3.2 基因工程的基本操作程序 课件 2024—2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

选择性必修3 第2节：基因工程的基本操作程序 从社会中来 1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗?培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤? 转基因抗虫棉(使棉铃虫死亡，左)与非转基因抗虫棉(右) 第一步：目的基因的筛选与获取 第二步：基因表达载体的构建 第三步：将目的基因导入受体细胞 第四步：目的基因的检测与鉴定 培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤： 基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的筛选与获取 第二步：基因表达载体的构建 第三步：将目的基因导入受体细胞 第四步：目的基因的检测与鉴定 基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的筛选与获取 1.目的基因 ①定义 在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状的或获得预期表达产物的基因。 目的基因 受体细胞 目的基因主要是指编码蛋白质的基因 抗逆性基因 生产药物基因 毒物降解基因 工业用酶基因 1.目的基因 ②目的基因 —— Bt基因 苏云金杆菌 产生 Bt基因 伴胞晶体蛋白 (Bt抗虫蛋白) 表达 破坏鳞翅目昆虫的消化系统 杀死棉铃虫 棉花细胞 导入 抗虫棉 培育 2.筛选合适的目的基因 基因海洋 目的基因 如何筛选 相关的已知结构 和功能清晰的基因 筛选 ①筛选方法之一 2.筛选合适的目的基因 ②Bt基因的筛选 苏云金杆菌 制成 杀虫剂 掌握目的基因的功能 掌握目的基因的结构 防治棉花害虫 发现杀虫作用与Bt基因有关 掌握Bt基因的序列 深入了解Bt基因的表达产物(Bt抗虫蛋白) Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。 2.筛选合适的目的基因 ③筛选目的基因的技术手段 测序技术 序列数据库(如GenBank) 序列比对工具(如BLAST) 测定核酸和蛋白质序列 以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库 把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。 人工合成 获取目的基因的方法 利用PCR获取和扩增目的基因 常用方法 我国首批转基因抗虫棉的培育使用 从基因文库中获取目的基因 人工合成 反转录法 化学合成法 已知DNA两端部分序列 相对分子质量较大，不知核苷酸序列的基因 相对分子质量较小，已知核苷酸序列的基因 3.利用PCR获取和扩增目的基因 ①PCR的含义 PCR是聚合酶链式反应的缩写。根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制。 DNA半保留复制 ②PCR的原理 ③DNA复制所需的基本条件 参与的组分 在DNA复制中的作用 解旋酶 DNA母链 4种脱氧核苷酸 DNA聚合酶 引物 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成DNA子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从引物的3‘端开始连接脱氧核苷酸 ④PCR所需的基本条件 参与的组分 在DNA复制中的作用 目的基因DNA 4种脱氧核苷酸 耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶) 引物（两种） 缓冲液 Mg2+ 高温 使DNA聚合酶能够从引物的3‘端开始连接脱氧核苷酸 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成DNA子链的原料 催化合成DNA子链 维持反应体系的pH 激活DNA聚合酶的活性 引物 引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物通常为20~30个核苷酸。在细胞中为一段单链RNA，在PCR中为一段人工合成的单链DNA。 引物为DNA聚合酶提供了游离的3’端，使DNA聚合酶从3’端延伸子链。(DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能) a.什么是引物 b.引物的作用 引物 引物为DNA聚合酶提供了游离的3’端，使DNA聚合酶从3’端延伸子链。(DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能) b.引物的作用 5‘- -3‘ 5‘- -3‘ -5‘ 3‘- 引物 引物 子链延伸 子链延伸 引物是决定PCR特异性的关键。 3‘- -5‘ 95℃ ⑤PCR的过程 5‘- -3‘ 3‘- -5‘ 3‘- -5‘ 5‘- -3‘ 第1步：变性 当温度超过90℃时，双链DNA解聚为单链。 DNA模板 4种脱氧核苷酸 引物 耐高温的DNA聚合酶 ⑤PCR的过程 3‘- -5‘ 5‘- -3‘ 第2步：复性 当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 50℃ 3‘- -5‘ 5‘- 5‘- -3‘ -5‘ ⑤PCR的过程 第3步：延伸 当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 72℃ 3‘- -5‘ 5‘- -3‘ 5‘- -3‘ -5‘ 3‘- 3‘- -5‘ 5‘- 5‘- -3‘ -5‘ ⑤PCR的过程 第一轮循环的产物作为第二轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环产物。 3‘- -5‘ 5‘- -3‘ 5‘- -3‘ -5‘ 3‘- 5‘- -3‘ -5‘ 3‘- -3‘ -5‘ 3‘- 5‘- 3‘- -5‘ 5‘- -3‘ 5‘- -3‘ -5‘ 3‘- 5‘- -3‘ -5‘ 3‘- -3‘ -5‘ 3‘- 5‘- -3‘ -5‘ 3‘- 5‘- -3‘ -5‘ 3‘- 5‘- 3‘- -5‘ 5‘- -3‘ 5‘- -3‘ -5‘ 3‘- 5‘- -3‘ -5‘ 3‘- 5‘- -3‘ -5‘ 3‘- 第二轮循环的产物作为第三轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环产物。 5‘- -3‘ -5‘ 3‘- -3‘ -5‘ 3‘- 5‘- 3‘- -5‘ 5‘- -3‘ 5‘- -3‘ -5‘ 3‘- TaqDNA聚合酶 引物1 原料 模板DNA 目的基因 3＇ 5＇ 5＇ 3＇ 引物2 95 50 72 ℃ PCR过程(三轮扩增) 95 50 72 ℃ 3＇ 5＇ 5＇ 3＇ 第一轮:高温变性 3＇ 5＇ 5＇ 3＇ 95 50 72 ℃ 第一轮:低温复性 3＇ 5＇ 5＇ 3＇ 95 50 72 ℃ 第一轮:中温延伸 3＇ 5＇ 5＇ 3＇ 95 50 72 ℃ 第二轮:高温变性 3＇ 5＇ 5＇ 3＇ 95 50 72 ℃ 第二轮:低温复性 3＇ 5＇ 5＇ 3＇ 95 50 72 ℃ 第二轮:中温延伸 3＇ 5＇ 5＇ 3＇ 95 50 72 ℃ 第三轮:高温变性 3＇ 5＇ 5＇ 3＇ 95 50 72 ℃ 第三轮:低温复性 3＇ 5＇ 5＇ 3＇ 95 50 72 ℃ 第三轮:中温延伸 DNA解链为单链 高温(95℃)变性 低温(50℃)复性 中温(72℃)延伸 引物结合到互补DNA链 TaqDNA聚合酶从引物起始进行子链的合成 ⑤PCR的过程 PCR过程可以在PCR扩增仪(PCR仪)中自动完成。 30 常采用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定PCR扩增产物。 ⑥PCR扩增产物的鉴定 较小的DNA片段在凝胶中的移动相对容易，较大的DNA片段移动难。 当电泳结束时，比较DNA样品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置(标准)，这些已知大小的片段称为DNA分子量标准样。 比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术 区别 解旋 方式 解旋酶催化 边解旋边复制 DNA在高温下变性解旋 全部解旋后在复制 场所 主要在细胞核内 细胞外(主要在PCR扩增仪内) 酶 解旋酶、DNA聚合酶等 耐高温的DNA聚合酶 温度 细胞内温和条件 控制温度，需在不同温度下进行 结果 合成整个DNA分子 扩增特定的DNA片段或基因 联系 ①模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板 ②原料:均为四种脱氧核苷酸 ③酶:均需DNA聚合酶 ④引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3‘端合成子链 拓展1：PCR相关计算 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 1 1 第一次扩增 中长链-短链DNA____个 2 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 3 3 第二次扩增 第三次扩增 中长链-短链DNA____个 4 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 7 7 短链-短链DNA______个 2 第四次扩增 中长链-短链DNA____个 6 长链-中长链DNA____个 含有引物A的DNA____个 含有引物B的DNA____个 2 15 15 短链-短链DNA______个 8 扩增次数 第1次 第2次 第3次 第4次 第n次 DNA总数 21 22 23 24 2n 长链-中长链DNA 中长链-短链DNA 短链-短链 DNA 含引物A(或B) 的DNA 2 0 0 2 2 2 4 0 2 2 6 8 2 2(n-1) 2n-2n 1 3 7 15 2n-1 PCR扩增DNA规律 一个DNA，一对引物（A与B），通过PCR扩增n次： ①扩增产物中，等长链DNA分子数为：______个 ②扩增产物中，不等长链DNA分子数为：_______个 ③扩增产物中，含模板链DNA分子数为：_______个 ④扩增产物中，含引物A（或B）的DNA分子数为：______个 ⑤复制过程中共需引物________个 ⑥第n次复制需要引物_________个 2n-2n 2n 2 2n-1 2n＋1 - 2 2n PCR扩增DNA规律 拓展2：PCR应用概述 扩增目的基因 检测目的基因 产生突变基因 用模板DNA和目的基因相关引物扩增 用待测DNA和目的相关引物扩增 有扩增产物则含有目的基因 无扩增产物则不含目的基因 可在引物中或引物的5`端引入突变序列 产生大量目的基因 产生大量突变基因 PCR的应用 SRY—PCR是对移植前的胚胎进行性别鉴定的技术。 以Y染色体上SRY基因（性别决定基因）的一段序列作引物，用被测胚胎DNA作_____进行PCR扩增。根据SRY基因序列设计的引物长度一般为20～24个核苷酸，其不宜过短的原因主要是__________________。两种引物中G＋C的含量相差不宜过大，原因主要是_________________ _______________。 防止引物随机结合 C、G含量差别大， 低温复性难统一 模板 拓展3：PCR引物的设计 PCR的首要任务就是引物设计。引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物。 设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增高效性。 1.引物设计需考虑的两个因素 扩增 特异性 扩增 高效性 引物 特异性：只扩增出目标DNA的特性 高效性：单位时间内扩增产物的量 特异性太强，扩增效率就会下降 提高扩增效率，扩增特异性就会下降 拓展3：PCR引物的设计 2.引物设计的原则 ①引物长度 一般在15-30碱基之间。过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。过短特异性差。 ②引物GC含量 一般在40%~60%之间，GC含量过高或过低都不利于引发反应。 拓展3：PCR引物的设计 2.