大题05 基因工程与细胞工程类（3大热点角度剖析）（大题专练）（江苏专用）2026年高考生物终极冲刺讲练测

大题05 基因工程与细胞工程类 内容导航 【命题解码·定方向】命题趋势+3年高考真题热点角度拆解 【解题建模·通技法】析典例，建模型，技法贯通破类题/变式 【实战刷题·冲高分】精选高考大题+名校模拟题，强化实战能力，得高分 命题·趋势·定位 1.重稳态调节：从种群数量变化、群落演替转向生态系统稳态维持、物质循环与能量流动的动态平衡分析。 2.重情境应用：结合生态农业、生物多样性保护、环境污染治理、碳中和等真实情境，考查解决实际问题能力。 3.重图表分析：以种群增长曲线、能量流动图解、物质循环模式图、种间关系曲线为核心载体，考查信息提取与逻辑推理。 4.重综合关联：与细胞代谢、遗传变异、生命活动调节、环境保护深度融合，突出知识系统性。 5.重实验探究：江苏高考特色，侧重种群密度调查、生态瓶制作、群落丰富度统计等实验设计与误差分析。 热点·角度·拆解 热点角度01 基因工程的工具、操作与应用 2025 江苏卷：限制酶选择、PCR 原理、目的基因检测鉴定 2024 江苏卷：基因表达载体构建、农杆菌转化法、标记基因 2023 江苏卷：转基因安全性、DNA 连接酶、转化方法 热点角度02 植物细胞工程与育种应用 2025 江苏卷：植物组织培养、脱分化 / 再分化、脱毒苗 2024 江苏卷：体细胞杂交、杂种细胞筛选、激素配比 2023 江苏卷：愈伤组织特点、突变体筛选、快速繁殖 热点角度03 动物细胞工程与胚胎工程 2025 江苏卷：动物细胞培养、核移植、单克隆抗体 2024 江苏卷：试管动物、胚胎移植、胚胎分割 2023 江苏卷：细胞融合、克隆动物、胚胎早期培养 热点角度01 基因工程的工具、操作与应用 析典例·建模型 1. （2026·江苏无锡·一模）小麦因M基因存在易被布氏白粉菌感染而患白粉病，导致严重减产。科研人员利用农杆菌转化法，gRNA-Cas9复合体可对DNA的特定序列识别并剪切，因此将gRNA基因和Cas9蛋白基因导入到小麦中，对M基因进行敲除，使其无法表达。其中PAM序列可帮助复合体定位目标DNA序列3'端。相关过程如图1所示。 (1)gRNA中的识别序列与目标DNA的相应序列特异性结合遵循___________原则，Cas9蛋白作用的化学键是___________。 (2)为了不破坏其他正常基因，需要设计gRNA精准识别的靶向序列。科研人员对小麦M基因测序，部分结果如图2所示。若在后续利用限制酶AvaⅡ进行辅助检测，则gRNA上的靶向序列应设计为5'___________3'(写出12个碱基)。 (3)利用图3中的载体1与载体2构建携带gRNA基因和Cas9蛋白基因的最终表达载体，应选择使用的限制酶有___________，最终表达载体还应具备的基本元件有___________(写出两点)。表达载体导入农杆菌后，利用含___________的培养基筛选出阳性菌落。 (4)对转化成功的小麦植株M基因相关序列进行PCR扩增，用限制酶AvaⅡ酶完全酶切并电泳检测。电泳时需要用___________缓冲液来配制琼脂糖凝胶。若检测结果出现1个条带，则该植株为M基因___________(填“敲除”或“未敲除”)的植株。 【解题建模】 第一步：审题定位 第二步：解题思路： 第三步：术语规范答题： 1.不写错字 2.酶的名称要规范必须加斜体或引号，且大小写正确。 答案：(1) 碱基互补配对 磷酸二酯键 (2)AGAUUGGGUCCU (3) SpeI和NheI 复制原点、终止子 潮霉素 (4) 电泳 敲除 研考点·通技法 1.基因工程的基本工具： 2.基因工程的基本步骤： 破类题·提能力 1.（2026·江苏·二模）BCL11A蛋白是一种转录抑制因子，能与γ珠蛋白基因启动子上游的调控序列中特异性结合位点结合，抑制γ珠蛋白基因的表达。为确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置，科研人员利用下列多对引物扩增了γ珠蛋白基因上游7种不同长度的片段，分别将这些片段插入载体中并导入受体细胞，一段时间后进行荧光检测，相关信息如图所示。请回答： (1)PCR扩增γ珠蛋白基因上游不同长度的片段过程中，在缓冲体系除需要加入Mg2+和模板外，还需要添加的主要成分有__________（至少答两点）。PCR每次循环要经历变性、复性（退火）和延伸三步，其中复性的目的是_________。 (2)载体上P的基本组成单位是_________，启动子的作用是__________。构建成功的基因表达载体上荧光蛋白基因和BCL11A基因转录时的模板链______（填“是”或“不是”）在同一条DNA链上。据图可知，为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，切割质粒载体用的限制酶是______________，要在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是_________，在R末端添加的序列所对应的限制酶是____________。 (3)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞后，含F1~F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞均有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞不表达荧光蛋白，无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞不表达荧光蛋白的原因是_____________。 (4)若BCL11A蛋白结合位点位于引物F3与F4在调控序列上所对应序列之间的区段上，若向培养液中添加适量的雌激素，则含__________（选填“F1~F6”）与R扩增产物的受体细胞有荧光。 热点角度02 植物细胞工程与育种应用 析典例·建模型 1．（2025·江苏南通·一模）人参和西洋参是五加科人参属的药用植物，它们含有的人参皂苷具有抗肿瘤等作用。科研人员选用人参和西洋参有性杂交获得的杂种胚细胞以及人参种子胚、西洋参种子胚的愈伤组织进行悬浮细胞培养，建立其单细胞株系并对三者的部分特性进行比较研究，图1是主要流程。请分析回答： (1)过程①的实质是________________，图1所示过程主要利用了________的原理。 (2)优化悬浮细胞培养体系，需进行蔗糖浓度的筛选，培养基中蔗糖浓度不宜过低的原因是__________________________________________，诱导过程⑤产生皂苷而不继续分化的关键是需要控制好培养基中________________的浓度和________。 (3)科研人员研究了三种愈伤组织中的人参皂苷Re、Rg3、Rb1和MRb1含量，结果如图2(Re具有治疗心肌缺血的功能，Rg3具有抗癌作用)。若要获得抗癌作用的药物应优先选择________的愈伤组织。 【解题建模】 第一步：快速审题 第一步：审题定位（抓关键词→定考点） 关键词：愈伤组织、悬浮细胞、脱分化、再分化、植物激素、蔗糖、次生代谢产物 定位：植物组织培养 + 细胞悬浮培养 第二步：解题思路 第三步：规范书写： 答案：(1) 基因的选择性表达 细胞增殖 (2) 蔗糖浓度过低不能提供足够的能源和碳源 生长素和细胞分裂素(植物激素) 比值 (3)人参 研考点·通技法 破类题·提能力 1．（2025·江苏·二模）野生黑芥细胞核具有黑腐病抗性基因，花椰菜细胞质具有高产基因。某研究小组用野生黑芥、花椰菜两种植物细胞进行体细胞杂交，以获得高产抗黑腐病的杂种植株，流程如图1。 回答下列问题： (1)过程①所需的酶有____________。实验中分别用不同植物幼苗的根和叶获取植物原生质体，即用不同颜色的原生质体进行融合，主要目的是____________。 (2)在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使野生黑芥原生质体和花椰菜原生质体的_____________、____________（填细胞结构）失活。 (3)融合后的原生质体经过细胞壁再生，进而脱分化形成愈伤组织。过程③产生的愈伤组织只能来自杂种细胞，下列分析正确的有_______。 A．未融合的野生黑芥或花椰菜原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂 B．同种融合的原生质体因野生黑芥或花椰菜原生质体失活而不能生长、分裂 C．培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂 D．杂种细胞由于结构和功能完整，可以正常生长、分裂 (4)采用特异性引物对花椰菜和野生黑芥的基因组DNA进行PCR扩增，得到两亲本的差异性条带，可用于杂种植株的鉴定。图2是用该引物对双亲及再生植株1～4进行PCR扩增的结果。得到图2实验结果所涉及的生物技术有___________（答两个）。据图2判断，再生植株1～4中一定是杂种植株的有________（多选，选“1”、“2”、“3”或“4”）。 热点角度03 动物细胞工程与胚胎工程 析典例·建模型 1.（2025·江苏盐城·二模·节选）运用乳房生物反应器可以从转基因牛的乳汁中获得t-PA改良蛋白，具体流程如图4。 (5)过程②运用的具体方法为_______；④过程前需取_______（填部位）的细胞进行性别鉴定。若改用膀胱生物反应器在尿液中获得t-PA改良蛋白，在构建基因表达载体时，需要添加______。 【解题建模】 第一步：审题定位：抓关键词→定考点 关键词：乳房生物反应器、膀胱生物反应器、转基因牛、卵母细胞、精子、性别鉴定、基因表达载体 定考点：基因工程 + 胚胎工程 + 动物反应器 第二步：解题思路 第三步：规范书写 答案：显微注射技术 滋养层 膀胱上皮细胞特异性表达基因的启动子 研考点·通技法 1.动物细胞工程： 2.胚胎工程： 破类题·提能力 1.（2025·江苏·一模）烟草具有生长周期短、生长环境要求低、叶片生物量大等优点，是良好的植物生物反应器。FLAG是由8个氨基酸组成的标签短肽，在基因工程中广泛应用，FLAG抗体常用于融合蛋白的分离、纯化。下图1表示科研人员构建瞬时超表达病毒载体感染烟草叶肉细胞，表达FLAG抗体，并纯化和鉴定的相关过程。构建的微型质粒无Vir序列，辅助Ti质粒无T-DNA序列，两者均显著小于野生Ti质粒。①～⑦代表相关过程，请回答下列问题。 LB和RB：T-DNA左右边界；C：病毒复制蛋白基因；T：终止子；HC、LC：抗体重链和轻链编码区；P35S：花椰菜花叶病毒启动子；GFP：绿色荧光蛋白基因：Kanr：卡那霉素抗性基因；Vir：表达产物参与T-DNA的转移 (1)过程①用FLAG注射小鼠，过程②从小鼠脾脏中获取______，与骨髓瘤细胞融合，经筛选获得杂交瘤细胞，再利用______技术获得能产生FLAG抗体的杂交瘤细胞。 (2)构建重组微型质粒时，选择______酶对微型质粒进行酶切，PCR扩增LC基因时，在基因一端不选择添加BamHⅠ识别序列，选择BgIⅡ识别序列，可能原因有______、______。 (3)与将目的基因和Vir序列插入同一质粒导入农杆菌相比，图中将目的基因和Vir序列插入不同质粒导入农杆菌的优点是______。 (4)过程⑤可通过检测______初步判断目的基因是否表达。T-DNA进入烟草叶肉细胞后就能迅速表达出大量FLAG抗体，从重组微型质粒组成分析，主要原因是______。 (5)过程⑦通过蛋白印迹技术分析抗体的亲和力，结果如下图所示（各检测组抗体量相同，抗原带有荧光标记）。结果表明在抗原稀释至______时仍有明显的荧光带，说明通过烟草生产的FLAG抗体具有较高的亲和力。 (6)与原核生物反应器相比，利用烟草生物反应器生产抗体的优点有______。 ①可利用生物膜系统对蛋白质进行加工 ②需要无菌、无毒环境 ③不需要较复杂的培养基 ④抗体易分离提纯 （建议用时：45分钟） 刷真题 1．（2025·江苏·高考真题）川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，为了更好地保护这一物种，研究者开展了以下研究。请回答下列问题： (1)川金丝猴警戒行为具有监测捕食者和同种个体的功能，这说明生物之间的关系有______。川金丝猴的警戒行为依赖于环境中获取的信息，信息类型有______。川金丝猴根据这些信息及时作出反应，一方面可以降低被捕食风险，另一方面为争夺______获得更多机会。 (2)川金丝猴以植食为主，消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化，这些微生物与川金丝猴构成______关系。 (3)研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下。请完成下表： 实验目的 简要操作步骤 释放DNA 在去杂后的样本中加入裂解液 析出DNA 离心后取①______，加入乙醇 ②______ 在沉淀物中加入纯水 扩增DNA 将③______、引物、样本DNA、含有Mg²⁺缓冲 液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR (4)为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbeL基因片段，是因为引物F和R的碱基能与rbcL基因的保守序列的碱基______。