大题05 生物技术与工程类-【大题精做】冲刺2025年高考生物大题突破+限时集训（福建专用）

大题05 生物技术与工程类 在近年福建及全国高考中，生物生物技术与工程专题常以丰富多样的现实科研、生产生活实例为情境，巧妙融合考点与考查形式。在微生物利用方面，会基于污水净化、食品发酵等场景，要求考生依据微生物的生长特性和培养基原理，设计实验分离、培养、计数特定微生物，以此考查对相关技术和原理的运用。基因工程的考查多围绕基因药物研发、作物基因改良等热点，给出具体的基因信息或技术流程，让考生分析基因操作的关键步骤、原理及可能遇到的问题，检验对基因工程操作程序的掌握。细胞工程中，无论是植物组织培养、体细胞杂交的植物培育情境，还是动物细胞培养、单克隆抗体制备的医学应用场景，常会通过流程图或文字描述，要求考生解读信息、分析技术要点、预测实验结果。胚胎工程则常以优良畜种培育为背景，呈现胚胎发育各阶段及胚胎工程技术操作过程，考查考生对胚胎发育知识的理解和胚胎移植、分割等技术的应用能力。整体考查形式注重创设复杂情境，要求考生提取信息、分析推理、设计实验并解释现象，着重培养和检验其科学思维、探究能力及解决实际问题的素养。2024年全国甲卷第37题以 “探究消毒液杀灭细菌效果” 的科学实验情境，着重检验考生对微生物培养、无菌操作要点、微生物计数方式，以及鉴别培养基使用等关键知识的掌握与运用水平。2024年山东第25题以“利用基因工程技术编辑基因L,培育耐盐碱大豆品系”的科学实验和探究为情境,考查基因工程等必备知识。2024 全国新课标第35题 以“基因表达载体构建、PCR 技术及环境保护” 的科学实验探究情境，考查考生能否选择恰当引物开展 PCR，以及对转基因成果进行精准分析的能力，及基因结构、PCR 原理、CRISPR/Cas9 技术以及环境保护等重要知识内容。2023年全国乙卷第37题以 “利用作物秸秆生产燃料乙醇” 的科学实验探究作为学科情境。涉及酵母菌的发酵，氮源主要作用以及高压蒸汽灭菌法的注意事项等内容，接种菌 T 对秸秆进行分解这一环节，则是对教材里分解纤维素微生物相关知识的实际应用。2024年福建第17题，以构建麻疹病毒易感转基因模型鼠为情境，考查了基因工程、胚胎工程及特异性免疫等必备和识,。2022年福建卷大题中考查了PCR 技术中引物合成、链延伸方向，以及基因工程里限制酶的应用、重组 DNA 连接方向鉴定原理。2021年福建卷大题考查了PCR引物选择，基因工程工具酶使用、载体构建与转化，以及实验结果分析等 。从近年高考题变化可知，生物试题对教材概念细节考查愈发突出，生物学关键词是得分关键。教学中需引导学生关注教材细节，扎实掌握并灵活运用基本概念与基础知识。 典例一：发酵技术与微生物培养 (2023年全国乙卷)某研究小组设计了一个利用作物秸秆生产燃料乙醇的小型实验。其主要步骤是：先将粉碎的作物秸秆堆放在底部有小孔的托盘中，喷水浸润、接种菌T，培养一段时间后，再用清水淋洗秸秆堆(清水淋洗时菌T不会流失)，在装有淋洗液的瓶中接种酵母菌，进行乙醇发酵(酒精发酵)。实验流程如图所示。 回答下列问题： (1)在粉碎的秸秆中接种菌T，培养一段时间后发现菌T能够将秸秆中的纤维素大量分解，其原因是________________________________________________________________________。 (2)采用液体培养基培养酵母菌，可以用淋洗液为原料制备培养基，培养基中还需要加入氮源等营养成分，氮源的主要作用是_________________________________(答出1点即可)。 通常，可采用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌。在使用该方法时，为了达到良好的灭菌效果，需要注意的事项有______________________________________(答出1点即可)。 (3)将酵母菌接种到灭菌后的培养基中，拧紧瓶盖，置于适宜温度下培养、发酵。拧紧瓶盖的主要目的是________________。但是在酵母菌发酵过程中，还需适时拧松瓶盖，原因是__________________。发酵液中的乙醇可用________________溶液检测。 (4)本实验收集的淋洗液中的________可以作为酵母菌生产乙醇的原料。与以粮食为原料发酵生产乙醇相比，本实验中乙醇生产方式的优点是_____________________________。 【答案】　(1)菌T能够分泌纤维素酶　(2)为合成微生物细胞结构提供原料　为达到良好的灭菌效果，一般在压力为100 kPa，温度为121 ℃的条件下，维持15～30 min　(3)制造无氧环境　排出二氧化碳　酸性的重铬酸钾　(4)葡萄糖　节约粮食、废物利用、清洁环保、不污染环境、生产成本低、原料来源广 【解析】　(1)菌T能够分泌纤维素酶，纤维素酶能将纤维素最终分解为葡萄糖，因此在粉碎的秸秆中接种菌T，培养一段时间后发现菌T能够将秸秆中的纤维素大量分解。(2)培养基的主要成分：水、碳源、氮源、无机盐，其中氮源主要为合成微生物的细胞结构提供原料，微生物细胞中的含氮物质有核酸、蛋白质、磷脂等。 高压蒸汽灭菌法的注意事项有：①把锅内的水加热煮沸，将其中原有的冷空气彻底排除后，将锅密闭，如果高压锅内的空气未排除或未完全排除，则蒸汽不能达到饱和，蒸汽的温度未达到要求，导致灭菌失败；②为达到良好的灭菌效果，一般在压力为100 kPa，温度为121 ℃的条件下，维持15～30 min；③无菌包不宜过大，不宜过紧，各包裹间要有间隙，使蒸汽能对流易渗透到包裹中央，有利于蒸汽流通；④灭菌完成后，当压力表的压力降到零时，打开排气阀，排气时间不少于10～12 min，如果提前打开排气阀，锅内蒸汽压力突然降低，灭菌容器内的液体会冲出容器，造成污染。(3)果酒的制作原理是酵母菌无氧呼吸产生酒精，将酵母菌接种到灭菌后的培养基中进行酒精发酵，酒精发酵需要在无氧的条件下进行，此时拧紧瓶盖的主要目的是制造无氧环境。酵母菌进行无氧呼吸产生酒精和二氧化碳，所以需要根据发酵进程适时拧松瓶盖放出二氧化碳。酒精可用酸性的重铬酸钾溶液来检测，该物质与酒精反应呈现灰绿色。(4)与以粮食为原料发酵生产乙醇相比，利用纤维素为原料生产乙醇具有节约粮食、废物利用、清洁环保、不污染环境、生产成本低、原料来源广等优点。 1．培养基制备与微生物纯化技术 2．微生物分离与计数的两个实例 3．理清“4”种传统发酵食品的制作技术 4．泡菜腌制过程中，乳酸菌数量、乳酸含量和亚硝酸盐含量随发酵时间变化的曲线 (2024年全国甲卷)合理使用消毒液有助于减少传染病的传播。某同学比较了3款消毒液A、B、C杀灭细菌的效果，结果如图所示。回答下列问题： (1)该同学采用显微镜直接计数法和活菌计数法分别测定同一样品的细菌数量，发现测得的细菌数量前者大于后者，其原因是____________________________________________。 (2)该同学从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，再从稀释菌液中取200 μL涂布平板，菌落计数的结果为100，据此推算细菌原液中细菌浓度为________个/mL。 (3)菌落计数过程中，涂布器应先在酒精灯上灼烧，冷却后再涂布。灼烧的目的是______________________ ________________，冷却的目的是__________________________。 (4)据图可知杀菌效果最好的消毒液是______，判断依据是__________________________________________ ________(答出两点即可)。 (5)鉴别培养基可用于反映消毒液杀灭大肠杆菌的效果。大肠杆菌在伊红－亚甲蓝培养基上生长的菌落呈________色。 【答案】　(1)显微镜直接计数法将活菌和死菌一起计数，活菌计数法中存在多个活菌形成一个菌落的情况且只计数活菌　(2)5 000　(3)杀死涂布器上可能存在的微生物，防止微生物污染　防止温度过高杀死菌种　(4)A　A消毒液活细胞减少量最多，且杀菌时间较短，效率最高　(5)深紫 【解析】　(2)从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，即稀释了10倍，再从稀释菌液中取200 μL涂布平板，即0.2 mL，已知菌落计数的结果为100。则1 mL细菌原液中细菌浓度＝(菌落数÷菌液体积)×稀释倍数＝(100个÷0.2 mL)×10＝5 000(个/mL)。 典例二：基因工程与细胞工程 （2023年山东高考真题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (1)与图甲中启动子结合的酶是____________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有________________（答出2个结构即可）。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物___________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的_____________（填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了__________，条带2所检出的蛋白______________（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。 【答案】(1) RNA聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等 (2) F2和R1或F1与R2 a链 (3) J-V5融合蛋白 不是 【分析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA分子，可以是四环素、氨苄青霉素等抗性基因，也可以是荧光蛋白基因或产物能显色的基因。 【详解】（1）基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。　 （2）据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3’-5'，非模板链（也就是a链）是5'-3'；考虑到DNA复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3’-5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。 （3）据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。 1．植物组织培养的过程——原理：植物细胞的全能性 (1)植物组织培养中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。 (2)脱分化阶段不需要光，再分化阶段需要光。 (3)生长素与细胞分裂素的比值高时，促进根的分化、抑制芽的形成；比值低时，促进芽的分化、抑制根的形成。 (4)体内细胞未表现全能性的原因：基因的表达具有选择性。 2．植物体细胞杂交技术——原理：植物细胞的全能性、细胞膜的流动性 3．动物细胞培养——原理：细胞增殖 (1)动物细胞培养中两次使用胰蛋白酶的作用不同：第一次：处理剪碎的组织，使其分散成单个细胞；第二次：使贴壁生长的细胞从瓶壁上脱落下来。 (2)使用或冷冻保存的是10代以内的细胞，原因是保持细胞正常的二倍体核型。 (3)避免杂菌污染的措施：培养液及培养用具灭菌处理，加入一定量的抗生素，定期更换培养液。 (4)区分原代培养和传代培养的关键是是否分瓶培养。 4．动物体细胞克隆技术(核移植技术)——原理：动物细胞核的全能性 (1)核移植获得的克隆动物与提供细胞核的亲本性状可能不同的三个原因：①克隆动物遗传物质来自两个亲本。②发育过程中可能发生基因突变或染色体变异。③外界环境可能引起不可遗传的变异。 (2)克隆动物的产生是无性繁殖，而试管动物则是在体外受精形成受精卵，由受精卵发育成的个体，因此属于有性繁殖。 5．单克隆抗体的制备——原理：细胞膜的流动性、细胞的增殖 2次筛选目的不同：(1)第1次：获得杂交瘤细胞。(2)第2次：获得能分泌所需特异性抗体的杂交瘤细胞。 6.根据限制酶切割位点的位置确定限制酶的种类 (1)应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。 (2)不能选择切割位点位于目的基因和标记基因内部的限制酶，如图甲、乙不能选择SmaⅠ。 (3)为避免目的基因和质粒的自身环化及随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。 7.根据质粒的特点确定限制酶的种类 8.根据Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶 图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)，分析如下： 9．准确记忆哺乳动物的早期胚胎发育过程 (1)桑椹胚是由受精卵分裂形成的，没有分化；而囊胚期虽然已进行细胞分化，但囊胚的内细胞团仍具有全能性。 (2)早期胚胎培养液成分：2“盐”——无机盐和有机盐；2“酸”——氨基酸和核苷酸；2“素”——维生素和激素；2“液体”——水和血清。 10．胚胎移植的操作流程及生理基础 (1)操作流程 ①胚胎移植过程中的两次检查：第一次对收集的胚胎进行检查；第二次对受体母畜是否妊娠进行检查。 ②胚胎移植产生的后代是有性生殖还是无性生殖，取决于胚胎发育的起点。若后代是由受精卵形成的，则为有性生殖；若后代是由核移植技术形成的重组细胞发育而成或胚胎分割形成的胚胎发育而成，则为无性生殖。 ③胚胎移植的胚胎并非只来源于体内受精的胚胎，用于移植的胚胎有三个来源：体内正常受精的胚胎、核移植的胚胎和体外受精产生的早期胚胎。 (2)生理学基础 11．胚胎分割——无性繁殖或克隆 12．胚胎干细胞(ES或EK细胞) （2023年湖北高考真题）某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A为抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。 回答下列问题： (1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞（含浆细胞）_______（填“需要”或“不需要”）通过原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是______。 (2)在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基（如HAT培养基），该培养基对_______和_______生长具有抑制作用。 (3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是_________。 (4)构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是_________。 【答案】(1)不需要 使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合 (2)未融合的亲本细胞 融合的具有同种核的细胞 (3)通过抗体检测呈阳性来获得分泌所需抗体的杂交瘤细胞 (4)④ 【分析】单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。 【详解】（1）浆细胞是高度分化的细胞，不能增殖，所以不需要通过原代培养扩大细胞数量。脂溶性物质PEG可使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。 （2）在杂交瘤细胞筛选过程中，用特定的选择培养基进行筛选，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。 （3）单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，是运用了抗原-抗体杂交技术，抗体检测呈阳性的细胞，即为所需的杂交瘤细胞。 （4）DNA连接酶能连接DNA片段，脱氧核苷酸的磷酸基团位于5'端，-OH位于3'端，①②③脱氧核苷酸链的两端基团有误；DNA连接酶能催化合成磷酸二酯键，即将一条脱氧核苷酸5'端的磷酸基团与另一条脱氧核苷酸链的3'端的-OH相连，④符合题意。 故选④。 （2022年福建高考真题）美西螈具有很强的再生能力。研究表明，美西螈的巨噬细胞在断肢再生的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制，科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14的单克隆抗体，具体方法如下。回答下列问题： （一）基因工程抗原的制备 (1)根据美西螈CD14基因的核苷酸序列，合成引物，利用PCR扩增CD14片段。已知DNA聚合酶催化引物的3’—OH与加入的脱氧核苷酸的5’—P形成磷酸二酯键，则新合成链的延伸方向是 （填“ 5’→3’ ”或“ 3’→5’ ”）。 (2)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切 抗性基因序列如图1所示。用Xho I和Sal 1分别酶切CD14和载体后连接，CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA．可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，理由是 。 培养能表达CD14蛋白的大肠杆菌，分离纯化目的蛋白。 （二）抗CD14单克隆抗体的制备流程如图2所示： (3)步骤①和步骤⑤分别向小鼠注射 和 。 (4)步骤②所用的SP2/0细胞的生长特点是 。 (5)吸取③中的上清液到④的培养孔中，根据抗原—抗体杂交原理，需加入 ① 进行专一抗体检测，检测过程发现有些杂交瘤细胞不能分泌抗CD14抗体，原因是 ② 。 (6)步骤⑥从 中提取到大量的抗CD14抗体，用于检测巨噬细胞。 【答案】(1)5'→3' (2)正向连接的重组DNA有这两种酶切位点（限制酶的识别序列）；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点（没有限制酶的识别序列） (3) CD14蛋白/CD14抗原 分泌抗CD14抗体的杂交瘤细胞 (4)能在体外无限增殖 (5) CD14蛋白 参与形成杂交瘤细胞的B淋巴细胞种类多，有的不能分泌抗CD14抗体 (6)小鼠腹水 【分析】1、PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 2、单克隆抗体制备流程：先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞；诱导B细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞；进行抗体检测，筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养；最后从培养液或小鼠腹水中获取单克隆抗体。 【详解】（1）PCR扩增时，DNA聚合酶催化引物的3'-OH与加入的脱氧核苷酸的5'-P形成磷酸二酯键，因此新链合成的方向是从5'→3'。 （2）可进一步用限制酶XhoⅠ和SalⅠ对CD14的连接方向进行鉴定，是因为正向连接的重组DNA有这两种酶切位点（限制酶的识别序列）；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点（没有限制酶的识别序列）。 （3）步骤①是注射特定抗原，针对本实验目的可知，要获得抗CD14单克隆抗体，故应该注射CD14蛋白/CD14抗原；步骤⑤是将分泌抗CD14抗体的杂交瘤细胞注入小鼠体内培养，以获得大量单克隆抗体。 （4）步骤②所用的SP2/0细胞是骨髓瘤细胞，特点是能在体外无限增殖。 （5）根据抗原—抗体杂交原理，应该用CD14蛋白检测其中是否含抗CD14蛋白的抗体。因为形成杂交瘤细胞的B淋巴细胞种类很多，因此有些杂交瘤细胞不能分泌抗CD14抗体。 （6）从制备单克隆抗体的流程可知，将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔后，最终要从小鼠的腹水中提取抗CD14抗体。 （2024年重庆高考真题）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 (1)基因S启动子的基本组成单位是 。 (2)通过基因工程方法,将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题19图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是 ；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是 。 (3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有 。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是 。 (4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是 。 【答案】(1)脱氧核糖核苷酸（脱氧核苷酸） (2) EcoRⅠ 酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我环化；不能保证目标片段与载体定向链接（反向链接） (3) 酶切后的空载体片段，启动子D+基因S片段      PCR (4)品种DN的基因S上游启动子效应比TL强，使得基因S表达量更高，种子更大 【分析】信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 启动子的基本组成单位 基因的结构 启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA的转录，是一段DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸 电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有哪些成分 PCR及琼脂糖凝胶电泳 电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D+基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段 检测转入是否成功的技术 检测目的基因是都导入受体细胞的方法 在分子水平上检测目的基因是否转入成功可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA 【详解】（1）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，用于启动DNA的转录，是一段DNA片段，其基本组成单位是四种脱氧核糖核苷酸。 （2）①根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoR Ⅰ的识别序列，若使用限制酶EcoR Ⅰ，会使目的基因序列被破坏； ②根据图中限制酶的识别序列可知，酶Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段单向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。 （3）①DNA电泳可以分离不同大小的DNA片段，用限制酶对重组表达载体酶切后的产物不仅有“启动子D+基因S”片段，还有酶切后的空载体片段，因此电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有酶切后的空载体片段和“启动子D+基因S”片段； ②在分子水平上检测目的基因是否转入成过可通过PCR等技术检测受体细胞的DNA上是否插入目的基因或目的基因是否转录出mRNA。 （4）根据（4）题目信息可知，再生植株YZ-1导入的目的基因为取自品种DN的“启动子D＋基因S”序列，再生植株YZ-2导入的目的基因为取自品种TL的“启动子T＋基因S”序列，结合题干信息“两品种中基因S序列无差异”可推测：品种DN的基因S上游的启动子D的效应强于品种TL的启动子T，启动子D使基因S表达量更高，因而种子更大。 （2024年江西高考真题）聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是一种聚酯塑料，会造成环境污染。磷脂酶可催化PET降解。为获得高产磷脂酶的微生物，研究人员试验了2种方法。回答下列问题： (1)方法1从土壤等环境样品中筛选高产磷脂酶的微生物。以磷脂酰乙醇酯（一种磷脂类物质）为唯一碳源制备 培养基，可提高该方法的筛选效率。除碳源外，该培养基中至少还应该有 、 、 等营养物质。 (2)方法2采用 技术定向改造现有微生物，以获得高产磷脂酶的微生物。除了编码磷脂酶的基因外，该技术还需要 、 、 等“分子工具”。 (3)除了上述2种方法之外，还可以通过 技术非定向改造现有微生物，筛选获得能够高产磷脂酶的微生物。 (4)将以上获得的微生物接种到鉴别培养基（在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加2%的琼脂粉和适量的卵黄磷脂）平板上培养，可以通过观察卵黄磷脂水解圈的大小，初步判断微生物产磷脂酶的能力，但不能以水解圈大小作为判断微生物产磷脂酶能力的唯一依据。从平板制作的角度分析，其原因可能是 。 【答案】(1) 选择 水 无机盐 氮源 (2) 基因工程（或转基因） 限制酶 DNA连接酶 载体（或质粒） (3)诱变育种 (4)不同平板中培养基量的差异以及平板内和平板间培养基厚度不均匀 【分析】1、培养基的基本成分：水、无机盐、碳源、氮源及特殊生长因子； 2、微生物的接种：微生物接种的方法很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，常用来统计样品活菌数目的方法是稀释涂布平板法。 【详解】（1）方法1从土壤等环境样品中筛选高产磷脂酶的微生物。以磷脂酰乙醇酯为唯一碳源制备选择培养基，在该培养基中只有能利用磷脂酰乙醇酯的微生物能生长，其他微生物的生长被抑制，进而获得筛选出所需要的微生物，为了提高该方法的筛选效率。除碳源外，该培养基中至少还应该有水分、无机盐和氮源等营养物质，同时还需要提供微生物生长所需要的外界环境条件。 （2）方法2采用基因工程技术定向改造现有微生物，以获得高产磷脂酶的微生物。除了编码磷脂酶的基因，即目的基因外，该技术还需要限制酶、DNA连接酶和载体（或质粒）等“分子工具”，进而可以实现目的基因表达载体的构建。 （3）除了上述2种方法之外，还可以通过诱变育种技术非定向改造现有微生物，筛选获得能够高产磷脂酶的微生物，该该技术的原理是基因突变，由于基因突变具有不定向性，因而该技术具有盲目性。 （4）将以上获得的微生物接种到鉴别培养基（在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加2%的琼脂粉和适量的卵黄磷脂）平板上培养，可以通过观察卵黄磷脂水解圈的大小，初步判断微生物产磷脂酶的能力，但不能以水解圈大小作为判断微生物产磷脂酶能力的唯一依据。从平板制作的角度分析，即倒平板过程中没有经过定量检测，且平板倒置的实际可能也会影响平板中培养基厚度的不同，因此不同平板中培养基量的差异以及平板内培养基厚度不均匀以及平板间厚度不均匀都会影响实验结果的判断，因此可采用降解圈的直径和菌落直径的比值作为判断依据。 （2024年甘肃高考真题）源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率，某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶（如下图），研究了三种酶混合的协同降解作用，以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。 (1)过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X，能起到筛选作用的原因是 。高产纤维素酶菌株筛选时，刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了 。 (2)过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是 。 (3)过程⑤在基因工程中称为 ，该过程需要的主要酶有 。 (4)过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有 。该过程用Ca2+处理细胞，使其处于一种 的生理状态。 (5)课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理，结果如下表。表中协同系数存在差异的原因是 （答出两点）。 生物质原料 降解率（%） 协同系数 酶A 酶B 酶C 混1 混2 混1 混2 小麦秸秆 7.08 6.03 8.19 8.61 26.98 74.33 114.64 玉米秸秆 2.62 1.48 3.76 3.92 9.88 24.98 77.02 玉米芯 0.62 0.48 0.86 0.98 6.79 1.82 11.34 注：混1和混2表示三种酶的混合物 【答案】(1) 只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖 菌落产生的纤维素酶的活性和量有关 (2)耐高温的DNA聚合酶 (3) 基因表达载体的构建 限制酶、DNA连接酶 (4) 繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等 能吸收周围环境中DNA分子 (5)生物质原料不同；混合物中不同酶的含量不同 【分析】信息获取与加工 题干关键信息 所学知识 信息加工 图中④是目的基因的扩增 原理是DNA的半保留复制 该过程温度相对较高，所需的关键酶是耐高温的DNA聚合酶 图中⑤是基因表达载体的构建 其实质是不同DNA片段的切割和连接 该过程需要的关键酶有限制酶和DNA连接酶 图中⑥是将目的基因导入受体细胞 根据受体细胞的不同，导入方法有一定的差异 其受体细胞是原核细胞，常用Ca2+处理受体细胞，使其处于易于吸收周围DNA的状态，即感受态 【详解】（1）选择培养基是指一类根据特定微生物的特殊营养要求或其对某理化因素抗性的原理而设计的培养基。具有只允许特定的微生物生长，而同时抑制或阻止其他微生物生长的功能。在以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的选择培养基中，只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖。 刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，使得含有纤维素的培养基呈现红色。当纤维素被纤维素酶分解时，刚果红与纤维素的复合物无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这个透明圈的大小直接反映了纤维素分解菌分解纤维素的能力。透明圈越大，说明纤维素分解菌分解纤维素的能力越强，即菌落产生的纤维素酶的活性强、量多。 （2）扩增目的基因片段在PCR仪中进行，因此需要耐高温的DNA聚合酶。 （3）根据图示中酶基因与质粒载体经过过程⑤构成重组质粒，推导出过程⑤为基因表达载体的构建，该过程需要限制酶和DNA连接酶。 （4）大肠杆菌作为受体细胞的优点繁殖能力强、生理结构和遗传物质简单、对环境因素敏感、容易进行遗传操作等。 先用Ca2+ 处理细胞，使其成为感受态细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。将重组质粒加于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。 （5）分析表格可知，表中协同系数共3行2列，彼此都不同，因此需要对行、列分别进行分析，各自得出一个原因，正好满足题干要求的2点。 对比同一列的协同系数，如倒数第2列（混1）的3行，从上到下分别为74.33、24.98、1.82，它们有差异的原因在于这三行的“生物质原料”不同（分别是小麦秸秆、玉米秸秆、玉米芯），这是3个数据的自变量，也是因变量协同系数不同的原因。最后一列（混2）的数据也是如此。 对比同一行的协同系数，如第1行（小麦秸秆）的2列，从左到右的分别为74.33、114.64，这两个数据有差异的原因显然在于混1、混2的不同，混1、混2表示酶A、酶B、酶C三种酶的混合物，由于三种酶的配比不同，即混合物中不同酶的含量不同，导致混1、混2协同系数有差异。下方两行（玉米秸秆、玉米芯）的数据也是如此。 综上，表中3行2列的协同系数存在差异的原因有两个，其一是生物质原料存在差异，其二是混合物中不同酶的含量不同。 （2021年福建省高考真题）微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题： (1)根据枣树的MTcDNA的核苷酸序列设计了相应的引物（图1甲），通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为 。 (2)本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。 ①选用 酶将载体P切开，再用 （填“T4DNA或“E·coli81DNA”）连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。 ②载体P′不具有表达MT基因的 和 。选用 酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用 离子处理的大肠杆菌，筛出MT工程菌。 (3)MT基因在工程菌的表达量如图2所示。结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌，理由是 。 【答案】(1)引物1和引物4 (2) EcoRV T4DNA 启动子 终止子 XhoI和PstI 钙 (3)尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定 【分析】1、PCR扩增目的基因需要有一段已知的碱基序列。 2、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞；（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）密码子位于mRNA上，是决定氨基酸的三个相邻碱基，起始密码子分别控制翻译的开始和结束，故为保证基因的正常表达，一对引物应分别位于位点A和位点B的两侧，故选择引物1和引物4。 （2）①MT基因的末端为平末端，故需要用EcoR Ⅴ或Sma Ⅰ切割载体P，但后续需进一步将重组载体P′和载体E连接，故需将MT基因插入Xho I和Pst I两个酶切位点之间，故选EcoR Ⅴ将载体P切开；由于E·coli81DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶可以连接平末端，而MT基因的末端为平末端，故需要用T4DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。 ②载体P′是重组质粒，故不含有有表达MT基因的启动子和终止子；为避免自身环化和反向连接，可选用两种酶切割两种载体，据图可知，载体P′和载体E均含有XhoI和PstI酶，故可选用XhoI和PstI酶进行酶切；将目的基因导入大肠杆菌的方法是钙离子处理法。 （3）由于尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定，故即使MT工程菌的MT蛋白相对含量较高，也无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌。 （2023年北京高考真题）变胖过程中，胰岛B细胞会增加。增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采用胸腺嘧啶类似物标记的方法，研究了L基因缺失导致肥胖的模型小鼠IK中新增B细胞的来源。 (1)EdU和BrdU都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA中，掺入DNA的EdU和BrdU均能与___________互补配对，并可以被分别检测。未掺入的EdU和BrdU短时间内即被降解。 (2)将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细胞，检测双标记细胞占EdU标记细胞的百分比（如图）。图中反映DNA复制所需时长的是从___________点到___________点。 (3)为研究变胖过程中B细胞的增殖，需使用一批同时变胖的小鼠。为此，本实验使用诱导型基因敲除小鼠，即饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，形成小鼠IK。科学家利用以下实验材料制备小鼠IK： ①纯合小鼠Lx：小鼠L基因两侧已插入特异DNA序列（x），但L的功能正常；②Ce酶基因：源自噬菌体，其编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失；③Er基因：编码的Er蛋白位于细胞质，与Er蛋白相连的物质的定位由Er蛋白决定；④口服药T：小分子化合物，可诱导Er蛋白进入细胞核。请完善制备小鼠IK的技术路线：______________________→连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→____________→获得小鼠IK。 (4)各种细胞DNA复制所需时间基本相同，但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上。据此，科学家先用EdU饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU饲喂，再过t2时间后检测B细胞被标记的情况。研究表明，变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，与之相应的检测结果应是_________________________。 【答案】(1)A/腺嘌呤 (2) Q R (3)将Ce酶基因和Er基因连接 饲喂口服药T (4)大多数B细胞没有被BrdU标记 【分析】DNA分子的复制时间：有丝分裂和减数分裂间期；条件：模板（DNA的双链）、能量（ATP水解提供）、酶（解旋酶和DNA聚合酶等）、原料（游离的脱氧核苷酸）；过程：边解旋边复制；结果：一条DNA复制出两条DNA；特点：半保留复制。 【详解】（1）分析题意可知，EdU和BrdU都是胸腺嘧啶（T）类似物，根据碱基互补配对的原则可知，掺入DNA的EdU和BrdU均能与A（腺嘌呤）互补配对，并可以被分别检测。 （2）DNA分子复制时会发生模板链与子链的碱基互补配对，据题可知，将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，则EdU会与A结合，导致子链出现放射性，随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，则BrdU也会与A结合，使放射性增强，最终实现双标记，随复制完成达到峰值，故结合题图可知，图中反映DNA复制所需时长的是从Q点到R点。　 （3）分析题意，要制备IK小鼠，需要用诱导型基因敲除小鼠，而饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，结合所给实验材料及药物可知，制备小鼠IK的技术路线为：将Ce酶基因和Er基因连接（Ce酶可作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失）→连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→饲喂口服药T（诱导Er蛋白进入细胞核）→获得小鼠IK。 （4）据题可知，变胖过程中增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ），由于但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上，若先用EdU饲喂小鼠IK，各种细胞DNA复制所需时间基本相同，t2时间已经经过一个细胞周期，所有的细胞应都含有EdU标记，实验假设是变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，即来源于途径I，该过程已经复制的B细胞直接分裂，不会再有DNA复制过程，故t2时间后用BrdU饲喂则不起作用，即大多数B细胞没有被BrdU标记。 （2023年浙江高考真题）赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题： (1)植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于______。根据这种调节方式，在培养基中添加______，用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。 (2)随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为： ①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因（目的基因），可通过检索______获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。 ②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF）。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与BEF膜发生______，表达载体最终进入细胞核，发生转化。 ③核移植。将转基因的BEF作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为______。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了______重组细胞发育的作用。 ④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至______，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。 ⑤检测。DNA水平检测：利用PCR技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以______为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对总RNA进行______处理，以去除DNA污染，再经逆转录形成cDNA，并以此为______，利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？______。 【答案】(1)负反馈调节 过量赖氨酸类似物 (2)基因数据库 融合 核受体细胞 激活 早期囊胚 转基因BEF DNA酶 PCR的模板 构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。 【分析】负反馈调节是指在一个系统中，系统工作的效果，反过来又作为信息调节该系统的工作，并且使系统工作的效果减弱或受到限制，有助于系统保持稳定。基因工程技术的基本步骤：(1)目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；(2)基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等；(3)将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样.将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法；(4)目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因-DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA-分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原抗体杂交技术.个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）负反馈调节是指在一个系统中，系统工作的效果，反过来又作为信息调节该系统的工作，并且使系统工作的效果减弱或受到限制，有助于系统保持稳定。植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于负反馈调节。如果想得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体可在培养基中添加过量赖氨酸类似物。 （2）①从基因数据库获取获取目的基因编码序列，用化学合成法制备可得到目的基因。 ②表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，根据细胞膜成分，其与BEF膜发生融合。 ③去核的卵母细胞作为受体细胞，其处于减数第二次分裂中期，因为卵母细胞中含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了激活重组细胞发育的作用。 ④胚胎发育到适宜阶段可取出向受体移植。牛、羊一般要培养到桑椹胚或囊胚阶段；植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。 ⑤阳性对照：按照当前实验方案一定能得到正面预期结果的对照实验。阳性对照是已知的对测量结果有影响的因素，目的是确定实验程序无误。阴性对照和阳性对照相反，按照当前的实验方案一定不能得到正面预期结果的对照实验。排除未知变量对实验产生的不利影响。本实验以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，为了检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。应该以含有目的基因的牛耳组织细胞为阳性对照。为了除去DNA污染，可以使用DNA酶使其水解。经逆转录形成cDNA，并以此为PCR的模板进行扩增。目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。 （2023省全国高考真题）GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。 (1)构建突变基因文库，科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常，基因文库是指_______。 (2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建表达载体，其模式图如下所示（箭头为GFP突变基因的转录方向）。图中①为_______；②为_______，其作用是_______；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是_______。 (3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是_______（答出1点即可）。 (4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因（黄色荧光蛋白基因）。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是_______。 【答案】(1)将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因 (2)终止子 启动子 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来 (3)密码子具有简并性 (4)将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达 【分析】有关密码子，考生可从以下几方面把握： ①概念：密码子是mRNA上相邻的3个碱基。 ②种类：64种，其中有3种是终止密码子，不编码氨基酸。 ③特点：一种密码子只能编码一种氨基酸，但一种氨基酸可能由一种或多种密码子编码；密码子具有通用性，即自然界所有的生物共用一套遗传密码。 【详解】（1）将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。 （2）一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子，终止子以及标记基因等，且基因的转录方向为从启动子到终止子，故图中①为终止子，②为启动子，启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素基因就可以作为这种基因。 （3）正常情况下，GFP突变基因应该不发绿色荧光，而大肠杆菌有的发绿色荧光，从密码子特点的角度分析，原因是密码子具有简并性，即一种氨基酸可能由一种或多种密码子决定。 （4）基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，可将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达，如果酵母菌发出黄色荧光，说明YFP基因能在真核细胞中表达，反之则不能在真核细胞中表达。 （2024年福建高考真题）病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR来应对感染。麻疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46（hCD46）是麻疹病毒入侵细胞的主要受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。 回答下列问题： (1)利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是 。 (2)将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是 。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用 限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。 (3)为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其 。将胚胎移植到小鼠c的子宫中，应选用桑葚胚的原因是 。 (4)利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组，目的是 。 (5)若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性，原因是 。 【答案】(1)两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结合 (2) EcoRⅠ和NotI AgeⅠ和HindⅢ (3) 超数排卵 桑葚胚易于在小鼠子宫着床 (4)排除PCR体系中外源DNA的污染 (5)该小鼠能被麻疹病毒感染，且干扰素无法作用于IFNAR以应对感染 【分析】PCR是聚合酶链式反应的缩写。PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过这一技术，可以获取大量的目的基因。PCR扩增反应需要两种引物、模板DNA、原料（4种脱氧核苷酸）、酶（耐高温的DNA聚合酶）。PCR反应过程是：变性→复性→延伸。 【详解】（1）利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的变化是两种引物分别与解开的两条模板链进行碱基互补配对，为子链的延伸做准备，即表现为两种引物分别与含hCD46基因的两条模板链结合 （2）结合图示可知，质粒中以及目的基因的两端含有限制酶EcoRⅠ和NotI的识别序列，且这两个序列位于启动子和终止子之间，因此，将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是EcoRⅠ和NotI。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用AgeⅠ和HindⅢ限制酶组合将重组质粒变为线性DNA，因为这两种限制酶可以将重组质粒分为含目的基因的片段和含有标记基因的片段。 （3）为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其超数排卵，为获取大量的供体胚胎做准备。将胚胎移植到小鼠c的子宫中，通常选用桑葚胚的原因是因为桑葚胚易于在小鼠子宫着床，进而可以提高胚胎的存活率。 （4）利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组作为空白对照，这样可以排除PCR体系中外源DNA的污染，提高实验结果的可信度。 （5）若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该转基因小鼠能接受抗原刺激，进而机体会分泌干扰素，但干扰素无法与相应的受体结合，因为转基因小鼠的受体IFNAR无法表达，因而干扰素无法起作用，因此，该小鼠对麻疹病毒具有高易感性。 （2025·宁夏银川·一模）尿素含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥，但若不经细菌的分解，就不能更好地被植物利用，某科研小组为了将土壤中分解尿素的细菌纯化培养，进行了如下操作，请回答相关问题： 成分 KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4·7H2O 葡萄糖 尿素 琼脂 含量（g） 1.4 2.1 0.2 10.0 1.0 15.0 操作将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1000毫升 (1)上表是尿素分解菌的选择培养基配方，选择培养基是指 。本实验中有两组对照，一组是未接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板和选择培养基平板，另一组是已接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板和选择培养基平板。设置前一组的平板上如果 ，说明培养基在使用前未被杂菌污染；后一组的平板上如果 ，可以说明选择培养基具有选择作用。 (2)将5g土壤溶于45mL无菌水，再稀释倍，按图[    ] （填数字及名称）接种方式将0.1mL样品接种到3个培养基上，统计菌落数目为134、131、137，据此可得出每克土壤中的纤维素分解菌活菌数约为 个。 (3)分解尿素的细菌能合成 ，催化尿素分解产生的可以作为细菌生长的氮源。如果培养基中加入了酚红指示剂，尿素分解的产物会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，根据功能划分该培养基属于 培养基。 (4)土壤中的某些固氮菌可以利用空气中的氮气作为氮源（如圆褐固氮菌能将大气中的氮气转化为，请设计实验进一步确定平板上分离得到的细菌是否是固氮菌。（写出简要思路及预期结果） 。 【答案】(1) 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基 没有菌落生长 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数显著多于选择培养基 (2) 1稀释涂布平板法 (3) 脲酶 鉴别 (4)将平板上分离得到的细菌接种到无氮源的培养基上培养一段时间后，观察是否有出现菌落。若能长出菌落，说明该菌为固氮菌，否则不是固氮菌 【分析】1、实验室的培养基按照功能划分，可以分为选择培养基和鉴别培养基。选择培养基是在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。 2、微生物常见的接种的方法：①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养.在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。 【详解】（1）根据分析，选择培养基是指在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称为选择培养基。本实验中有两组对照，一组是未接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板和选择培养基平板，可证明灭菌是否彻底；另一组是已接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板。前一组的平板上如果没有菌落生长，可以说明培养基在使用前未被杂菌污染；后一组的平板上如果菌落数显著多于同一稀释度的选择培养基平板上的，可以说明选择培养基具有选择作用。 （2）统计菌落数目一般使用稀释涂布平板法，将5g土壤溶于45mL无菌水，再稀释105倍，按图[1]稀释涂布平板法接种方式，将0.1mL样品接种到3个培养基上，统计菌落数目为134、131、137，据此可得出每克土壤中的纤维素分解菌活菌数约为（ 134+131+137）÷3÷0.1×10×105=1.34×109 个。 （3）分解尿素的细菌能合成脲酶，催化尿素分解产生的 NH3 可以作为细菌生长的氮源。如果培养基中加入了酚红指示剂，尿素分解的产物 NH3 会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，根据功能划分该培养基属于鉴别培养基。 （4）土壤中的某些固氮菌可以利用空气中的氮气作为氮源，设计实验时用到的是无氮源培养基，然后检测是否有固氮菌即可。简要思路、预期结果和结论：将平板上分离得到的细菌接种到无氮源的培养基上培养，若能生长，说明该菌为固氮菌，否则不是固氮菌，进一步确定平板上分离得到的细菌是否是固氮菌。 （24-25高三下·贵州·阶段练习）为研究巨噬细胞的作用机制，科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14的单克隆抗体，基本方法如下。回答下列问题： （一）基因工程抗原的制备    注：质粒载体和CD14基因含有的酶切位点及相关结构如图所示，CD14基因中ATG是对应起始密码子的序列，该基因可被HindⅢ切割成Xbp和Ybp的两个片段，且X<Y。 (1)用 技术获取CD14基因时，需要先合成引物1和引物2，根据载体的结构和CD14基因的相关序列，下列序列中最可能参与构成引物1是 。 A．5'-CTCGAGATGAAC-3'    B．5'-GTCGAGTTAATG-3' C．5'-GAGCTCATGAAC-3'    D．5'-CTCGAGTACTTG-3' (2)构建基因表达载体时，用XhoⅠ和SalⅠ分别切割CD14基因和载体后连接，CD14基因会出现正向连接和反向连接，可进一步对重组质粒酶切后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，若正向连接的重组质粒酶切后电泳得到的较小片段为Xbp，所选用的限制酶应该是 。然后培养能表达CD14蛋白的大肠杆菌，并分离纯化CD14蛋白。 （二）抗CD14单克隆抗体的制备流程如图所示：    (3)图中用到CD14蛋白的过程是 （填图中序号），作用分别是 。 (4)步骤⑤通过体内培养获得抗CD14单克隆抗体的具体过程是 。 【答案】(1) PCR A (2)XhoI和Hind Ⅲ (3) ①④ ①过程中CD14蛋白作为抗原刺激小鼠产生相应的B淋巴细胞；③过程中用CD14蛋白检测筛选出能产生抗CD14抗体的杂交瘤细胞 (4)将筛选出的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔中，待小鼠腹腔内产生腹水后，提取腹水中的抗体。 【分析】PCR原理：在高温条件下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。 【详解】（1）用PCR技术提取CD14基因时，需要先合成引物1和引物2，PCR扩增时，子链的延伸的方向是由5'3'端，其中引物由两部分组成：引物1的5'端为XhoⅠ的识别序列+CD14基因的编码链的识别序列，即5'-CTCGAGATGAAC-3'，A正确，BCD错误。 故选A。 （2）依据题干信息，用XhoⅠ和SalⅠ分别切割CD14基因和载体后连接，CD14基因会出现正向连接和反向连接，可进一步对重组质粒酶切后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，若正向连接的重组质粒酶切后电泳得到的较小片段为Xbp，说明此时所用的酶为XhoI和Hind Ⅲ，因为经过XhoI和Hind Ⅲ酶切后，CD14基因才可以产生Xbp序列。 （3）图示过程为抗CD14单克隆抗体的制备流程图，图示中，需要在①和④两个环节用到CD14蛋白，其中，①过程中CD14蛋白的作用，主要是作为抗原刺激小鼠产生相应的B淋巴细胞；④过程中CD14蛋白的作用是，用CD14蛋白检测筛选出能产生抗CD14抗体的杂交瘤细胞。 （4）步骤⑤可通过体外培养和体内培养两个途径获取单克隆抗体，其中体内培养的具体过程为：将筛选出的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔中，待小鼠腹腔内产生腹水后，提取腹水中的抗体即可。 （2025·黑龙江·一模）葡萄糖二酸是一种葡萄糖衍生物，广泛应用于医药、保健和聚合物材料等领域。传统的葡萄糖二酸合成主要通过化学氧化葡萄糖实现，存在选择性低、产生副产物和高污染废物等问题。我国研究人员利用酿酒酵母实现了葡萄糖二酸的高效生产。肌醇加氧酶（MIOX）和糖醛酸脱氢酶（Udh）是从葡萄糖到葡萄糖二酸的生物合成途径中的两种关键酶，研究人员将融合蛋白基因MIOX4—Udh导入酿酒酵母的基因组，经过高通量筛选最终获得目的菌株GA16。 (1)研究人员需设计MIOX4基因的引物M1、M2及Udh基因的引物U1、U2，分别利用PCR扩增基因MIOX4和Udh，然后混合杂交把基因MIOX4和Udh拼接在一起。设计4种引物时应做到 。获得融合蛋白基因MIOX4—Udh后利用PCR扩增时 （填“需要”或“不需要”）另外设计引物。 (2)研究人员将含融合蛋白基因MIOX4—Udh的DNA片段以及酿酒酵母的染色体DNA用 切割，然后用 拼接（如图1），并进一步获得目的菌株GA16。为保证融合蛋白基因导入位置的正确性，避免酿酒酵母其他内源碱基序列对融合蛋白基因MTOX4—Udh表达的干扰，还需对基因表达载体利用PCR扩增后检测，选择的最佳引物组合是 。 (3)Myo-肌醇是合成葡萄糖二酸的前体物质，研究人员通过调控相关基因表达、改善培养条件等措施，对目的菌株GA16进行优化培养，想进一步提高葡萄糖二酸的生产效率，优化培养前（图2）后（图3）的测量结果如图。据图分析，研究人员的目的 （填“已经”或“未”）达到，依据是 。改善培养条件是指 。 注：OD600的数值可反映反应容器中的酿酒酵母的浓度。 【答案】(1) M1、M2中的一种引物与U1、U2中的一种引物必须具有互补配对的片段 不需要 (2) （相同）限制酶 DNA连接酶 引物1和引物4 (3) 已经 与优化培养前相比，葡萄糖 二酸浓度和OD600的数值升高，Myo-肌醇的浓度降低 调节反应容器中碳源、氮源的浓 度（或比例）、温度等（合理即可） 【分析】构建基因表达载体时，需要用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶，限制酶用来切劃质粒载体和目的基因，DNA连接酶用来连接目的基因和质粒载体。 【详解】（1）为实现MIOX4基因和Udh基因的拼接，引物设计需要注意的是M1、M2中的一种引物与U1、U2中的一种引物必须具有互补配对的片段，使扩增后的基因片段能通过碱基互补配对完成连接。由于融合基因的两端仍可分别与 4种引物中的另外2种 结合，因此得到融合基因后用 PCR 扩增时不需要另外专门设计新引物。 （2）切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，又称限制酶，DNA连接酶可连接DNA片段之间的磷酸二酯键，故研究人员将含融合蛋白基因MIOX4—Udh的DNA片段以及酿酒酵母的染色体DNA用同种限制酶切割，然后用DNA连接酶拼接，并进一步获得目的菌株GA16。为保证融合蛋白基因 MIOX4一Udh导人位置的正确性并能够表 达，利用PCR扩增时需用引物1和引物4，因为这两种引物分别结合启动子区和终止子区。 （3）据图分析，与优化培养前相比，葡萄糖二 酸浓度和OD600的数值升高，Myo-肌醇的浓 度降低，说明通过控制相关基因表达、改善培 养条件等措施加快了Myo-肌醇向葡萄糖二 酸的转化，研究人员的目的已经达到。改善培养条件是指调节反应容器中碳源、氮源的浓度、温度等。 （2025·河南·模拟预测）水稻基因组中的B基因仅在体细胞和精子中正常表达，在卵细胞中不能转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，科研人员设计了如图所示的实验。回答下列问题： (1)构建表达载体时，将水稻B基因编码蛋白的序列与荧光素酶Luc基因拼接成B—Luc融合基因，其目的是 。表达载体中潮霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因作为 ，可用于筛选含有表达载体的水稻细胞。启动子是 识别和结合的部位，能驱动基因转录。 (2)图中①过程常采用感受态细胞法，是利用 处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。②过程中，农杆菌侵染水稻愈伤组织，使T-DNA整合到水稻细胞的 上。鉴定筛选水稻幼苗时，检测指标除了幼苗对潮霉素和卡那霉素的抗性外，还可以检测 。 (3)若转基因植株中B基因在卵细胞中正常表达，与野生型相比，其受精能力可能发生改变。为验证这一推测，可进行杂交实验：让转基因植株作母本，野生型植株作父本进行杂交，同时设置 作为对照，统计并比较 。 【答案】(1) 便于检测B基因在卵细胞中的表达情况 标记基因 RNA聚合酶 (2) Ca2+ 染色体DNA 是否有荧光 (3) 野生型植株作母本，野生型植株作父本的杂交实验 两组实验的子代数量 【分析】图中①表示将目的基因导入农杆菌，②表示采用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞，之后再采用植物组织培养技术获得转基因植株。 【详解】（1）荧光素酶Luc基因表达的产物可通过特定方法检测，将水稻B基因编码蛋白的序列与荧光素酶Luc基因拼接成B—Luc融合基因，就能通过检测荧光来判断B基因在卵细胞中是否表达以及表达情况。潮霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因作为标记基因，使含有表达载体的水稻细胞能在含有潮霉素或卡那霉素的培养基中存活，可用于筛选。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，只有结合后才能驱动基因转录。 （2）采用感受态细胞法将表达载体导入农杆菌时，通常利用Ca2+处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中的DNA分子的生理状态。农杆菌中的Ti质粒上的T—DNA 可转移至受体细胞，并整合到水稻细胞的染色体DNA上。因为构建了B—Luc融合基因，所以除了检测幼苗对潮霉素和卡那霉素的抗性外，还能通过检测是否有荧光（或荧光强度）来判断融合基因是否表达，进而判断B基因的表达情况。 （3）为验证转基因植株中B基因在卵细胞中正常表达时其受精能力可能发生改变的推测，可让转基因植株作母本，野生型植株作父本进行杂交，同时设置野生型植株作母本，野生型植株作父本的杂交实验作为对照，通过统计并比较两组实验的子代数量，如果两组子代数量有明显差异，就可以说明转基因植株卵细胞的受精能力发生了改变。 （24-25高三下·陕西安康·阶段练习）埃博拉病毒（EBOV）是一种极其危险且罕见的病毒，其引起的埃博拉出血热是世界上最致命的病毒性出血热之一。NP蛋白在EBOV的复制中具有重要作用，也是检测EBOV的重要靶蛋白。研究人员从EBOV中分离出NP蛋白，并用于制备抗EBOV单克隆抗体，相关实验流程如图1所示。请回答下列问题： (1)在培养骨髓瘤细胞时，所用培养液中常需要添加血清，原因是 。图1中给小鼠注射NP蛋白的目的是 。 (2)利用抗EBOV单克隆抗体检测血浆中EBOV含量的原理如图2所示。为判断某人是否感染了EBOV，研究人员进行了两组检测。先将抗EBOV单克隆抗体固定在支持物上，甲组向检测体系中同时添加一定量该人的血液和适量酶标记的NP蛋白；乙组向检测体系中只添加等量酶标记的NP蛋白。保温一段时间后洗涤，再向甲、乙两组检测体系中添加a，最后比较b。 ①甲组向检测体系中添加一定量该人血液的同时，还需加入适量酶标记的NP蛋白，目的是 。 ②请将上述步骤补充完整：a． 。b． 。 ③预期结果和结论： 。 【答案】(1) 提供细胞生长所需的营养物质（如生长因子）和激素 诱导小鼠产生针对NP蛋白的特异性B淋巴细胞 (2) 作为竞争性抗原，与患者血液中的NP蛋白（若存在）竞争结合固定在支持物上的抗体 添加酶反应的底物（如白色底物） 检测并比较甲、乙两组的蓝色的显色强度 若甲组蓝色的显色强度显著低于乙组，说明患者血液中含有NP蛋白（感染EBOV）；若甲、乙两组蓝色的显色强度无显著差异，说明患者未感染EBOV 【分析】本实验通过竞争性ELISA法检测EBOV感染。 血清作用：提供细胞培养所需的生长因子。  免疫小鼠：获取特异性B细胞以制备单克隆抗体。  检测原理：利用抗原-抗体竞争结合及酶标记信号放大，定量分析NP蛋白存在与否。 关键点在于竞争结合的逻辑和对照组的设置，确保检测结果的准确性和特异性。 【详解】（1）动物细胞培养时，血清提供必需的营养成分和生长因子，弥补合成培养基的不足，确保细胞正常生长。通过免疫小鼠，其脾脏中会产生能分泌抗NP蛋白抗体的B细胞，这是制备单克隆抗体的关键步骤，所以图1中给小鼠注射NP蛋白。 （2）①根据题意信息可知，若血液中存在EBOV的NP蛋白，会与酶标记的NP蛋白竞争结合抗体位点，减少酶标记物的结合量，降低检测信号，所以加入适量酶标记的NP蛋白作为竞争性抗原，与患者血液中的NP蛋白（若存在）竞争结合固定在支持物上的抗体，从而通过信号变化判断感染情况。 ②根据图示反应原理，待测抗原中的目标抗原和酶标记抗原竞争结合固相抗体，标记抗原的酶可催化白色底物变为蓝色产物。所以a.可以向甲、乙两组检测体系中添加添加酶反应的底物（如白色底物），b．最后检测并比较甲、乙两组的蓝色的显色强度。 ③如果如果血液中NP蛋白的含量越少，酶标记抗原和抗体结合得越多，酶催化生成的蓝色产物就越多，检测体系蓝色就越深。预期结果和结论：若甲组蓝色的强度显著低于乙组，说明患者血液中含有NP蛋白较多（感染EBOV）；若甲、乙两组蓝色的显色强度无显著差异，说明患者未感染EBOV。 （2025·河北保定·一模）由P基因编码的P蛋白是一种水通道蛋白，该蛋白在植物调节水分吸收方面发挥着 重要作用。科研人员利用基因工程技术培育出了高表达P蛋白的转基因玉米，图1表示P 基因片段和农杆菌的Ti质粒及几种限制酶的识别序列和切割位点。回答下列问题： (1)若b链为P基因转录的模板链，则扩增P 基因时，应选择的引物是 。构建基因 表达载体时，切割Ti质粒应选用的两种酶为 。 (2)用含重组 Ti质粒的农杆菌侵染玉米后，应在含 的培养基中进行筛选。科研人 员进一步用PCR 验证P基因是否成功导入玉米细胞，电泳结果如图2所示。其中①为 P 基因，作为阳性对照，②为阴性对照，③为检测结果，由此可验证 。 (3)为了验证玉米植株中是否成功表达出P 蛋白，可用 技术进行检测。 (4)侵染后的玉米外植体需要先进行脱分化，然后在含有 （填植物激素）的培养基上诱导生根和生芽。从遗传学的角度看，玉米外植体能形成完整植株的原因是 。 【答案】(1) 引物2和引物3 EcoR I和SpeI (2) 潮霉素 P基因成功导入了玉米细胞 (3)抗原一抗体杂交 (4) 生长素、细胞分裂素 玉米外植体细胞含有发育成完整个体的全部遗传信息 【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸；转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 【详解】（1）启动子在基因的左边，b链为P基因转录的模板链，则b链的5'端在右边，3'端在左边；链的5'端在左边，3'端在右边。引物结合在模板链的3'端，所以选择的引物应该为引物2和引物3。 构建基因表达载体时，切割Ti质粒的其中一种限制酶不能选用XbaI，否则会切下终止子，故限制酶只能在EcoR I、SpeI及MunI中选择。MunI在T-DNA的边界序列以外，故应该选择EcoR I和PSeI。 （2）潮霉素抗性基因位于T-DNA内，用含重组Ti质粒的农杆菌侵染玉米后，应在含潮霉素的培养基中筛选出含P基因的玉米细胞。经过电泳图谱比较，③待测玉米细胞中有一条条带与①的阳性对照相同，说明P基因成功导入了玉米细胞。 （3）为了验证玉米植株中是否成功表达出P蛋白，常用抗原一抗体杂交技术进行检测。 （4）侵染后的玉米外植体需要先进行脱分化，然后在含有生长素和细胞分裂素等的培养基上诱导生根和生芽。从遗传学的角度看，玉米外植体能形成完整植株的原因是玉米外植体细胞含有发育成完整个体的全部遗传信息。 （24-25高三下·河北邯郸·开学考试）中国科学院的研究团队利用细胞工程和基因编辑技术，成功培育出世界上首例只有双母亲来源的孤雌小鼠和双父亲来源的孤雄小鼠，实现了哺乳动物的同性繁殖，实验流程如图所示。请回答下列问题： (1)用 对雌性小鼠进行超数排卵处理可得到大量卵母细胞，受精时的卵母细胞所处的时期为 。 (2)体外培养动物细胞时，除需要满足无菌、无毒的环境及适宜的营养物质、温度等条件外，还需要满足的气体条件是 。 (3)为了获得更多甲的后代，在得到的重构胚发育到 或囊胚期时，对其进行分割；在分割囊胚阶段的胚胎时，应注意 ，否则会影响胚胎的恢复和进一步发育。 (4)卵细胞、精子分别转化为phESC、ahESC，它们类似于胚胎干细胞，胚胎干细胞具有 的潜能。不考虑致死情况，得到的孤雄小鼠性染色体组成为 。 (5)据图分析，只依赖雄性小鼠不能得到孤雄小鼠，请写出两个理由： 。 【答案】(1) 促性腺激素 MⅡ期 (2)95%空气和5%CO2的混合气体 (3) 桑葚胚 将内细胞团均等分割 (4) 分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体 XX、XY或YY (5)需要将ahESC和另一个精子一起注入一个去核卵细胞中；重构胚必须移植到雌性小鼠体内才能发育为个体 【分析】1、卵细胞激活转化成phFSC，通过基因编辑技术获得具精子细胞核特点的phESC，获得甲，从而得到孤雌小鼠。 2、精子激活转化成ahFSC，通过基因编辑技术获得具卵细胞细胞核特点的ahESC，获得乙，从而得到孤雄小鼠。 【详解】（1）用促性腺激素对雌性小鼠进行超数排卵处理可得到大量卵母细胞，而卵母细胞需要培养到MII期才能受精。 （2）体外培养动物细胞时，除需要满足无菌、无毒的环境及适宜的营养物质、温度等条件外，还需要控制的气体条件是95%空气与5%CO2的混合气体，其中CO2的主要作用是维持培养液的pH。 （3）为了获得更多甲的后代，应选择发育良好、形态正常的桑葚胚或囊胚，将其移入盛有操作液的培养皿中，然后在显微镜下用分割针或分割刀分割。在分割囊胚阶段的胚胎时，要注意将内细胞团均等分割，否则会影响胚胎的恢复和进一步发育。 （4）卵细胞、精子分别转化为phESC、ahESC，它们类似于胚胎干细胞，胚胎干细胞具有分化为成年动物体内的任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。不考虑致死情况，孤雌小鼠具有双母亲来源，因此其性染色体组成为XX，而孤雄小鼠的染色体来源于两只雄鼠产生的精子，精子的性染色体为X或Y，所以孤雄小鼠的性染色体组成可能是XX、XY或YY。 （5）结合题图可知，只依赖雄性小鼠不能得到孤雄小鼠，这是因为要获得孤雄小鼠需要将ahESC和另一个精子一起注入一个去核卵细胞中，而卵细胞来自雌性小鼠，另外获得的重构胚必须移植到雌性小鼠体内才能发育为个体，可见离开雌性小鼠不能获得孤雄小鼠。 1 / 38 学科网（北京）股份有限公司 $$ 大题05 生物技术与工程类 在近年福建及全国高考中，生物生物技术与工程专题常以丰富多样的现实科研、生产生活实例为情境，巧妙融合考点与考查形式。在微生物利用方面，会基于污水净化、食品发酵等场景，要求考生依据微生物的生长特性和培养基原理，设计实验分离、培养、计数特定微生物，以此考查对相关技术和原理的运用。基因工程的考查多围绕基因药物研发、作物基因改良等热点，给出具体的基因信息或技术流程，让考生分析基因操作的关键步骤、原理及可能遇到的问题，检验对基因工程操作程序的掌握。细胞工程中，无论是植物组织培养、体细胞杂交的植物培育情境，还是动物细胞培养、单克隆抗体制备的医学应用场景，常会通过流程图或文字描述，要求考生解读信息、分析技术要点、预测实验结果。胚胎工程则常以优良畜种培育为背景，呈现胚胎发育各阶段及胚胎工程技术操作过程，考查考生对胚胎发育知识的理解和胚胎移植、分割等技术的应用能力。整体考查形式注重创设复杂情境，要求考生提取信息、分析推理、设计实验并解释现象，着重培养和检验其科学思维、探究能力及解决实际问题的素养。2024年全国甲卷第37题以 “探究消毒液杀灭细菌效果” 的科学实验情境，着重检验考生对微生物培养、无菌操作要点、微生物计数方式，以及鉴别培养基使用等关键知识的掌握与运用水平。2024年山东第25题以“利用基因工程技术编辑基因L,培育耐盐碱大豆品系”的科学实验和探究为情境,考查基因工程等必备知识。2024 全国新课标第35题 以“基因表达载体构建、PCR 技术及环境保护” 的科学实验探究情境，考查考生能否选择恰当引物开展 PCR，以及对转基因成果进行精准分析的能力，及基因结构、PCR 原理、CRISPR/Cas9 技术以及环境保护等重要知识内容。2023年全国乙卷第37题以 “利用作物秸秆生产燃料乙醇” 的科学实验探究作为学科情境。涉及酵母菌的发酵，氮源主要作用以及高压蒸汽灭菌法的注意事项等内容，接种菌 T 对秸秆进行分解这一环节，则是对教材里分解纤维素微生物相关知识的实际应用。2024年福建第17题，以构建麻疹病毒易感转基因模型鼠为情境，考查了基因工程、胚胎工程及特异性免疫等必备和识,。2022年福建卷大题中考查了PCR 技术中引物合成、链延伸方向，以及基因工程里限制酶的应用、重组 DNA 连接方向鉴定原理。2021年福建卷大题考查了PCR引物选择，基因工程工具酶使用、载体构建与转化，以及实验结果分析等 。从近年高考题变化可知，生物试题对教材概念细节考查愈发突出，生物学关键词是得分关键。教学中需引导学生关注教材细节，扎实掌握并灵活运用基本概念与基础知识。 典例一：发酵技术与微生物培养 (2023年全国乙卷)某研究小组设计了一个利用作物秸秆生产燃料乙醇的小型实验。其主要步骤是：先将粉碎的作物秸秆堆放在底部有小孔的托盘中，喷水浸润、接种菌T，培养一段时间后，再用清水淋洗秸秆堆(清水淋洗时菌T不会流失)，在装有淋洗液的瓶中接种酵母菌，进行乙醇发酵(酒精发酵)。实验流程如图所示。 回答下列问题： (1)在粉碎的秸秆中接种菌T，培养一段时间后发现菌T能够将秸秆中的纤维素大量分解，其原因是________________________________________________________________________。 (2)采用液体培养基培养酵母菌，可以用淋洗液为原料制备培养基，培养基中还需要加入氮源等营养成分，氮源的主要作用是_________________________________(答出1点即可)。 通常，可采用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌。在使用该方法时，为了达到良好的灭菌效果，需要注意的事项有______________________________________(答出1点即可)。 (3)将酵母菌接种到灭菌后的培养基中，拧紧瓶盖，置于适宜温度下培养、发酵。拧紧瓶盖的主要目的是________________。但是在酵母菌发酵过程中，还需适时拧松瓶盖，原因是__________________。发酵液中的乙醇可用________________溶液检测。 (4)本实验收集的淋洗液中的________可以作为酵母菌生产乙醇的原料。与以粮食为原料发酵生产乙醇相比，本实验中乙醇生产方式的优点是_____________________________。 1．培养基制备与微生物纯化技术 2．微生物分离与计数的两个实例 3．理清“4”种传统发酵食品的制作技术 4．泡菜腌制过程中，乳酸菌数量、乳酸含量和亚硝酸盐含量随发酵时间变化的曲线 (2024年全国甲卷)合理使用消毒液有助于减少传染病的传播。某同学比较了3款消毒液A、B、C杀灭细菌的效果，结果如图所示。回答下列问题： (1)该同学采用显微镜直接计数法和活菌计数法分别测定同一样品的细菌数量，发现测得的细菌数量前者大于后者，其原因是____________________________________________。 (2)该同学从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，再从稀释菌液中取200 μL涂布平板，菌落计数的结果为100，据此推算细菌原液中细菌浓度为________个/mL。 (3)菌落计数过程中，涂布器应先在酒精灯上灼烧，冷却后再涂布。灼烧的目的是______________________ ________________，冷却的目的是__________________________。 (4)据图可知杀菌效果最好的消毒液是______，判断依据是__________________________________________ ________(答出两点即可)。 (5)鉴别培养基可用于反映消毒液杀灭大肠杆菌的效果。大肠杆菌在伊红－亚甲蓝培养基上生长的菌落呈________色。 典例二：基因工程与细胞工程 （2023年山东高考真题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。 (1)与图甲中启动子结合的酶是____________。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有________________（答出2个结构即可）。 (2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物___________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的_____________（填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了__________，条带2所检出的蛋白______________（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。 1．植物组织培养的过程——原理：植物细胞的全能性 (1)植物组织培养中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。 (2)脱分化阶段不需要光，再分化阶段需要光。 (3)生长素与细胞分裂素的比值高时，促进根的分化、抑制芽的形成；比值低时，促进芽的分化、抑制根的形成。 (4)体内细胞未表现全能性的原因：基因的表达具有选择性。 2．植物体细胞杂交技术——原理：植物细胞的全能性、细胞膜的流动性 3．动物细胞培养——原理：细胞增殖 (1)动物细胞培养中两次使用胰蛋白酶的作用不同：第一次：处理剪碎的组织，使其分散成单个细胞；第二次：使贴壁生长的细胞从瓶壁上脱落下来。 (2)使用或冷冻保存的是10代以内的细胞，原因是保持细胞正常的二倍体核型。 (3)避免杂菌污染的措施：培养液及培养用具灭菌处理，加入一定量的抗生素，定期更换培养液。 (4)区分原代培养和传代培养的关键是是否分瓶培养。 4．动物体细胞克隆技术(核移植技术)——原理：动物细胞核的全能性 (1)核移植获得的克隆动物与提供细胞核的亲本性状可能不同的三个原因：①克隆动物遗传物质来自两个亲本。②发育过程中可能发生基因突变或染色体变异。③外界环境可能引起不可遗传的变异。 (2)克隆动物的产生是无性繁殖，而试管动物则是在体外受精形成受精卵，由受精卵发育成的个体，因此属于有性繁殖。 5．单克隆抗体的制备——原理：细胞膜的流动性、细胞的增殖 2次筛选目的不同：(1)第1次：获得杂交瘤细胞。(2)第2次：获得能分泌所需特异性抗体的杂交瘤细胞。 6.根据限制酶切割位点的位置确定限制酶的种类 (1)应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。 (2)不能选择切割位点位于目的基因和标记基因内部的限制酶，如图甲、乙不能选择SmaⅠ。 (3)为避免目的基因和质粒的自身环化及随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。 7.根据质粒的特点确定限制酶的种类 8.根据Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶 图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)，分析如下： 9．准确记忆哺乳动物的早期胚胎发育过程 (1)桑椹胚是由受精卵分裂形成的，没有分化；而囊胚期虽然已进行细胞分化，但囊胚的内细胞团仍具有全能性。 (2)早期胚胎培养液成分：2“盐”——无机盐和有机盐；2“酸”——氨基酸和核苷酸；2“素”——维生素和激素；2“液体”——水和血清。 10．胚胎移植的操作流程及生理基础 (1)操作流程 ①胚胎移植过程中的两次检查：第一次对收集的胚胎进行检查；第二次对受体母畜是否妊娠进行检查。 ②胚胎移植产生的后代是有性生殖还是无性生殖，取决于胚胎发育的起点。若后代是由受精卵形成的，则为有性生殖；若后代是由核移植技术形成的重组细胞发育而成或胚胎分割形成的胚胎发育而成，则为无性生殖。 ③胚胎移植的胚胎并非只来源于体内受精的胚胎，用于移植的胚胎有三个来源：体内正常受精的胚胎、核移植的胚胎和体外受精产生的早期胚胎。 (2)生理学基础 11．胚胎分割——无性繁殖或克隆 12．胚胎干细胞(ES或EK细胞) （2023年湖北高考真题）某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A为抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。 回答下列问题： (1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞（含浆细胞）_______（填“需要”或“不需要”）通过原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是______。 (2)在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基（如HAT培养基），该培养基对_______和_______生长具有抑制作用。 (3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是_________。 (4)构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是_________。 （2022年福建高考真题）美西螈具有很强的再生能力。研究表明，美西螈的巨噬细胞在断肢再生的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制，科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14的单克隆抗体，具体方法如下。回答下列问题： （一）基因工程抗原的制备 (1)根据美西螈CD14基因的核苷酸序列，合成引物，利用PCR扩增CD14片段。已知DNA聚合酶催化引物的3’—OH与加入的脱氧核苷酸的5’—P形成磷酸二酯键，则新合成链的延伸方向是 （填“ 5’→3’ ”或“ 3’→5’ ”）。 (2)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切 抗性基因序列如图1所示。用Xho I和Sal 1分别酶切CD14和载体后连接，CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA．可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，理由是 。 培养能表达CD14蛋白的大肠杆菌，分离纯化目的蛋白。 （二）抗CD14单克隆抗体的制备流程如图2所示： (3)步骤①和步骤⑤分别向小鼠注射 和 。 (4)步骤②所用的SP2/0细胞的生长特点是 。 (5)吸取③中的上清液到④的培养孔中，根据抗原—抗体杂交原理，需加入 ① 进行专一抗体检测，检测过程发现有些杂交瘤细胞不能分泌抗CD14抗体，原因是 ② 。 (6)步骤⑥从 中提取到大量的抗CD14抗体，用于检测巨噬细胞。 （2024年重庆高考真题）大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN（种子较大）中的表达量高于品种TL（种子较小），然后克隆了该基因（两品种中基因S序列无差异）及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 (1)基因S启动子的基本组成单位是 。 (2)通过基因工程方法,将DN克隆的“启动子D+基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题19图所示信息（不考虑未标明序列）判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是 ；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ。原因是 。 (3)为验证“启动子D+基因S”是否连接在表达载体上，可用限制酶对重组表达载体酶切后进行电泳。电泳时，对照样品除指示分子大小的标准参照物外，还应有 。经验证的重组表达载体需转入农杆菌，检测转入是否成功的技术是 。 (4)用检测后的农杆菌转化品种YZ所得再生植株YZ-1的种子变大。同时将从TL克隆的“启动子T+基因S”序列成功导入YZ，所得再生植株YZ-2的种子也变大，但小于YZ-1。综合分析，大豆品种DN较TL种子大的原因是 。 （2024年江西高考真题）聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是一种聚酯塑料，会造成环境污染。磷脂酶可催化PET降解。为获得高产磷脂酶的微生物，研究人员试验了2种方法。回答下列问题： (1)方法1从土壤等环境样品中筛选高产磷脂酶的微生物。以磷脂酰乙醇酯（一种磷脂类物质）为唯一碳源制备 培养基，可提高该方法的筛选效率。除碳源外，该培养基中至少还应该有 、 、 等营养物质。 (2)方法2采用 技术定向改造现有微生物，以获得高产磷脂酶的微生物。除了编码磷脂酶的基因外，该技术还需要 、 、 等“分子工具”。 (3)除了上述2种方法之外，还可以通过 技术非定向改造现有微生物，筛选获得能够高产磷脂酶的微生物。 (4)将以上获得的微生物接种到鉴别培养基（在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加2%的琼脂粉和适量的卵黄磷脂）平板上培养，可以通过观察卵黄磷脂水解圈的大小，初步判断微生物产磷脂酶的能力，但不能以水解圈大小作为判断微生物产磷脂酶能力的唯一依据。从平板制作的角度分析，其原因可能是 。 （2024年甘肃高考真题）源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率，某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶（如下图），研究了三种酶混合的协同降解作用，以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。 (1)过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X，能起到筛选作用的原因是 。高产纤维素酶菌株筛选时，刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了 。 (2)过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是 。 (3)过程⑤在基因工程中称为 ，该过程需要的主要酶有 。 (4)过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有 。该过程用Ca2+处理细胞，使其处于一种 的生理状态。 (5)课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理，结果如下表。表中协同系数存在差异的原因是 （答出两点）。 生物质原料 降解率（%） 协同系数 酶A 酶B 酶C 混1 混2 混1 混2 小麦秸秆 7.08 6.03 8.19 8.61 26.98 74.33 114.64 玉米秸秆 2.62 1.48 3.76 3.92 9.88 24.98 77.02 玉米芯 0.62 0.48 0.86 0.98 6.79 1.82 11.34 注：混1和混2表示三种酶的混合物 （2021年福建省高考真题）微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题： (1)根据枣树的MTcDNA的核苷酸序列设计了相应的引物（图1甲），通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为 。 (2)本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。 ①选用 酶将载体P切开，再用 （填“T4DNA或“E·coli81DNA”）连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。 ②载体P′不具有表达MT基因的 和 。选用 酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用 离子处理的大肠杆菌，筛出MT工程菌。 (3)MT基因在工程菌的表达量如图2所示。结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌，理由是 。 （2023年北京高考真题）变胖过程中，胰岛B细胞会增加。增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采用胸腺嘧啶类似物标记的方法，研究了L基因缺失导致肥胖的模型小鼠IK中新增B细胞的来源。 (1)EdU和BrdU都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA中，掺入DNA的EdU和BrdU均能与___________互补配对，并可以被分别检测。未掺入的EdU和BrdU短时间内即被降解。 (2)将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细胞，检测双标记细胞占EdU标记细胞的百分比（如图）。图中反映DNA复制所需时长的是从___________点到___________点。 (3)为研究变胖过程中B细胞的增殖，需使用一批同时变胖的小鼠。为此，本实验使用诱导型基因敲除小鼠，即饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，形成小鼠IK。科学家利用以下实验材料制备小鼠IK： ①纯合小鼠Lx：小鼠L基因两侧已插入特异DNA序列（x），但L的功能正常；②Ce酶基因：源自噬菌体，其编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失；③Er基因：编码的Er蛋白位于细胞质，与Er蛋白相连的物质的定位由Er蛋白决定；④口服药T：小分子化合物，可诱导Er蛋白进入细胞核。请完善制备小鼠IK的技术路线：______________________→连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→____________→获得小鼠IK。 (4)各种细胞DNA复制所需时间基本相同，但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上。据此，科学家先用EdU饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU饲喂，再过t2时间后检测B细胞被标记的情况。