引物设计的原则 ③引物自身及引物之间不应存在互补序列 碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。否则引物自身会折叠成发夹结构或引物之间配对结合，从而影响引物与模板的复性结合。 拓展3：PCR引物的设计 2.引物设计的原则 ④退火（复性）温度 退火温度高，扩增特异性强，退火温度低扩增效率高。 如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，使DNA双链结合。一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的。 拓展3：PCR引物的设计 2.引物设计的原则 ⑤引物的5'端可以修饰，而3'端不可修饰 引物的5' 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5'端修饰包括：加酶切位点，加标记荧光，引入蛋白质结合DNA序列，引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。 第二步：基因表达载体的构建 1.基因表达载体的作用 ①使目的基因在受体细胞中稳定存在且遗传给下一代 ②使目的基因在受体细胞中能够表达且发挥作用 是核心步骤 2.基因表达载体的组成 质粒 标记基因 复制原点 启动子 终止子 限制酶切位点 2.基因表达载体的组成 质粒 标记基因 复制原点 启动子 终止子 限制酶切位点 位于基因的上游，紧挨转录起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位，具有驱动基因转录的作用。 位于基因下游，使转录在所需的地方停止下来。 供目的基因插入载体中 2.基因表达载体的组成 质粒 标记基因 复制原点 启动子 终止子 限制酶切位点 诱导型启动子 诱导物 作用 激活或抑制 目的基因表达 2.基因表达载体的组成 质粒 标记基因 复制原点 启动子 终止子 限制酶切位点 便于重组DNA的筛选 能够在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上 基因克隆载体必须具备的条件 标记基因 复制原点 启动子 终止子 限制酶切位点 基因表达载体必须具备的条件 基因克隆载体 与 基因表达载体 基因表达载体插入的目的基因中必须含有能转录出完整的起始密码子、终止密码子和核糖体结合位点的序列。  项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子 化学 成分 DNA片段 DNA片段 mRNA上三个相邻碱基 mRNA上三个相邻碱基 位置 目的基因首端 目的基因尾端 mRNA首端 mRNA尾端 作用 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出RNA 决定转录 的结束 翻译的 起始信号 决定翻译过程的结束 3.基因表达载体的构建过程 限制酶 限制酶 同种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶切割 DNA 连接酶 目的基因 限制酶切割位点 获取目的基因 限制酶切割位点 质粒 重组 DNA分子 3.基因表达载体的构建过程 限制酶 限制酶 DNA 连接酶 质粒 重组 DNA分子 第1步： 用同种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶分别切割质粒和含有目的基因的DNA片段。 第2步： 用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，形成重组DNA分子。 拓展：“单酶切”与“双酶切”构建基因表达载体 用同一种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶分别切割质粒和含有目的基因的DNA片段 构建基因表达载体 1.单酶切 a b c d a、b、c、d四个黏性末端相同。 限制酶切割 DNA连接酶连接 启动子 方向 目的基因转录方向 思考：单酶切有什么缺点？ 单酶切有什么缺点？ 缺点1： 在DNA连接酶的作用下，质粒被重新环化 a b c d 限制酶切割 DNA连接酶连接 DNA连接酶连接 56 单酶切有什么缺点？ 缺点2： 在DNA连接酶的作用， 目的基因被环化。 a b c d 限制酶切割 DNA连接酶连接 DNA连接酶连接 57 单酶切有什么缺点？ 缺点3： 在DNA连接酶的作用，目的基因与质粒反向连接，造成目的基因不能正确表达。 a b c d 限制酶切割 DNA连接酶连接 反向连接重组DNA 58 a b c d 限制酶切割 DNA连接酶连接 缺点1 缺点2 缺点3 思考：如何确定以上缺点？ 单酶切的缺点 反向连接重组DNA 质粒重新环化 目的基因被环化 59 2.双酶切 用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段 构建基因表达载体 限制酶a切割 限制酶b切割 限制酶a切割 限制酶b切割 DNA连接酶连接 a b c d 黏性末端a与c相同；黏性末端b与d相同。 2.双酶切 限制酶a切割 限制酶b切割 限制酶a切割 限制酶b切割 DNA连接酶连接 a b c d 质粒不会重新环化 目的基因 不会被环化 优点1 优点2 优点3 目的基因与质粒 不会发生反向连接 第三步：将目的基因导入受体细胞 基因表达载体 受体细胞 导入 转化： 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 动物 植物 微生物 第三步：将目的基因导入受体细胞 1.将目的基因导入植物细胞 方法1 花粉管通道法 我国科学家独创的一种方法，将Bt基因导入棉花细胞。 用微量注射器将含有目的基因的DNA溶液直接注入子房中 花粉管通道法 子房注射 花柱滴加 在植物授粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加到花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 花粉落到柱头上刺激花粉管萌发并生长至子房 滴管蘸取外源DNA溶液涂抹雌蕊柱头 也可以柱头滴加(如下图) 外源DNA沿花粉管通道进入胚囊 外源DNA 进入受精卵 DNA随机整合 萌发的花粉管 花柱 子房 胚囊 卵细胞 方法1 花粉管通道法 优点 柱头 ①利用植物授粉后形成的天然花粉管通道，将外源基因携带进入胚囊，此时的受精卵未形成细胞壁，且正在进行活跃的DNA复制，容易将外源DNA片段整合到受体基因组中。 ②操作简单、技术成本低，免去了组织培养以及诱导再生植株的全套人工培养过程。 方法2 农杆菌转化法 农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。 ①农杆菌 当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，农杆菌能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA) 转移到被侵染的细胞，并将其整合到该细胞的DNA上。 Ti质粒 T-DNA 农杆菌 ②农杆菌转化法原理 __________插入Ti质粒的________中形成重组Ti质粒 重组Ti质粒转入__________ 转化植物细胞 目的基因插入植物细胞中的________________上 目的基因在植物细胞中稳定存在并__________ 表达 目的基因 T-DNA 农杆菌 染色体DNA Ti质粒 目的基因 构建表达载体 含目的基因的重组Ti质粒 转入 农杆菌 含重组Ti质粒的农杆菌 植物细胞 导入植物细胞 表现出新性状的植物 将目的基因插入染色体DNA中 农杆菌转化法 农杆菌转化法 两次拼接、两次导入 ①两次拼接 第一次拼接：目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上； 第二次拼接(非人工操作)：被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。 农杆菌转化法 两次拼接、两次导入 ②两次导入 第一次导入：将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌； 第二次导入(非人工操作)：含目的基因的T-DNA导入受体细胞。 研究人员将两个抗虫基因(T)导入棉花细胞内培育转基因抗虫棉。那么两个抗虫基因在染色体上随机整合有几种情况？ 转两个T基因 普通棉花细胞 甲 乙 丙 思考·讨论 有三种情况，如右图所示。 若甲、乙、丙三种植株自交，其后代抗虫与不抗虫的比例为多少？ 甲自交→全为抗虫 乙自交→抗虫：不抗虫=3:1 丙自交→抗虫：不抗虫=15:1 2.将目的基因导入动物细胞 ①导入动物细胞通常选择受精卵 ②导入方法： 受精卵 注射器 固定吸管 显微注射仪 显微注射法 3.将目的基因导入原核生物细胞 ①原核生物的作为受体细胞的优点 繁殖快 单细胞 遗传物质少 ②导入方法 (感受态细胞法或Ca2+处理法) Ca2+处理大 肠杆菌细胞 细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态 将重组的基因表达载体导入 胰腺 提取筛选 胰岛素mRNA 胰岛素cDNA 逆转录 重组 质粒 质粒 导入 大肠杆菌 mRNA 胰岛素原 胰岛素 加工 用原核生物生产胰岛素示意图 第四步：目的基因的检测与鉴定 1.分子水平的检测 ①检测目的基因是否导入 如：检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因 ——通过PCR等技术检测 提取棉花细胞DNA 用与Bt基因相关的 引物进行PCR扩增 对扩增产物进行检测 1.分子水平的检测 ②检测目的基因是否转录 如：检测Bt基因是否转录出mRNA 提取棉花细胞mRNA 逆转录 产生DNA 对扩增产物进行检测 用与Bt基因相关的 引物进行PCR扩增 ——通过PCR等技术检测 1.分子水平的检测 ③检测目的基因是否翻译成蛋白质 如：检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白 从棉花中 提取蛋白质 用相应抗体进行 抗原-抗体杂交检测 ——通过抗原-抗体杂交检测 2.个体水平的检测 检测目的基因是否表现出相应的性状 如：检测抗虫棉是否具有抗虫性状 采摘抗虫棉叶片 饲喂 棉铃虫 观察棉铃虫存活情况 筛选和获取目的基因 获取质粒、噬菌体等载体 构建基因表达载体 将含有目的基因的表达载体导入受体细胞 检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性 基因工程的基本操作流程图 筛选和获取目的基因 1.利用PCR获取和扩增目的基因 2.人工合成目的基因 3.通过构建基因文库获取目的基因 第一步：目的基因的筛选与获取 构建基因表达载体 1.用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段 2.用DNA连接酶连接 第二步：基因表达载体的构建 将含有目的基因的表达载体导入受体细胞 1.导入植物细胞：花粉管通道法；农杆菌转化法 2.导入动物细胞：显微注射法 3.导入原核细胞：Ca2+处理法或感受态细胞法 第三步：将目的基因导入受体细胞 检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性 1.分子水平检测 ①检测目的基因是否导入（PCR等技术检测） ②检测目的基因是否转录（PCR等技术检测） ③检测目的基因是否翻译（抗原-抗体检测） 2.个体水平检测 第四步：目的基因的检测与鉴定 DNA片段的扩增及电泳鉴定 探究·实践 1.实验原理 （1）利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理 ①PCR利用了DNA的_________原理，通过_________来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够______________的仪器，一次PCR一般要经历____次循环； 热变性 调节温度 自动调控温度 30 ②PCR扩增DNA片段还利用了_____________的原理。 DNA半保留复制 DNA片段的扩增及电泳鉴定 DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.实验原理 （2）DNA片段电泳鉴定的原理 ①DNA分子具有_____________，在一定的___下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_____的作用下，这些_______________会向着__________________的电极移动，这个过程就是________。 