用引物F和R对4种植物样本甲~丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序，结果如图所示。若对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析，能检出的样本是______。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序，得到的序列有图中的3种序列，据此可确定川金丝猴摄食的植物有______。若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物，参照叶绿体基因库，还需选用______的保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析。 注：“·”表示与植物甲对应位置上相同的碱基：“……”表示省略200个碱基 (5)依据上述研究，保护川金丝猴可采取的措施有______（填字母）。 a．建立川金丝猴生态廊道，促进种群间基因交流     b．保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物 c．需用标记重捕法定期重捕，以精确监测种群数量     d．主要依赖迁地保护，扩大川金丝猴种群数量 2．（2024·江苏·高考真题）为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列-（GTTCCTGGTGTTGGC）50-限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题： (1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是________。 (2)步骤②转化时，科研人员常用________处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有________的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是________。 (3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与________结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是________（从图2的“A~D”中选填）。 (4)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。 （ⅰ）20℃时，加入NaCl后实验结果是________。 （ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是________。 （ⅲ）据图分析，融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有________。 3.（2023·江苏·高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有______，扩增程序中最主要的不同是______。 (2)有关基因序列如图2，引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用______。 A．ATGGTG------CAACCA B．TGGTTG------CACCAT C．GACGAG------CTGCAG D．CTGCAG------CTCGTC (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有_______。 (4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。 A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落 B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 (5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有______。 (6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是______。 刷模拟 1．（2026·江苏·一模）可编程染色体工程（PCE）是基于迭代Cre-Lox重组系统发展起来的一种前沿基因组编辑技术，能够实现对染色体上大片段DNA的精准操作。科研人员利用该技术对水稻中一段315kb的基因组片段进行倒位操作（该倒位片段命名为inv-315H），成功将OsHIS1基因的启动子与OsRPL27．3基因的启动子互换（图1）。图2为Cre-Lox系统作用原理简图，其中a部分显示LoxP位点序列组成，b、c部分示意Cre酶介导的删除与倒位重组机制。图3为PCE系统在植物中实现大片段DNA倒位的完整工作流程示意图。请回答下列问题： 【相关序列信息】LoxAR2：5′-ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TTTCCGATGTTAT-3′ Lox71：5′-TACCGTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT-3′ (1)据图2分析，LoxP位点的方向由其____________序列决定；当Cre酶持续存在时，其对位于反向平行排列的LoxP位点间的片段所介导的DNA倒置重组反应具有____________性。 (2)PCE系统由经AI辅助工程化改造的高效Cre酶、新型Lox位点（LoxAR2和Lox71）以及一个可编程基因编辑系统共同构成。其中，基因编辑系统负责将新型Lox位点精准插入基因组目标位置。与传统loxP位点相比，LoxAR2和Lox71的改造主要发生在____________区域。结合图3分析，在第2步中，由基因编辑系统在目标区域两端精准插入LoxAR2与Lox71位点，这两个位点的方向____________，这是后续Cre酶催化该片段发生倒位的结构基础。 (3)为验证该315kb片段是否成功倒位，科研人员首先在大量T0代再生植株中，利用针对倒位连接处的特异性引物进行初步PCR筛选，从中选出若干候选阳性植株（编号H1～H16）。进一步提取这些候选植株及野生型（WT）的DNA进行PCR验证，电泳结果如图4所示。根据图4结果，可初步判断____________。为进一步验证该倒位操作是否赋予植株除草剂抗性，科研人员将T0代阳性植株与野生型对照一并移栽至含除草剂硝磺草酮的培养基中，持续培养1～2周后观察生长状况。若观察到____________现象，说明倒位成功赋予水稻硝磺草酮的抗性。硝磺草酮通过抑制HPPD酶的活性来阻断类胡萝卜素的合成，从而使植物死亡，而水稻中的OsHIS1基因能编码一种可以分解硝磺草酮的解毒酶。分析倒位操作使水稻获得抗性的原因：倒位使____________连接，导致OsHIS1基因表达水平显著提高，从而合成了更多的解毒酶；当硝磺草酮存在时，过量合成的解毒酶可以____________，使水稻得以正常生长，表现出抗性。 (4)为探究该倒位性状的遗传稳定性，他们将T0代植株自交获得T1代群体。首先，通过PCR检测inv-315H倒位连接处和野生型OsHIS1位点以鉴定基因型；同时，利用T-DNA特异性引物检测外源转基因元件的残留情况，电泳结果见图5。T1代群体中，具有____________条带的植株为纯合倒位植株，该类型植株在T1代群体中约占____________。图中用三角形标记的植株与用箭头标记植株相比在农业应用中的核心优势是____________。 2．（2026·江苏·一模）基因组测序时需对生物基因组的全部序列进行扩增。我国科学家开发的多次退火环状循环扩增技术（MALBAC）能获得更高覆盖率和保真度的全基因组扩增产物，具体过程如下图所示。请回答下列问题： 注：图中的粗线条均为DNA单链 (1)MALBAC的引物经过特殊设计，由若干通用碱基和随机碱基构成，每种引物的通用碱基序列相同，随机碱基序列有差异。随机碱基序列位于引物的_____端，可以和基因组DNA的_____（填“特定”或“多个”）位点结合。MALBAC设置复性温度为低温（0℃）的目的是______。 (2)相较于PCR使用的TaqDNA聚合酶，MALBAC使用的BstDNA聚合酶在85℃时就失活了，因此扩增过程中需要_____。另外该聚合酶具有链置换活性，遇到模板链与其他单链结合而被阻挡时，会解开阻挡的双链并继续沿模板链合成子链。图中n代表结合到模板链上的引物延伸形成的子链数量，以一段基因组的单链DNA为模板，经过预扩增和一次循环，得到半扩增子_____条，理论上得到的全扩增子数应少于______条。 (3)图中全扩增子能自发环化的原因是_____，环化的全扩增子自动脱离反应的原因是______。 3．（2026·江苏南通·二模）双乙酰是啤酒中的主要风味物质，含量过高会影响啤酒的品质；谷胱甘肽可以提高啤酒的抗老化能力。研究发现，ILV2基因编码合成双乙酰的关键酶，GSH1基因编码合成谷胱甘肽的关键酶。为生产低双乙酰且抗老化的啤酒，科研人员运用基因工程技术制备啤酒酵母工程菌，过程如下图1，其中CUP1基因的表达产物可使细胞对一定浓度的硫酸铜（会破坏膜结构、影响酶活性）产生抗性。请回答下列问题： (1)利用PCR扩增目的基因时，反应体系中需要加入缓冲液及图中相关物质外，还需要______等物质。设计P1的依据是______。 (2)已知P3的序列为5′-TGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCCTTTT-3′，则P2的序列为______。 ①5′-TTGGCTATGTTTTACGATTAGGCAGCGATTCGAC-3′ ②5′-GCCACCGCCTTCCCCCCCACCGCCGTCGCTAAGCTG-3′ ③5′-CGCTGGCGGAACCGGCGGTGGCGGCAGCGATTCGAC-3′ ④5′-GAGGAGCGAAAACCGAGAGAGCTTAGGGCCTACGCTATATATCG-3′ (3)过程②将质粒2导入大肠杆菌的目的是______。 (4)转化后的啤酒酵母应置于含______的培养基中初步筛选。进一步鉴定需要以转化后啤酒酵母的总DNA为模板，优先选用图示引物1（30bp）和______进行PCR扩增，再对产物进行______鉴定。若扩增产物的大小为______，则说明CUP1基因和GSH1基因已整合到啤酒酵母的染色体上。 (5)将啤酒酵母工程菌与未转化的受体菌分别置于麦芽汁培养基中培养，定期取样检测，部分结果如图2。 ①据图2分析，啤酒酵母工程菌生产的啤酒抗老化能力______。 ②请在答题纸指定区域画出工程菌双乙酰含量的变化曲线______并阐述理由______。 4．（2026·江苏镇江·一模）酵母双杂交技术是一种用于检测两种蛋白质间是否存在相互作用的分子生物学技术，其基本原理如图1所示。研究人员拟利用该技术探究水稻SH蛋白与ELC蛋白之间是否存在相互作用，图2所示为分别用于构建重组质粒pAD-SH和pBD-ELC的两种空白质粒。请回答下列问题： (1)构建重组质粒时需要使用PCR技术扩增目的基因，扩增时除加入模板、含Mg2+的缓冲液、引物外，还需添加______（答两点），当温度下降到50℃时，PCR反应体系中发生的反应是______。 (2)为使ELC基因正确插入质粒pBD，利用PCR扩增ELC基因时应在两种引物的______端分别添加______限制酶的识别序列，宜用______（选填“E.coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）将质粒pBD和ELC基因的末端进行连接。 (3)将不同类型的质粒导入自身不能合成色氨酸、亮氨酸、腺嘌呤和组氨酸的营养缺陷型酵母细胞（含有图1所示启动子和报告基因）中，然后分别接种于两种选择培养基上培养，结果如下表所示。请回答： 选择培养基类型导入质粒类型 培养基1（-Trp-Leu） 培养基2（-Trp-Leu-Ade-His） 甲组:pAD和pBD-ELC 乙组:pAD-SH和pBD 丙组:pAD-SH和pBD-ELC 注:“-”表示培养基中缺乏该物质；Trp:色氨酸Leu:亮氨酸Ade:腺嘌呤His:组氨酸； ①三组酵母菌均可在只缺少色氨酸和亮氨酸的培养基上生长，说明______。该实验的报告基因为______合成基因。设置甲和乙实验组目的是______。 ②根据结果分析，SH蛋白与ELC蛋白______（选填“能”或“不能”）相互作用，理由是______。 5．（2026·江苏南通·一模）限制性核酸内切酶BsmBⅠ具有偏移剪切特性，其识别序列及切割位点（位于接头序列两侧）如图1.利用BsmBⅠ实现多DNA片段无缝连接的技术称为Golden Gate克隆，其过程如图2.请回答下列问题。 (1)由图1可知，BsmBⅠ酶切DNA中的________键，产生________（类型）末端。BsmBⅠ一次酶切产生的两个末端________（填“相同”、“不相同”、“可能相同”）。 (2)PCR1~n不宜在同一反应体系中进行，其原因有________、________。