2025届高三生物二轮复习课件PCR的应用

PCR技术的应用 2019人教版选择性必修三二轮复习专题课件 1.全称： ； 2.原理： ； 3.条件： ①缓冲液：含有 ，目的是 ； ②模板：DNA双链； ③原料：4种 ，既作为 又作为 ； ④酶： 的 酶； ⑤引物： 种，使DNA聚合酶能从引物的 端开始连接脱氧核苷酸。 聚合酶链式反应 半保留复制 Mg2+ 激活DNA聚合酶 脱氧核苷酸（dNTP) 原料 能量 耐高温 DNA聚合 2 3’ PCR基础知识回顾 PCR技术的应用 1、逆转录—聚合酶链反应（RT－PCR) 2、实时PCR（real－time PCR） 3、添加限制酶切位点 5.重叠延伸PCR 8.反向PCR 4.基因融合 6.大引物PCR 7.巢式PCR 9.DNA测序 10.不对称 PCR 技术 RT－PCR即逆转录—聚合酶链反应：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，利用引物和逆转录酶逆转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT－PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能，某些病毒的核酸检测就是依据此原理。 PCR技术的应用 1、逆转录—聚合酶链反应（RT－PCR) 对点训练 1.RT－PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，可利用此技术获取目的基因，具体过程如图所示，以下说法错误的是 (　 　) A. 设计扩增目的基因的引物时需考虑表达载体的序列 B. GC含量高的引物在与模板链结合时，需要更高的温度 C. 过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、Taq酶和引物A等 D. 过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上需要2n－1个引物B C 过程Ⅰ是逆转录过程，所以需要加入缓冲液、原料、逆转录酶酶和引物A等 实时PCR（real－time PCR）是一种定量测定样品中特定DNA片段的聚合酶链式反应（如图所示）。反应中一般使用带有荧光标记的PCR引物，从而能够通过荧光监测每次PCR循环后扩增所得的产物的量。通过连续监测下获得的反应动力学曲线，可推导出样品中模板DNA的初始含量。 PCR技术的应用 2、实时PCR（real－time PCR） 实时荧光定量 PCR 简称 qPCR，灵敏度高特异性好，是目前检测微小残留病变的常用方法。将标有荧光素的 Taqman 探针与待测样本 DNA 混合后，在变性、复性、延伸的热循环中，与待测样本 DNA 配对结合的 Taqman 探针被 Taq 酶切断，在特定光激发下发出荧光(如图所示)，随着循环次数的增加，荧光信号 强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可得 Ct 值(该值与待测样本中目的基因的个数呈负相关)。下列有关叙述正确的是( ) A．每个模板 DNA 分子含有 2 个游离的磷酸基团 B．做 qPCR 之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成 1 种引物和 1 种 Taqman 探针 C．在反应过程中，需要细胞中的 ATP 为新链的合成提供能量 D．荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明含有的病变的概率越小 对点训练 A 无需ATP 2种 越大 PCR技术的应用 3、添加限制酶切位点 PCR技术中，在上游引物的5'端可以加入限制性内切酶切割位点，以便后续对PCR产物进行克隆、测序等操作 1.（2024·河北邢台模拟）PCR引物的3′端为结合模板DNA的关键碱基，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列。下列叙述正确的是（　　） A．PCR第5个循环，消耗了16对引物 B．脱氧核苷酸作为扩增的原料会依次连接到5′端 C．PCR反应体系中需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、Ca2＋等 D．用图中引物扩增至少四个循环后才能获得两端均添加限制酶切点的目的产物 对点训练 A 3′ Mg2＋ 两个循环 对点训练 对点训练 PCR技术的应用 4.基因融合 PCR技术的应用 4.基因融合 对点训练 PCR技术的应用 5.重叠延伸PCR 重叠延伸PCR可实现定点基因诱变，其操作过程如图所示(凸起处代表突变位点)。 引物A 引物B 引物C 引物D PCR1 PCR2 PCR3 PCR4 图2所示的4次PCR应该分别如何选择图1中所示的引物？请填写以下表格（若选用该引物划“√”，若选用该引物划“×”） √ √ × × × × √ √ × × × × √ × × √ 对点训练 大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR。 第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。 PCR技术的应用 6.大引物PCR ①预期蛋白质的功能 ②设计预期的蛋白质结构 ③推测应有的氨基酸序列 ④找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因 ⑤获得所需蛋白质 天然胰岛素B链部分氨基酸序列： 酪氨酸 苏氨酸 脯氨酸 赖氨酸 苏氨酸 设计后胰岛素B链部分氨基酸序列： B28 B29 酪氨酸 苏氨酸 赖氨酸 脯氨酸 苏氨酸 B28 B29 mRNA mRNA 翻译 翻译 转录 天然胰岛素对应的部分基因： 改造后应得到的基因序列： 转录 PCR技术的应用 6.大引物PCR 18 天然胰岛素B链部分氨基酸序列： 酪氨酸 苏氨酸 脯氨酸 赖氨酸 苏氨酸 设计后胰岛素B链部分氨基酸序列： B28 B29 酪氨酸 苏氨酸 赖氨酸 脯氨酸 苏氨酸 B28 B29 mRNA mRNA 翻译 翻译 转录 天然胰岛素对应的部分基因： 改造后应得到的基因序列： 转录 待突变位点 常规下游引物 突变上游引物 进行PCR 产物作为下一轮PCR的大引物 19 天然胰岛素对应的部分基因： 待突变位点 常规下游引物 突变上游引物 进行PCR 产物作为下一轮PCR的大引物 进行PCR 待突变位点 下游大引物 常规上游引物 20 天然胰岛素对应的部分基因： 待突变位点 常规下游引物 突变上游引物 进行PCR 产物作为下一轮PCR的大引物 进行PCR 待突变位点 下游大引物 常规上游引物 进行PCR 天然胰岛素对应的部分基因： 待突变位点 PCR 合成的人胰岛素突变基因 21 1.（2023·山东高考节选）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。 F2和R1 或 F1与R2 对点训练 2、重组PCR技术是一项新的PCR技术，可将来两个不相关的DNA连接起来，组成一个新的分子。实验小组从猪源大肠杆菌中扩增得到LTB基因和ST1基因片段，用重组PCR技术构建了LTB-ST融合基因。融合基因的制备过程如图所示。回答下列问题: 对点训练 (1)设计引物时，引物P1与引物P2的碱基序列 (填“能”或“不能”)互补;引物P2与引物P3的碱基序列 (填“能”或“不能”)部分互补，原因是 。 不能 能使LTB基因与ST1基因的单链融合在一起 (2)从P2，P3两种引物的角度分析，LTB和ST1基因能够融合的关键是PCR1和PCR2不能在同一个反应体系中进行，原因是： 。 引物之间的结合会干扰引物和模板链的结合，从而影响PCR过程 能 (4)杂交链延伸生成LTB-ST1融合基因的过程 (填“需要”或“不需要”)加入引物。在图标出杂交链两条母链的3'端和5'端。 (3)DNA子链是从5'端向3'端延伸。为了使杂交链顺利延伸子链，至少需要经过2次循环才能得到用于杂交的目的链L、S，则第2次循环的目的是 。 为杂交链延伸子链起始部位提供3'端 不需要 3.大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，如图表示利用大引物PCR对基因M进行定点诱变。下列说法错误的是（ ） A．第一轮PCR中，至少需要2个循环才能获得相应的大引物模板 B．第二轮PCR所用的引物是第一轮PCR的产物DNA的两条链 C．扩增的定点诱变产物通常需具备启动子、终止子等结构才能进行转录 D．为了使两轮PCR在同一支试管中进行，设计引物时应考虑不同的退火（复性）温度 对点训练 B 2024南昌一模试题(节选) 21.(12分)HNF1α基因突变可引发糖尿病等疾病。HNF1a的第249位丝氨酸(S249)是其重要功能位点，为进一步研究S249的重要性，研究人员将249位丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)，成功构建了人源HNF1α-S249A转基因小鼠。下图为基因表达载体部分结构示意图，Myc为标记基因，引物F和R之间的序列长度386bp碱基对。回答下列问题: (3)获得HNF1α-cDNA后，可利用cDNA中间序列设计引物实现定点突变目的，从而制备HNF1α-S249A cDNA。已知HNF1α中248、249、250三个氨基酸对应的密码子序列为 ACCUCUGUG，丙氨酸对应的密码子有GCU、GCC、GCG、GCA四种，为了保证引物与模板的结合效率及突变目的，请设计其中一个引物: 。 ACCGCTGTG或TGGCGACAC 对点训练 巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应（如图所示），使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为它们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低，巢式PCR的扩增特异更强。 PCR技术的应用 7.巢式PCR 为减少引物与模板之间的非特异性配对，人们对普通PCR技术进行改良，发明了巢式PCR，原理是利用两套引物进行两轮PCR扩增。首先利用第一对引物（外引物）对目的基因所在的DNA进行第一轮扩增，第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板，利用第二对引物（内引物或巢式引物）结合在第一轮扩增产物内部，经过15～30次循环，获得第二轮扩增片段（即目的基因），最终第二轮扩增片段短于第一轮，基本过程如图所示。下列叙述错误的是（ ） A．两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段 B．使用外引物至少经过3次循环，才能得到图示的第一轮扩增产物 C．若第一轮扩增产生错误片段，则其进入第二轮扩增的概率极低 D．普通PCR与巢式PCR相比，特异性更强，错误率更高 D 对点训练 反向PCR是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段。实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切，然后用连接酶使带有黏性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究。 PCR技术的应用 8.反向PCR 利用反向 PCR 技术扩增未知基因序列，如果已知一小段 DNA的序列，可采用 PCR 方法，简捷地分析 出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以 EcoR Ⅰ酶切为例)。 请据图回答问题： (1)如表所列为已知的 DNA 序列和设计的一些 PCR 引物，步骤 Ⅲ选用的引物必须是________(从表格引物①②③④中选择，填编号)。 PCR技术的应用 8.反向PCR ②④ （ 2020·江苏卷 ）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图所示(以EcoR Ⅰ酶切为例)。若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是_____ 引物 ①5′- AACTATGCGCTCATGA-3′ ②5′- GCAATGCGTAGCCTCT-3′ ③5′- AGAGGCTACGCATTGC-3′ ④5′- TCATGAGCGCATAGTT-3′ PCR技术的应用 8.反向PCR (4) 对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是___ 。 A. 5′—AACTATGCG－－－－AGCCCTT—3′ B. 5′—AATTCCATG－－－－CTGAATT—3′ C. 5′—GCAATGCGT－－－－TCGGGAA—3′ D. 5′—TTGATACGC－－－－CGAGTAC—3′ B PCR技术的应用 8.反向PCR 分4组PCR，都含有4种dNTP，每组一种ddNTP，即每组4+1原料 得到特定碱基为末端的片段 电泳分析，或电泳后检测荧光图谱 【进一步拓展】 1.化学法DNA测序 DNA末端标记，再对某种碱基进行化学处理（如甲基化、N化、环化、去除）等，使DNA序列在特定部位断裂（类似于ddNTP处理) 2.自动化测序 原理同PCR链终止法，只是用不同颜色荧光标记不同ddNTP，在一个泳道中直接得到四色图谱曲线 3.芯片测序 PCR技术的应用 9.DNA测序 (不定项)(2024·湖南，15)最早的双脱氧测序法是在 PCR 反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷 三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP 或 ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则， 以加入 ddATP 的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延 伸；PCR 产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下 列叙述正确的是( ) A．上述 PCR 反应体系中只加入一种引物 B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C．5′-CTACCCGTGAT-3′为对照个体的一段序列 D．患者该段序列中某位点的碱基 C 突变为 G 对点训练 AC 不对称 PCR 技术:其基本原理是采用不等量的一对引物，经若干次循环后，低浓度的引物（限制性引物）被消耗尽，以后的循环只产生高浓度引物 （非限制性引物）的延伸产物，结果可获得大量 ss—DNA。 PCR技术的应用 10.不对称 PCR 技术 例：若反应体系中原有100个模板 DNA，最初10个循环后限制性引物耗尽，再进行 20 个循环，理论上可制备 ss—DNA 个（不考虑长度差异，用科学计数法表示），在 PCR 的其他条件均适宜，引物总量一定的前提下，30 个循环后 最终中 ss—DNA 的产生量主要受 的影响。 PCR技术的应用 10.不对称 PCR 技术     限制性引物和非限制性引物的比例  2.048×106  感谢观看 $$