应的最初加热过程中，样品温度上升到70℃之前，在较低的温度下引物可能与部分单链模板形成非特异性结合，并在Taq DNA 聚合酶的作用下延伸，结果会导致引物错配形成的产物的扩增，影响反应的特异性；热启动可减少引物错配形成的产物的扩增，提高反应的特异性，B正确； C、DNA分子复制具有方向性，都是从5′端向3′端延伸，C正确； D、Taq酶没有特异性，与普通的DNA聚合酶相比，Taq酶更耐高温，D错误。 故选BC。 （2）①从图上看，载体A只有一个Sma I的酶切位点，故被Sma I切开后，载体由环状变为链状DNA，将Sma I切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进载体A与添加同源序列的m的黏性末端碱基互补配对。将A-m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及DNA连接酶等，完成质粒的环化。 ②重组质粒中，载体A被Sma I切开的位置已经与基因m相连，原来的酶切位点已不存在，若正确构建的重组质粒A—m仍能被Sma I切开，则Sma I的酶切位点可能在基因m的连接处或基因m内部。 （3）①筛选目的菌株的机理是：导入了质粒A-m的目的菌株由于含有URA3基因，能在无尿嘧啶的培养基上存活，而URA3基因缺失型酵母则不能存活。 ②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含lag标签，位于lag标签上游的基因m应该正常表达，说明融合基因表达（或融合基因正确解码）。 基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的获取 1.目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因 。 2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反 转录法_和化学合成法_。 3.PCR 技术扩增目的基因 （1）原理：DNA 双链复制 （2）过程：第一步：加热至 90～95℃DNA 解链；第二步：冷却到 55～60℃，引物结合到互补 DNA 链；第三步：加热至 70～75℃，热稳定 DNA 聚合酶从引物起始互补链的合成。 PCR解旋条件为90℃以上高温。PCR的扩增缓冲液中一般含有Mg2+作用为激活DNA聚合酶。PCR中复制的原料实际为dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）除作为原料，还可以水解产生能量为合成DNA子链提供能量。因此，PCR反应体系中不需要添加ATP。 第二步：基因表达载体的构建 1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表 达和发挥作用。 2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因 （1）启动子：是一段有特殊结构的 DNA 片段，位于基因的首端，是 RNA 聚合酶识别和结 合的部位，能驱动基因转录出 mRNA，最终获得所需的蛋白质。 （2）终止子：也是一段有特殊结构的 DNA 片段 ，位于基因的尾端。 （3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因 的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。 第三步：将目的基因导入受体细胞_ 1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2.常用的转化方法： 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是 农杆菌转化法，其次还有 基因枪法和 花 粉管通道法等。 将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 显微注射技术。此方法的受体细胞多是 受精 卵。 将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是 繁殖快、多为单细胞、遗 传物质相对较少 ，最常用的原核细胞是 大肠杆菌 ，其转化方法是：先用 Ca 2+ 处理细胞， 使其成为 感受态细胞 ，再将 重组表达载体 DNA 分子 溶于缓冲液中与感受态细胞混合， 在一定的温度下促进感受态细胞吸收 DNA 分子，完成转化过程。 3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。 第四步：目的基因的检测和表达 1.首先要检测 转基因生物的染色体 DNA 上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA 分子杂 交技术。 2.其次还要检测 目的基因是否转录出了 mRNA，方法是采用 用标记的目的基因作探针与 mRNA 杂交。 3.最后检测 目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取 蛋白质，用相应的 抗体进行抗原－抗体杂交。 4.有时还需进行 个体生物学水平的鉴定。如：转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。 1．（2025·黑龙江·一模）研究人员通过基因工程制备了能生产乙肝病毒抗原蛋白的酿酒酵母。抗原蛋白基因转录的模板链碱基序列为5'-GATTCG-3',5'-CCATGC-3'。如图表示育种过程利用的载体及限制酶的识别序列（注：假设目的基因内不含有相应酶的识别序列）。    (1)在通过PCR扩增目的基因片段的反应条件中，预变性的目的是 。在实际PCR反应中，扩增效率通常低于100%。若某次PCR反应的扩增效率为80%（PCR扩增效率是指在PCR反应中，每个循环中目标DNA分子的实际增加倍数与理论增加倍数的比值），初始模板DNA的量为10ng，经过25个循环后，实际获得的PCR产物量为 ng。 (2)据图分析，为了构建基因表达载体，我们应选择 来切割载体。由于抗原蛋白基因无法直接插入载体中，因此需要通过设计特定的引物，这些引物不仅包含与目的基因两端匹配的序列，还需包含特定的酶切位点，以便在扩增后能够与载体进行连接。引物的碱基序列从5'端到3'端依次 、 。 (3)真核生物的基本启动子没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列，可增强一个或多个基因的转录水平（如图）。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。    ①对文中“增强子”的理解，错误的是 A．增强子是含有特定碱基序列的DNA片段 B．一个增强子只能作用于一个基本启动子 C．增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上 D．很多增强子在不同组织中的活性不同 ②科学家鉴定出小鼠某胚胎细胞内一个增强子附近有两个基因A和B，为了确定这两个基因是否为特异表达的基因，他们应该检测 。 (4)检测受体细胞是否成功导入了重组载体，除了利用利用抗生素抗性筛选，还可以利用 方法。 【答案】(1) 使DNA双链完全打开，为DNA复制提供单链模板。（或答提高模板DNA彻底变性的概率，为PCRDNA反应提供单链模板；或答确保模板完全解链） 10×（1.8）25 (2) EcoR I、BamH 1 5´-GAATTCGATTCG-3´ 5´-GGATCCGCATGG-3´ (3) B 这两个基因在不同组织或细胞类型中是否转录出相应的基因或是否翻译出相应的蛋白质 (4)PCR检测 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）PCR过程包括变性、复性、延伸等过程，其中变性的目的是使DNA双链完全打开，为DNA复制提供单链模板。PCR的本质是DNA的复制，原本1个DNA经复制1次后可得到2个DNA，由题意可知，PCR反应的扩增效率为80%，则1ngDNA经1次复制后可得到1.8ngDNA，所以10ngDNA经复25次循环，即25次复制后可得到10×1.825ngDNA。 （2）为了保证目的基因能正常表达，切割载体时，切割位点应选在启动子和终止子之间，结合图示可知，由于EcoR V切割所得的是平末端，不利于表达载体的构建，所以选择EcoR I、BamH I对载体进行切割。由题意可知，抗原蛋白基因转录的模板链碱基序列为5'-GATTCG-3'，5'-CCATGC-3'，为将目的基因与载体连接起来，应在目的基因两端加上对应的限制酶切割位点，所以引物的碱基序列从5'端到3'端依次5´-GAATTCGATTCG-3´，5´-GGATCCGCATGG-3´。 （3）①AC、依据题干“增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因 表达的调控序列”可知，增强子是含有特定碱基序列的DNA片 段，增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体 上，AC正确； B、由图可知，一个增强子可作用于多个基本启动子，B错误； D、依据题干“很多增强子具有组织特异的活性”可知，很多增强子在不同组织中的活性不同，D正确。 故选B。 ②为了确定这两个基因是否为特异表达的基因，他们应该检测这两个基因在不同组织或细胞类型中是否转录出相应的基因或是否翻译出相应的蛋白质，若转录出相应的基因或是否翻译出相应的蛋白质，说明该基因表达，否则该基因未表达。 （4）检测目的基因是否导入受体细胞，可通过利用表达载体上抗性基因（标记基因）对应的抗生素进行筛选，也可通过PCR检测，若PCR后可检测到相关条带，则说明导入成功。 2．（2025·山东聊城·一模）水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因（如图1所示）的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将斑马鱼的vtg基因，与人工构建的含萤火虫荧光素酶基因（无启动子）的载体（如图2所示）连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼。图2中Luc表示萤火虫荧光素酶基因，可以催化荧光素氧化产生荧光；为氨苄青霉素抗性基因，表示四环素抗性基因，BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、BsrGⅠ为限制酶。 (1)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体并降低“空载”概率，可选用限制酶 进行双酶切Luc基因载体，其优点是 。 (2)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，通过PCR技术扩增vtg基因时，需设计合适的加端引物。依据图1、图2信息推测引物2包含的碱基序列为 。一个vtg基因经过4轮循环后，得到的子代DNA分子中，只含有1种引物的DNA分子所占的比例为 。 (3)若筛选导入vtg-Luc基因重组载体的大肠杆菌，可将大肠杆菌依次放在含有氨苄青霉素、四环素的培养基中培养，筛选 的大肠杆菌即为目的菌；若要判断斑马鱼转基因是否成功，可在水体中添加 进行检测。 【答案】(1) EcoRI、HindⅢ 防止质粒和目的基因的自身环化和目的基因的反向连接 (2) 5'-AAGCTTAGAGGC-3' 1/8 (3) 能在含有氨苄青霉素的培养基中生长但不能在含有四环素的培养基中生长 雌激素和荧光素 【分析】基因工程技术的基本步骤：   1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。   2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。   3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。   4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）要使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体并降低“空载”概率，应选用两种不同的限制酶进行双酶切。观察图2，EcoRI和HindⅢ的酶切位点分别位于Luc基因载体的不同位置，用这两种酶双酶切可以满足要求，可以防止质粒和目的基因的自身环化和目的基因的反向连接； （2）引物2要与vtg基因的模板链互补配对，并且要包含与Luc基因载体双酶切后相同的黏性末端（HindⅢ的黏性末端）。根据图1中vtg基因的序列以及图2中HindⅢ的识别序列，引物2包含的碱基序列为5'-AAGCTTAGAGGC-3'；一个vtg基因经过4轮循环后，共得到24 = 16个DNA分子。其中只含有1种引物的DNA分子有2个，只含有1种引物的DNA分子所占的比例为1/8； （3）重组载体中含有氨苄青霉素抗性基因，而四环素抗性基因因酶切被破坏，所以导入vtg - Luc基因重组载体的大肠杆菌能在含有氨苄青霉素的培养基中生长，不能在含有四环素的培养基中生长，筛选能在氨苄青霉素培养基中生长，不能在四环素培养基中生长的大肠杆菌即为目的菌；水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。因为转基因斑马鱼含有萤火虫荧光素酶基因，该酶可以催化荧光素氧化产生荧光，所以若要判断斑马鱼转基因是否成功，可在水体中添加雌激素和荧光素进行检测。 3．（2025·天津蓟州·一模）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： (1)进行PCR扩增时需要耐高温的DNA聚合酶，为使其活化应在PCR反应缓冲液中加入 （填“Ca2+”或“Mg2+”）。 (2)有关基因序列如图2，引物F2-F、F1-R应在下列选项中分别选用 。 A．5'-ATGGTG……CAACCA-3' B．5'-TGGTTG……CACCAT-3' C．5'-GACGAG……CTGCAG-3' D．5'-CTGCAG……CTCGTC-3' (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在酶的作用下可形成环形质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要是 。 (4)构建好的重组质粒除了含有目的基因、标记基因，还要有 ，用以控制目的基因的表达。 (5)如何将重组质粒导入大肠杆菌？ 。 (6)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3.根据图中结果判断，符合要求的质粒为 。 【答案】(1)Mg2+ (2)CD (3)限制酶 (4)启动子和终止子 (5)用Ca2+处理大肠杆菌，使细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，可将重组质粒导入细胞 (6)P1和P2 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）进行 PCR扩增时需要耐高温的DNA聚合酶，为使其活化应在PCR反应缓冲液中加入Mg2+。 （2）由图1可知，引物F2−F用于扩增F2片段，引物F1−R用于扩增F1片段，C选项中5′−GACGAG−3′ 能与EGFP基因右端和AnBI 中左侧部分碱基进行碱基互补配对，因此引物 F2−F 选用C；D选项中 5′−CTGCAG−3′ 能与AnBI 中左侧部分碱基和GFP基因右端右侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物F1−R选用D。 故选CD。 （3）传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用 DNA 连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将 PCR 产物片段与线性质粒载体混合后，在 DNA 连接酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制酶。 （4）启动子好和终止子分别控制转录的开始和结束，故构建好的重组质粒除了含有目的基因、标记基因，还要有启动子和终止子，用以控制目的基因的表达。 （5）大肠杆菌属于原核生物，将重组质粒导入大肠杆菌一般是用Ca2+处理大肠杆菌，使细胞处于能吸收周围环境中 DNA 分子的生理状态。 （6）EGFP为720bp，AnBI 为390bp，二者的总大小为720bp+390bp=1100bp，用引物F1−F和F2−R进行了PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，符合要求的质粒有P1、P2。 1．（2024·广西·高考真题）β-地中海贫血是人11号染色体上β-珠蛋白基因HBB突变所造成的遗传病。如图为HBB几种常见的基因突变位点及功能区域示意图。回答下列问题：    注：-28A→C中，“-”表示转录起始位点前，数值表示碱基位点，A→C表示碱基A突变为C；仅标示了非模板链上的变化，模板链也发生对应变化，但没有标示出来。 (1)654C→T突变， （选填“会”或“不会”）增加该基因嘌呤碱基总数量。-28A→C突变，会导致β-珠蛋白的表达异常，其原因是 。 (2)HBB在转录形成mRNA的过程中，细胞核内特定RNA复合物能特异性识别初级转录产物（mRNA前体），并将内含子对应区域剪切以及拼接外显子对应区域，这表明上述RNA复合物是一种 。 (3)含有17A→T突变的HBB转录出的mRNA，对应位点的碱基是 。 (4)某男性一条染色体上的HBB存在突变位点W，其配偶无W突变，他们生育的孩子 （选填“一定”或“不一定”）存在该突变，从遗传概率角度分析，其原因是 。为有效降低人群中β-地中海贫血的发病率，可以采取 和 等措施。 【答案】(1) 不会 启动子区域发生碱基替换，使RNA聚合酶无法识别和结合，从而影响转录和翻译水平，使B-珠蛋白合成异常。 (2)酶（特异性酶） (3)U（尿嘧啶） (4) 不一定 孩子有50%概率不含该突变 遗传咨询 产前检测 【分析】1、DNA分子中发生碱基的替换、增添或缺失，而引起的基因碱基序列的改变，叫作基因突变。基因突变若发生在配子中，将遵循遗传规律传递给后代。若发生在体细胞中，一般不能遗传。但有些植物的体细胞发生了基因突变，可以通过无性生殖遗传。 2、通过遗传咨询和产前诊断等手段，对遗传病进行检测和预防，在一定程度上能够有效地预防遗传病的产生和发展。 3、启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。 【详解】（1）依题意，654C→T突变是指非模板链上的第654位碱基C突变为T，模板链也发生对应的654G→A变化，故654C→T突变不会增加该基因呤碱基总数量。据图可知，基因的第28位碱基位于基因的启动子上，-28A→C突变，启动子区域发生碱基替换，使RNA聚合酶无法识别和结合，从而影响转录和翻译水平，使B-珠蛋白合成异常。 （2）依题意，RNA复合物能特异性识别mRNA前体，并将内含子对应区域剪切以及拼接外显子对应区域，则该复合物使RNA的化学键发生了断裂和形成，故上述RNA复合物应是一种酶（特异性酶）。 （3）依题意，17A→T表示基因非模板链上的变化，基因非模板链的碱基排序与对应的mRNA碱基排序相同，故含有17A→T突变的HBB转录出的mRNA，对应位点的碱基变化是由17A→U，即对应位点的碱基是U。 （4）β-地中海贫血是人11号染色体上β-珠蛋白基因HBB突变所造成的遗传病，即β-地中海贫血为常染色体上基因控制的遗传病。该男性一条染色体上的HBB存在突变位点W，另一条染色体上基因是正常的，且其配偶无W突变，故其子代有50%概率不含该突变，他们生育的孩子不一定存在该突变。通过遗传咨询和产前诊断等手段，对遗传病进行检测和预防，在一定程度上能够有效地预防遗传病的产生和发展。故为有效降低人群中β-地中海贫血的发病率，可以采取遗传咨询和产前检测等措施。 2．（2024·广西·高考真题）M蛋白与“记忆”的形成密切相关。科研人员制备了M基因表达可控的实验模型小鼠，主要制作流程见下图，实验模型小鼠通过特异性表达Cre重组酶来敲除两个LoxP位点间的序列，同时利用体内表达的蛋白A激活诱导型T启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M基因（M-GFP）的表达，恢复小鼠自身被敲除的M基因功能，同时便于示踪。回答下列问题： 注：基因型A/+指的是A基因被嵌合在细胞同源染色体中的一条，即可表示为Aa；两端添加上LoxP位点的M基因称为floxM。 (1)在PCR扩增片段①和②时，通常会在所用引物的一端添加被限制酶识别的序列，该序列添加的位置位于引物 （选填“3'端”或“5'端”）。在构建载体1时，为了阻断A基因的表达，从转录水平考虑，连接的片段可以是 ；而从翻译水平考虑，连接的片段可以是 。为了鉴定载体2是否构建成功，需要限制酶切割载体后，再进行 。 (2)培养小鼠胚胎干细胞需定时更换培养液，其目的是 （至少答2方面）。 (3)为了快速高效繁育出含有4对基因（遵循自由组合定律）的实验模型小鼠，应将培育出的基因型Cre/+A/+小鼠和M-GFP/+floxM/+小鼠分别与基因型floxM/floxM小鼠杂交，杂交获得的子代，再进行一代杂交后最终获得基因型为 实验模型小鼠。 (4)为了实现M基因的表达可控，在实验模型小鼠喂食时，可添加竞争性结合A蛋白的四环素，抑制T启动子的活性。添加四环素与未添加相比，目的是 。 【答案】(1) 5′端 两端包含loxP序列的终止子 两端包含loxP序列的可转录出终止密码子相应的DNA序列 电泳 (2)清除代谢产物、提供营养物质、调节pH、维持渗透压 (3)cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM (4)添加四环素会竞争性结合A蛋白，无法激活T启动子，导致M-GFP基因不能表达，从而不能恢复被敲除的M基因的功能；不添加四环素，A蛋白基因表达激活T启动子，启动M-GFP基因表达，从而恢复被敲除的M基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照，增加实验的准确性。 【分析】基因工程技术的基本步骤：  1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。  2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。  3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。  4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）PCR扩增DNA时，子链的合成方向是5'→3'，故应在引物的5'端添加被限制酶识别的序列。终止子：使转录在所需要的地方停下来，它位于基因的下游，也是一段有特殊序列结构的DNA片段。转录是以DNA为模板合成RNA的过程。从转录水平考虑为了阻断A基因的表达，连接的片段可以是两端包含LoxP序列的终止子。终止密码子：蛋白质翻译过程中终止肽链合成的mRNA上的三联体碱基序列。从翻译水平考虑为了阻断A基因的表达，连接的片段可以是两端包含LoxP序列的可转录出终止密码子相应的DNA序列。为鉴定载体2是否构建成功，需利用限制酶切割载体后进行电泳，观察是否出现预期大小的目标条带。 （2）细胞培养液需要定期更换，以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害。此外，定期更换培养液还能维持细胞生存适宜的pH 和渗透压、确保细胞获得充足的营养，保证细胞的健康生长和繁殖。 （3）实验的目的是制备M基因表达可控的实验模型小鼠，对M基因的控制是通过蛋白A激活诱导型T启动子来调控的。为了便于追踪，构建了带绿色荧光蛋白基因的M基因，方便观察 M基因的表达情况，而自身所带的M基因则需要被敲除，已知两端添加LoxP位点的M基因可被Cre重组酶敲除，所以需要构建两端添加了LoxP 位点的M 基因纯合小鼠，相关基因型为foxM/1oxM。该小鼠体内需要有Cre重组酶来切除自身的M基因，同时还要有表达蛋白A的基因以及融合了绿色荧光蛋白基因的M基因来替换被敲除的M基因。综上分析，需进行如下杂交： 最终获得基因型为cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM的实验模型小鼠。 （4）添加四环素与未添加相比，添加四环素会竞争性结合A蛋白，无法激活T启动子，导致M-GFP基因不能表达，从而不能恢复被敲除的M基因的功能；不添加四环素，A蛋白基因表达激活T启动子，启动M-GFP基因表达，从而恢复被敲除的M基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照，增加实验的准确性。 3．（2025·浙江·高考真题）3-磷酸甘油脱氢酶（GPD）是酵母细胞中甘油合成的关键酶。利用某假丝酵母菌株为材料，克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因（Gpd）。采用的方案是：先通过第1次PCR扩增出该基因的中间部分，再通过第2次PCR分别扩增出该基因的两侧，经拼接获得完整基因的序列，如图所示，回答下列问题：    (1)分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的 ，确定DNA序列，进而设计1对引物。以该菌株基因组DNA为模板进行第1次PCR，利用 凝胶电泳分离并纯化DNA片段，进一步测定PCR产物的序列。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要确认或调整刻度和量程，还需要 。 (2)若在上述PCR扩增结果中，除获得一条阳性条带外，还出现了另外一条条带，不可能的原因是__________。 A．DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染 B．每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点 C．在基因组中Gpd基因有2个拷贝 D．在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因 (3)为获得完整的Gpd基因，分别用限制性核酸内切酶PstⅠ和SalⅠ单酶切基因组DNA后，各自用DNA连接酶连接形成环形DNA，再用苯酚-氯仿抽提除去杂质，最后加入 沉淀环形DNA。根据第一次PCR产物测定获得的序列，重新设计一对引物，以环形DNA为模板进行第二次PCR，最后进行测序。用于第二次PCR的一对引物，其序列应是DNA链上的 （A．P1和P2  B．P3和P4 C．P1和P4 D．P2和P3）。根据测序结果拼接获得完整的Gpd基因序列，其中的启动子和终止子具有 功能。 (4)为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的 进行比对。将Gpd基因的编码区与 连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。 【答案】(1) 密码子/遗传密码 琼脂糖 更换微量移液器的枪头 (2)C (3) 冷的95%乙醇 D 调控 (4) 基因数据库/序列数据库 表达载体 【分析】基因工程技术的基本步骤：(1) 目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。(2) 基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、复制原点和标记基因等。(3) 将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。(4) 目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目 的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质一抗原-抗体杂交技术。 个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的密码子，根据碱基互补配对，确定DNA序列，进而设计1对引物。可通过琼脂糖凝胶电泳分离并纯化目标DNA片段。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要更换微量移液器的枪头，以避免交叉污染。 （2）A、DNA模板被其他酵母细胞的基因组DNA污染，可能扩增出其他DNA，从而出现另外一条条带，A错误； B、每个引物与DNA模板存在2个配对结合位点，从而扩增出不同的DNA片段，从而出现另外一条条带，B错误； C、在基因组中Gpd基因有2个拷贝，扩增出的DNA是相同DNA，电泳时只会出现一个条带，C正确； D、在基因组中存在1个与Gpd基因序列高度相似的其他基因，可能将相似的基因扩增出来，从而出现另外一条条带，D错误。 故选C。 （3）DNA在冷的95%乙醇中溶解度较低，可通过将酶切后的DNA经苯酚-氯仿抽提除去杂质，在加入冷的95%乙醇中沉淀，得到环形DNA。PCR过程中，子链的延伸方向为5'→3'，结合图示可知，应选择P2和P3引物进行第二次扩增。启动子可启动转录，终止子可终止转录，即启动子和终止子具有调控功能。 （4）为确定克隆获得的Gpd基因的准确性，可将获得的基因序列与已建立的基因数据库进行对比，若二者相同，则说明克隆获得的Gpd基因准确。将Gpd基因的编码区与表达载体连接，构建重组质粒，再将重组质粒导入酿酒酵母细胞中，使之进行表达，实现利用酿酒酵母高效合成甘油的目的。 4．（2024·天津·高考真题）金黄色葡萄球菌（简称Sa）是人体重要致病细菌、不规范使用抗生素易出现多重抗药性Sa。 (1)Sa产生抗药性可遗传变异的来源有 （至少答出2点）。 (2)推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测，以图1中R基因的上、下游片段和质粒1构建质粒2，然后通过同源重组（质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换）敲除Sa的R基因。    ①根据图1信息，简述质粒2的构建过程（需包含所选引物和限制酶）： ，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含 的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落。 ③将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含 的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含 的平板上，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。 ④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是 。    【答案】(1)基因突变、基因重组、表观遗传等 (2) 采用引物1和4进行PCR扩增（或采用引物1和3以及引物2和4分别进行PCR扩增），用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切 氯霉素（或氯霉素+头孢霉素） 脱水四环素 头孢霉素 D 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 判断可遗传变异的来源 可遗传变异来源有：基因突变、基因重组、染色体变异及表观遗传 Sa是原核生物，没有染色体 简述基因表达载体构建过程 利用PCR扩增目的基因时，需要目的基因两端的一段已知序列构建引物 质粒1及Sa的基因组中都含有SacII酶识别位点，质粒2上含有R基因上下游片段 筛选含质粒2的Sa菌落 用标记基因筛选目的菌 质粒2上有氯霉素抗性基因 筛选并获得不再含有质粒2的菌落 用标记基因筛选目的菌 质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换，R基因被交换至质粒2上，则Sa的基因组中没有了R基因；Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关，失去R基因，Sa没有头孢霉素抗性；质粒2上含有的Y是可被脱水四环素诱导表达的Sa致死基因，则含质粒2的Sa在含脱水四环素的培养基中会死亡 筛选R基因被敲除的Sa PCR扩增目的基因时需要目的基因两端的一段已知序列构建引物 发生同源重组时，质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对，并发生交换，敲除Sa的R基因，但R基因两端的上、下游片段仍在Sa基因组中 （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）Sa为原核生物产生抗药性可遗传变异的来源有基因突变、基因重组、表观遗传等。 （2）①由图1可知，质粒2上依次接有SacⅡ、EcoRⅠ、SacⅡ三个酶切位点，而质粒1上只有SacⅡ酶切位点，R基因的上下游依次含有SacⅡ、EcoRⅠ、EcoRⅠ、SacⅡ酶切位点，若要构建质粒2，可以采用引物1和4进行PCR扩增可得到整个R基因，以及上下游片段（或采用引物1和3以及引物2和4分别进行PCR扩增），用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切，然后回收上、下游片段，再与SacII酶切质粒1所得大片段连接，获得质粒2。 ②用质粒2转化临床分离的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa，因为重组的质粒2上含有氯霉素抗性基因，所以可以将重组后的含质粒2的菌落涂布在含氯霉素（或氯霉素+头孢霉素）的平板上，能生存下来的菌落就是，含质粒2的Sa单菌落。 ③推测Sa产生头孢霉素抗性与其R基因有关。为验证该推测需要敲除R基因，因为质粒2上含有Y可被脱水四环素又到表达的Sa致死基因，所以将②获得的单菌落多次传代以增加同源重组敲除R基因的几率，随后稀释涂布在含脱水四环素的平板上，可诱导R基因死亡，若无法增殖，则对应菌落中细菌的R基因疑似被敲除。 ④以③获得的菌株基因组为模板，采用不同引物组合进行PCR扩增，电泳检测结果如图2，表明R基因已被敲除的是D组，由图1可知，R基因两侧含有的引物为2和3，所以扩增后含有引物2或3，或者2和3的可能含有R基因，所以表明R基因已被敲除的是D组。 5．（2024·福建·高考真题）病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR来应对感染。麻疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46（hCD46）是麻疹病毒入侵细胞的主要受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。 回答下列问题： (1)利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是 。 (2)将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是 。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用 限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。 (3)为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其 。将胚胎移植到小鼠c的子宫中，应选用桑葚胚的原因是 。 (4)利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组，目的是 。 (5)若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性，原因是 。 【答案】(1)两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结合 (2) EcoRⅠ和NotI AgeⅠ和HindⅢ (3) 超数排卵 桑葚胚易于在小鼠子宫着床 (4)排除PCR体系中外源DNA的污染 (5)该小鼠能被麻疹病毒感染，且干扰素无法作用于IFNAR以应对感染 【分析】PCR是聚合酶链式反应的缩写。PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过这一技术，可以获取大量的目的基因。PCR扩增反应需要两种引物、模板DNA、原料（4种脱氧核苷酸）、酶（耐高温的DNA聚合酶）。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 【详解】（1）利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的变化是两种引物分别与解开的两条模板链进行碱基互补配对，为子链的延伸做准备，即表现为两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结合 （2）结合图示可知，质粒中以及目的基因的两端含有限制酶EcoRⅠ和NotI的识别序列，且这两个序列位于启动子和终止子之间，因此，将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是EcoRⅠ和NotI。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用AgeⅠ和HindⅢ限制酶组合将重组质粒变为线性DNA，因为这两种限制酶可以将重组质粒分为含目的基因的片段和含有标记基因的片段。 （3）为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其超数排卵，为获取大量的供体胚胎做准备。将胚胎移植到小鼠c的子宫中，通常选用桑葚胚的原因是因为桑葚胚易于在小鼠子宫着床，进而可以提高胚胎的存活率。 （4）利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组作为空白对照，这样可以排除PCR体系中外源DNA的污染，提高实验结果的可信度。 （5）若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该转基因小鼠能接受抗原刺激，进而机体会分泌干扰素，但干扰素无法与相应的受体结合，因为转基因小鼠的受体IFNAR无法表达，因而干扰素无法起作用，因此，该小鼠对麻疹病毒具有高易感性。 6．（2024·海南·高考真题）酿酒酵母是重要的发酵菌种，广泛应用于酿酒、食品加工及生物燃料生产等。研究人员对酿酒酵母菌株A进行基因工程改造以提高发酵中的乙醇产量。回答下列问题： (1)酿酒酵母在有氧和无氧的条件下都能生存，属于 微生物，在无氧条件下能进行 发酵，可用于制作果酒等。 (2)传统发酵中，新鲜水果不接种酿酒酵母也能制备果酒，原因是 。 (3)工业上常采用单一菌种发酵生产食品。菌株A存在于环境中，实验室获得该单一菌种的分离方法有 和 。 (4)菌株A含有1个FLO基因，其表达的FLO蛋白可提高发酵中乙醇产量，且FLO蛋白量与乙醇产量成正相关，研究人员基于菌株A构建得到菌株B、C、D（如图）。该实验中，构建菌株B的目的是 ，预期菌株A、B、C、D发酵中乙醇产量的高低为 。 (5)菌株A中，X和Y基因的表达均可以提高发酵中乙醇产量。研究人员将X和Y基因融合在一起，构建了XY融合基因能表达的菌株E（如图），其在发酵中具有更高的乙醇产量。菌株E中无单独的X和Y基因，且其他基因未被破坏。简要写出由菌株A到菌株E的构建思路 。 【答案】(1) 异养兼性厌氧 酒精 (2)新鲜水果表皮附着酵母菌 (3) 平板划线法 稀释涂布平板法 (4) 作为空白对照组，排除基因表达载体对乙醇产量的影响 菌株C＞菌株A=菌株B＞菌株D (5)从菌株A获得X、Y基因，使用4种引物分别扩增X、Y基因，其中X基因后端和Y基因前端的引物末端部分序列互补配对，可形成具有重叠链的PCR产物，接着利用融合PCR技术构建融合基因，再将获得的融合基因构建基因表达载体，将基因表达载体导入菌株，进行目的基因检测与鉴定，最终获得菌株E。 【分析】酵母菌是兼性厌氧菌，在无氧条件下进行酒精发酵；醋酸菌是好氧细菌，当氧气、糖源都充足时，能将糖分分解成醋酸，当缺少糖源时，则将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变成醋酸。 【详解】（1）酿酒酵母在有氧和无氧的条件下都能生存，属于异养兼性厌氧型微生物，在无氧条件下能进行酒精发酵，因此常用于制作果酒。 （2）传统发酵中，新鲜水果不接种酿酒酵母也能制备果酒，因为新鲜水果表面附着着酵母菌。 （3）实验室获得该单一菌种的分离方法有稀释涂布平板法和平板划线法，稀释涂布平板法中，经过一定的稀释后将菌液涂布在固体培养基上，可以获得单菌落；平板划线法是在无菌平板表面进行连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，经多次划线培养后，可在平板表面得到单菌落。 （4）菌株B导入不含FLO基因的表达载体作为空白对照组，可以排除表达载体对乙醇产量结果的影响，根据题干可知，FLO基因表达的FLO蛋白可提高发酵中乙醇产量，且FLO蛋白量与乙醇产量成正相关，FLO基因数：菌株C＞菌株B＞菌株D，所以乙醇产量：菌株C＞菌株A=菌株B＞菌株D。 （5）菌株E中无单独的X和Y基因，菌株A含有X和Y基因，需要先利用限制酶从菌株A获得X、Y基因，使用4种引物分别扩增X、Y基因，其中X基因后端和Y基因前端的引物末端部分序列互补配对，可形成具有重叠链的PCR产物，利用融合PCR技术构建融合基因，再将获得的融合基因构建基因表达载体，将基因表达载体导入菌株，进行目的基因检测与鉴定，最终获得菌株E。 7．（2024·重庆·高考真题）有研究者构建了H基因条件敲除小鼠用于相关疾病的研究，原理如图。构建过程如下：在H基因前后均插入LX序列突变成h基因（仍正常表达H蛋白），获得Hh雌性小鼠；将噬菌体的G酶基因插入6号染色体上，获得G+G-雄鼠（G+表示插入，G_表示未插入G酶基因） (1)以上述雌雄小鼠为亲本，最快繁殖两代就可以获得H基因条件敲除小鼠（hhG+G-和hhG+G+）。在该过程中，用于繁殖F1的基因型是 。长期采用近亲交配，会导致小鼠后代生存和生育能力下降，诱发这种情况的遗传学原因是 。在繁殖时，研究人员偶然发现一只G+G-不表达G酶的小鼠，经检测发现在6号和8号染色体上含有部分G酶基因序列，该异常结果形成的原因是 。 (2)部分小鼠的基因型鉴定结果如图2，③的基因型为 。结合图1的原理，若将图2中所有基因型的小鼠都喂食TM试剂一段时间后，检测H蛋白水平为0的是 （填序号）。 (3)某种病的患者在一定年龄会表现出智力障碍，该病与H蛋白表达下降有关（小鼠H蛋白与人的功能相同）。现有H基因完全敲除鼠甲和H基因条件敲除鼠乙用于研究缺失H蛋白导致该病发生的机制，更适合的小鼠是 （“甲”或“乙”），原因是 。 【答案】(1) HhG+G- 近亲繁殖会导致隐性致病基因纯合可能性增加 染色体片段从一条染色体移接到另一条非同源染色体上 (2) HhG+G+、HhG+G- ④ (3) 乙 乙的H基因敲除后表达受TM试剂调控 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 长期近亲交配导致小鼠后代生存和生育能力下降的遗传学原因 人类的遗传病及其预防 近亲繁殖会导致隐性致病基因纯合可能性增加，会导致小鼠后代生存和生育能力下降 6号和8号染色体上含有部分G酶基因序列 染色体结构变异 6号和8号染色体上含有部分G酶基因序列，G酶基因序列分开到两条染色体上，异常表达，其变异为染色体片段从一条染色体移接到另一条非同源染色体上 （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）由题干可知，亲本为HhG-G-、HHG+G-，要获得H基因条件敲除小鼠hhG+G-和hhG+G+，则用于繁殖F1的基因型是HhG+G-。近亲繁殖会导致隐性致病基因纯合可能性增加，会导致小鼠后代生存和生育能力下降。6号和8号染色体上含有部分G酶基因序列，G酶基因序列分开到两条染色体上，异常表达，其变异为染色体片段从一条染色体移接到另一条非同源染色体上。 （2）由图2可知，③含有基因H、h、G，故其基因型为HhG+G+、HhG+G-。结合图1和图2，①只含有h基因，仍正常表达H蛋白，②③都含有H基因，可正常表达H蛋白，④含有h基因和G基因，TM试剂激活G酶可剪切LX序列，使h基因异常，无法表达H蛋白，故检测H蛋白水平为0的是④。 （3）由题干可知，患者在一定年龄会表现出智力障碍，该病与H蛋白表达下降有关，由题干和题图可知，乙的H基因敲除后表达受TM试剂调控，故选择H基因条件敲除鼠乙。 8．（2024·重庆·高考真题）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 (1)基因S启动子的基本组成单位是 。 (2)通过基因工程方法,将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题19图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是 ；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是 。 (3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有 。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是 。 (4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是 。 【答案】(1)脱氧核糖核苷酸（脱氧核苷酸） (2) EcoRⅠ 酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向链接（反向链接） (3) 酶切后的空载体片段，启动子D+基因S片段      PCR (4)品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 启动子的基本组成单位 基因的结构 启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA的转录，是一段DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸 电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有哪些成分 PCR及琼脂糖凝胶电泳 电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D+基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段 检测转入是否成功的技术 检测目的基因是都导入受体细胞的方法 在分子水平上检测目的基因是否转入成功可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA的转录，是一段DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸。 （2）①根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoR Ⅰ的识别序列，若使用限制酶EcoR Ⅰ，会使目的基因序列被破坏； ②根据图中限制酶的识别序列可知，酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段单向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。 （3）①DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D+基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段； ②在分子水平上检测目的基因是否转入成过可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA。 （4）根据（4）题目信息可知，再生植株YZ-1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D＋基因S”序列，再生植株YZ-2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测：品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T，启动子D使基因S表达量更高，因而种子更大。 9．（2024·贵州·高考真题）研究者用以蔗糖为唯一碳源的液体培养基，培养真菌A的野生型（含NV基因）、突变体（NV基因突变）和转基因菌株（转入NV基因），检测三种菌株NV酶的生成与培养液中的葡萄糖含量，结果如表所示（表中“+”表示有，“—”表示无）。 检测用菌株 蔗糖 NV酶 葡萄糖（培养液中） 野生型 + + + 野生型 — — — 突变体 + — — 转基因菌株 + + + 回答下列问题。 (1)据表可推测 诱导了NV基因表达。NV酶的作用是 。检测NV酶活性时，需测定的指标是 （答出1点即可）。 (2)表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得。从野生型与突变体中分别提取基因组DNA作为模板，用与 （选填“T-DNA”或“NV基因”）配对的引物进行PCR扩增。若突变体扩增片段长度 （选填“>”“=”或“<”）野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功，从基因序列分析其原因是 。 (3)为进一步验证NV基因的功能，表中的转基因菌株是将NV基因导入 细胞获得的。在构建NV基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是 。 【答案】(1) 蔗糖 参与蔗糖分解代谢，将蔗糖分解生成葡萄糖 单位时间内葡萄糖的生成量（或蔗糖的减少量等） (2) NV 基因 > T-DNA 插入导致 NV 基因增加部分碱基序列 (3) 突变体 便于筛选出成功导入 NV 基因的细胞 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 表中有蔗糖一组则有NV酶 蔗糖诱导了NV基因表达，产生NV酶 测NV酶活性时，可用单位时间内，蔗糖的消耗量或葡萄糖的增加量来表示 表中有NV酶一组则有葡萄糖 NV酶可催化蔗糖水解，产生葡萄糖 表中突变体由T-DNA随机插入野生型菌株基因组DNA筛选获得 野生型无T-DNA，扩增时选与NV基因配对的引物 扩增片段突变体长度大于野生型长度，说明突变体构建成功 （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）根据表格，野生型菌株加入蔗糖就会合成NV酶，不加就不会合成，推测蔗糖诱导了 NV 基因表达。 分析表可知有NV 酶，菌株就能将蔗糖分解出葡萄糖，因此NV酶可能参与蔗糖的分解代谢过程，将蔗糖分解生成葡萄糖。 检测 NV 酶活性时，可以测定单位时间内葡萄糖的生成量或蔗糖的减少量等。 （2）从题目中可知，突变体是通过 T-DNA 随机插入野生型菌株基因组 DNA 筛选获得的。在进行 PCR 扩增时，使用的引物需要与特定的 DNA 序列配对结合，才能启动 DNA 的扩增。野生型菌株的基因组 DNA 中没有 T-DNA 的插入，所以用与 NV 基因配对的引物进行扩增时，可以扩增出完整的 NV 基因片段。而突变体由于 T-DNA 的随机插入，导致 NV 基因中增加部分序列。这样一来，使用同样的引物进行扩增时，扩增片段的长度就会大于野生型扩增片段的长度。因此若突变体扩增片段长度>野生型扩增片段长度，则表明突变体构建成功。 从基因序列分析其原因是 T-DNA 插入导致 NV 基因增加部分序列。 （3）为进一步验证 NV 基因的功能，表中的转基因菌株是将 NV 基因导入突变体细胞获得的。突变体由于 NV 基因发生突变，无法正常表达 NV 酶，导致相关生理功能缺失或异常。通过将正常的 NV 基因导入突变体细胞，如果能够恢复原本在突变体中缺失或异常的生理功能，就可以有力地证明 NV 基因确实具有特定的功能。 在构建 NV 基因表达载体时，需要添加新的标记基因，原因是便于筛选出成功导入 NV 基因的细胞。 10．（2024·江西·高考真题）植物体表蜡质对耐干旱有重要作用，研究人员通过诱变获得一个大麦突变体Cer1（纯合体），其颖壳蜡质合成有缺陷（本题假设完全无蜡质）。初步研究表明，突变表型是因为C基因突变为c，使棕榈酸转化为16-羟基棕榈酸受阻所致（本题假设完全阻断），符合孟德尔遗传规律，回答下列问题： (1)在C基因两侧设计引物，PCR扩增，电泳检测PCR产物。如图泳道1和2分别是突变体Cer1与野生型（WT，纯合体）。据图判断，突变体Cer1中c基因的突变类型是 。    (2)将突变体Cer1与纯合野生型杂交．F1全为野生型，F1与突变体Cer1杂交，获得若干个后代，利用上述引物PCR扩增这些后代的基因组DNA，电泳检测PCR产物，可以分别得到与如图泳道 和泳道 （从1~5中选择）中相同的带型，两种类型的电泳带型比例为 。 (3)进一步研究意外发现，16-羟基棕榈酸合成蜡质过程中必需的D基因（位于另一条染色体上）也发生了突变，产生了基因d1，其编码多肽链的DNA序列中有1个碱基由G变为T，但氨基酸序列没有发生变化，原因是 。 (4)假设诱变过程中突变体Cer1中的D基因发生了使其丧失功能的突变，产生基因d2。CCDD与ccd2d2个体杂交，F1的表型为野生型，F1自交，F2野生型与突变型的比例为 ；完善以下表格： F2部分个体基因型 棕榈酸（填“有”或“无”） 16-羟基棕榈酸（填“有”或“无”） 颖壳蜡质（填“有”或“无”） Ccd2d2 有 ① 无 CCDd2 有 有 ② 【答案】(1)碱基对的缺失 (2) 3 1 1：1 (3)密码子具有简并性 (4) 9：7 有 有 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 基因突变类型判断 基因结构中碱基对增添、缺失及替换会导致基因结构改变 C基因碱基对数为1960pb，突变基因c碱基对数为1100pb，发生了碱基对缺失 利用C基因两侧设计的引物扩增F1与突变体Cer1杂交的后代 PCR的产物一般用琼脂糖凝胶电泳法检测和鉴定 突变体（cc）与纯合野生型(CC)杂交，F1全为野生型(Cc)，F1与突变体(cc)杂交，获得若干个后代(1Cc:1cc) 基因发生了碱基对的替换，但氨基酸序列没有改变的原因 密码子具有简并性，即不同密码子可编码同一种氨基酸 D基因突变成了d基因，但氨基酸序列未变，说明突变前后的碱基对应的mRNA上的密码子编码同种氨基酸 求F2中野生型与突变型的比例 位于非同源染色体上的非等位基因在遗传时符合基因的自由组合规律 D基因与C基因位于非同源染色体上，它们的遗传符合自由组合规律，且C基因突变为c，使棕构酸转化为16-经基棕桐酸受阻；16-经基棕榈酸合成蜡质过程中必需的D基因，突受体Cer1中的D基因发生了使其丧失功能的突变，产生基因ds，据此可推断CD表现野生型，其它基因型表现突变型 （2）逻辑推理与论证： 【详解】（1）图示为在C基因两侧设计引物，PCR扩增，电泳检测PCR产物，c基因是C基因突变而来，c基因两侧的碱基序列与C基因相同，PCR扩增也能扩增c基因，由图可知，泳道1是突变体Cer1，则扩增c基因时两引物间的长度为1100bp，泳道2是野生型（WT，纯合体），则扩增C基因时两引物间的长度为2000bp，说明c基因比C基因长度变短，是碱基对的缺失引起的突变。 （2）突变体Cer1为cc，纯合野生型为CC，则F1为Cc，F1与突变体Cer1杂交后代中Cc：cc=1：1，电泳检测PCR产物，可以分别得到与如图泳道3和泳道1中相同的带型，两种类型的电泳带型比例为1：1； （3）编码多肽链的DNA序列中有1个碱基由G变为T，但氨基酸序列没有发生变化，原因是密码子具有简并性； （4）由题意可知，C/c、D/d2基因遵循基因的自由组合定律，因此CCDD与ccd2d2个体杂交，F1为（CcDd2），表型为野生型，F1（CcDd2）自交，F2野生型与突变型的比例为C-D-：（ccD-+C-d2d2+ccd2d2）=9：7；Ccd2d2含有C基因无D基因，有16-羟基棕榈酸，由于不含D基因，因为16-羟基棕榈酸合成蜡质过程中必需有D基因，故无颖壳蜡质；CCDd2含有C基因和D基因，有16-羟基棕榈酸，也有颖壳蜡质。 11．（2024·江西·高考真题）聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是一种聚酯塑料，会造成环境污染。磷脂酶可催化PET降解。为获得高产磷脂酶的微生物，研究人员试验了2种方法。回答下列问题： (1)方法1从土壤等环境样品中筛选高产磷脂酶的微生物。以磷脂酰乙醇酯（一种磷脂类物质）为唯一碳源制备 培养基，可提高该方法的筛选效率。除碳源外，该培养基中至少还应该有 、 、 等营养物质。 (2)方法2采用 技术定向改造现有微生物，以获得高产磷脂酶的微生物。除了编码磷脂酶的基因外，该技术还需要 、 、 等“分子工具”。 (3)除了上述2种方法之外，还可以通过 技术非定向改造现有微生物，筛选获得能够高产磷脂酶的微生物。 (4)将以上获得的微生物接种到鉴别培养基（在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加2%的琼脂粉和适量的卵黄磷脂）平板上培养，可以通过观察卵黄磷脂水解圈的大小，初步判断微生物产磷脂酶的能力，但不能以水解圈大小作为判断微生物产磷脂酶能力的唯一依据。从平板制作的角度分析，其原因可能是 。 【答案】(1) 选择 水 无机盐 氮源 (2) 基因工程（或转基因） 限制酶 DNA连接酶 载体（或质粒） (3)诱变育种 (4)不同平板中培养基量的差异以及平板内和平板间培养基厚度不均匀 【分析】1、培养基的基本成分：水、无机盐、碳源、氮源及特殊生长因子； 2、微生物的接种：微生物接种的方法很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，常用来统计样品活菌数目的方法是稀释涂布平板法。 【详解】（1）方法1从土壤等环境样品中筛选高产磷脂酶的微生物。以磷脂酰乙醇酯为唯一碳源制备选择培养基，在该培养基中只有能利用磷脂酰乙醇酯的微生物能生长，其他微生物的生长被抑制，进而获得筛选出所需要的微生物，为了提高该方法的筛选效率。除碳源外，该培养基中至少还应该有水分、无机盐和氮源等营养物质，同时还需要提供微生物生长所需要的外界环境条件。 （2）方法2采用基因工程技术定向改造现有微生物，以获得高产磷脂酶的微生物。除了编码磷脂酶的基因，即目的基因外，该技术还需要限制酶、DNA连接酶和载体（或质粒）等“分子工具”，进而可以实现目的基因表达载体的构建。 （3）除了上述2种方法之外，还可以通过诱变育种技术非定向改造现有微生物，筛选获得能够高产磷脂酶的微生物，该该技术的原理是基因突变，由于基因突变具有不定向性，因而该技术具有盲目性。 （4）将以上获得的微生物接种到鉴别培养基（在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加2%的琼脂粉和适量的卵黄磷脂）平板上培养，可以通过观察卵黄磷脂水解圈的大小，初步判断微生物产磷脂酶的能力，但不能以水解圈大小作为判断微生物产磷脂酶能力的唯一依据。从平板制作的角度分析，即倒平板过程中没有经过定量检测，且平板倒置的实际可能也会影响平板中培养基厚度的不同，因此不同平板中培养基量的差异以及平板内培养基厚度不均匀以及平板间厚度不均匀都会影响实验结果的判断，因此可采用降解圈的直径和菌落直径的比值作为判断依据。 12．（2024·北京·高考真题）学习以下材料，回答（1）～（4）题。 筛选组织特异表达的基因 筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。 真核生物的基本启动子位于基因5'端附近，没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。 很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定组织中表达（图A）。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”（图B），并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活报告基因的表达（图C）。 获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组DNA，通过PCR扩增含有捕获载体序列的DNA片段。对PCR产物进行测序后，与相应的基因组序列比对，即可确定载体的插入位点，进而鉴定出相应的基因。 研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，研究其在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。 (1)在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生 的过程称为细胞分化，分化是基因 的结果。 (2)对文中“增强子”的理解，错误的是________。 A．增强子是含有特定碱基序列的DNA片段 B．增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上 C．一个增强子只能作用于一个基本启动子 D．很多增强子在不同组织中的活性不同 (3)研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应检测 。 (4)真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B所示载体进行了改造，期望改造后的载体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突变，以研究基因功能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称 （略）。 【答案】(1) 稳定性差异 选择性表达 (2)C (3)各组织器官中G和H的mRNA (4) 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 细胞分化 细胞分化是指在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程 分化是基因选择性表达的结果 基因表达 包括转录和翻译 若要确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，可通过PCR等技术检测其他器官细胞中G和H两个基因是否转录出相应的mRNA （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）细胞分化是指在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。分化是基因选择性表达的结果。 （2）AB、依据题干“增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因 表达的调控序列”可知,增强子是含有特定碱基序列的DNA片 段，增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体 上，AB正确； C、由图C可知，一个增强子可作用于多个基本启动子，C错误； C、依据题干“很多增强子具有组织特异的活性”可知，很多增强子在不同组织中的活性不同，D正确。 故选C。 （3）若要确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，可通过PCR等技术检测其他器官细胞中G和H两个基因是否转录出相应的 mRNA。 （4）增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。而当增强子捕获载体的插入位点位于基因内部，会引起造成该增强子所调控的基因发生突变，为研究某目的基因的功能，可将图B所示载体去掉基本启动子，则该载体插入基因内部后才会发挥作用，图如下： 。 13．（2024·北京·高考真题）啤酒经酵母菌发酵酿制而成。生产中，需从密闭的发酵罐中采集酵母菌用于再发酵，而直接开罐采集的传统方式会损失一些占比很低的独特菌种。研究者探究了不同氧气含量下酵母菌的生长繁殖及相关调控，以优化采集条件。 (1)酵母菌是兼性厌氧微生物，在密闭发酵罐中会产生 和CO2。有氧培养时，酵母菌增殖速度明显快于无氧培养，原因是酵母菌进行有氧呼吸，产生大量 。 (2)本实验中，采集是指取样并培养4天。在不同的气体条件下从发酵罐中采集酵母菌，统计菌落数（图甲）。由结果可知，有利于保留占比很低菌种的采集条件是 。 (3)根据上述实验结果可知，采集酵母菌时O2浓度的陡然变化会导致部分菌体死亡。研究者推测，酵母菌接触O2的最初阶段，细胞产生的过氧化氢（H2O2）浓度会持续上升，使酵母菌受损。已知H2O2能扩散进出细胞。研究者在无氧条件下从发酵罐中取出酵母菌，分别接种至含不同浓度H2O2的培养基上，无氧培养后得到如图乙所示结果。请判断该实验能否完全证实上述推测，并说明理由 。 (4)上述推测经证实后，研究者在有氧条件下从发酵罐中取样并分为两组，A组菌液直接滴加到H2O2溶液中，无气泡产生；B组菌液有氧培养4天后，取与A组活菌数相同的菌液，滴加到H2O2溶液中，出现明显气泡。结果说明，酵母菌可通过产生 以抵抗H2O2的伤害。 【答案】(1) 酒精/C2H5OH ATP (2)无氧取样，无氧培养 (3)不能，因为没有“接触 O2 后，酵母菌内源 H2O2 浓度上升”的证据 (4)过氧化氢酶/H2O2 酶 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 酵母菌 兼性厌氧型微生物 无氧条件（密闭发酵罐）：酵母进进行无氧呼吸，产生酒精和CO2 有氧条件：酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖 研究者探究了不同氧气含量下酵母菌的生长繁殖及相关调控 自变量是不同氧气含量，因变量是酵母菌生长分支即相关调控情况 图甲中，无氧取样，无氧培养条件下，菌落数最多，说明该条件下，占比较低的菌种也会产生菌落，有利于保留占比很低菌种 （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）酵母菌在密闭发酵罐中进行无氧呼吸，会产生酒精（C2H5OH）和CO2。有氧培养时，酵母菌进行有氧呼吸，有机物被彻底氧化分解，产生大量能量，而无氧呼吸中有机物不能彻底分解，只产生少量能量，故有氧培养时酵母菌增殖速度明显快于无氧培养。 （2）由图甲结果可知，无氧/无氧条件下，菌落数最多，因此有利于保留占比很低菌种的采集条件是无氧/无氧。 （3）依据图乙结果可知，随着H2O2浓度的持续上升，酵母菌存活率下降（酵母菌受损程度加深），但不能证明酵母菌接触O2的最初阶段，细胞产生的H2O2浓度会持续上升，因为没有“接触 O2 后，酵母菌内源 H2O2 浓度上升”的证据。 （4）过氧化氢酶能催化H2O2分解出现明显气泡，因此实验结果说明，酵母菌可通过产生过氧化氢酶以抵抗H2O2的伤害。 14．（2024·湖南·高考真题）百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题： (1)体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前，先用 去除细胞壁获得原生质体，使原生质体融合，得到杂种细胞后，继续培养，常用 （填植物激素名称）诱导愈伤组织形成和分化，获得完整的杂种植株。 (2)单倍体育种。常用 的方法来获得单倍体植株，鉴定百合单倍体植株的方法是 。 (3)基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。 ①研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取pL，首先选用 酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草（P1、P2和P3）进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中 的诱导作用最强。 ②现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路 。 【答案】(1) 纤维素酶和果胶酶 生长素和细胞分裂素 (2) 花药离体培养 利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目 (3) HindⅢ、BamHⅠ 交链格孢 利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 去除细胞壁获得原生质体 植物体细胞杂交的过程 植物体细胞杂交的过程中需要先去除植物细胞的细胞壁，植物细胞壁的成分是纤维素和果胶，需要用相应的酶完成去壁的过程 获得单倍体植株 植物组织培养技术 通过植物组织培养技术，经过脱分化和再分化的过程，利用花药离体培养可获得单倍体 鉴定百合单倍体植株 有丝分裂的过程 单倍体植株是由配子发育而来，染色体数目减半，观察染色体的数目可判断是否是单倍体植株，有丝分裂中期的染色体形态固定，数目清晰，是观察染色体最佳时期 （2）逻辑推理与论证： 【详解】（1）因植物细胞细胞壁的成分主要是纤维素和果胶，因此获得原生质体的方法是用纤维素酶和果胶酶对植物细胞进行处理。得到原生质体后使原生质体融合，形成杂种细胞，再用生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织形成和分化，从而获得完整的杂种植株。 （2）获得单倍体植株的常用方法是花药（花粉）离体培养；鉴定百合单倍体植株的方法是利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目，如果染色体数目减少一半，则获得的植株即为单倍体植株。 （3）根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，启动子两侧都有两种酶，若要获得pL并连接到质粒上，可选用限制酶HindⅢ、BamHⅠ进行酶切，以替换Ti质粒中的启动子，从而达到根据GUS酶活性反映启动子活性的目的。根据图c的结果可知，交链格孢处理的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高，可确定其诱导作用最强。欲培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，可利用转基因技术将百合B中L基因的启动子替换为野生百合中L基因的启动子pL。 15．（2024·湖南·高考真题）色盲可分为红色盲、绿色盲和蓝色盲等。红色盲和绿色盲都为伴X染色体隐性遗传，分别由基因L、M突变所致；蓝色盲属常染色体显性遗传，由基因s突变所致。回答下列问题： (1)一绿色盲男性与一红色盲女性婚配，其后代的表型及比例为 或 ；其表型正常后代与蓝色盲患者（Ss）婚配，其男性后代可能的表型及比例为 （不考虑突变和基因重组等因素）。 (2)1个L与1个或多个M串联在一起，Z是L上游的一段基因间序列，它们在X染色体上的相对位置如图a。为阐明红绿色盲的遗传病因，研究人员将男性红绿色盲患者及对照个体的DNA酶切产物与相应探针杂交，酶切产物Z的结果如图b，酶切产物BL，CL、DL、BM、CM和DM的结果见下表，表中数字表示酶切产物的量。 BL CL DL BM CM DM 对照 15.1 18.1 33.6 45.5 21.3 66.1 甲 0 0 0 21.9 10.9 61.4 乙 15.0 18.5 0 0 0 33.1 丙 15.9 18.0 33.0 45.0 21.0 64.0 丁 16.0 18.5 33.0 45.0 21.0 65.0 ①若对照个体在图a所示区域的序列组成为“Z+L+M+M”则患者甲最可能的组成为 （用Z、部分Z，L、部分L，M、部分M表示）。 ②对患者丙、丁的酶切产物Z测序后，发现缺失Z1或Z2，这两名患者患红绿色盲的原因是 。 ③本研究表明：红绿色盲的遗传病因是 。 【答案】(1) 正常女性∶红色盲男性=1∶1 正常女性∶绿色盲女性∶红色盲男性∶红绿色盲男性=1∶1∶1∶1 红蓝色盲∶绿蓝色盲∶红色盲∶绿色盲=1∶1∶1∶1 (2) 部分Z+M+部分M Z发生突变，导致L、M基因无法表达 L、M基因的共用调控序列发生突变或L、M基因发生基因突变 【分析】【关键能力】 （1）信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 红色盲和绿色盲都为伴X染色体隐性遗传 X染色体隐性遗传属于伴性遗传，基因位于X染色体上 X染色体隐性遗传病女患者的儿子和父亲一定患病，正常女性可能是携带者 酶切产物Z的结果 DNA分子的凝胶电泳 距离点样孔越近，DNA分子越大 蓝色盲属常染色体显性遗传 孟德尔的分离定律 常染色体显性遗传符合孟德尔的分离定律，有显性基因的个体患病 （2）逻辑推理与论证 【详解】（1）根据题意分析，绿色盲男性的基因型为XLmY，红色盲女性的基因型为XlMXlM或XlMXlm，若该女性的基因型为XlMXlM，则后代的基因型及比例为XLmXlM∶XlMY=1∶1,表型及比例为正常女性∶红色盲男性=1∶1；若该女性的基因型为XlMXlm，则后代的基因型及比例为XLmXlM∶XLmXlm∶XlMY∶XlmY=1∶1∶1∶1，表型及比例为正常女性∶绿色盲女性∶红色盲男性∶红绿色盲男性=1∶1∶1∶1。无论哪种情况，后代的正常个体只有女性，且基因型为XLmXlM，若同时考虑蓝色盲，其基因型为ssXLmXlM，而蓝色盲男性的基因型为SsXLMY，两者婚配，其男性后代的基因型及比例为SsXLmY∶SsXlMY∶ssXLmY∶ssXlMY=1∶1∶1∶1，表型及比例为绿蓝色盲∶红蓝色盲∶绿色盲∶红色盲=1∶1∶1∶1。 （2）①根据对照组的实验结果可知，对照组的序列组成为Z+L+M+M，患者甲的Z序列的电泳结果和对照组不同，且电泳距离更远，因此片段较小，只具有部分Z片段；患者甲BL、CL和DL均缺失，因此不含L片段；对照组含有两个M片段，其BM、CM和DM的量分别为45.5、21.3和66.1，而患者甲BM、CM和DM的量分别为21.9、10.9和61.4，其BM、CM的量为对照组的一半，而DM的量和对照组相差不大，因此患者甲含有一个完整的M片段和第二个M片段的DM区，因此其序列组成表示为部分Z+M+部分M。 ②患者丙和患者丁的L和M片段的相关结果和对照组无差异，但缺失Z1或Z2，说明Z1和Z2的缺失会影响L和M基因的表达，从而使机体患病，因此其患病的原因是Z发生突变，导致L、M基因无法表达。 ③结合①②的结果并分析甲、乙、丙和丁的检测结果可知，红绿色盲的遗传病因是L、M基因的共用调控序列发生突变或L、M基因发生基因突变。 1．（2025·广东深圳·一模）苦草是一种适应能力强的沉水植物，可以有效修复受多环芳烃（PAHs）污染的沉积物，回答下列问题： (1)苦草富集的内生菌能促进PAHs的分解，降低PAHs对苦草的毒害，而苦草可以向内生菌提供养料，推测内生菌与苦草之间的种间关系是 ，二者相互作用并不断演化的过程称为 。 (2)为研究苦草分解PAHs的机制，研究人员开展了如下实验。 ①选取多株长势优良的苦草，并重点检查苦草的 （填部位），避免采集过程的影响。 ②将处理后的苦草分成三组，对苦草根表面和沉积物进行下表中的处理，根据整个实验分析，推断表格中a和b的处理分别是 。 处理组 苦草根表面 沉积物 Ⅰ 不灭菌 灭菌 Ⅱ 灭菌 不灭菌 Ⅲ a b ③在三种处理条件下分别进行PAHs分解的模拟实验，15天后所测得结果如图，据图分析， （填“苦草根表面”或“沉积物”）的微生物在PAHs降解过程中发挥着更大的作用。根据实验结果，从种间关系的角度提出进一步研究的假说 。 (3)综合上述分析，从生态学的角度就增强PAHs污染修复效果提出合理方案 。 【答案】(1) 互利共生 协同进化 (2) 根部 灭菌 苦草根表面 苦草（根表面）能够改善沉积物中PAHs分解菌的生长环境，或促进沉积物中PAHs分解菌的生长 (3)适当增加苦草的种群数量；改善沉积物中PAHs分解菌的生存环境（合理即可） 【分析】种间关系主要有：原始合作、互利共生、种间竞争、捕食和寄生等。 【详解】（1）依据题干信息，苦草富集的内生菌能促进PAHs的分解，降低PAHs对苦草的毒害，而苦草可以向内生菌提供养料，可知，内生菌与苦草之间的种间关系是互利共生，二者相互作用并不断演化的过程，称为协同进化。 （2）①结合实验过程可知，应选取多株长势优良的苦草，并重点检查苦草的根部，避免采集过程的影响。 ②枯草根部的内生菌能促进PAHs的分解，将处理后的苦草分成三组，对苦草根表面和沉积物进行下表中的处理，结合Ⅰ组、Ⅱ组的实验处理，可知对Ⅲ组中的a和b的处理应为灭菌处理。 ③据图可知，Ⅰ组处理组的多环芳烃含量最低，说明改组的分解能力最强，Ⅰ组的苦草根表面没有进行灭菌，进而说明苦草根表面的微生物在PAHs降解过程中发挥着更大的作用。从种间关系的角度来看，可以进一步提出如下假说：苦草（根表面）能够改善沉积物中PAHs分解菌的生长环境，或者说，苦草（根表面）能够促进沉积物中PAHs分解菌的生长。 （3）结合小问2，可知，PAHs的降解与枯草、PAHs分解菌有关，所以从生态学角度来看，适当增加枯草的种群数量；改善沉积物中PAHs分解菌的生存环境，可以增强PAHs的污染修复效果。 2．（2025·河南驻马店·一模）αl-抗胰蛋白酶（AAT）是一种主要由肝细胞合成的血浆蛋白。AAT缺乏症患者的体内正常AAT浓度低，常表现为肺气肿和严重的肝脏疾病。PiM是正常基因，PiS基因导致血浆中AAT轻度缺乏，PiZ基因导致血浆中AAT重度缺乏。PiM对PiS、PiZ为显性，PiS对PiZ为显性。图1是AAT缺乏症患者家系的遗传系谱图，对部分个体的PiM、PiZ和PiS基因进行PCR，结果如图2所示。回答下列问题。    (1)AAT缺乏症为 染色体 遗传病。PiM、PiZ和PiS互为复等位基因，产生的根本原因是 ，Ⅱ4的基因型是 。 (2)若Ⅲ3和与其基因型相同的女性结婚，所生的正常孩子中含有PiZ基因的概率是 。 (3)图2的上方为加样孔，根据电泳条带的分布推测，AAT缺乏症的根本原因是编码AAT的基因发生了碱基对的 。 (4)遗传咨询中医生初步推测某人是否为患者，主要依据是 （填序号）。 ①血型②家族病史③观察症状 临床上常通过测定血清的AAT浓度诊断该病，也可以通过 测序，准确检测。 【答案】(1) 常 隐性 基因突变(或碱基的增添、缺失、替换) PiMPiS (2)2/3 (3)缺失 (4) ②③ 基因 【分析】由图1和图2的Ⅱ3、Ⅲ2和Ⅲ3可知,AAT缺乏症为常染色体隐性遗传病。由Ⅱ3、Ⅲ2和Ⅲ3可推知，Ⅱ4的基因型是PiMPiS。Ⅲ3的基因型为PiMPiZ，PiMPiZ和PiMPiZ结婚，正常孩子中含有PiZ基因的概率是2/3。 【详解】（1）由图1可以看出，Ⅰ1和Ⅰ2正常，但他们有一个患病的女儿Ⅱ3，所以该病为隐性遗传病，但是Ⅱ3的儿子Ⅲ3不患病，可知AAT缺乏症为常染色体隐性遗传病。复等位基因，产生的根本原因是基因突变(或碱基的增添、缺失、替换)，PiM是正常基因，PiS基因导致血浆中AAT轻度缺乏，PiZ基因导致血浆中AAT重度缺乏。PiM对PiS、PiZ为显性，PiS对PiZ为显性，结合图2，可知。基因②为PiZ，由Ⅱ3（PiZPiZ）、Ⅲ2（PiSPiZ）、基因③为PiS，基因①PiM，和Ⅲ3可推知，Ⅱ4的基因型是PiMPiS。 （2）由小问1，可知Ⅲ3基因型PiMPiZ，与其基因型相同PiMPiZ的女性结婚，所生的孩子有PiMPiM， 2PiMPiZ，PiZPiZ，其中正常孩子中含有PiZ基因的概率是2/3。 （3）从图2的电泳条带可知，不同的基因有不同的条带，说明基因的结构有差异，AAT缺乏症是由于相关基因发生了突变，从电泳条带的分布推测，AAT缺乏症的根本原因是编码AAT的基因发生了碱基对的缺失。 （4）遗传咨询中医生初步推测某人是否为患者，血型与AAT缺乏症并无直接关联，①不符合;家族病史可以帮助判断是否有遗传该病的可能，②符合；观察症状能够初步判断是否可能患有相关疾病，③符合，所以遗传咨询中医生初步推测某人是否为患者，主要依据是主要依据是②③；临床上常通过测定血清的AAT浓度诊断该病，也可以通过基因测序，准确检测是否存在相关致病基因。 3．（2025·黑龙江吉林·一模）实验室某小组新发现一个调控水稻种子活力的基因Oshipll，并通过基因编辑获得含有其突变基因a、b、c的三种水稻，来鉴定该基因作用机制。利用CRISPR/Cas9复合体进行基因编辑时，复合体首先会定位目标序列（非模板链）的5´-NGG-3´位点（N表示任意一种碱基），然后利用自身所含的一段20bp长度的向导RNA，与该位点5´端相连的序列互补配对，若能够互补，复合物会切割互补序列某位点，使该位点插入或丢失部分碱基，可能导致基因突变失活。下图表示相应基因的非模板链部分序列和编码的肽链的部分氨基酸序列。回答下列问题。    相应基因合成的肽链的氨基酸序列为 Oshipll         MANSKSLLLCWCSLLLL……*73    a           MANSKSLLLLLVLAPPP……*64    b            MANSKSLLL*9    c            MANSKSLLLLAAAAPPAL……*85 注：各个英文大写字母表示不同的氨基酸；*后面的数字表示肽链氨基酸个数；终止密码子为UAA、UAG、UGA (1)该复合物与基因工程基本操作工具中 酶作用相似，作用的化学键为 。 (2)若分析基因a、b、c的突变位点，应设计 ，扩增相应基因，然后测序，并利用 分析比较得出突变位点。 (3)该复合物所含的向导RNA的序列为5´- ...-3´（只填5´端前6个碱基），b基因所编码肽链的氨基酸数目比Oshipll减少的原因是 。 (4)下图图1为携带基因Oshipll及突变基因a、b、c的水稻萌发处理后发芽率比较。图2为用不同浓度ABA浸泡5天后，携带基因Oshipll及突变基因a、b的水稻发芽指数（发芽指数可反映种子萌发的速度，发芽指数越高种子萌发速度越快）比较。从图中数据可以得出基因Oshipll对于水稻萌发的作用为 ；出现图2结果的作用机制可能是 。    【答案】(1) 限制酶 磷酸二酯键 (2) 特异性引物 序列比对工具（BLAST） (3) GCAGAG 基因b的基因编辑位点增加了一个碱基，使终止密码子提前出现，翻译出多肽链变短 (4) 提高了发芽率，缩短了发芽时间 Oshipll抵抗ABA的作用来促进萌发 【分析】限制性核酸内切酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。 【详解】（1）由题意可知，CRISPR/Cas9复合体进行基因编辑时，会切割互补序列某位点，与基因工程中限制酶作用相似，作用的化学键为磷酸二酯键。 （2）PCR技术可以特异性地扩增目的基因。若分析基因a、b、c的突变位点，应设计特异性引物，扩增相应基因，然后测序，并利用序列比对工具（如BLAST）等分析比较得出突变位点。 （3）CRISPR/Cas9复合体含有的向导RNA定位目标序列的5´-NGG-3´位点（N表示任意一种碱基），与该位点5´端相连的序列互补配对，故向导RNA的序列为5´-GCAGAG-3´，对比Oshipll和突变基因b的序列可知，基因b的基因编辑位点增加了一个碱基A，使终止密码子提前出现，导致翻译提前终止，翻译出多肽链变短。 （4）由图1可知，携带基因Oshipll水稻的发芽率高于携带突变基因a、b、c的水稻。由图2可知，在3种ABA浓度下，携带基因Oshipll水稻的发芽指数高于携带突变基因a、b的水稻，即种子萌发速度快。综上所述，基因Oshipll对于水稻萌发的作用为提高水稻种子的发芽率和发芽速率，缩短了发芽时间。图2中，携带突变基因a、b的水稻随着ABA浓度升高，发芽指数下降程度大于携带基因Oshipll水稻，可能是由于基因Oshipll抵抗ABA的作用来促进萌发。 4．（2025·安徽·一模）某些植物凝集素如雪花莲凝集素和尾穗苋凝集素对一部分昆虫有毒性，可用作抗虫转基因植物的目的基因。研究人员将雪花莲凝集素基因（GNA）和尾穗苋凝集素基因（ACA）与载体（pBI121）结合，然后导入棉花细胞，获得转基因抗虫棉。部分过程如图所示，图中KpnⅠ及XhoⅠ为载体上限制酶的识别位点。回答下列问题： (1)限制酶SmaⅠ的识别序列为，可使用SmaⅠ处理GNA及ACA，然后用 DNA连接酶处理可获得二者的融合基因。若图1中融合基因的①链为模板链，使用限制酶KpnⅠ及XhoⅠ构建基因表达载体时，需在融合基因的ACA侧添加限制酶 的识别序列。 (2)将基因表达载体导入植物细胞常用的方法是 （答出两种）。取一部分在添加了卡那霉素的培养基上正常生长的棉花细胞，通过 技术获得的棉花植株不一定具有抗虫性状的原因是 （答出两点）。 (3)图2是重组质粒的部分结构放大示意图，对单独使用KpnⅠ处理融合基因和载体得到的转基因棉花细胞需要进行进一步鉴定：获得棉花细胞的DNA，再用图2中的引物 进行PCR，并利用 技术对PCR产物进行鉴定。 【答案】(1) T4 KpnⅠ (2) 农杆菌转化法、花粉管通道法 植物组织培养 导入棉花细胞的是空质粒或目的基因不能成功转录和翻译（合理即可） (3) 1和3或2和4 琼脂糖凝胶电泳 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因启动子终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）根据限制酶SmaⅠ的识别序列，用SmaⅠ处理GNA及ACA后，形成平末端，用T4DNA连接酶处理可获得二者的融合基因。 图1中融合基因的①链为模板链，转录时RNA聚合酶从模板链的3'至5'端移动，所以先转录ACA，再转录GNA，根据启动子的方向，所以应该在融合基因的ACA侧添加限制酶KpnⅠ的识别序列。 （2）将基因表达载体导入植物细胞常用的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法等，再通过植物组织培养技术获得棉花植株，但不一定具有抗虫性状，可能的原因是导入棉花细胞的是空质粒或目的基因不能成功转录和翻译。 （3）对单独使用Kpnl处理融合基因和载体得到的转基因棉花细胞进行鉴定，获得棉花细胞的DNA后，可以用图2中的引物1和引物3或引物2和引物4进行PCR，这样可以扩增出包含融合基因的片段。对PCR技术产物鉴定用琼脂糖凝胶电泳技术。 5．（2025·山东济宁·一模）为筛选出能与SARS病毒的S蛋白特异性结合的受体蛋白，研究人员利用基因工程技术，在S蛋白末端添加TAP标签（能特异性地与人和哺乳动物体内IgG类抗体结合）形成S-TAP融合蛋白，再利用该标签在病毒敏感细胞中纯化出S蛋白及其相互作用的蛋白质，部分过程如图。回答下列问题。    注：XhoI、SmaI、EcoRI、BamHI表示限制酶识别序列，各限制酶识别序列及切割后产生的DNA末端均不同；F、R表示引物；T7表示启动子；Kozak序列是调控基因表达的重要序列且不含限制酶识别序列。 (1)为成功构建重组质粒pcDNA3．1-S-TAP，在利用PCR扩增S基因时，需在F引物的5'端外侧依次添加 序列。PCR时新合成链的延伸方向是 （填“5′→3′”或“3′→5′”）。 (2)使用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，DNA分子的迁移速率与 有关。 (3)在该重组质粒pcDNA3.1-S-TAP中，T7的作用是 ，重组质粒中还应该有的结构有 。 (4)为检测转染细胞中是否表达出了S-TAP融合蛋白，科研人员将转染细胞置于载玻片，洗涤、固定后，滴加带有荧光标记的 稀释液，荧光显微镜下观察，若出现荧光标记，则说明转染细胞中表达出了S-TAP融合蛋白。 【答案】(1) Kozak和SmaⅠ酶 5′→3′ (2)凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象 (3) RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 终止子、标记基因、复制原点 (4)IgG类抗体 【分析】基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。基因工程包括四个基本步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）依题意，Kozak序列是调控基因表达的重要序列且不含限制酶识别序列，T7表示启动子，根据构建的重组质粒图示可分析，在S基因的上游加入了Kozak序列以调控S基因表达，故要在F引物的5'端外侧添加Kozak序列；目的基因和质粒要连接构成表达载体，根据T7启动子的方向及质粒上的酶切位点可知，S基因上游不能用XhoI（S基因会被XhoI酶切），应该有用Smal酶切，故F引物的5'端外侧还要添加SmaI酶识别序列；PCR是体外DNA复制技术，DNA复制的方向是新链的5′→3′，故PCR时新合成链的延伸方向是5′→3′。 （2）PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。 （3）依题意，T7表示启动子，启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。基因表达载体是载体的一种，包含目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点等。结合图示可知，基因表达载体中已有启动子、目的基因，还应有的结构是终止子、标记基因、复制原点。 （4）依题意，S蛋白末端添加TAP标签能特异性地与人和哺乳动物体内IgG类抗体结合，若要检测转染细胞中是否表达出了S-TAP融合蛋白，可滴加带有荧光标记的IgG类抗体稀释液，置荧光显微镜下观察，若出现荧光标记，则说明转染细胞中表达出了S-TAP融合蛋白。 6．（2025·山东聊城·一模）现发现一株叶色为黄绿色且雄性不育的双突变体两性植物（既可以自花传粉又可以异花传粉），其野生型表型为叶色绿色且雄性可育。已知叶色和雄蕊的育性分别受A/a和B/b控制。科研人员以该突变株（）和野生型（）进行了杂交，50%为绿色雄性可育，50%为黄绿色雄性可育，选取中黄绿色雄性可育植株自交，所得中绿色雄性可育：黄绿色雄性可育：绿色雄性不育：黄绿色雄性不育=3：6：1：2．回答下列问题： (1)结合实验分析，亲本和的基因型分别为 。 (2)中绿色雄性可育中纯合子所占的比例为 ，让中所有的黄绿色雄性可育植株间随机受粉，获得的子代中绿色雄性不育植株的概率为 (3)如果将中所有的绿色雄性可育株与绿色雄性不育株间行种植，则在绿色雄性不育株上收获的种子将来发育成绿色雄性不育株的概率为 ，绿色雄性可育株上收获的种子将来发育成绿色雄性不育株的概率为 (4)SSR是DNA中的简单重复序列，非同源染色体上、不同品种的同源染色体上的SSR重复次数不同，故常用于染色体特异性标记。科研人员提取出亲本、亲本及中50株雄性不育株叶肉细胞的核DNA，利用6号、8号染色体上特异的SSR进行PCR扩增，电泳结果如图2。 ①据图分析，控制雄性不育性状的基因可能位于 号染色体上。 ②2号不育株6号染色体SSR扩增结果出现的原因是 。 ③请在图3中画出植株8号染色体SSR扩增后的电泳结果 。 【答案】(1)aaBB、Aabb (2) 1/3 1/27 (3) 1/3 1/9 (4) 6 F1在减数分裂产生配子过程中，6号同源染色体的非姐妹染色单体发生 交换，形成了同时含雄性不育基因和P1亲本SSR标记的配子，并与含有雄性不育基因和P1亲本SSR标记的配子结合，发育成的子代同时具有两条条带 【分析】基因分离定律和自由组合定律的实质：进行有性生殖的生物在进行减数分裂形成配子的过程中，位于同源染色体上的等位基因随同源染色体分离而分离，分别进入不同的配子中，随配子独立遗传给后代，同时位于非同源染色体上的非等位基因进行自由组合。 【详解】（1）由实验一可知，绿色雄性可育（P1）与黄绿色雄性不育（P2）杂交，F1全为雄性可育，说明雄性可育为显性性状，由实验二可知，F1黄绿色雄性可育植株自交，F2出现绿色个体，说明黄绿色对绿色为显性，且绿色雄性可育（P1）与黄绿色雄性不育（P2）杂交F1中绿色雄性可育：黄绿色雄性可育=1：1，可推断出亲本中绿色雄性可育（P1）的基因型为aaBB，黄绿色雄性不育（P2）的基因型为Aabb。 （2）由（1）可知，F1黄绿色雄性可育植株的基因型为AaBb，F2中黄绿色雄性可育（A_B_）：黄绿色雄性不育（A_bb）：绿色雄性可育（aaB_）：绿色雄性不育（aabb）=6：2：3：1，与9：3：3：1相比可知，AA基因纯合致死，因此实验二F2中绿色雄性可育中纯合子（aaBB）所占的比例为1/3；F2中所有的黄绿色雄性可育的基因型及比例为AaBB：AaBb=1：2，产生的配子及比例是2/6AB、2/6aB、1/6Ab、1/6ab，F2中所有的黄绿色雄性可育自交，由于AA纯合致死，据棋盘法可知，后代中绿色雄性不育（aabb）的概率为1/27。 （3）实验二F2中所有的绿色雄性可育株的基因型及比例为aaBB：aaBb=1：2，绿色雄性不育株的基因型为aabb，将所有的绿色雄性可育株与绿色雄性不育株间行种植，由于绿色雄性不育株只能作母本，因此在绿色雄性不育株上收获的种子将来发育成绿色雄性不育株（aabb）的概率为2/3（aa）×1/2（bb）=1/3；绿色雄性可育株（aaBB：aaBb=1：2）上收获的种子将来发育成绿色雄性不育株（aabb）的概率为1/3×1/3=1/9。 （4）①据图分析，F2中50株雄性不育株叶肉细胞的核DNA的SSR中，所有的不育植株6号染色体SSR均有条带，故控制雄性不育性状的基因可能位于6号染色体上。 ②2号不育株6号染色体SSR扩增结果是含有双亲的SSR，原因可能是F1在减数分裂产生配子过程中，6号同源染色体的非姐妹染色单体发生 交换，形成了同时含雄性不育基因和P1亲本SSR标记的配子，并与含有雄性不育基因和P1亲本SSR标记的配子结合，发育成的子代同时具有两条条带。 ③F1植株8号染色体SSR应同时含有双亲的SSR，即有两个条带，故绘制图形如下： 7．（2025·河北沧州·一模）我国科学家利用分子生物学技术和体细胞核移植技术获得了世界首例高产赖氨酸转基因克隆牛，标志着国际克隆技术的又一次重大突破，过程如下图。回答下列问题：    (1)过程①的核心步骤是 。从序列数据库中检索获取了高产赖氨酸基因的碱基序列后，可以通过 的方法获得目的基因。在用PCR扩增目的基因时，需要在其两端加上两种限制酶的识别序列，限制酶识别序列应添加到引物的 （填“3′”或“5′”）端，不能添加到另一端的原因是 。 (2)为使高产赖氨酸基因只在克隆牛的乳腺细胞中表达，上述方法获得的目的基因片段需要和质粒上 等调控元件相连接。 (3)过程④必需利用 技术。最终黄白花母牛生下高产赖氨酸转基因克隆牛犊的性别及体色为 。在个体生物学水平上，高产赖氨酸转基因克隆牛培育成功的表现为 。 【答案】(1) 基因表达载体的构建 人工合成 5′ 限制酶识别序列不能与目的基因碱基互补配对，若添加到引物的3'端，则无法延伸子链(DNA聚合酶必须从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸) (2)乳腺中特异性表达的基因的启动子 (3) 胚胎移植 雌性、黑白花 转基因克隆牛成年泌乳后，其乳汁中赖氨酸的含量远高于同品种的非转基因奶牛 【分析】基因工程技术的基本步骤： (1)目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； (2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； (3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样.将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； (4)目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测： ①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术； ②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术； ③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原抗体杂交技术.个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）过程①的核心步骤是基因表达载体的构建。从序列数据库中检索获取了高产赖氨酸基因的碱基序列后，可以通过人工合成的方法获得目的基因。在用PCR扩增目的基因时，需要在其两端加上两种限制酶的识别序列，限制酶识别序列应添加到引物的5'端，这是由于限制酶识别序列不能与目的基因碱基互补配对，若添加到引物的3'端，则无法延伸子链(DNA聚合酶必须从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸)。 （2）为使高产赖氨酸基因只在克隆牛的乳腺细胞中表达，上述方法获得的目的基因片段需要和质粒上含有乳腺中特异性表达的基因的启动子等调控元件相连接。 （3）过程④必需利用胚胎移植技术。由于在进行核移植过程中，利用的是“黑白花奶牛”胎儿成纤维细胞的细胞核，且目的是为了获得高产赖氨酸牛奶，所以最终黄白花母牛生下高产赖氨酸转基因克隆牛犊的性别及体色为雌性、黑白花奶牛。在个体生物学水平上，高产赖氨酸转基因克隆牛培育成功的表现为转基因克隆牛成年泌乳后，其乳汁中赖氨酸的含量远高于同品种的非转基因奶牛。 8．（2025·宁夏石嘴山·一模）亚洲玉米螟、黏虫是造成我国玉米减产的主要害虫。我国科研人员通过图示过程将Bt基因（能够控制合成Bt毒蛋白）转入玉米细胞培育出了抗虫转基因玉米。回答下列问题： (1)用PCR扩增下面的Bt基因的DNA片段：5'-GACCTGTGGAAGC．.....CATACGGGATTG-3' 3'-CTGGACACCTTCG......GTATGCCCTAAC-5'供选择的引物有：①5'-GACCTGTGGAAGC-3'  ②5'-CTGGACACCTTCG-3'  ③5'-GTTAGGCATAC-3'④5'-CAATCCCGTATG-3'共四种，应选择________（填字母）。 A．①② B．②③ C．③④ D．①④ (2)据图分析，为确保目的基因能够与Ti质粒正确连接，形成含有目的基因的重组Ti质粒，科研人员应选用限制酶 切割Ti质粒和含Bt基因的DNA片段。在获得重组Ti质粒后，可将其加入经 处理的农杆菌；导入重组质粒的玉米细胞经 成为转基因玉米植株。    (3)为检测转基因玉米是否培育成功，科研人员首先利用 法检测Bt基因是否成功翻译：在进行个体生物学水平的鉴定时，科研人员将获得的多株转基因玉米进行自交，发现除少数植株的子代均抗虫外，多数植株的子代中均出现了不抗虫植株，统计这些植株的子代中抗虫与不抗虫的比例，发现有3:1和15:1两种情况。出现15:1的原因是 。 (4)某科研小组在做抗虫棉试验时，虽已经检测出棉花植株中含有抗虫基因，但让棉铃虫食用棉花叶片时，棉铃虫并没有被杀死，这说明 ，为此，科学家对棉花植株中的Bt毒蛋白基因进行了修饰，结果食用了棉叶的棉铃虫中毒死亡了，从变异类型分析，这种对Bt毒蛋白基因的修饰属于 。 【答案】(1)D (2) XbaⅠ和HindⅢ Ca2+ 植物组织培养 (3) 抗原-抗体杂交 在两对同源染色体的各一条染色体上转入了抗虫基因 (4) Bt毒蛋白基因没有成功表达 基因重组 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定。目的基因的检测与鉴定包括分子水平上的检测与个体水平上的鉴定两种方式。 【详解】（1）PCR引物应分别与待扩增片段两端的互补链3′端结合，且引物序列与其结合处应保持“正向一致”。Bt基因的DNA片段的上链(5′→3′)是GACCTGTGGAAGC…CATACGGGATTG，对应的下链(3′→5′)是CTGGACACCTTCG…GTATGCCCTAAC。前向引物通常与上链5′端相同序列（①），后向引物则与上链3′端互补且方向为5′→3′（④），应选①和④。 故选D。 （2） 据图分析，在构建目的基因表达载体外，由于BamHⅠ能将目的基因切割，因此不能用BamHⅠ切割，因此对于目的基因的左侧只能用XbaⅠ切割，而右侧HindⅢ和EcoRⅠ是目的基因和终止子近侧共有的限制酶，但目的基因的左侧有EcoRⅠ的识别序列，因此目的基因右侧需要用HindⅢ切割，因此，为确保目的基因能够与Ti质粒正确连接，形成含有目的基因的重组Ti质粒，科研人员应选用限制酶XbaⅠ和HindⅢ切割Ti质粒和含Bt基因的DNA片段；在获得重组Ti质粒后，可将其加入经Ca2+处理（使其处于易于吸收周围环境DNA分子的状态）的农杆菌；导入重组质粒的玉米细胞经植物组织培养成为转基因玉米植株，该操作的原理是植物细胞的全能性。 （3）翻译的产物是蛋白质，由于抗原与抗体的结合具有特异性，故为检测转基因玉米是否培育成功，可在分子水平条件下，科研人员首先利用抗原—抗体杂交法检测Bt基因是否成功翻译；在进行个体生物学水平的鉴定时，科研人员将获得的多株转基因玉米进行自交，发现除少数植株的子代均抗虫外，多数植株的子代中均出现了不抗虫植株，统计这些植株的子代中抗虫与不抗虫的比例，发现有3∶1和15∶1两种情况。其中15∶1为9∶3∶3∶1的变式，说明目的基因转入了两条具有非同源染色体的两条染色体上，即在两对同源染色体的各一条染色体上转入了抗虫基因，进而通过自交产生了性状分离比为15∶1的后代表现。 （4） 科学家最初做抗虫棉试验时，虽已经检测出棉花植株中含有抗虫基因，但让棉铃虫食用棉花叶片时，棉铃虫并没有被杀死，这说明Bt毒蛋白基因没有成功表达；为此，科学家对棉植株中的Bt毒蛋白基因进行了修饰，结果食用了棉叶的棉铃虫中毒死亡了，从变异类型分析，这种对Bt毒蛋白基因的修饰是蛋白质工程的应用，是第二代基因工程，其原理是基因重组。 9．（2025·福建龙岩·一模）油菜花是两性花，其雄蕊的育性由位于同源染色体相同位置上的3个基因（、、）决定。研究人员为培育具有杂种优势的油菜新品种，利用品系1（，雄性不育）、品系2（，育性正常）、品系3（，育性正常），进行如下实验： 实验一：将品系1与品系2杂交，均为雄性不育植株，将与亲本回交获得； 实验二：将品系1与品系3杂交，均育性正常，将与品系1回交获得． (1)上述杂交实验中，在授粉前必须对品系1采取的操作是 。 (2)若、、基因中碱基数目不同，原因是基因突变时发生了 。根据杂交一、二的结果判断、、之间的显隐性关系是 。 (3)SNP是指基因组中由单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性。当SNP位点与某基因非常接近时，它们在后代中往往保持连锁状态，使得SNP可以作为特定基因的遗传标记。研究人员提取实验一中亲本、、若干植株DNA，利用PCR扩增不同样本的SNP遗传标记，电泳结果如下图：    ①染色体互换通常发生在 时期，其引起的变异属于 。 ②据图推测， 序列与雄性不育基因紧密连锁，可作为雄性不育基因的分子标记，理由是 。 ③为进一步验证上述结论，研究人员提取实验二中亲本、、各植株DNA，并将表现型一致的植株DNA混合，利用PCR扩增不同样本的SNP遗传标记，请在下图画出支持上述结论的电泳结果 。    【答案】(1)套袋 (2) 碱基对的增添、缺失 对、为显性，对为显性 (3) 减数第一次分裂前期（减数分裂Ⅰ前期） 基因重组 SNPe 不育植株均检测出SNPe序列    【分析】基因的分离定律的实质是：在杂合子的细胞中，位于一 对同源染色体上的等位基因，具有一定的独立性；在减数分 裂形成配子的过程中，等位基因会随同源染色体的分开而分 离，分别进入两个配子中，独立地随配子遗传给后代。 基因的自由组合定律的实质是：位于非同源染色体上 的非等位基因的分离或组合是互不干扰的；在减数分裂过 程中，同源染色体上的等位基因彼此分离的同时，非同源 染色体上的非等位基因自由组合。 【详解】（1）两性花的杂交实验步骤是母本去雄（人工去雄）➡套袋➡人工授粉➡套袋；上述杂交实验中，在授粉前必须对品系1采取的操作是套袋。 （2）DNA分子中发生碱基的替换、增添或缺失，而引起的基因碱基序列的改变，叫作基因突变；若、、基因中碱基数目不同，原因是基因突变时发生了碱基对的增添、缺失；根据杂交一、二的结果判断、、之间的显隐性关系是对、为显性，对为显性。 （3）①在减 数第一次分裂前期过程中，同源染色体两两配对的现象叫作联会，联会后的每对 同源染色体含有四条染色单体，叫作四分体。四分体中的非姐 妹染色单体之间经常发生缠绕，并交换相应的片段，可见染色体互换通常发生在减数第一次分裂前期（减数分裂Ⅰ前期），其引起的变异属于基因重组。 ②据图推测，F1雄性不育植株样本均检测出SNPe序列，可见SNPe序列与雄性不育基因紧密连锁。 ③进一步验证上述结论，研究人员提取实验二中亲本、、各植株DNA，并将表现型一致的植株DNA混合，利用PCR扩增不同样本的SNP遗传标记，电泳结果如下图所示，表明了SNPe序列与雄性不育基因紧密连锁：    10．（2025·山东青岛·一模）水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将图1中的vtg基因与图2中Luc基因载体连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼，当极微量雌激素污染水体，斑马鱼的肝脏就发出荧光。Luc表示荧光素酶基因（无启动子），Kanr为卡那霉素抗性基因，ori为复制起点，BamHI、BclI、HindIII、BsrGI为限制酶，→表示转录方向。 注：图1DNA片段不含有图2所示限制酶的识别序列 (1)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，选用限制酶 切割Luc基因载体可降低“空载”概率。通过PCR技术获取vtg基因时，需设计合适的引物。依据图示信息，推测引物1包含的碱基序列为5′ 3′。（写出已知的所有碱基序列） (2)将“vtg-Luc基因重组载体”导入大肠杆菌中进行扩增，为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含 的培养基中，转基因成功的斑马鱼只在肝脏中发出荧光指示污染，其原因是 。 (3)Luc基因载体上有一段P2A序列，其功能如图所示，据此推测P2A的作用 。 (4)进一步研究发现，E蛋白能与vtg基因启动子的特定序列结合，启动该基因的表达。已知vtg基因启动子含区域1和区域2，为研究E蛋白的结合位点，设计如下实验：用限制酶将启动子切割成含区域1和区域2的两个片段，将两个酶切片段分别与Luc基因载体连接，连接位点位于Luc基因的上游，形成两种重组载体。将重组载体分别导入斑马鱼的 ，待发育成熟后，往水体中添加 进行检测。 【答案】(1) Bcl I和Hind Ⅲ 5'-TGATCAAACTAT-3' (2) 卡那霉素 vtg基因在肝脏中特异性表达 (3)有助于序列两侧的基因表达成独立的蛋白质 (4) 受精卵 雌激素和荧光素 【分析】基因工程的步骤： （1）提取目的基因：基因组文库中获取、cDNA文库中获取。 （2）目的基因与运载体结合：将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒作为运载体，首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。 （3）将目的基因导入受体细胞：将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。目的基因的片段与运载体在生物体外连接形成重组DNA分子后，下一步是将重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增。 （4）目的基因的检测和表达。 【详解】（1）由图可知，限制酶BsrGI会破坏Luc，因此不能选择BsrGI，Luc基因载体上存在两个BamHI识别位点，因此不能选择BamHI，为防止目的基因和载体的自身环化和反向连接，因此需选用两种限制酶，即选择BelI、HindIII切割Luc基因载体可降低“空载”概率。根据启动子的位置和基因载体上限制酶的位置，因此需要在引物1上添加限制酶BelI识别序列，因此引物1包含的碱基序列为5′TGATCAAACTAT3′。 （2）Kanr为卡那霉素抗性基因做为标记基因，供重组DNA的鉴定和选择，因此为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含卡那霉素的培养基中；转基因成功的斑马鱼只在肝脏中发出荧光指示污染，说明vtg基因只在肝脏中特异性表达。 （3）由图可知2A肽的作用可使两侧基因形成完整蛋白，即P2A有助于序列两侧的基因表达成独立的蛋白质。 （4）可利用显微注射法将目的基因导入动物的受精卵中。由题意可知，在含有雌激素的污水中，转基因斑马鱼可发出荧光，因此可在斑马鱼发育成熟后，往水体中添加雌激素和荧光素检测是否发荧光。 11．（2025·内蒙古阿拉善盟·一模）双乙酰是啤酒中的主要风味物质，含量过高会影响啤酒的品质；谷胱甘肽可以提高啤酒的抗老化能力。研究发现，ILV2基因编码双乙酰合成中的关键酶，GSH1基因编码谷胱甘肽合成中的关键酶。为生产低双乙酰且抗老化的啤酒，科研人员运用基因工程技术制备啤酒酵母工程菌，过程如图，其中CUPI基因的表达产物可使细胞对一定浓度的硫酸铜产生抗性。请分析回答： SalⅠ 5'-G↓TCGAC-3' Kpn Ⅰ 5'-G↓GTACC-3' Sph Ⅰ 5' -GCATG↓C -3 Xba Ⅰ 5'-T↓CTAGA-3'' Bgl Ⅱ 5'-A↓GATCT-3' Pst Ⅰ 5'-CTCC↓AG-3' (1)分析图1可知，需用 （填限制酶名称）切割质粒1以获取CUPI基因。 (2)转化后的啤酒酵母应置于含 的培养基中进行初步筛选。 (3)进一步鉴定需要以转化后啤酒酵母的 为模板，用图示两种引物进行PCR扩增。若扩增产物的大小约为1300bp，则说明 基因已整合到啤酒酵母的染色体上。 (4)将啤酒酵母工程菌与未转化的受体菌分别置于麦芽汁培养基中培养，定期取样检测，结果如图2。    据图2分析，啤酒酵母工程菌抗老化能力 。啤酒酵母工程菌的双乙酰合成量明显 未转化的受体菌，原因是 。 【答案】(1)Bgl Ⅱ 和 Sal Ⅰ (2)一定浓度的硫酸铜 (3) 总DNA CUP1基因和GSH1基因 (4) 增强 低于 啤酒酵母工程菌的ILV2基因被破坏 【分析】基因工程的基本操作程序包括四个步骤：目的基因的获得、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和鉴定。其中需要用的基本工具有限制性内切核酸酶（简称限制酶）、DNA连接酶和运载体。限制酶能够识别DNA上特定的碱基序列，将DNA从特定的位置切开，用同种的限制酶处理目的DNA和运载体，得到相同的末端，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接起来，形成重组运载体。 【详解】（1）观察图1中质粒1的结构，CUPI基因两端的限制酶切割位点分别为Sal Ⅰ和Bg1Ⅱ，所以要用Sal Ⅰ和Bg1Ⅱ切割质粒1，才能将CUPI基因完整地从质粒1上切割下来； （2）由题意“CUPI基因的表达产物可使细胞对一定浓度的硫酸铜产生抗性”可知，转化后的啤酒酵母应置于含一定浓度的硫酸铜的培养基中进行初步筛选，这样就可以筛选出转化后含有CUPI基因的啤酒酵母，只有成功导入并表达CUPI基因的啤酒酵母才能在含铜离子的培养基中生存； （3）进一步鉴定需要检测目的基因是否整合到啤酒酵母的染色体上，所以应以转化后啤酒酵母的总DNA为模板，因为啤酒酵母的总DNA包含了可能整合进去的CUPI基因等所有遗传物质；由图1可知，用Kpn Ⅰ和Pst Ⅰ处理重组质粒后导入啤酒酵母的片段含有CUPI基因和GSH1基因。已知CUPI基因大小为1028bp，引物1到引物2之间还包含ILV2 -左部分片段（270bp），1028+270=1298，约为1300bp，因此扩增产物的大小约为1300bp则说明CUPI基因导入啤酒酵母的染色体上，也说明CUPI基因和GSH1基因已整合到啤酒酵母的染色体上； （4）由题意可知，谷胱甘肽含量越高，抗老化能力越强。从图2可以看出，工程菌的谷胱甘肽含量高于未转化的受体菌，所以啤酒酵母工程菌抗老化能力增强；由图2可知，啤酒酵母工程菌的双乙酰合成量明显低于未转化的受体菌，由题意可知，ILV2基因是编码双乙酰合成中的关键酶，如果转化的啤酒酵母工程菌的ILV2基因被破坏，就不能编码双乙酰合成中的关键酶，从而使工程菌的双乙酰合成量降低。 12．（2025·河北保定·一模）由P基因编码的P蛋白是一种水通道蛋白，该蛋白在植物调节水分吸收方面发挥着 重要作用。科研人员利用基因工程技术培育出了高表达P蛋白的转基因玉米，图1表示P 基因片段和农杆菌的Ti质粒及几种限制酶的识别序列和切割位点。回答下列问题： (1)若b链为P基因转录的模板链，则扩增P 基因时，应选择的引物是 。构建基因 表达载体时，切割Ti质粒应选用的两种酶为 。 (2)用含重组 Ti质粒的农杆菌侵染玉米后，应在含 的培养基中进行筛选。科研人 员进一步用PCR 验证P基因是否成功导入玉米细胞，电泳结果如图2所示。其中①为 P 基因，作为阳性对照，②为阴性对照，③为检测结果，由此可验证 。 (3)为了验证玉米植株中是否成功表达出P 蛋白，可用 技术进行检测。 (4)侵染后的玉米外植体需要先进行脱分化，然后在含有 （填植物激素）的培养基上诱导生根和生芽。从遗传学的角度看，玉米外植体能形成完整植株的原因是 。 【答案】(1) 引物2和引物3 EcoR I和SpeI (2) 潮霉素 P基因成功导入了玉米细胞 (3)抗原一抗体杂交 (4) 生长素、细胞分裂素 玉米外植体细胞含有发育成完整个体的全部遗传信息 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸；转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 【详解】（1）启动子在基因的左边，b链为P基因转录的模板链，则b链的5'端在右边，3'端在左边；链的5'端在左边，3'端在右边。引物结合在模板链的3'端，所以选择的引物应该为引物2和引物3。 构建基因表达载体时，切割Ti质粒的其中一种限制酶不能选用XbaI，否则会切下终止子，故限制酶只能在EcoR I、SpeI及MunI中选择。MunI在T-DNA的边界序列以外，故应该选择EcoR I和PSeI。 （2）潮霉素抗性基因位于T-DNA内，用含重组Ti质粒的农杆菌侵染玉米后，应在含潮霉素的培养基中筛选出含P基因的玉米细胞。经过电泳图谱比较，③待测玉米细胞中有一条条带与①的阳性对照相同，说明P基因成功导入了玉米细胞。 （3）为了验证玉米植株中是否成功表达出P蛋白，常用抗原一抗体杂交技术进行检测。 （4）侵染后的玉米外植体需要先进行脱分化，然后在含有生长素和细胞分裂素等的培养基上诱导生根和生芽。从遗传学的角度看，玉米外植体能形成完整植株的原因是玉米外植体细胞含有发育成完整个体的全部遗传信息。 13．（2025·河北邯郸·一模）逆转录转座子是真核生物基因组中最丰富的一类可移动基因元件。逆转录转座子经过转录和逆转录后可整合进基因组中达到复制自身的目的，且插入基因组中时表现出精细的插入位点特异性。某研究团队为了研究4.5SRNA逆转录转座子的生物学作用，对4.5SRNA逆转录转座子DNA进行了克隆，部分过程如图1所示。回答下列问题： (1)获取鼠肝细胞总RNA时，使用异硫氰酸胍法提取，从保护RNA完整性的角度推测，异硫氰酸胍的作用是 。过程①和②中需要使用的酶分别是 、 。 (2)过程②获得的DNA补平且磷酸化后形成平末端，电泳鉴定结果如图2所示，优先使用 酶将DNA与pGEM3Zf连接形成重组质粒pGEM3Zf—4.5S．将重组质粒导入大肠杆菌中进行克隆。从大肠杆菌中提取质粒，选择限制酶 和 进行双酶切，酶切产物经过电泳鉴定，出现大小为139bp的条带，说明克隆成功。 (3)将4.5SRNA逆转录转座子DNA接入表达载体的SV40启动子的上游后，脂质体转染法将表达载体导入小鼠骨髓瘤细胞NS—1、SP2/0和人乳腺癌细胞Bca61中，研究4.5SRNA逆转录转座子对荧光素酶基因表达的影响，结果如图3所示，说明 。 (4)请你提出逆转录转座子在基因工程中的应用前景，逆转录转座子可作为 （写出1点即可）。 【答案】(1) 抑制RNA酶的活性 逆转录酶 耐高温的DNA聚合酶 (2) T4DNA连接 EcoR I Hind Ⅲ (3)4.5SRNA逆转录转座子对荧光素酶基因表达的影响与正向接入或反向接入无关，但存在种属的特异性 (4)基因工程技术中的载体 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定 【详解】（1）从保护RNA完整性的角度推测，异硫氰酸胍的作用是抑制RNA酶的活性，因为RNA酶会降解RNA，抑制其活性可保护RNA不被分解。过程①是逆转录过程，需要逆转录酶，过程②是以单链DNA为模板合成双链DNA的过程，需要耐高温的DNA聚合酶。 （2）因为过程②获得的DNA补平且磷酸化后形成平末端，而T4DNA连接酶可连接平末端，所以优先使用T4DNA连接酶将DNA与pGEM3Zf连接形成重组质粒pGEM3Zf-4.5S。要鉴定克隆是否成功，需选择合适的限制酶进行双酶切。观察图1可知，质粒上EcoR I和Hind Ⅲ限制酶切位点之间的片段大小为51bp，结合图2可知，4.5SDNA片段大小为81bp，结合图1中重组质粒可以发现，4.5SDNA插入到了质粒上EcoR I和Sal Ⅰ限制酶切位点之间，若酶切产物经过电泳鉴定，出现大小为139bp的条带，说明选择的限制酶是EcoR I和Hind Ⅲ，表明克隆成功。 （3）观察图3，可以发现将4.5SRNA逆转录转座子DNA接入表达载体后，不论正向接入还是反向接入，基因在NS-1和SP2/0细胞中的活性对荧光素酶基因的表达量没有影响，但不同细胞中荧光素酶基因的表达量不同，说明4.5SRNA逆转录转座子对荧光素酶基因表达的影响与正向接入或反向接入无关，但存在种属的特异性。 （4）逆转录转座子可作为基因工程技术中的载体，因为它可以整合进基因组中，能够携带目的基因进入受体细胞。 14．（2025·河北承德·一模）为解决猪肉中多不饱和脂肪酸（PUFAs）含量不足的问题，研究人员获取了控制PUFAs合成的两个必需酶基因fat2和fat1，并构建pCAG-fat1-fat2融合表达质粒（如图所示），该质粒全长15300 bp（碱基对），CMV启动子启动EGFP基因表达绿色荧光蛋白，CAG启动子启动融合基因fatl-fat2的表达，AflⅡ和DraⅢ为两种限制酶的酶切位点。科研人员将构建好的质粒导入猪胎儿成纤维细胞，并最终获得转fatl-fat2融合基因的转基因猪。请回答下列问题：    (1)启动子是 识别和结合的部位，其作用是 。图中的EGFP起到了 的作用，便于重组DNA分子的筛选。 (2)用DraⅢ酶切如图所示质粒时，可断裂 个磷酸二酯键，且酶切产物是 bp和1700 bp两个片段。 (3)科研人员通过 法将构建好的质粒导入猪胎儿成纤维细胞，可通过 等技术检测目的基因是否进入受体细胞，该技术的原理是 。 (4)将含目的基因的猪胎儿成纤维细胞的细胞核移入 中，通过 法使两细胞融合形成重构胚，并用特定方法激活重构胚，使其发育为转基因猪，该技术属于 （填“有性”或“无性”）繁殖技术。 【答案】(1) RNA聚合酶 驱动基因转录出Mrna 标记基因 (2) 4 13600 (3) 显微注射 PCR DNA半保留复制（和热变性） (4) 去核的卵母细胞 电融合 无性 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，其作用是驱动基因转录出mRNA。图中的EGFP基因控制合成绿色荧光蛋白，起到了标记基因的作用，便于重组DNA分子的筛选。 （2）图中的质粒中有2个DraⅢ酶切位点，因此用DraⅢ酶切图示质粒时，可断裂4个磷酸二酯键，且酶切产物是15300-1700=13600 bp和1700 bp两个片段。 （3）科研人员通过显微注射法将构建好的质粒导入猪胎儿成纤维细胞，可通过PCR等技术检测目的基因是否进入受体细胞，PCR技术的原理是DNA半保留复制（和热变性）。 （4）将含目的基因的猪胎儿成纤维细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，通过电融合法使两细胞融合形成重构胚，并用特定方法激活重构胚，使其发育为转基因猪，该技术属于无性繁殖技术，其涉及的技术手段有转基因技术和核移植技术。 15．（2025·河北石家庄·一模）草甘膦是一种广泛使用的除草剂，对大多数植物都具有杀灭作用。为在作物生长期间定向除草，研究人员改变芥菜EPSPS基因特定位点，将其导入芥菜，培育出了抗草甘膦的新品种，操作流程如图。回答下列问题：    (1)过程①为 ，其需要在缓冲液中进行，缓冲液的作用是 ；①与②（PCR）的反应体系相比不同点有 （答出两点即可）。 (2)以cDNA为模板扩增EPSPS基因后一般通过 鉴定产物，并置于 下观察结果。 (3)芥菜EPSPS基因定点突变原理如图2所示，引物2的部分核苷酸序列为5'－GAATAGTCATGCGTTCACTC…－3'，请据此补充引物3的核苷酸序列5'－GTGAACGCATGA …－3'，引物3与反义链相应的核苷酸序列 （填“相同”或“不同”）。    (4)研究人员将突变基因插入T－DNA的绿色荧光蛋白基因上游，如图3。为使两个基因融合表达以确定EPSPS在细胞的位置，需要去除突变基因的 序列。 【答案】(1) 逆转录 维持反应体系的pH稳定，并提供酶所需的离子环境（如Mg²⁺） ①（反转录）需要逆转录酶，而PCR需要耐高温的DNA聚合酶（如Taq酶）；反转录的引物为oligo(dT)或随机引物，而PCR需要特异性引物 (2) 琼脂糖凝胶电泳 紫外灯 (3) CTATTC 不同 (4)编码终止密码子的序列 【分析】1、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取，②基因表达载体的构建，③将目的基因导入受体细胞，④目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）过程①将RNA转化为cDNA，属于逆转录。  缓冲液为酶反应提供适宜环境，包括pH和离子条件，缓冲液的作用是维持反应体系的pH稳定，并提供酶所需的离子环境（如Mg²⁺）。  反转录与PCR的差异主要体现在酶、引物类型及反应温度（如反转录无需高温循环），①（反转录）需要逆转录酶，而PCR需要耐高温的DNA聚合酶（如Taq酶）；反转录的引物为oligo(dT)或随机引物，而PCR需要特异性引物。 （2）PCR产物通常通过琼脂糖凝胶电泳分离，DNA与溴化乙锭（EB）结合后，在紫外灯下显示荧光条带。 （3）根据图示信息可知，引物2和引物3有部分序列是互补的，由此可知引物3需补充序列为5'－CTATTC…－3'，在PCR中，引物需与模板链的3'端互补。若反义链为模板，引物3的序列应与反义链互补（即与正义链相同）。题目中引物3的序列设计为与反义链互补，但是由于是进行基因定点突变，所以引物3与反义链对应区域的核苷酸序列不同。 （4）为使EPSPS突变基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合表达，需去除编码终止密码子的序列，使两个基因共同表达为融合蛋白。题中EPSPS基因是逆转录生成的，没有终止子。 1 / 18 学科网（北京）股份有限公司 $$