过程②需要的酶有________。 (3)片段1和片段2的部分序列如图3所示，已知R1的序列为5’CGTCTCNcgacCAAAT…3’，则F2的序列为________（接头序列用小写字母表示）。R1和F2还有另一种设计方案，请写出该方案中F2的序列________（接头序列用小写字母表示）。 (4)据图1、2分析，GoldenGate克隆技术的优点有________。 a.不受天然酶切位点的限制 b.实现多片段一次性有序连接 c.有利于大片段DNA的高效连接 d.片段1~n之间不会引入外源序列实现无缝连接 6．（2026·江苏徐州·一模）人工合成的mRNA分子等通过脂质体包裹可制备mRNA疫苗。下图是mRNA疫苗进入树突状细胞等细胞中表达，并引发相关的免疫反应的机制图，请回答： (1)MHCI类分子分布在________。制备mRNA疫苗时，常用脂质体包裹mRNA后再接种，目的是________（答出1点即可）。mRNA疫苗常因无法准确递送到抗原呈递细胞而使效果大打折扣，为了解决该问题，设计脂质体时，在脂质体表面连接能与________特异性结合的抗体。 (2)活化细胞1的两个信号分别是________、________。 (3)细胞3参与的特异性免疫是________。与灭活病毒疫苗制备过程相比，mRNA疫苗不需要用到细胞工程中的________技术。 (4)RNA本身也可作为抗原引发机体炎症反应，带来安全性问题。研究者猜测修饰过的RNA疫苗可能会减弱机体炎症反应，研究人员向培养的树突状细胞中加入不同种类的脂质体，一段时间后检测培养液中促炎细胞因子的含量，结果如图：据图判断，研究者的假设________（填“能”或“不能”）成立，判断依据是________。 (5)结合上述研究，与传统的灭活疫苗相比，利用单克隆抗体修饰的脂质体和修饰碱基的mRNA制备的新型疫苗所具有的优势包括________。 7．（2025·江苏徐州·一模）在自然界中，酸性土壤占全球没有冰层覆盖土壤的30%，铝毒是酸性土壤中限制作物生长的主要因素之一。丹波黑大豆（RB）根尖SGF14α基因的表达对提升作物铝耐受性具有一定的作用。欲通过构建SGF14α的植物表达载体，转化烟草产生SGF14α过量表达株系，考察过量表达大豆SGF14α对烟草铝耐受性的影响，完善下列相关操作。 (1)获取RB根尖SGF14α基因:首先根据基因数据库中SGF14α的cDNA编码区序列设计上、下游特异性引物，在设计引物时，应在引物的________端添加特定限制酶的识别序列，其目的是________。 (2)植物表达载体（pK - 35S - SGF14α）的构建和获取:获得SGF14α的cDNA编码区全长DNA片段，再将SGF14α的cDNA编码区连接到克隆pENTR载体上，产生克隆载体pENTR - SGF14α，然后与表达载体pK发生重组反应，构建出植物表达载体（如图所示）。一般将构建的表达载体导入经______处理的大肠杆菌，并在添加大观霉素的LB培养基上培养筛选重组克隆，获得植物表达载体，此处将表达载体先导入大肠杆菌的原因是________。 (3)烟草的转化及转基因烟草的筛选:通过电转化法将植物表达载体pK - 35S - SGF14α转入农杆菌中，在含有的平板上筛选________（填“阳性”或“阴性”）克隆用于野生型（WT）烟草的转化，然后利用转染后的叶片诱导外植体发芽，待芽长大后从外植体上切下转入________（填激素名称）比例较高的生根培养基上诱导根的生长，得到重组烟草植株。提取转基因烟草的总DNA进行PCR扩增并经凝胶电泳鉴定的结果如图所示，图中SGF14α已导入烟草植株的有________。 (4)目的基因的检测与鉴定:利用RT - PCR（反转录 - 聚合酶链式反应）法检测基因的转录水平，在RT - PCR中需要加入________酶。提取转基因植株根细胞内的蛋白质，利用________技术检测基因的表达水平。为了进一步考察转基因的性能，应将野生型烟草和转基因烟草置于铝胁迫的环境中，若________，即表示转基因烟草培育成功。 8．（2025·江苏徐州·二模）如图为利用ES细胞打靶技术建立基因修饰小鼠模型的主要过程，其中核心技术是在小鼠胚胎干细胞（ES细胞）中进行DNA同源重组。请回答下列问题∶ 注∶为新霉素抗性基因，可以使具有该基因的细胞在含有G418（新霉素的类似物）的培养基上生长；为疱疹病毒胸苷激酶基因，其基因产物可使GANC转变成一种有毒物质使细胞死亡 (1)基因打靶载体构建过程中需要用到的工具酶有_______。为防止外源基因环化及外源基因与载体反向连接，采取的措施一般是用两种限制酶切割_______、_______。 (2)ES细胞作为受体细胞的原因是ES细胞具有_______，将中靶载体转入受体ES细胞常用的方法是_______。 (3)在进行药物筛选时，培养基中加入G418和GANC的作用分别是_______，原因分别是_______。 (4)胚胎移植前要对受体母鼠进行_______处理，若要快速繁育此种小鼠，可采用_______技术，在此技术操作时，主要将_______均等分割。 9．（2024·江苏南通·三模）非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒（ASFV）感染引起的一种传染病。下图表示研究人员扩增ASFV的CP530R 和 F317L基因，并导入含病毒载体1和pSC101质粒的大肠杆菌，在细胞内实现同源重组并制备重组病毒疫苗的主要过程。pSC101是一种低拷贝数的温度敏感质粒（在30℃下能复制、在37℃下不能复制），recET基因和ccdA 基因的启动子分别受鼠李糖和阿拉伯糖诱导。请回答下列问题。 (1)引物F的设计依据是____。过程①的程序为：98℃2min；98℃10s，55℃5s，72℃30s，35个循环；72℃3min。最后72℃3min的目的是____。 (2)ccdB基因编码的毒性蛋白CcdB抑制DNA促旋酶，导致细胞死亡。ccdA基因编码的蛋白CcdA 可保护细胞免受CcdB毒害。将大肠杆菌先接种在含____的培养基中，在____℃下培养一段时间，加入目的基因并电激；一段时间后将大肠杆菌接种在含____的培养基中，在____℃下继续培养，获得含病毒载体2的大肠杆菌。 (3)据重组原理可知重组蛋白 RecT 的功能有____，重组过程涉及____键的水解和形成。 (4)转化后的 Vero细胞，在37℃、含____（气体条件）的培养箱中培养48h，收获细胞及上清液，利用____技术鉴定重组病毒表面的蛋白。与灭活疫苗相比，重组病毒疫苗的优势是____。 10．（2025·江苏·二模）I型糖尿病(T1D)是一种以胰岛B细胞进行性损伤、胰岛素分泌不足为主要表现的自身免疫病。T1D患者体内仍存留部分具有再生能力的胰岛B细胞，研究促进其再生的机制，对减少并发症的发生具有重要意义。 (1)T1D患者胰岛B细胞向________细胞呈递抗原，同时________细胞分泌________促进该细胞增殖分化，进而攻击胰岛B细胞；此外，T1D患者________细胞直接识别胰岛B细胞表面抗原，该细胞接受辅助性T细胞直接接触和细胞因子等刺激，增殖分化后分泌______，这些免疫细胞和免疫活性物质共同作用使胰岛B细胞损伤。 (2)CD20是人体B淋巴细胞的特异性膜蛋白之一。为制备抗CD20的单克隆抗体，研究者向小鼠多次注射________获取B淋巴细胞，诱导其与骨髓瘤细胞融合，将筛选出的杂交瘤细胞用________(填器材)进行克隆化培养和抗体检测。最终将筛选的细胞进行体内培养，从小鼠腹水中提取抗CD20单克隆抗体。 (3)IL-10是一种免疫抑制因子。为评估IL-10与抗CD20单抗联合治疗自身免疫病的效果，设置4组I型糖尿病小鼠，进行相关治疗，实验结果如图1。 据图1可得出结论：________；据图2分析，出现图1结果的原因是_______。 (4)为进一步研究抗CD20单抗+IL-10联合治疗对糖尿病鼠胰岛B细胞功能的影响，研究者还需检测四组糖尿病鼠________等指标。 4 / 20 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $ 大题05 基因工程与细胞工程类 内容导航 【命题解码·定方向】命题趋势+3年高考真题热点角度拆解 【解题建模·通技法】析典例，建模型，技法贯通破类题/变式 【实战刷题·冲高分】精选高考大题+名校模拟题，强化实战能力，得高分 命题·趋势·定位 1.重稳态调节：从种群数量变化、群落演替转向生态系统稳态维持、物质循环与能量流动的动态平衡分析。 2.重情境应用：结合生态农业、生物多样性保护、环境污染治理、碳中和等真实情境，考查解决实际问题能力。 3.重图表分析：以种群增长曲线、能量流动图解、物质循环模式图、种间关系曲线为核心载体，考查信息提取与逻辑推理。 4.重综合关联：与细胞代谢、遗传变异、生命活动调节、环境保护深度融合，突出知识系统性。 5.重实验探究：江苏高考特色，侧重种群密度调查、生态瓶制作、群落丰富度统计等实验设计与误差分析。 热点·角度·拆解 热点角度01 基因工程的工具、操作与应用 2025 江苏卷：限制酶选择、PCR 原理、目的基因检测鉴定 2024 江苏卷：基因表达载体构建、农杆菌转化法、标记基因 2023 江苏卷：转基因安全性、DNA 连接酶、转化方法 热点角度02 植物细胞工程与育种应用 2025 江苏卷：植物组织培养、脱分化 / 再分化、脱毒苗 2024 江苏卷：体细胞杂交、杂种细胞筛选、激素配比 2023 江苏卷：愈伤组织特点、突变体筛选、快速繁殖 热点角度03 动物细胞工程与胚胎工程 2025 江苏卷：动物细胞培养、核移植、单克隆抗体 2024 江苏卷：试管动物、胚胎移植、胚胎分割 2023 江苏卷：细胞融合、克隆动物、胚胎早期培养 热点角度01 基因工程的工具、操作与应用 析典例·建模型 1. （2026·江苏无锡·一模）小麦因M基因存在易被布氏白粉菌感染而患白粉病，导致严重减产。科研人员利用农杆菌转化法，gRNA-Cas9复合体可对DNA的特定序列识别并剪切，因此将gRNA基因和Cas9蛋白基因导入到小麦中，对M基因进行敲除，使其无法表达。其中PAM序列可帮助复合体定位目标DNA序列3'端。相关过程如图1所示。 (1)gRNA中的识别序列与目标DNA的相应序列特异性结合遵循___________原则，Cas9蛋白作用的化学键是___________。 (2)为了不破坏其他正常基因，需要设计gRNA精准识别的靶向序列。科研人员对小麦M基因测序，部分结果如图2所示。若在后续利用限制酶AvaⅡ进行辅助检测，则gRNA上的靶向序列应设计为5'___________3'(写出12个碱基)。 (3)利用图3中的载体1与载体2构建携带gRNA基因和Cas9蛋白基因的最终表达载体，应选择使用的限制酶有___________，最终表达载体还应具备的基本元件有___________(写出两点)。表达载体导入农杆菌后，利用含___________的培养基筛选出阳性菌落。 (4)对转化成功的小麦植株M基因相关序列进行PCR扩增，用限制酶AvaⅡ酶完全酶切并电泳检测。电泳时需要用___________缓冲液来配制琼脂糖凝胶。若检测结果出现1个条带，则该植株为M基因___________(填“敲除”或“未敲除”)的植株。 【解题建模】 第一步：审题定位 第二步：解题思路： 第三步：术语规范答题： 1.不写错字 2.酶的名称要规范必须加斜体或引号，且大小写正确。 答案：(1) 碱基互补配对 磷酸二酯键 (2)AGAUUGGGUCCU (3) SpeI和NheI 复制原点、终止子 潮霉素 (4) 电泳 敲除 研考点·通技法 1.基因工程的基本工具： 2.基因工程的基本步骤： 破类题·提能力 1.（2026·江苏·二模）BCL11A蛋白是一种转录抑制因子，能与γ珠蛋白基因启动子上游的调控序列中特异性结合位点结合，抑制γ珠蛋白基因的表达。为确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置，科研人员利用下列多对引物扩增了γ珠蛋白基因上游7种不同长度的片段，分别将这些片段插入载体中并导入受体细胞，一段时间后进行荧光检测，相关信息如图所示。请回答： (1)PCR扩增γ珠蛋白基因上游不同长度的片段过程中，在缓冲体系除需要加入Mg2+和模板外，还需要添加的主要成分有__________（至少答两点）。PCR每次循环要经历变性、复性（退火）和延伸三步，其中复性的目的是_________。 (2)载体上P的基本组成单位是_________，启动子的作用是__________。构建成功的基因表达载体上荧光蛋白基因和BCL11A基因转录时的模板链______（填“是”或“不是”）在同一条DNA链上。据图可知，为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，切割质粒载体用的限制酶是______________，要在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是_________，在R末端添加的序列所对应的限制酶是____________。 (3)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞后，含F1~F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞均有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞不表达荧光蛋白，无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞不表达荧光蛋白的原因是_____________。 (4)若BCL11A蛋白结合位点位于引物F3与F4在调控序列上所对应序列之间的区段上，若向培养液中添加适量的雌激素，则含__________（选填“F1~F6”）与R扩增产物的受体细胞有荧光。 【答案】(1) dNTP、TaqDNA聚合酶、（不同的）引物对 使两种引物分别与两条单链DNA结合 (2) （4种）脱氧核苷酸 RNA聚合酶识别和结合部位，驱动基因转录 不是 MunⅠ和XhoⅠ SalⅠ EcoRⅠ (3)F7与R扩增产物不含启动子（调控序列），荧光蛋白基因不表达 (4)F4、F5、F6 【详解】（1）PCR扩增γ珠蛋白基因上游不同长度的片段过程中，在缓冲体系除需要加入Mg2+和模板外，还需要添加的主要成分有dNTP、TaqDNA聚合酶、引物。。PCR每次循环要经历变性、复性（退火）和延伸三步，其中复性的目的是使两种引物分别与两条单链DNA结合。 （2）载体上P启动子，是一段DNA，DNA的基本单位是脱氧核苷酸，启动子的作用是RNA聚合酶识别和结合部位，驱动基因转录；模板链作为转录的模板，从启动子到终止子的方向进行转录，表达载体上荧光蛋白基因和BCL11A基因启动子到终止子的方向相反， 因此转录时的模板链不在同一条链上；为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是SalⅠ，与载体上Xho I酶切后的黏性末端相同，在R末端添加的序列所对应的限制酶是EcoRⅠ，与载体上Mun Ⅰ 切割后的黏性末端一样，载体上不能用EcoRⅠ进行切割，会破坏荧光蛋白基因，对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 切割，对扩增后的产物用限制酶EcoR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 进行切割，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体，且保证目的基因接入载体时启动子和终止子的方向与荧光蛋白基因的启动子和终止子的方向相同。 （3）含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达。 （4）若BCL11A蛋白结合位点位于引物F3与F4在调控序列上所对应序列之间的区段上，F4-R、F5-R、F6-R扩增出来的片段中都不包含BCL11A蛋白结合位点，不会抑制荧光蛋白基因的表达，都会发荧光。 热点角度02 植物细胞工程与育种应用 析典例·建模型 1．（2025·江苏南通·一模）人参和西洋参是五加科人参属的药用植物，它们含有的人参皂苷具有抗肿瘤等作用。科研人员选用人参和西洋参有性杂交获得的杂种胚细胞以及人参种子胚、西洋参种子胚的愈伤组织进行悬浮细胞培养，建立其单细胞株系并对三者的部分特性进行比较研究，图1是主要流程。请分析回答： (1)过程①的实质是________________，图1所示过程主要利用了________的原理。 (2)优化悬浮细胞培养体系，需进行蔗糖浓度的筛选，培养基中蔗糖浓度不宜过低的原因是__________________________________________，诱导过程⑤产生皂苷而不继续分化的关键是需要控制好培养基中________________的浓度和________。 (3)科研人员研究了三种愈伤组织中的人参皂苷Re、Rg3、Rb1和MRb1含量，结果如图2(Re具有治疗心肌缺血的功能，Rg3具有抗癌作用)。若要获得抗癌作用的药物应优先选择________的愈伤组织。 【解题建模】 第一步：快速审题 第一步：审题定位（抓关键词→定考点） 关键词：愈伤组织、悬浮细胞、脱分化、再分化、植物激素、蔗糖、次生代谢产物 定位：植物组织培养 + 细胞悬浮培养 第二步：解题思路 第三步：规范书写： 答案：(1) 基因的选择性表达 细胞增殖 (2) 蔗糖浓度过低不能提供足够的能源和碳源 生长素和细胞分裂素(植物激素) 比值 (3)人参 研考点·通技法 破类题·提能力 1．（2025·江苏·二模）野生黑芥细胞核具有黑腐病抗性基因，花椰菜细胞质具有高产基因。某研究小组用野生黑芥、花椰菜两种植物细胞进行体细胞杂交，以获得高产抗黑腐病的杂种植株，流程如图1。 回答下列问题： (1)过程①所需的酶有____________。实验中分别用不同植物幼苗的根和叶获取植物原生质体，即用不同颜色的原生质体进行融合，主要目的是____________。 (2)在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使野生黑芥原生质体和花椰菜原生质体的_____________、____________（填细胞结构）失活。 (3)融合后的原生质体经过细胞壁再生，进而脱分化形成愈伤组织。过程③产生的愈伤组织只能来自杂种细胞，下列分析正确的有_______。 A．未融合的野生黑芥或花椰菜原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂 B．同种融合的原生质体因野生黑芥或花椰菜原生质体失活而不能生长、分裂 C．培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂 D．杂种细胞由于结构和功能完整，可以正常生长、分裂 (4)采用特异性引物对花椰菜和野生黑芥的基因组DNA进行PCR扩增，得到两亲本的差异性条带，可用于杂种植株的鉴定。图2是用该引物对双亲及再生植株1～4进行PCR扩增的结果。得到图2实验结果所涉及的生物技术有___________（答两个）。据图2判断，再生植株1～4中一定是杂种植株的有________（多选，选“1”、“2”、“3”或“4”）。 【答案】(1) 纤维素酶、果胶酶 便于观察细胞融合的状况（或以叶绿体颜色等差异为标志可识别杂种细胞） (2) 细胞质 细胞核 (3)ABD (4) DNA的提取（纯化）、PCR扩增、凝胶电泳 1、2、3、4 【分析】分析图1可知，过程①表示原生质体的制备，要用纤维素酶和果胶酶去掉植物细胞的细胞壁，过程②表示诱导原生质体融合，体现了生物膜“具有一定的流动性”的结构特点。将杂种细胞培养成杂种植株的过程是借助植物组织培养技术实现的。 【详解】（1）过程①表示去除细胞壁获得原生质体。植物细胞壁的主要成分为纤维素和果胶，在获取植物细胞的原生质体时，常采用纤维素酶和果胶酶处理。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，以叶绿体颜色等差异为标志可识别杂种细胞。 （2）由题意可知，野生黑芥细胞核具有黑腐病抗性基因，花椰菜细胞质具有高产基因，为获得高产抗黑腐病的杂种植株，在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使野生黑芥原生质体的细胞质和花椰菜原生质体的细胞核失活，使融合后的杂种植株具有野生黑芥的细胞核基因和花椰菜的细胞质基因。 （3）A、未融合的野生黑芥或花椰菜原生质体经处理后，因为细胞质或细胞核的失活，无法正常生长、分裂，A正确； B、同种融合的原生质体因野生黑芥原生质体细胞质或花椰菜原生质体细胞核失活而不能生长、分裂，B正确； C、诱导原生质体融合的化学法包括聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+—高pH融合法等，由图可知：培养基含有诱导原生质体融合的物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂，C错误； D、杂种细胞由于结构和功能完整，可以正常生长、分裂，D正确。 故选ABD。 （4）若要得到图2实验结果，首先需要提取纯化两亲本及再生植株的总DNA，其次采用特异性引物对花椰菜、野生黑芥及再生植株的基因组DNA进行PCR扩增，最后将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析。由图2显示的实验结果可知，再生植株1、2、3、4同时含有野生黑芥和花椰菜的基因组，是杂种植株。 热点角度03 动物细胞工程与胚胎工程 析典例·建模型 1.（2025·江苏盐城·二模·节选）运用乳房生物反应器可以从转基因牛的乳汁中获得t-PA改良蛋白，具体流程如图4。 (5)过程②运用的具体方法为_______；④过程前需取_______（填部位）的细胞进行性别鉴定。若改用膀胱生物反应器在尿液中获得t-PA改良蛋白，在构建基因表达载体时，需要添加______。 【解题建模】 第一步：审题定位：抓关键词→定考点 关键词：乳房生物反应器、膀胱生物反应器、转基因牛、卵母细胞、精子、性别鉴定、基因表达载体 定考点：基因工程 + 胚胎工程 + 动物反应器 第二步：解题思路 第三步：规范书写 答案：显微注射技术 滋养层 膀胱上皮细胞特异性表达基因的启动子 研考点·通技法 1.动物细胞工程： 2.胚胎工程： 破类题·提能力 1.（2025·江苏·一模）烟草具有生长周期短、生长环境要求低、叶片生物量大等优点，是良好的植物生物反应器。FLAG是由8个氨基酸组成的标签短肽，在基因工程中广泛应用，FLAG抗体常用于融合蛋白的分离、纯化。下图1表示科研人员构建瞬时超表达病毒载体感染烟草叶肉细胞，表达FLAG抗体，并纯化和鉴定的相关过程。构建的微型质粒无Vir序列，辅助Ti质粒无T-DNA序列，两者均显著小于野生Ti质粒。①～⑦代表相关过程，请回答下列问题。 LB和RB：T-DNA左右边界；C：病毒复制蛋白基因；T：终止子；HC、LC：抗体重链和轻链编码区；P35S：花椰菜花叶病毒启动子；GFP：绿色荧光蛋白基因：Kanr：卡那霉素抗性基因；Vir：表达产物参与T-DNA的转移 (1)过程①用FLAG注射小鼠，过程②从小鼠脾脏中获取______，与骨髓瘤细胞融合，经筛选获得杂交瘤细胞，再利用______技术获得能产生FLAG抗体的杂交瘤细胞。 (2)构建重组微型质粒时，选择______酶对微型质粒进行酶切，PCR扩增LC基因时，在基因一端不选择添加BamHⅠ识别序列，选择BgIⅡ识别序列，可能原因有______、______。 (3)与将目的基因和Vir序列插入同一质粒导入农杆菌相比，图中将目的基因和Vir序列插入不同质粒导入农杆菌的优点是______。 (4)过程⑤可通过检测______初步判断目的基因是否表达。T-DNA进入烟草叶肉细胞后就能迅速表达出大量FLAG抗体，从重组微型质粒组成分析，主要原因是______。 (5)过程⑦通过蛋白印迹技术分析抗体的亲和力，结果如下图所示（各检测组抗体量相同，抗原带有荧光标记）。结果表明在抗原稀释至______时仍有明显的荧光带，说明通过烟草生产的FLAG抗体具有较高的亲和力。 (6)与原核生物反应器相比，利用烟草生物反应器生产抗体的优点有______。 ①可利用生物膜系统对蛋白质进行加工 ②需要无菌、无毒环境 ③不需要较复杂的培养基 ④抗体易分离提纯 【答案】(1) 已免疫的B淋巴细胞 克隆化培养和抗原-抗体杂交 (2) XhoⅠ和BamHⅠ LC基因中有BamHⅠ识别序列 BglⅡ和BamHⅠ是同尾酶 (3)质粒更小，转化成功率更高（或可导入较大的目的基因） (4) 叶片是否具有绿色荧光 T-DNA中的C给基因可使T-DNA快速复制，P35S能使目的基因高效表达 (5)1ng.ml-1 (6)①③ 【详解】（1）在FLAG单克隆抗体过程中，首先需要用FLAG作为抗原刺激小鼠，以获得能产生FLAG抗体的已免疫的B淋巴细胞，经筛选获得杂交瘤细胞后，这些杂交瘤细胞种类较多，需要从中选出只能产生FLAG抗体的杂交瘤细胞，需要利用细胞的克隆化培养和抗原-抗体杂交技术筛选出既能产生FLAG抗体、又能大量增殖的杂交瘤细胞。 （2）由图可知，微型质粒上有XhoⅠ、BamHⅠ、BglⅡ三种限制酶的识别序列，其中BglⅡ位于终止子之后，因此只能选择位于启动子与终止子之间的XhoⅠ、BamHⅠ；分析题图可知，构建重组微型质粒过程中，PCR扩增LC基因后，将LC作为目的基因与微型质粒相连，通过酶切后要求目的基因和微型质粒上有相同的黏性末端，因此不选择添加BamHⅠ识别序列，选择BglⅡ识别序列，可能原因是LC基因上已有BamHⅠ识别序列，但位于基因编码区，使用酶BamHⅠ会破坏LC基因，BglⅡ与BamHⅠ是同尾酶，可使目的基因与微型质粒产生相同的黏性末端。 （3）根据题意，微型质粒较小，且微型质粒的T-DNA转移是需要Vir表达产物参与，因此二者插入不同质粒导入农杆菌，既能使质粒更小，转化成功率更高，也可携带更大的目的基因，同时也可使农杆菌中表达Vir表达产物，不影响T-DNA的转移。 （4）根据题图可知，含有目的基因的重组微型质粒的启动子与终止子之间有目的基因和GFP，若该对启动子与终止子正常发挥功能，则目的基因和GFP均可转录出产物甚至可能同时翻译出相关蛋白质，因此可用GFP基因表达产物绿色荧光蛋白初步判断目的基因是否表达，即检测叶片是否具有绿色荧光；因重组微型质粒上含有C（病毒复制蛋白基因），该基因可使重组微型质粒快速复制，同时重组微型质粒上还含有P35S，作为病毒的启动子，其启动转录的作用很强，因此T-DNA进入烟草叶肉细胞后就能迅速复制且表达出大量FLAG抗体。 （5）由图可知，在实验所给的浓度范围内，有明显荧光带的抗原最低浓度为1ng.ml-1。 （6）原核生物细胞中只有核糖体一中细胞器，抗体作为分泌蛋白，需要内质网、高尔基体的加工才具备生物活性，利用烟草生物反应器生产抗体，可利用细胞中的内质网和高尔基体等细胞器对蛋白质进行加工，这两类细胞器均为膜性细胞器，属于生物膜系统的一部分，即可利用生物膜系统对蛋白质进行加工；原核生物通常为单细胞生物，需要配置培养基进行培养，而烟草作为生产者，种植之后可利用土壤、空气等自然环境中的物质，无需配置较复杂的培养基。 （建议用时：45分钟） 刷真题 1．（2025·江苏·高考真题）川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，为了更好地保护这一物种，研究者开展了以下研究。请回答下列问题： (1)川金丝猴警戒行为具有监测捕食者和同种个体的功能，这说明生物之间的关系有______。川金丝猴的警戒行为依赖于环境中获取的信息，信息类型有______。川金丝猴根据这些信息及时作出反应，一方面可以降低被捕食风险，另一方面为争夺______获得更多机会。 (2)川金丝猴以植食为主，消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化，这些微生物与川金丝猴构成______关系。 (3)研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下。请完成下表： 实验目的 简要操作步骤 释放DNA 在去杂后的样本中加入裂解液 析出DNA 离心后取①______，加入乙醇 ②______ 在沉淀物中加入纯水 扩增DNA 将③______、引物、样本DNA、含有Mg²⁺缓冲 液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR (4)为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbeL基因片段，是因为引物F和R的碱基能与rbcL基因的保守序列的碱基______。用引物F和R对4种植物样本甲~丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序，结果如图所示。若对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析，能检出的样本是______。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序，得到的序列有图中的3种序列，据此可确定川金丝猴摄食的植物有______。若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物，参照叶绿体基因库，还需选用______的保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析。 注：“·”表示与植物甲对应位置上相同的碱基：“……”表示省略200个碱基 (5)依据上述研究，保护川金丝猴可采取的措施有______（填字母）。 a．建立川金丝猴生态廊道，促进种群间基因交流     b．保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物 c．需用标记重捕法定期重捕，以精确监测种群数量     d．主要依赖迁地保护，扩大川金丝猴种群数量 【答案】(1) 捕食和种内竞争 物理信息、化学信息、行为信息 食物和空间、配偶等 (2)互利共生 (3) 上清液 溶解DNA 4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶 (4) 互补配对 丁 丙丁 叶绿体基因组其他DNA 片段 (5)ab 【详解】（1）捕食者与川金丝猴是捕食关系，川金丝猴和同种个体之间是种内竞争关系。生态系统中信息的种类有物理信息、化学信息和行为信息。川金丝猴根据这些信息及时作出反应，一方面可以降低被捕食风险，另一方面为争夺食物和空间等资源获得更多机会。 （2）川金丝猴以植食为主，消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化，这些微生物从川金丝猴胃内获取营养物质，又能为川金丝猴分解纤维素，两者构成互利共生关系。 （3）研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下：释放DNA：在去杂后的样本中加入裂解液，细胞裂解，内容物释放，→析出DNA：DNA呈溶解状态，离心后取①上清液，再加入乙醇，DNA不溶于酒精→故在沉淀物中加入纯水，②再次溶解DNA→扩增DNA：PCR扩增DNA，需要将③4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、引物、样本DNA、含有Mg²⁺缓冲 液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR。 （4）为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbeL基因片段，是因为引物F和R的碱基能与rbeL基因的保守序列的碱基互补配对，从而在耐高温的DNA聚合酶的作用下延伸子链。用引物F和R对4种植物样本甲~丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序，结果如图所示，可知植物甲、乙、丙的条带一样长，植物丁的短。对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析，只能区分不同长度的DNA片段，故能检出的样本是丁。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序，得到的序列有图中的3种，说明摄食的植物有三种，甲和乙的序列相同，不能确定，故据此可确定川金丝猴摄食的植物有丙和丁。选用叶绿体的其他基因的保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析，能更准确地鉴定出川金丝猴摄食的植物。 （5） a、建立川金丝猴生态廊道，促进种群间基因交流，能够保护川金丝猴遗传多样性和物种多样性，a正确； b、保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物，能够保护川金丝猴，b正确； c、川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，不能用标记重捕法定期重捕，c错误； d、保护川金丝猴主要依赖就地保护，d错误。 故选ab。 2．（2024·江苏·高考真题）为了高效纯化超氧化物歧化酶（SOD），科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50，以融合表达SOD-ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列-（GTTCCTGGTGTTGGC）50-限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题： (1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是________。 (2)步骤②转化时，科研人员常用________处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有________的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是________。 (3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与________结合，驱动转录，翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是________（从图2的“A~D”中选填）。 (4)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。 （ⅰ）20℃时，加入NaCl后实验结果是________。 （ⅱ）100℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是________。 （ⅲ）据图分析，融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有________。 【答案】(1)EcoR I、Hind Ⅲ (2) CaCl2 卡那霉素 S-F和P-R (3) 启动子 C (4) SOD-ELP50组纯化蛋白数量更多 高温使蛋白变性 低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持 【详解】（1）目的基因应插入启动子和终止子之间，结合题意可知，ELP50应插入pET-SOD之后，由图可知，限制酶a和限制酶b分别是EcoR I、Hind Ⅲ。 （2）将目的基因导入细菌时常用CaCl2处理细菌，使其处于容易吸收外来DNA分子的状态。由图可知，重组DNA含有标记基因卡那霉素抗性基因，所以转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。成功导入pET-SOD-ELP50同时含有pET-SOD和ELP50，结合图示可知，引物S-F和P-R对应序列包含SOD和ELP50的相应序列，可特异性对pET-SOD-ELP50进行扩增。由于ELP50中含有重复序列，使用S-F和E-R对导入普通质粒和重组质粒的大肠杆菌进行PCR扩增，得到的产物可能无法区分。 （3）RNA聚合酶与启动子结合后，启动转录。由图可知，决定SOD-ELP50融合蛋白的基因长度为462+750=1212bp，编码1212÷3=404个氨基酸，已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa，融合蛋白的相对分子质量约为404×0.11kDa=44.44kDa，电泳后应该为条带C。 （4）（ⅰ）由图可知，20℃时，较不加NaCl，加入NaCl后纯化蛋白数量更多。 （ⅱ）100℃时，温度过高，导致蛋白质变性而沉淀。 （ⅲ）20℃，加入NaCl时，较SOD，SOD-ELP50组沉淀中蛋白质相对含量较高，说明低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持。 3.（2023·江苏·高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题： (1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有______，扩增程序中最主要的不同是______。 (2)有关基因序列如图2，引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用______。 A．ATGGTG------CAACCA B．TGGTTG------CACCAT C．GACGAG------CTGCAG D．CTGCAG------CTCGTC (3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有_______。 (4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。 A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落 B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高 C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落 D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化 (5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有______。 (6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是______。 【答案】(1) 模板（片段F1、片段F2）、引物 退火温度 (2)CD (3)限制性内切核酸酶（限制酶）和DNA连接酶 (4)ABC (5)P3、P4 (6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列 【详解】（1）PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时， 配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。不同的PCR反应体系中，模板和引物是不同的：扩增 程序中依据不同引物设置不同的退火温度是最重要的环节，恰当地选择退火温度，尽量避免引物与 模板的非特异性结合，以保证目的产物的有效扩增。