可解离的基团 pH 电场 带电分子 电泳 与它所带电荷相反 ②PCR的产物一般通过____________________来鉴定。 ③在凝胶中DNA分子的迁移速率与_________________、________________和_____等有关 ④凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为________的________下被检测出来。 琼脂糖凝胶电泳 凝胶的浓度 染色 300nm 紫外灯 DNA分子的大小 构象 DNA片段的扩增及电泳鉴定 2.材料用具 ①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增） ②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所） ③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体） ④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头） ⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等） DNA片段的扩增及电泳鉴定 PCR仪 微量离心管 微量移液器 电泳装置 推动杆 调节旋钮 卸枪头按钮 体积刻度 吸液杆 枪头 （注意：加不同样品时，需要更换枪头） DNA片段的扩增及电泳鉴定 2.材料用具 10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL 20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL 20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL 20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL H2O 28～33μL 1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U 模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL 总体积 50μL ⑧PCR反应体系的配方 ⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。 ⑦电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等 注意：酶和缓冲液要在冰块上缓慢融化，用后置于-20℃冰箱中保存。酶和缓冲液一般分装成小份，避免反复融化导致活性降低甚至失活。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 3.PCR实验操作过程 使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。 3.方法步骤 （1）DNA片段的扩增 ①移液： 用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分 ②离心： 待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率） ③反应： 参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。 预变性： DNA片段的扩增及电泳鉴定 可根据目的片段长度适当调整延伸时间 循环程序 变性 复性 延伸 预变性 94℃,5min / / 30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min 最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min （2）DNA片段的电泳鉴定 ①配制琼脂糖溶液 根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀 ②制备凝胶 A.将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。 C.将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜 B.待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。 3.方法步骤 DNA片段的扩增及电泳鉴定 ③加样 将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。 ④电泳 接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1-5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳 ⑤观察记录 取出凝胶置于紫外灯下观察和照相 （2）DNA片段的电泳鉴定 3.方法步骤 DNA片段的扩增及电泳鉴定 注意 为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 PCR扩增不能随意加大试剂用量。 3.方法步骤 DNA片段的扩增及电泳鉴定 DNA片段的扩增及电泳鉴定 4.结果分析与评价 (1)你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ 可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。 如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 (2)你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 一、概念检测 1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上,然后用它侵染番茄细胞,获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。 afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。（ ） (2)构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。（ ） (3)只要检测出番茄细胞中含有afp基因,就代表抗冻番茄培育成功。（ ） √ × × 一、概念检测 2.利用PCR既可以快速扩增特定基因,也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是（ ） A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶 B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶 C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则 D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸 D 二、拓展应用 1.研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时,发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律,在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料,尝试对这个问题作出解释。 答案： 外源基因插入基因组中可能为单位点插入,或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下,插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此,外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如,科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时,发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外,外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。 2.八氢番茄红素合酶(其基因用psy表示)和胡萝卜素脱饱和酶(其基因用crtI表示)参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因,它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtl基因转人水稻,使水稻胚乳中富含β-胡萝ト素,由此生产出的大米称为“黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。 普通大米 黄金大米 (1)科学家在培育“黄金大米”时,将crtI和psy基因导人含pmi基因的质粒中,构建了质粒pSYN12424,该项研究的目的基因是_________________标记基因是__________质粒pSYN12424的作用是_____________ 答案： crtI和psy基因 pmi基因 将目的基因送入水稻细胞 2.八氢番茄红素合酶(其基因用psy表示)和胡萝卜素脱饱和酶(其基因用crtI表示)参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因,它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtl基因转人水稻,使水稻胚乳中富含β-胡萝ト素,由此生产出的大米称为“黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。 普通大米 黄金大米 (2)在构建质粒载体时,目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列?为什么? 答案： 不能，如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断。 (3)请查找相关资料,了解科学家为什么要培育“黄金大米”以及当前关于“是否要推广‘黄金大米'”的各种争论。你还可以提出自己的看法,并与同学交流讨论。 答案： 维生素A在人体内具有非常重要的生理功能,对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是,人体不能合成维生素A,需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病,该地区的居民一般以籼稻作为主食。 (3)请查找相关资料,了解科学家为什么要培育“黄金大米”以及当前关于“是否要推广‘黄金大米'”的各种争论。你还可以提出自己的看法,并与同学交流讨论。 关于“是否要推广‘黄金大米’”的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开。 β-胡萝卜素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此,科学家将两个参与β-胡萝卜素合成的酶的基因转人了籼稻中,使其胚乳中富含β-胡萝卜素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A,从而降低维生素A缺乏症的患病率。 新冠病毒核酸检测 咽拭子采样 检测是否有新冠病毒RNA 新冠病毒RNA的量太少无法检测出来 需要扩增后检测 PCR只能扩增双链DNA 将新冠病毒的RNA通过逆转录后形成DNA PCR扩增逆转录后的DNA 检测 实时荧光定量PCR可以在扩增DNA的同时进行检测。 DNA片段的扩增及电泳鉴定 5.新冠病毒核酸的PCR检测 Lavf58.51.100 Multimedia Cloud Transcode (cloud.baidu.com) Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.6.10 Lavf58.29.100 Bilibili VXCode Swarm Transcoder v0.4.17 $$