研究表明，变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，与之相应的检测结果应是_________________________。 （2023年浙江高考真题）赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题： (1)植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于______。根据这种调节方式，在培养基中添加______，用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。 (2)随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为： ①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因（目的基因），可通过检索______获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。 ②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF）。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与BEF膜发生______，表达载体最终进入细胞核，发生转化。 ③核移植。将转基因的BEF作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为______。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了______重组细胞发育的作用。 ④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至______，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。 ⑤检测。DNA水平检测：利用PCR技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以______为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对总RNA进行______处理，以去除DNA污染，再经逆转录形成cDNA，并以此为______，利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？______。 （2023省全国高考真题）GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。 (1)构建突变基因文库，科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常，基因文库是指_______。 (2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建表达载体，其模式图如下所示（箭头为GFP突变基因的转录方向）。图中①为_______；②为_______，其作用是_______；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是_______。 (3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是_______（答出1点即可）。 (4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因（黄色荧光蛋白基因）。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是_______。 （2024年福建高考真题）病毒感染初期，机体会分泌干扰素并作用于细胞受体IFNAR来应对感染。麻疹是由麻疹病毒感染引起的急性传染病。已知人白细胞分化抗原46（hCD46）是麻疹病毒入侵细胞的主要受体，小鼠没有该受体，科研人员构建hCD46转基因小鼠用于相关研究，部分流程如图所示。 回答下列问题： (1)利用PCR技术获取目的基因hCD46，复性温度下发生的扩增过程是 。 (2)将hCD46接入质粒应选用的限制酶组合是 。为提高转基因效率，同时避免标记基因进入胚胎体内，应选用 限制酶组合将重组质粒变为线性DNA。 (3)为获取大量胚胎用于移植，可用激素处理小鼠a，使其 。将胚胎移植到小鼠c的子宫中，应选用桑葚胚的原因是 。 (4)利用PCR技术对子代小鼠进行hCD46基因检测，应设置不加DNA模板的对照组，目的是 。 (5)若能进一步构建既表达hCD46受体又敲除IFNAR基因的小鼠，则该小鼠对麻疹病毒具有高易感性，原因是 。 （2025·宁夏银川·一模）尿素含氮量高，化学性质相对稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥，但若不经细菌的分解，就不能更好地被植物利用，某科研小组为了将土壤中分解尿素的细菌纯化培养，进行了如下操作，请回答相关问题： 成分 KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4·7H2O 葡萄糖 尿素 琼脂 含量（g） 1.4 2.1 0.2 10.0 1.0 15.0 操作将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1000毫升 (1)上表是尿素分解菌的选择培养基配方，选择培养基是指 。本实验中有两组对照，一组是未接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板和选择培养基平板，另一组是已接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板和选择培养基平板。设置前一组的平板上如果 ，说明培养基在使用前未被杂菌污染；后一组的平板上如果 ，可以说明选择培养基具有选择作用。 (2)将5g土壤溶于45mL无菌水，再稀释倍，按图[    ] （填数字及名称）接种方式将0.1mL样品接种到3个培养基上，统计菌落数目为134、131、137，据此可得出每克土壤中的纤维素分解菌活菌数约为 个。 (3)分解尿素的细菌能合成 ，催化尿素分解产生的可以作为细菌生长的氮源。如果培养基中加入了酚红指示剂，尿素分解的产物会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，根据功能划分该培养基属于 培养基。 (4)土壤中的某些固氮菌可以利用空气中的氮气作为氮源（如圆褐固氮菌能将大气中的氮气转化为，请设计实验进一步确定平板上分离得到的细菌是否是固氮菌。（写出简要思路及预期结果） 。 （24-25高三下·贵州·阶段练习）为研究巨噬细胞的作用机制，科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14的单克隆抗体，基本方法如下。回答下列问题： （一）基因工程抗原的制备    注：质粒载体和CD14基因含有的酶切位点及相关结构如图所示，CD14基因中ATG是对应起始密码子的序列，该基因可被HindⅢ切割成Xbp和Ybp的两个片段，且X<Y。 (1)用 技术获取CD14基因时，需要先合成引物1和引物2，根据载体的结构和CD14基因的相关序列，下列序列中最可能参与构成引物1是 。 A．5'-CTCGAGATGAAC-3'    B．5'-GTCGAGTTAATG-3' C．5'-GAGCTCATGAAC-3'    D．5'-CTCGAGTACTTG-3' (2)构建基因表达载体时，用XhoⅠ和SalⅠ分别切割CD14基因和载体后连接，CD14基因会出现正向连接和反向连接，可进一步对重组质粒酶切后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，若正向连接的重组质粒酶切后电泳得到的较小片段为Xbp，所选用的限制酶应该是 。然后培养能表达CD14蛋白的大肠杆菌，并分离纯化CD14蛋白。 （二）抗CD14单克隆抗体的制备流程如图所示：    (3)图中用到CD14蛋白的过程是 （填图中序号），作用分别是 。 (4)步骤⑤通过体内培养获得抗CD14单克隆抗体的具体过程是 。 （2025·黑龙江·一模）葡萄糖二酸是一种葡萄糖衍生物，广泛应用于医药、保健和聚合物材料等领域。传统的葡萄糖二酸合成主要通过化学氧化葡萄糖实现，存在选择性低、产生副产物和高污染废物等问题。我国研究人员利用酿酒酵母实现了葡萄糖二酸的高效生产。肌醇加氧酶（MIOX）和糖醛酸脱氢酶（Udh）是从葡萄糖到葡萄糖二酸的生物合成途径中的两种关键酶，研究人员将融合蛋白基因MIOX4—Udh导入酿酒酵母的基因组，经过高通量筛选最终获得目的菌株GA16。 (1)研究人员需设计MIOX4基因的引物M1、M2及Udh基因的引物U1、U2，分别利用PCR扩增基因MIOX4和Udh，然后混合杂交把基因MIOX4和Udh拼接在一起。设计4种引物时应做到 。获得融合蛋白基因MIOX4—Udh后利用PCR扩增时 （填“需要”或“不需要”）另外设计引物。 (2)研究人员将含融合蛋白基因MIOX4—Udh的DNA片段以及酿酒酵母的染色体DNA用 切割，然后用 拼接（如图1），并进一步获得目的菌株GA16。为保证融合蛋白基因导入位置的正确性，避免酿酒酵母其他内源碱基序列对融合蛋白基因MTOX4—Udh表达的干扰，还需对基因表达载体利用PCR扩增后检测，选择的最佳引物组合是 。 (3)Myo-肌醇是合成葡萄糖二酸的前体物质，研究人员通过调控相关基因表达、改善培养条件等措施，对目的菌株GA16进行优化培养，想进一步提高葡萄糖二酸的生产效率，优化培养前（图2）后（图3）的测量结果如图。据图分析，研究人员的目的 （填“已经”或“未”）达到，依据是 。改善培养条件是指 。 注：OD600的数值可反映反应容器中的酿酒酵母的浓度。 （2025·河南·模拟预测）水稻基因组中的B基因仅在体细胞和精子中正常表达，在卵细胞中不能转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，科研人员设计了如图所示的实验。回答下列问题： (1)构建表达载体时，将水稻B基因编码蛋白的序列与荧光素酶Luc基因拼接成B—Luc融合基因，其目的是 。表达载体中潮霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因作为 ，可用于筛选含有表达载体的水稻细胞。启动子是 识别和结合的部位，能驱动基因转录。 (2)图中①过程常采用感受态细胞法，是利用 处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。②过程中，农杆菌侵染水稻愈伤组织，使T-DNA整合到水稻细胞的 上。鉴定筛选水稻幼苗时，检测指标除了幼苗对潮霉素和卡那霉素的抗性外，还可以检测 。 (3)若转基因植株中B基因在卵细胞中正常表达，与野生型相比，其受精能力可能发生改变。为验证这一推测，可进行杂交实验：让转基因植株作母本，野生型植株作父本进行杂交，同时设置 作为对照，统计并比较 。 （24-25高三下·陕西安康·阶段练习）埃博拉病毒（EBOV）是一种极其危险且罕见的病毒，其引起的埃博拉出血热是世界上最致命的病毒性出血热之一。NP蛋白在EBOV的复制中具有重要作用，也是检测EBOV的重要靶蛋白。研究人员从EBOV中分离出NP蛋白，并用于制备抗EBOV单克隆抗体，相关实验流程如图1所示。请回答下列问题： (1)在培养骨髓瘤细胞时，所用培养液中常需要添加血清，原因是 。图1中给小鼠注射NP蛋白的目的是 。 (2)利用抗EBOV单克隆抗体检测血浆中EBOV含量的原理如图2所示。为判断某人是否感染了EBOV，研究人员进行了两组检测。先将抗EBOV单克隆抗体固定在支持物上，甲组向检测体系中同时添加一定量该人的血液和适量酶标记的NP蛋白；乙组向检测体系中只添加等量酶标记的NP蛋白。保温一段时间后洗涤，再向甲、乙两组检测体系中添加a，最后比较b。 ①甲组向检测体系中添加一定量该人血液的同时，还需加入适量酶标记的NP蛋白，目的是 。 ②请将上述步骤补充完整：a． 。b． 。 ③预期结果和结论： 。 （2025·河北保定·一模）由P基因编码的P蛋白是一种水通道蛋白，该蛋白在植物调节水分吸收方面发挥着 重要作用。科研人员利用基因工程技术培育出了高表达P蛋白的转基因玉米，图1表示P 基因片段和农杆菌的Ti质粒及几种限制酶的识别序列和切割位点。回答下列问题： (1)若b链为P基因转录的模板链，则扩增P 基因时，应选择的引物是 。构建基因 表达载体时，切割Ti质粒应选用的两种酶为 。 (2)用含重组 Ti质粒的农杆菌侵染玉米后，应在含 的培养基中进行筛选。科研人 员进一步用PCR 验证P基因是否成功导入玉米细胞，电泳结果如图2所示。其中①为 P 基因，作为阳性对照，②为阴性对照，③为检测结果，由此可验证 。 (3)为了验证玉米植株中是否成功表达出P 蛋白，可用 技术进行检测。 (4)侵染后的玉米外植体需要先进行脱分化，然后在含有 （填植物激素）的培养基上诱导生根和生芽。从遗传学的角度看，玉米外植体能形成完整植株的原因是 。 （24-25高三下·河北邯郸·开学考试）中国科学院的研究团队利用细胞工程和基因编辑技术，成功培育出世界上首例只有双母亲来源的孤雌小鼠和双父亲来源的孤雄小鼠，实现了哺乳动物的同性繁殖，实验流程如图所示。请回答下列问题： (1)用 对雌性小鼠进行超数排卵处理可得到大量卵母细胞，受精时的卵母细胞所处的时期为 。 (2)体外培养动物细胞时，除需要满足无菌、无毒的环境及适宜的营养物质、温度等条件外，还需要满足的气体条件是 。 (3)为了获得更多甲的后代，在得到的重构胚发育到 或囊胚期时，对其进行分割；在分割囊胚阶段的胚胎时，应注意 ，否则会影响胚胎的恢复和进一步发育。 (4)卵细胞、精子分别转化为phESC、ahESC，它们类似于胚胎干细胞，胚胎干细胞具有 的潜能。不考虑致死情况，得到的孤雄小鼠性染色体组成为 。 (5)据图分析，只依赖雄性小鼠不能得到孤雄小鼠，请写出两个理由： 。 1 / 21 学科网（北京）股份有限公司 $$