而对于延伸时间而言，以常用的Taq DNA聚 133 合酶为例，催化DNA延伸的速度为1000~2000 bp/min，通常在实验室中可根据目的片段大小在 30s~2min的时长内大致设置延伸时间，一般不需要精确控制。 （2）由图1可知，引物F2-F用于扩增F2片段，引物F1-R用于扩增F1片段，C选项中5'-GACGAG-3'能与AnBI中左侧部分碱基进行碱基互补配对，因此引物F2-F选用C。D选项中5'-CTGCAG-3'能与EGFP中的右侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物F1-R选用D。 （3）传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，由于PCR产物片段和线性质粒载体具有同源序列，可通过重组酶形成环化质粒。不需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）和DNA连接酶。 （4）A、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，用稀释涂布平板法筛选时，菌落数可能低于30，A错误； B、培养基冷却后才能接种，抗性平板上未长出菌落，一般不是培养基温度太高所致，B错误； C、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误； D、稀释涂布平板和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D正确。 故选ABC。 （5）EGFP为720bp，AnBI为390bp，二者的总大小为720bp+390bp=1110bp，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。 （6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。 刷模拟 1．（2026·江苏·一模）可编程染色体工程（PCE）是基于迭代Cre-Lox重组系统发展起来的一种前沿基因组编辑技术，能够实现对染色体上大片段DNA的精准操作。科研人员利用该技术对水稻中一段315kb的基因组片段进行倒位操作（该倒位片段命名为inv-315H），成功将OsHIS1基因的启动子与OsRPL27．3基因的启动子互换（图1）。图2为Cre-Lox系统作用原理简图，其中a部分显示LoxP位点序列组成，b、c部分示意Cre酶介导的删除与倒位重组机制。图3为PCE系统在植物中实现大片段DNA倒位的完整工作流程示意图。请回答下列问题： 【相关序列信息】LoxAR2：5′-ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TTTCCGATGTTAT-3′ Lox71：5′-TACCGTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT-3′ (1)据图2分析，LoxP位点的方向由其____________序列决定；当Cre酶持续存在时，其对位于反向平行排列的LoxP位点间的片段所介导的DNA倒置重组反应具有____________性。 (2)PCE系统由经AI辅助工程化改造的高效Cre酶、新型Lox位点（LoxAR2和Lox71）以及一个可编程基因编辑系统共同构成。其中，基因编辑系统负责将新型Lox位点精准插入基因组目标位置。与传统loxP位点相比，LoxAR2和Lox71的改造主要发生在____________区域。结合图3分析，在第2步中，由基因编辑系统在目标区域两端精准插入LoxAR2与Lox71位点，这两个位点的方向____________，这是后续Cre酶催化该片段发生倒位的结构基础。 (3)为验证该315kb片段是否成功倒位，科研人员首先在大量T0代再生植株中，利用针对倒位连接处的特异性引物进行初步PCR筛选，从中选出若干候选阳性植株（编号H1～H16）。进一步提取这些候选植株及野生型（WT）的DNA进行PCR验证，电泳结果如图4所示。根据图4结果，可初步判断____________。为进一步验证该倒位操作是否赋予植株除草剂抗性，科研人员将T0代阳性植株与野生型对照一并移栽至含除草剂硝磺草酮的培养基中，持续培养1～2周后观察生长状况。若观察到____________现象，说明倒位成功赋予水稻硝磺草酮的抗性。硝磺草酮通过抑制HPPD酶的活性来阻断类胡萝卜素的合成，从而使植物死亡，而水稻中的OsHIS1基因能编码一种可以分解硝磺草酮的解毒酶。分析倒位操作使水稻获得抗性的原因：倒位使____________连接，导致OsHIS1基因表达水平显著提高，从而合成了更多的解毒酶；当硝磺草酮存在时，过量合成的解毒酶可以____________，使水稻得以正常生长，表现出抗性。 (4)为探究该倒位性状的遗传稳定性，他们将T0代植株自交获得T1代群体。首先，通过PCR检测inv-315H倒位连接处和野生型OsHIS1位点以鉴定基因型；同时，利用T-DNA特异性引物检测外源转基因元件的残留情况，电泳结果见图5。T1代群体中，具有____________条带的植株为纯合倒位植株，该类型植株在T1代群体中约占____________。图中用三角形标记的植株与用箭头标记植株相比在农业应用中的核心优势是____________。 【答案】(1) 间隔 可逆（双向） (2) 反向重复序列 相反 (3) 植株均成功实现了倒位（均为阳性植株） 阳性植株正常生长，野生型植株生长受抑制或死亡 OsHIS1基因与OsRPL27.3基因启动子 高效分解硝磺草酮，保护HPPD酶的活性，从而保障类胡萝卜素的合成 (4) inv-315H倒位连接处条带且无野生型OsHIS1位点条带 1/4 不含外源转基因成分（T-DNA），避免了转基因生物安全风险，有利于推广应用 【详解】（1）由题意得知，Cre酶特异性识别LoxP序列，并在图中所示位置进行切割，结合图示可知，LoxP具有方向性主要由图2中a部分标出的间隔序列所决定。当两个LoxP位点反向平行排列时，Cre酶介导的重组反应具有可逆性，即倒位后若Cre酶仍存在，可再次催化复位。 （2）LoxAR2和Lox71的工程化改造主要发生在反向重复序列，核心间隔序列保持不变以维持Cre酶识别功能。在目标片段两端插入LoxAR2与Lox71时，二者必须方向相反（反向平行），这是后续Cre酶催化该片段发生倒位的结构基础。 （3）PCR技术中，阳性植株能扩增出目标片段，野生型没有该倒位连接序列，无法扩增出对应条带。从图4电泳结果看，H1~H16都出现了和M对应的inv-315H条带，而WT没有，说明H1~H16都是候选阳性植株，即这些植株中发生了倒位。如果倒位成功赋予水稻硝磺草酮抗性，那么阳性植株能在含硝磺草酮的培养基中正常生长，野生型因为没有抗性，会因为硝磺草酮抑制HPPD酶活性，阻断类胡萝卜素合成而死亡，所以预期观察到阳性植株正常生长，野生型植株死亡或生长受抑制的现象。基因表达受启动子等调控序列的影响，倒位操作应该是使OsHIS1基因与OsRPL27.3基因启动子连接，从而让OsHIS1基因表达水平显著提高，合成更多解毒酶。硝磺草酮的作用是抑制HPPD酶活性阻断类胡萝卜素合成使植物死亡，而OsHIS1基因编码的解毒酶能分解硝磺草酮，过量的解毒酶可以高效分解培养基中的硝磺草酮，或解除硝磺草酮对HPPD酶的抑制作用，使得HPPD酶能正常发挥功能，类胡萝卜素合成正常，水稻正常生长。 （4）纯合倒位植株的基因组中只有inv-315H倒位位点，没有野生型OsHIS1位点，同时无外源T-DNA残留，所以电泳后只有inv-315H的634bp这1条条带。T0代是倒位杂合子，自交后根据孟德尔遗传规律，子代基因型及比例为纯合倒位:杂合:野生型=1:2:1，所以纯合倒位植株占1/4。观察电泳图，三角形标记的植株无T-DNA条带，说明不含外源转基因元件残留；箭头标记的植株有T-DNA条带，存在外源转基因元件。在农业应用中，无外源转基因元件残留的植株不会引发转基因生物安全问题，更适合在农业生产中推广。 2．（2026·江苏·一模）基因组测序时需对生物基因组的全部序列进行扩增。我国科学家开发的多次退火环状循环扩增技术（MALBAC）能获得更高覆盖率和保真度的全基因组扩增产物，具体过程如下图所示。请回答下列问题： 注：图中的粗线条均为DNA单链 (1)MALBAC的引物经过特殊设计，由若干通用碱基和随机碱基构成，每种引物的通用碱基序列相同，随机碱基序列有差异。随机碱基序列位于引物的_____端，可以和基因组DNA的_____（填“特定”或“多个”）位点结合。MALBAC设置复性温度为低温（0℃）的目的是______。 (2)相较于PCR使用的TaqDNA聚合酶，MALBAC使用的BstDNA聚合酶在85℃时就失活了，因此扩增过程中需要_____。另外该聚合酶具有链置换活性，遇到模板链与其他单链结合而被阻挡时，会解开阻挡的双链并继续沿模板链合成子链。图中n代表结合到模板链上的引物延伸形成的子链数量，以一段基因组的单链DNA为模板，经过预扩增和一次循环，得到半扩增子_____条，理论上得到的全扩增子数应少于______条。 (3)图中全扩增子能自发环化的原因是_____，环化的全扩增子自动脱离反应的原因是______。 【答案】(1) 3′ 多个 降低引物与模板结合的特异性，使随机碱基序列能与基因组 DNA 的多个位点结合，实现全基因组的随机扩增 (2) 在每次升温变性后补充Bst DNA聚合酶（或全程多次补充Bst DNA聚合酶） 2n n2 (3) 全扩增子的两端具有互补的通用碱基序列，能通过碱基互补配对形成环状结构 环化后无游离的3′端，无法作为引物的结合位点和DNA聚合酶的延伸起点，因此脱离扩增反应 【详解】（1）DNA聚合酶只能从引物的3′端开始延伸子链，因此随机碱基序列必须位于引物的 3′端，才能与模板DNA结合并启动扩增；引物的随机碱基序列存在差异，无固定的互补序列，因此能与基因组DNA的多个位点结合，而非特定位点，这是实现全基因组随机扩增的关键； 复性温度会影响引物与模板结合的特异性，低温（0℃）能降低结合的特异性，让随机碱基序列更易与基因组DNA的不同位点结合，从而覆盖整个基因组，实现全基因组的扩增。 （2）PCR的Taq DNA聚合酶耐高温，变性（90℃以上）后仍有活性，而MALBAC使用的Bst DNA聚合酶85℃即失活，扩增过程中变性步骤需要升温，因此每次变性后需补充新的Bst DNA聚合酶，才能保证后续延伸步骤正常进行；Bst DNA聚合酶有链置换活性，以一段基因组单链DNA为模板，每循环一次，最初的基因组DNA就起一次模板作用，产生n个半扩增子，经过预扩增和一次循环，得到半扩增子2n条； 全扩增子为两端均带有通用碱基序列的扩增产物，第二轮循环，有n个半扩增子作为模板，若每个半扩增子又可随机结合n个引物，则每个半扩增子可产生n个全扩增子，共计n2个全扩增子。但实际上半扩增子依次变短，不可能都结合n个引物，因此，实际产生的全扩增子数量远小于n2。 （3）MALBAC引物的通用碱基序列相同，因此全扩增子的两端会带有相同的通用碱基序列，且序列互补，能通过碱基互补配对自发形成环状DNA结构； DNA聚合酶的延伸依赖游离的3′端，全扩增子环化后，分子无游离的3′端，既无法结合新的引物，也不能作为DNA聚合酶的延伸模板，因此自动脱离扩增反应，避免被持续扩增而导致产物过量，保证扩增的保真度和覆盖率。 3．（2026·江苏南通·二模）双乙酰是啤酒中的主要风味物质，含量过高会影响啤酒的品质；谷胱甘肽可以提高啤酒的抗老化能力。研究发现，ILV2基因编码合成双乙酰的关键酶，GSH1基因编码合成谷胱甘肽的关键酶。为生产低双乙酰且抗老化的啤酒，科研人员运用基因工程技术制备啤酒酵母工程菌，过程如下图1，其中CUP1基因的表达产物可使细胞对一定浓度的硫酸铜（会破坏膜结构、影响酶活性）产生抗性。请回答下列问题： (1)利用PCR扩增目的基因时，反应体系中需要加入缓冲液及图中相关物质外，还需要______等物质。设计P1的依据是______。 (2)已知P3的序列为5′-TGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCCTTTT-3′，则P2的序列为______。 ①5′-TTGGCTATGTTTTACGATTAGGCAGCGATTCGAC-3′ ②5′-GCCACCGCCTTCCCCCCCACCGCCGTCGCTAAGCTG-3′ ③5′-CGCTGGCGGAACCGGCGGTGGCGGCAGCGATTCGAC-3′ ④5′-GAGGAGCGAAAACCGAGAGAGCTTAGGGCCTACGCTATATATCG-3′ (3)过程②将质粒2导入大肠杆菌的目的是______。 (4)转化后的啤酒酵母应置于含______的培养基中初步筛选。进一步鉴定需要以转化后啤酒酵母的总DNA为模板，优先选用图示引物1（30bp）和______进行PCR扩增，再对产物进行______鉴定。若扩增产物的大小为______，则说明CUP1基因和GSH1基因已整合到啤酒酵母的染色体上。 (5)将啤酒酵母工程菌与未转化的受体菌分别置于麦芽汁培养基中培养，定期取样检测，部分结果如图2。 ①据图2分析，啤酒酵母工程菌生产的啤酒抗老化能力______。 ②请在答题纸指定区域画出工程菌双乙酰含量的变化曲线______并阐述理由______。 