3.1重组DNA技术的基本工具课件-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3

普通棉 抗虫棉 苏云 金杆菌 Bt抗虫 基因 普通棉花 抗虫棉 导入 表达 提取 第3章 基因工程 问题1：不同生物的基因为什么能拼接？ 问题2：外源基因为什么能在受体细胞中表达？ 相同的碱基互补配对方式 相同的复制、转录、翻译方式 通用的遗传密码 1.绝大多数生物都以DNA为遗传物质 2.不同的生物具有相同的遗传分子机制 基因工程诞生的理论基础： 相同的遗传信息在不同的生物体内表达出相同的蛋白质。 基因 控制 性状 DNA RNA 蛋白质 复制 转录 翻译 基因在空间上转移并成功表达 第3章 基因工程 本节聚焦 1."分子手术刀"—限制性内切核酸酶 2."分子缝合针"—DNA连接酶 3."分子运输车"—载体 基因工程概念 重组DNA技术的基本工具 第1节 重组DNA技术的基本工具 　　基因工程是指按照人们的愿望, 通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 生物体外 基因 DNA分子水平 基因重组 基因工程育种优点： 一、基因工程概念 重组DNA技术 、基因拼接技术 、转基因技术 定向改造生物的遗传特性。 克服远缘杂交不亲和的障碍（打破生殖隔离）。 工程别名：操作环境： 操作对象： 操作水平： 操作原理： 二、重组DNA技术的基本工具 1.主要来源： 2.种类： 3.作用： 数千种 原核生物 EcoRⅠ识别GAATTC序列，在G和A间切开 SmaⅠ识别CCCGGG序列，在C和G间切开。 识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，断开特定部位的磷酸二酯键。 切开的是两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，氢键自动断开。 （一）"分子手术刀"—限制性内切核酸酶（限制酶） 5' 5' 3' 3' 5' 5' 3' 3' 产生黏性末端或平末端 4.作用结果(切割产物)： 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。 黏性末端 平末端 5.作用特点： 一种限制酶一般只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的位置切割DNA分子。 专一性： 特异性： 限制酶只能切割DNA，而不能作用于RNA、蛋白质等物质。 ②呈现碱基互补对称，中轴线两侧的碱基反向对称重复排列的 ，称为回文序列。 ①大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数4个、8个或其他数量。 识别序列特点： 拓展：限制酶的名字的由来 P72 EcoRⅠ：大肠杆菌（Escherichia coli）R型菌株中分离出的第一个限制酶； SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分离出的第一个限制酶。 EcoRⅠ 种加词头两个字母 菌株型号 数字表示分离出来的第几种限制酶 属名首字母 切割侵入细胞的外源DNA，使之失效，保证自身安全。 细菌的DNA分子不具备该限制酶的识别序列；或者限制酶识别序列被甲基化了。 1.限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？ 2.为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？ 3.请写出下列限制酶切割形成的黏性末端。 同种限制酶产生的黏性末端相同。 不同的限制酶可能会形成相同的黏性末端。 识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。 (二)"分子缝合针"—DNA连接酶 1. 作用： 2.DNA连接酶种类： 种类 E.coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 来源 功能特性 相同点 将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 大肠杆菌 T4噬菌体 可以连接两种末端，但是连接平末端的效率较低 可以连接粘性末端和平末端，但连接平末端的效率低于T4DNA连接酶 都恢复被限制酶切开的磷酸二酯键 DNA连接酶作用没有特异性。 注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但不能连接单链DNA！ DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？ 都能催化磷酸二酯键形成。 DNA聚合酶连接的是游离的脱氧核苷酸，需要模板； DNA连接酶连接的是DNA片段。 相同点： 不同点： 3.几种相关酶的比较 名称 作用部位 作用结果 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA(水解)酶 解旋酶 磷酸二酯键 碱基对之间的氢键 将DNA切成两个片段 磷酸二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子 磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端 磷酸二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸 将双链DNA分子局部解旋为单链 课堂练习 1.(2022·天津耀华中学高二期中)以下是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是 A.以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的 B.②片段是在识别序列为 的限制酶作用下形成的 C.①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下可形成重组DNA分子 D.限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键 √ 探究‧活动： 思考2：要想获得目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？ 要切2个切口，产生4个黏性末端。 5' 3' 5' 3' 运用限制酶从苏云金杆菌的DNA上提取出Bt基因。 思考3：Bt基因是否可以直接导入到棉花细胞（受体细胞）？为什么？ 否，外源基因难以进入细胞，直接导入后也不容易稳定存在并表达。通常需要利用载体将基因送入细胞。 思考1：限制酶切割一次可断开几个磷酸二酯键？产生多少游离的磷酸基团？产生几个黏性末端？消耗几分子水？ 2；2；2；2。 (三)"分子运输车"—载体 1.作用： 将目的基因运输到受体细胞中。 使目的基因能够在受体细胞内大量复制。 问题1.载体要与外源基因连接，需要具备什么条件？ 问题2.要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？ 问题3.我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？ 2.基因工程载体所具备的条件： ③具有标记基因，便于筛查含有重组DNA分子的细胞 ②能在受体细胞中稳定保存并复制 ①有一个至多个限制酶切割位点，便于插入目的基因 能在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。 ④对受体细胞无害、易分离 真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 2.种类： 质粒、噬菌体、动植物病毒等 （1）质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。 （2）噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，能在宿主细胞内复制，部分噬菌体能引起宿主裂解。 （3）病毒能侵染细胞，有些病毒(HIV)还可以将自己的核酸整合到宿主细胞的染色体上。 质粒和噬菌体由严格的宿主选择性，只能在相应的菌体中生存和繁殖。向动物细胞中导入外源基因，常用到DNA病毒或RNA病毒。 标记基因的筛选原理： 载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示： 课堂总结 限制酶 DNA连接酶 载体 ①有一个至多个限制酶切割位点 ②在受体细胞中稳定保存并复制 ③有特殊的标记基因 ④对受体细胞无害,易分离 质粒、噬菌体 、动植物病毒 基因工程的基本工具 作为载体的条件 种类： 磷酸二酯键 来源： 主要来源于原核生物 特点： 作用部位： 具有特异性和专一性 结果： 形成黏性末端或平末端 连接部位：磷酸二酯键 种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶 作用： 把两条双链DNA片段拼接起来 提取： 鉴定： 在一定温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。 1.实验原理 （1）DNA不溶于(冷)酒精，但某些蛋白质溶于酒精。 （2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，能溶于2mol/L的NaCl溶液。 2.材料和试剂 选材： 富含DNA的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。 不选哺乳动物血液，因其成熟的红细胞无细胞核和线粒体等。 可选择鸡血，鸡血不需要研磨，可以加入放入清水中，让细胞吸水涨破。 探究.实践 DNA的粗提取 试剂 溶解并提取DNA 溶解杂质、析出DNA 溶解DNA 鉴定DNA，要现配现用 利用DNA 、RNA蛋白质和脂质在理化性质方面的差异进行提取。 研磨液成分 作用 EDTA SDS Tris-HCl缓冲液 使蛋白质变性 抑制DNA酶活性 稳定DNA 研磨液: 体积分数95%的酒精: 2mol/L的NaCl溶液: 二苯胺试剂: 蒸馏水 3.方法步骤 （1）称取洋葱，切碎，倒入研磨液，充分研磨。 （2）纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取上清液。 （3）上清液中加入等体积、预冷酒精，静置2-3min，用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷 起白色丝状物（粗提取的DNA） 。 （4）2mol/L的NaCl+丝状物或沉淀物+二苯胺试剂4ml混匀，沸水浴5min，冷却后观察 到蓝色。 （或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干） （或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取上清液） 防止DNA发生断裂，得到较完整的DNA。 破碎细胞 去除杂质 析出DNA 鉴定DNA 问题1：为何要用预冷酒精？ 问题2：玻璃棒为何沿一个方向搅拌？ 问题3：提取得到的丝状物是不是纯DNA？ 酒精的目的是溶解杂质、析出DNA。预冷后降低DNA酶的活性抑制DNA降解。 粗提取物，可能还有少量RNA和蛋白质等杂质。 蓝色深浅与DNA含量有关 （不加DNA做对照） ①目的基因自连 ③目的基因与运载体连接 ②运载体自连 ④目的基因与目的基因连接 ⑤运载体与运载体连接 将同一种限制酶切割获得的目的基因与运载体混合后加入DNA连接酶会出现的连接方式有哪几种？ 用不同的限制酶分别切割目的基因和质粒，以形成不同的末端，避免片段的任意连接。 探究‧活动： 优化酶切方案 识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。 不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义? 同尾酶使构建载体时切割位点的选择范围扩大。 怎样才能避免片段的任意连接？ 酶b 例如，选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。 选择限制酶的方法： (1）根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择 PstI。 ②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲能选择 SmaI。 ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶（非同尾酶）切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用 PstI和EcoRI 两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点）。 2.下列关于基因运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由均正确的是 A.能够复制，以便目的基因插入其中 B.具有多个限制酶切割位点，便于目的基因的表达 C.具有某些标记基因，便于重组DNA的筛选 D.对受体细胞无害，便于重组DNA的筛选 √ 3.某细菌质粒上有标记基因如图所示，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是 A.①是c；②是b；③是a B.①是a和b；②是a；③是b C.①是a和b；②是b；③是a D.①是c；②是a；③是b √ （2）根据质粒的特点确定限制酶的种类 4.图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。 （1）在基因工程的操作中，不宜选用SmaI，原因是SmaI会破坏__________ 和__________________________。 （2）在基因工程的操作中，不宜选用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，___________________________________________________。 目的基因 质粒上的抗生素抗性基因 目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中 （3）由于反应体系中含有大量的外源DNA片段和质粒，加入PstI一种限制酶后，会得到大量的目的基因片段和质粒片段，再加入DNA连接酶后，除了会形成目的基因与质粒连接的环状产物外，还会形成______________________连接的环状产物以及_____________________连接的环状产物。此外，目的基因与质粒的连接既可以是正向连接，也可以是____________，后者可能会导致目的基因无法正常表达。 目的基因与目的基因 质粒片段与质粒片段 反向连接 Lavf60.16.100 $$