【答案】(1) 4种脱氧核苷酸（dNTP）、TaqDNA聚合酶 CUP1基因左端的序列和Bgl Ⅱ的识别序列 (2)③ (3)扩增质粒2 (4) 一定浓度硫酸铜 引物2 琼脂糖凝胶电泳 1330bp (5) 增强（或提高） 峰值低于未转化组，整体趋势先升后降 ILV2基因是合成双乙酰的关键酶基因，工程菌中该基因表达被抑制，双乙酰合成减少，故含量更低 【详解】（1）PCR技术需要的条件包括模板DNA、四种脱氧核苷酸（dNTP）、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）和缓冲液。P1需扩增含CUP1左端的目的片段，故依据CUP1基因左端序列设计；同时为便于后续与载体连接，需在引物5'端引入BglⅡ识别序列。因此，P1设计依据是CUP1基因左端序列和BglⅡ识别序列的组合。 （2）P3序列5'端为TGCC...，其反向互补序列应以...GGCA结尾。选项③（5'-CGCT...GCA...-3'）的3'端含GCA，能与P3的5'端TGC形成互补配对（C-G, G-C, A-T）。在重叠延伸PCR中，这种3'端互补是引物退火并延伸的关键，使P2能作为P3的“搭档”扩增出融合基因片段，而其他选项无此互补特征，故选③。 （3）质粒2含CUP1-GSH1融合基因。大肠杆菌繁殖快、易培养，导入后可利用其快速分裂大量复制重组质粒，从而获得足量DNA用于后续转化酵母，解决直接转化酵母效率低、获量少的问题。 （4）CUP1为铜诱导型启动子，需添加一定浓度硫酸铜诱导融合基因表达；验证GSH1是否插入，需用引物2（结合GSH1）与通用引物进行PCR，若扩增出条带则证明存在；PCR产物需经琼脂糖凝胶电泳分离检测；图中 ILV2 左边界片段长度为270bp，总扩增片段长度= 引物1（30 bp）+CUP1（1030 bp）+ILV2左边界片段（270 bp）=1330 bp。 这说明CUP1和GSH1已通过同源重组整合到酵母染色体ILV2位点，PCR可扩增出该特征长度片段。 （5）据图2分析，工程菌谷胱甘肽含量显著高于未转化受体菌，因此啤酒抗老化能力增强（提高）；工程菌双乙酰含量变化曲线：整体低于未转化受体菌，呈先上升后下降趋势，峰值更低。理由：ILV2基因是合成双乙酰的关键酶基因，工程菌中 ILV2基因被抑制（或敲低），双乙酰合成减少，故含量低于受体菌。 4．（2026·江苏镇江·一模）酵母双杂交技术是一种用于检测两种蛋白质间是否存在相互作用的分子生物学技术，其基本原理如图1所示。研究人员拟利用该技术探究水稻SH蛋白与ELC蛋白之间是否存在相互作用，图2所示为分别用于构建重组质粒pAD-SH和pBD-ELC的两种空白质粒。请回答下列问题： (1)构建重组质粒时需要使用PCR技术扩增目的基因，扩增时除加入模板、含Mg2+的缓冲液、引物外，还需添加______（答两点），当温度下降到50℃时，PCR反应体系中发生的反应是______。 (2)为使ELC基因正确插入质粒pBD，利用PCR扩增ELC基因时应在两种引物的______端分别添加______限制酶的识别序列，宜用______（选填“E.coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）将质粒pBD和ELC基因的末端进行连接。 (3)将不同类型的质粒导入自身不能合成色氨酸、亮氨酸、腺嘌呤和组氨酸的营养缺陷型酵母细胞（含有图1所示启动子和报告基因）中，然后分别接种于两种选择培养基上培养，结果如下表所示。请回答： 选择培养基类型导入质粒类型 培养基1（-Trp-Leu） 培养基2（-Trp-Leu-Ade-His） 甲组:pAD和pBD-ELC 乙组:pAD-SH和pBD 丙组:pAD-SH和pBD-ELC 注:“-”表示培养基中缺乏该物质；Trp:色氨酸Leu:亮氨酸Ade:腺嘌呤His:组氨酸； ①三组酵母菌均可在只缺少色氨酸和亮氨酸的培养基上生长，说明______。该实验的报告基因为______合成基因。设置甲和乙实验组目的是______。 ②根据结果分析，SH蛋白与ELC蛋白______（选填“能”或“不能”）相互作用，理由是______。 【答案】(1) dNTP、耐高温的DNA聚合酶 引物结合到互补DNA链上（复性） (2) 5' NdeI、SmaI（顺序可颠倒） T4DNA连接酶 (3) 质粒导入酵母菌，并成功表达相关基因 腺嘌呤和组氨酸 排除AD与ECL蛋白及BD与SH蛋白的相互作用（出现假阳性）的可能 能 丙组酵母菌能在缺亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤的培养基上长出菌落，说明报告基因成功表达 【详解】（1）扩增目的基因的PCR反应体系，除了模板、含Mg²⁺的缓冲液、引物外，还需要加入Taq酶（耐高温的DNA聚合酶）和dNTP（脱氧核苷酸）。 当温度下降到55℃时，PCR反应体系中发生的反应是引物结合到互补DNA链上（复性）。 （2）分析图2pBD载体上的酶切位点，选择NdeI、SmaI限制酶可以保证ELC基因正确插入pBD。故利用PCR扩增ELC基因时应在两种引物的5'端分别添加NdeI、SmaI限制酶的识别序列，再用T4DNA连接酶（既可以连接黏性末端，又连接平末端）将其与pBD载体连接。 （3）①三组酵母菌都能在只缺少色氨酸（Trp）和亮氨酸（Leu）的培养基（培养基1）上生长，说明质粒导入酵母菌，并成功表达相关基因。该实验的报告基因为腺嘌呤（Ade）和组氨酸（His）的合成基因，因为培养基2同时缺少这两种物质，只有报告基因表达时酵母菌才能生长。设置甲、乙组的目的是作为对照，排除AD与ELC蛋白及BD与SH蛋白的相互作用（出现假阳性）的可能； ② 根据结果分析，SH蛋白与ELC蛋白能相互作用，理由是丙组酵母菌能在缺亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤的培养基上长出菌落，说明报告基因成功表达。 5．（2026·江苏南通·一模）限制性核酸内切酶BsmBⅠ具有偏移剪切特性，其识别序列及切割位点（位于接头序列两侧）如图1.利用BsmBⅠ实现多DNA片段无缝连接的技术称为Golden Gate克隆，其过程如图2.请回答下列问题。 (1)由图1可知，BsmBⅠ酶切DNA中的________键，产生________（类型）末端。BsmBⅠ一次酶切产生的两个末端________（填“相同”、“不相同”、“可能相同”）。 (2)PCR1~n不宜在同一反应体系中进行，其原因有________、________。过程②需要的酶有________。 (3)片段1和片段2的部分序列如图3所示，已知R1的序列为5’CGTCTCNcgacCAAAT…3’，则F2的序列为________（接头序列用小写字母表示）。R1和F2还有另一种设计方案，请写出该方案中F2的序列________（接头序列用小写字母表示）。 (4)据图1、2分析，GoldenGate克隆技术的优点有________。 a.不受天然酶切位点的限制 b.实现多片段一次性有序连接 c.有利于大片段DNA的高效连接 d.片段1~n之间不会引入外源序列实现无缝连接 【答案】(1) 磷酸二酯 黏性 可能相同 (2) 不同PCR反应的退火温度有差异 不同引物间会互补配对 BsmBⅠ酶、DNA连接酶 (3) 5'CGTCTCNgtcgGTGCTGTA……3' 5'CGTCTCNgtgcTGTA……3' (4)abd 【详解】（1）限制性核酸内切酶切割的是DNA中的磷酸二酯键。由图1可知，BsmBⅠ切割后产生的是黏性末端。因为其识别序列及切割位点位于接头序列两侧，如果接头序列相同切割后产生的两个末端是相同的，如果接头序列不相同切割后产生的两个末端是不相同的，所以BsmBⅠ一次酶切产生的两个末端可能相同。 （2）PCR1~n不宜在同一反应体系中进行，一方面是因为不同片段长度不同，PCR反应条件（如退火温度等）可能不同，在同一体系中难以同时满足；另一方面，不同片段的引物都含有BsmBⅠ识别序列，不同引物之间可能会互补配对，影响PCR的进行。过程②是将片段与质粒连接形成重组质粒，需要的酶是限制酶（BsmBⅠ酶）和DNA连接酶。 （3）据图可知片段1和片段2经PCR后需要连接在一起，即R1被切割后形成的黏性末端需和F2被切割后形成的黏性末端互补，据图1可知，限制性核酸内切酶BsmBⅠ切割后的黏性末端为接头序列，由于R1序列为5’CGTCTCNcgacCAAAT…3’，则F2的序列由识别序列和接头序列以及片段2部分序列组成，即5'CGTCTCNgtcgGTGCTGTA……3'。由R1序列可知本方案接头序列属于片段1的一部分，所以另一套方案中F2中的接头序列可以用片段二的一部分（前4个碱基）即5'CGTCTCNgtgcTGTA……3'，而R1则为5’CGTCTCNgcacCGACCAAAT…3’ （4）a、通过设计接头序列，可以在任意位置引入酶切位点，所以不受天然酶切位点的限制，a符合题意； b、从图2可以看出，多个片段可以一次性有序连接，b符合题意； c、该技术可以实现多片段的连接，有利于小片段DNA的高效连接，c不符合题意； d、片段1~n之间通过接头序列碱基互补原则连接，不会引入外源序列实现无缝连接，d符合题意。 故选abd。 6．（2026·江苏徐州·一模）人工合成的mRNA分子等通过脂质体包裹可制备mRNA疫苗。下图是mRNA疫苗进入树突状细胞等细胞中表达，并引发相关的免疫反应的机制图，请回答： (1)MHCI类分子分布在________。制备mRNA疫苗时，常用脂质体包裹mRNA后再接种，目的是________（答出1点即可）。mRNA疫苗常因无法准确递送到抗原呈递细胞而使效果大打折扣，为了解决该问题，设计脂质体时，在脂质体表面连接能与________特异性结合的抗体。 (2)活化细胞1的两个信号分别是________、________。 (3)细胞3参与的特异性免疫是________。与灭活病毒疫苗制备过程相比，mRNA疫苗不需要用到细胞工程中的________技术。 (4)RNA本身也可作为抗原引发机体炎症反应，带来安全性问题。研究者猜测修饰过的RNA疫苗可能会减弱机体炎症反应，研究人员向培养的树突状细胞中加入不同种类的脂质体，一段时间后检测培养液中促炎细胞因子的含量，结果如图：据图判断，研究者的假设________（填“能”或“不能”）成立，判断依据是________。 (5)结合上述研究，与传统的灭活疫苗相比，利用单克隆抗体修饰的脂质体和修饰碱基的mRNA制备的新型疫苗所具有的优势包括________。 【答案】(1) 内质网 保护mRNA分子免受降解/帮助其进入细胞，将mRNA直接递送至细胞a内/降低免疫系统对mRNA的过早清除风险 抗原呈递细胞表面的特异性受体 (2) 抗原蛋白和B细胞（细胞1）接触 辅助性T细胞（细胞2）表面的特定分子发生变化并与B细胞（细胞1）结合 (3) 细胞免疫 动物细胞培养 (4) 能 含不同修饰RNA的脂质体的细胞培养液中，促炎细胞因子的含量均少于含未修饰RNA的脂质体，且与不含RNA的脂质体接近 (5)同时激活体液免疫和细胞免疫；新型疫苗不易引发机体的炎症反应；无需通过培养宿主细胞的工程技术制备疫苗，生产速度更快，成本更低；新型疫苗作用的靶细胞可以被调控 【详解】（1）MHCI类分子是主要组织相容性复合体的一部分，由图可知，分布在细胞中内质网上，负责呈递抗原信息。制备mRNA疫苗时，常用脂质体包裹mRNA后再接种，脂质体可以保护mRNA分子免受降解，同时帮助其进入细胞，将mRNA直接递送至细胞内，降低免疫系统对mRNA的过早清除风险。为了使mRNA疫苗可以准确递送到抗原呈递细胞，设计脂质体时，在脂质体表面连接能与抗原呈递细胞的受体特异性结合的抗体。 （2）分析题图可知，细胞1可以增殖分化后产生抗体，故为B细胞，当抗原蛋白呈递在细胞表面时，一些抗原蛋白可以和B细胞（细胞1）接触，这为激活B细胞提供了第一个信号。一些抗原蛋白被树突状细胞、B细胞等抗原呈递细胞摄取。抗原呈递细胞将抗原处理后呈递在细胞表面，然后传递给辅助性T细胞（细胞2）。辅助性T细胞表面（细胞2）的特定分子发生变化并与B细胞结合，这是激活B细胞（细胞1）的第二个信号。 （3）细胞3能与感染病毒的靶细胞接触，是细胞毒性T细胞，参与的特异性免疫是细胞免疫。与灭活病毒疫苗制备过程中，需要通过动物细胞培养技术培养病毒宿主细胞，再利用宿主细胞培养病毒，制备灭活病毒，与之相比，mRNA疫苗需要在体外大量合成mRNA，再与脂质体结合mRNA疫苗，不需要用到细胞工程中的动物细胞培养技术。 （4）分析题图可知，含不同修饰RNA的脂质体的细胞培养液中，促炎细胞因子的含量均显著少于含未修饰RNA的脂质体，且与不含RNA的脂质体接近，说明修饰RNA相比未修饰RNA，能显著减弱机体炎症反应。 （5）结合图示可知，mRNA制备的新型疫苗能同时激活体液免疫和细胞免疫，提供更全面的免疫保护，而传统的灭活疫苗，主要激活体液免疫；mRNA经碱基修饰后能显著减少机体促炎细胞因子的含量，说明新型疫苗不易引发机体的炎症反应；传统疫苗是减毒或灭活的病毒，需要大规模进行病毒宿主细胞培养来获得大量病毒原料，新型疫苗无需依赖宿主细胞培养，生产速度更快，成本更低；人工合成的脂质体表面可以通过单克隆抗体修饰，与靶细胞表面的特异性受体的特异性识别，实现新型疫苗的精准运送，从而调控疫苗的靶细胞，这是传统疫苗不具有的。 7．（2025·江苏徐州·一模）在自然界中，酸性土壤占全球没有冰层覆盖土壤的30%，铝毒是酸性土壤中限制作物生长的主要因素之一。丹波黑大豆（RB）根尖SGF14α基因的表达对提升作物铝耐受性具有一定的作用。欲通过构建SGF14α的植物表达载体，转化烟草产生SGF14α过量表达株系，考察过量表达大豆SGF14α对烟草铝耐受性的影响，完善下列相关操作。 (1)获取RB根尖SGF14α基因:首先根据基因数据库中SGF14α的cDNA编码区序列设计上、下游特异性引物，在设计引物时，应在引物的________端添加特定限制酶的识别序列，其目的是________。 (2)植物表达载体（pK - 35S - SGF14α）的构建和获取:获得SGF14α的cDNA编码区全长DNA片段，再将SGF14α的cDNA编码区连接到克隆pENTR载体上，产生克隆载体pENTR - SGF14α，然后与表达载体pK发生重组反应，构建出植物表达载体（如图所示）。一般将构建的表达载体导入经______处理的大肠杆菌，并在添加大观霉素的LB培养基上培养筛选重组克隆，获得植物表达载体，此处将表达载体先导入大肠杆菌的原因是________。 (3)烟草的转化及转基因烟草的筛选:通过电转化法将植物表达载体pK - 35S - SGF14α转入农杆菌中，在含有的平板上筛选________（填“阳性”或“阴性”）克隆用于野生型（WT）烟草的转化，然后利用转染后的叶片诱导外植体发芽，待芽长大后从外植体上切下转入________（填激素名称）比例较高的生根培养基上诱导根的生长，得到重组烟草植株。提取转基因烟草的总DNA进行PCR扩增并经凝胶电泳鉴定的结果如图所示，图中SGF14α已导入烟草植株的有________。 (4)目的基因的检测与鉴定:利用RT - PCR（反转录 - 聚合酶链式反应）法检测基因的转录水平，在RT - PCR中需要加入________酶。提取转基因植株根细胞内的蛋白质，利用________技术检测基因的表达水平。为了进一步考察转基因的性能，应将野生型烟草和转基因烟草置于铝胁迫的环境中，若________，即表示转基因烟草培育成功。 【答案】(1) 5' 方便SGF14α（目的基因）与载体正确连接 (2) CaCl2（或Ca2+） 大肠杆菌增殖速度快，表达载体先转入大肠杆菌中能随大肠杆菌的增殖而进行复制，有利于获得高浓度的表达载体 (3) 阳性 生长素 S4、S11、S12、S13、S19、S23 (4) 逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶 抗原-抗体杂交 转基因烟草的存活率比野生型烟草的高 【详解】（1）PCR扩增过程中，子链的延伸方向是5'端到3'端，引物能使DNA聚合酶将脱氧核苷酸连接在子链的3'端；在设计引物时，应在引物的5'端添加特定限制酶的识别序列，其目的是方便SGF14α（目的基因）与载体正确连接。 （2）自然条件下，细菌的转化效率很低，通过化学和物理方法处理可以增强细菌捕获外源DNA的能力而成为感受态细胞。因Ca2+能促进细菌摄取外源DNA，故一般将构建的表达载体导入经CaCl2溶液处理的大肠杆菌。大观霉素抗性基因为标记基因，可在添加大观霉素的LB培养基上培养以筛选重组克隆，获得植物表达载体。将表达载体先导入大肠杆菌的原因是大肠杆菌增殖速度快，表达载体先转入大肠杆菌中能随大肠杆菌的增殖而进行复制，有利于获得高浓度的表达载体。 （3）将目的基因导入植物细胞时，常使用农杆菌转化法，本实验采用电转化法。获得高浓度的表达载体后要转入农杆菌中，但需先在含有Sper的平板上筛选具有阳性的克隆才能用于烟草的转化。培养基中生长素与细胞分裂素的比值高时，有利于生根，故外植体需转到生长素比例较高的生根培养基中诱导根的生长，进而得到重组烟草植株。根据电泳图可知，NC为阴性对照，PC为阳性对照，WT是野生型烟草，S4、S11、S12、S13、S19、S23属于SGF14α已导入烟草植株。 （4）由于转录得到的是mRNA，故在RT - PCR中需要加入逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶。检测基因的表达水平时，可提取转基因植株根细胞内的蛋白质，利用抗原 - 抗体杂交技术进行鉴定。为了进一步考察转基因的性能，应将野生型烟草和转基因烟草置于铝胁迫的环境中，若转基因烟草的存活率比野生型烟草的高，即转基因烟草培育成功。 8．（2025·江苏徐州·二模）如图为利用ES细胞打靶技术建立基因修饰小鼠模型的主要过程，其中核心技术是在小鼠胚胎干细胞（ES细胞）中进行DNA同源重组。请回答下列问题∶ 注∶为新霉素抗性基因，可以使具有该基因的细胞在含有G418（新霉素的类似物）的培养基上生长；为疱疹病毒胸苷激酶基因，其基因产物可使GANC转变成一种有毒物质使细胞死亡 (1)基因打靶载体构建过程中需要用到的工具酶有_______。为防止外源基因环化及外源基因与载体反向连接，采取的措施一般是用两种限制酶切割_______、_______。 (2)ES细胞作为受体细胞的原因是ES细胞具有_______，将中靶载体转入受体ES细胞常用的方法是_______。 (3)在进行药物筛选时，培养基中加入G418和GANC的作用分别是_______，原因分别是_______。 (4)胚胎移植前要对受体母鼠进行_______处理，若要快速繁育此种小鼠，可采用_______技术，在此技术操作时，主要将_______均等分割。 【答案】(1) 限制酶、DNA连接酶 外源基因 载体 (2) 发育的全能性 显微注射法 (3) 筛选成功导入含有neo'的细胞、筛选发生同源重组的细胞 只有含有neo'的细胞才能在含有G418的培养基上生长、只有发生同源重组的细胞才不含HSV-tk，不会将GANC转变成有毒物质而存活 (4) 同期发情 胚胎分割 内细胞团 【详解】（1）构建基因表达载体是重组DNA技术的核心环节，基因打靶载体构建过程中需要用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶。为防止外源基因环化及外源基因与载体反向连接，采取的措施一般是用两种限制酶分别切割外源基因和载体。 （2）由于ES细胞具有发育的全能性，所以经常作为细胞工程的受体细胞。将目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射法。 （3）加入G418的作用是筛选出成功导入了含有neo'的细胞，因为只有含有neo'的细胞才能在含有G418的培养基上生长；加入GANC的作用是筛选出发生了同源重组的细胞，因为只有发生同源重组的细胞才不含HSV-tk，不会将GANC转变成有毒物质而存活，而含有HSV-tk的细胞会死亡。 （4）为使受体母鼠能为供体胚胎提供适于胚胎发育的生理变化环境，为胚胎存活提供可能，移植前要对受体母鼠进行同期发情处理，让其子宫具备能够接受胚胎的生理状态。采用胚胎分割技术可以将一个胚胎分割成多个，该技术可在短时间内获得多个遗传物质相同的个体，从而实现快速繁育小鼠的目的。在进行胚胎分割时，注意要将内细胞团均等分割，因为内细胞团将来发育成胎儿的各种组织，如果分割不均，会影响分割后胚胎的发育，导致个体发育不良甚至死亡。 9．（2024·江苏南通·三模）非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒（ASFV）感染引起的一种传染病。下图表示研究人员扩增ASFV的CP530R 和 F317L基因，并导入含病毒载体1和pSC101质粒的大肠杆菌，在细胞内实现同源重组并制备重组病毒疫苗的主要过程。pSC101是一种低拷贝数的温度敏感质粒（在30℃下能复制、在37℃下不能复制），recET基因和ccdA 基因的启动子分别受鼠李糖和阿拉伯糖诱导。请回答下列问题。 (1)引物F的设计依据是____。过程①的程序为：98℃2min；98℃10s，55℃5s，72℃30s，35个循环；72℃3min。最后72℃3min的目的是____。 (2)ccdB基因编码的毒性蛋白CcdB抑制DNA促旋酶，导致细胞死亡。ccdA基因编码的蛋白CcdA 可保护细胞免受CcdB毒害。将大肠杆菌先接种在含____的培养基中，在____℃下培养一段时间，加入目的基因并电激；一段时间后将大肠杆菌接种在含____的培养基中，在____℃下继续培养，获得含病毒载体2的大肠杆菌。 (3)据重组原理可知重组蛋白 RecT 的功能有____，重组过程涉及____键的水解和形成。 (4)转化后的 Vero细胞，在37℃、含____（气体条件）的培养箱中培养48h，收获细胞及上清液，利用____技术鉴定重组病毒表面的蛋白。与灭活疫苗相比，重组病毒疫苗的优势是____。 【答案】(1) TK1 序列、CMV启动子序列 使子链充分延伸 (2) 鼠李糖、阿拉伯糖 30 氯霉素 37 (3) 与单链结合，保持单链稳定、介导单链入侵 磷酸二酯 (4) 5%CO2和95%空气 抗原-抗体杂交 能增殖，较长时间刺激免疫系统 【详解】（1）由图可知，使用引物F和引物R的目的是扩增出目的基因，同时便于扩增后的DNA片段进行同源重组，故引物F的设计依据是TK1 序列、CMV启动子序列。72℃属于延伸过程，故最后72℃3min的目的是保证延伸时间，使子链充分延伸。 （2）recET基因和ccdA 基因的启动子分别受鼠李糖和阿拉伯糖诱导，故先将大肠杆菌接种在含鼠李糖、阿拉伯糖的培养基中，pSC101是一种低拷贝数的温度敏感质粒，在30℃下能复制、在37℃下不能复制，先在30℃下培养一段时间，加入目的基因并电激；由于大肠杆菌中含有氯霉素抗性基因，故一段时间后将大肠杆菌接种在含氯霉素的培养基中，在37℃下继续培养，阻止质粒pSC101复制，从而获得含病毒载体2的大肠杆菌。 （3）由图可知，据重组原理可知重组蛋白 RecT 能够与单链结合，保持单链的稳定，介导单链入侵，重组过程涉及到DNA片段的替换，故该过程涉及磷酸二酯键的水解和形成。 （4）转化后的 Vero细胞，在37℃、含5%CO2和95%空气的培养箱中培养48h，收获细胞及上清液，利用抗原-抗体杂交技术鉴定重组病毒表面的蛋白。与灭活疫苗相比，重组病毒疫苗的优势是能增殖，较长时间刺激免疫系统。 10．（2025·江苏·二模）I型糖尿病(T1D)是一种以胰岛B细胞进行性损伤、胰岛素分泌不足为主要表现的自身免疫病。T1D患者体内仍存留部分具有再生能力的胰岛B细胞，研究促进其再生的机制，对减少并发症的发生具有重要意义。 (1)T1D患者胰岛B细胞向________细胞呈递抗原，同时________细胞分泌________促进该细胞增殖分化，进而攻击胰岛B细胞；此外，T1D患者________细胞直接识别胰岛B细胞表面抗原，该细胞接受辅助性T细胞直接接触和细胞因子等刺激，增殖分化后分泌______，这些免疫细胞和免疫活性物质共同作用使胰岛B细胞损伤。 (2)CD20是人体B淋巴细胞的特异性膜蛋白之一。为制备抗CD20的单克隆抗体，研究者向小鼠多次注射________获取B淋巴细胞，诱导其与骨髓瘤细胞融合，将筛选出的杂交瘤细胞用________(填器材)进行克隆化培养和抗体检测。最终将筛选的细胞进行体内培养，从小鼠腹水中提取抗CD20单克隆抗体。 (3)IL-10是一种免疫抑制因子。为评估IL-10与抗CD20单抗联合治疗自身免疫病的效果，设置4组I型糖尿病小鼠，进行相关治疗，实验结果如图1。 据图1可得出结论：________；据图2分析，出现图1结果的原因是_______。 (4)为进一步研究抗CD20单抗+IL-10联合治疗对糖尿病鼠胰岛B细胞功能的影响，研究者还需检测四组糖尿病鼠________等指标。 【答案】(1) 细胞毒性T 辅助性T 细胞因子 B淋巴 抗体 (2) CD20 96孔板 (3) 联合治疗可减弱自身免疫反应，且强于单独治疗 联合治疗组与其他组相比，各蛋白均产生的更多，说明抗CD20单抗+IL-10联合治疗可促进胰岛B细胞的再生，且作用强于单独治疗 (4)胰岛素和血糖含量 【详解】（1）胰岛B细胞受损是细胞免疫发生异常的结果，据此推测，T1D患者胰岛B细胞向细胞毒性T细胞呈递抗原，同时辅助性T细胞分泌细胞因子促进该细胞增殖分化，进而攻击胰岛B细胞；此外，T1D患者B淋巴细胞直接识别胰岛B细胞表面抗原，该细胞接受辅助性T细胞直接接触和细胞因子等刺激，增殖分化后分泌抗体，这些免疫细胞和免疫活性物质共同作用使胰岛B细胞损伤，最终导致胰岛素分泌减少，表现为糖尿病。 （2）CD20是人体B淋巴细胞的特异性膜蛋白之一。为制备抗CD20的单克隆抗体，研究者向小鼠多次注射CD20使小鼠发生特异性免疫反应，进而从其脾脏中获取B淋巴细胞，诱导其与骨髓瘤细胞融合，将筛选出的杂交瘤细胞用96孔板进行克隆化培养和抗体检测，该培养的目的是保证每个小孔中只有一个杂交瘤细胞。最终将筛选的细胞（能产生抗CD20抗体的细胞）进行体内培养，从小鼠腹水中提取抗CD20单克隆抗体，体内培养操作简单，经济实惠。 （3）①由图可知，联合治疗组小鼠胰岛炎症等级主要是0、1级；单抗治疗组主要是1、2级，IL-10 治疗组胰岛炎症等级主要是1、2级；对照组小鼠胰岛炎症等级主要是2、3级，联合治疗组与单抗治疗组相比，0级自身免疫反应占的更多，即自身免疫反应弱，可得出结论为联合治疗可减弱自身免疫反应，且强于单独治疗。联合治疗组与其他组相比，各蛋白均产生的更多，说明抗CD20单抗+IL-10联合治疗可促进胰岛B细胞的再生，且作用强于单独治疗。 （4）若研究“抗CD20单抗+IL-10联合治疗对糖尿病鼠胰岛B细胞功能的影响”，需检测胰岛B细胞的功能变化，胰岛B细胞可分泌胰岛素，因此可对小鼠进行胰岛素和血糖含量的检测，也可检测糖尿病小鼠的体重。 4 / 20 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $