专题08 基因工程（山东专用）-【好题汇编】2025年高考生物一模试题分类汇编

专题08基因工程 考点概览 考点01基因工程 基因工程考点01 一、单选题 1．（2025·山东青岛·一模）野生大豆的SAMS基因具有提高抗逆性的作用。水稻是一种盐敏感型作物，为提高水稻的抗盐碱胁迫能力，研究者将野生大豆的SAMS基因转入水稻细胞内，从而培养出转基因水稻株系，具体过程如图。下列说法错误的是（    ） A．图示过程中发生了两次转化 B．Ⅰ和Ⅲ都需使用固体培养基 C．Ⅰ中的筛选可使用PCR技术 D．获得的转基因水稻苗都具备抗盐碱能力 【答案】D 【分析】将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法。 【详解】A、转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，图示过程需要两次转化，分别为，一是将目的基因（SAMS基因）转化质粒的T-DNA分子上，二是指被插入目的基因的T-DNA转化到受体细胞的染色体DNA分子上，A正确； B、Ⅰ和Ⅲ分别用于培养农杆菌和植物组织培养的再分化过程，均需要使用固体培养基，B正确； C、PCR技术可用于目的基因和基因表达载体的筛选，C正确； D、SAMS基因具有提高抗逆性的作用，获得的转基因水稻幼苗不一定都具有抗盐碱的能力，所以需要将转基因水稻置于盐碱的环境中，进行筛选与鉴定，D错误。 故选D。 2．（2025·山东青岛·一模）采用PCR技术可获取并扩增目的基因。下列说法正确的是（    ） A．若PCR的模板是mRNA，完成扩增只需要逆转录酶 B．预变性有利于模板DNA充分解聚为单链 C．复性温度太高会导致引物和模板的非特异性结合增加 D．一个DNA模板完成第20轮循环需要（220-2）个引物 【答案】B 【分析】PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可分为变性、复性、延伸三步。在循环之前，常需要进行一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。PCR过程为：变性，当温度上升到90 ℃以上时，氢键断裂，双链DNA解旋为单链。复性，当温度降低到50℃左右是，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。延伸，温度上升到72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸，在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。 【详解】A、若PCR的模板是mRNA，完成扩增需要逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶，A错误； B、预变性温度较高，双链DNA在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA，B正确； C、复性温度太低会导致引物和模板的非特异性结合增加，温度太高会使引物与模板结合减少，C错误； D、合成1个DNA分子需要2个引物，一个模板完成第20轮循环会合成220-219个DNA，因此需要的引物为（220-219）×2=220个，D错误。 故选B。 3. （2025·山东泰安·一模）关于“DNA粗提取与鉴定”、“琼脂糖凝胶电泳”、“PCR扩增”实验，下列说法正确的是（ ） A. 将洋葱切碎、研磨、过滤，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟后，DNA存在于沉淀物中 B. 鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 C. 凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察 D. 对2个双链DNA分子进行PCR扩增，第n次循环共需引物2n+1个 【答案】D 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。 （2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、将洋葱切碎加研磨液研磨、过滤后，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟后，DNA存在于上清液中，A错误； B、在DNA鉴定过程中，常用二苯胺在沸水浴条件下与DNA反应呈现蓝色来鉴定DNA。在这个过程中，鉴定过程中DNA双螺旋结构会解旋，B错误； C、DNA分子在凝胶载样缓冲液中带正电荷或负电荷，可用于电泳；电泳缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，在波长为300nm的紫外灯下可以被检测出来，凝胶载样缓冲液中加入的是指示剂，C错误； D、PCR技术中，DNA复制遵循半保留复制原则。一个双链DNA分子经过n次循环后得到2ⁿ个DNA分子，需要的引物数量为（2ⁿ⁺¹ - 2）×2个（因为最初的2个DNA分子各有2条模板链，不需要引物）。n-1次循环共需引物（2ⁿ - 2）×2，第n次循环共需引物2n+1个，D正确。 故选D。 4. （2025·山东淄博·一模）科研人员利用花菜对DNA的粗提取实验进行改进。使用不同的研磨液过滤提取DNA、加酒精后用不同的去杂质方法纯化DNA，并进行相关检测，结果如下表。的比值可检查DNA纯度，纯DNA的为1.8，当存在蛋白质污染时，这一比值会明显降低。下列说法正确的是（ ） 研磨提取 加酒精后去杂质 研磨液的NaCl浓度 （mol/L） 沉淀质量 （g） 提取的 DNA浓度 （ng/μL） OD260/OD280 去杂质方式 沉淀质量 （g） 纯化的 DNA浓度 （ng/μL） OD260/OD280 0.14 0.0789 59.5 1.29 离心 0.068 81.5 1.53 2 0.0409 100.6 1.57 4℃冰箱静置 0.1028 336.4 1.41 A. 研磨液配置过程中，需用2mol/L的HCl溶液将研磨液调至弱碱性 B. 与0.14mol/L相比，用2mol/L的NaCl溶液研磨得到的沉淀物中的DNA浓度更高 C. 去杂质时应用1500 r/min离心转速将DNA沉淀下来，且离心法获得的纯度高 D. DNA分子在碱性溶液中加热降解后可与二苯胺反应生成蓝色络合物 【答案】A 【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理是：①DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出，从而达到分离的目的；②DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离；③在沸水浴的条件下DNA遇二苯胺会呈现蓝色。 【详解】A、研磨液配置过程中，需用2mol/L的HCl溶液将研磨液调pH至8.0，呈弱碱性，A正确； B、表格显示，2 mol/L NaCl研磨后提取的DNA浓度更高（100.6 ng/μL vs 59.5 ng/μL），但这是由于高盐浓度下DNA溶解度高，杂质沉淀更多，而非沉淀物中DNA浓度更高。实际上，高盐浓度下DNA溶解于上清液，沉淀物中的DNA更少，B错误； C、根据图表信息可知，离心法获得的OD260/OD280比值为1.53，高于静置法的1.41，说明离心法纯度更高，但是研磨液的NaCl浓度不同，所以无法得出去杂质时应用1500 r/min的离心转速将DNA沉淀下来，且离心法获得的纯度高，C错误； D、二苯胺试剂需在酸性条件下与DNA反应生成蓝色络合物，而非碱性条件，题目中“碱性溶液中加热降解”的描述与实验原理不符，D错误。 故选A。 二、多选题 5．（2025·山东枣庄·一模）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”（实验1）和“DNA的粗提取与鉴定”（实验2）的实验操作，下列相关叙述错误的是（　　） A．实验1中，DNA电泳时需要在琼脂糖熔化之后凝固之前加入核酸染料 B．实验1中，将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳，加样前应先接通电源 C．实验2中，取洋葱研磨液的上清液，加入等体积的体积分数为70%的冷酒精后析出DNA D．实验2中，需先将白色丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液中，再加二苯胺试剂并进行沸水浴，用于鉴定DNA 【答案】BC 【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、DNA电泳鉴定时需要在琼脂糖熔化之后尚未完全凝固之前加入核酸染料，预先将染料加入凝胶中，可使电泳分离后的DNA分子在凝胶中能充分染色，A正确； B、进行PCR扩增产物电泳时，应在加样后再接通电源，B错误； C、实验2中，取洋葱研磨液的上清液，加入等体积的体积分数为95%的冷酒精（或冷的无水乙醇）后析出DNA，C错误； D、在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此实验2中需先将白色丝状物（析出的DNA）溶于2mol/L的NaCl溶液中，再加二苯胺试剂并进行沸水浴，用于鉴定DNA，D正确。 故选BC。 6. （2025·山东泰安·一模）荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量，其原理是：在PCR反应体系中每加入一对引物同时加入一个与某条模板链部分互补的荧光探针，在PCR反应过程中，子链延伸至荧光探针处，TaqDNA聚合酶会将其水解以便继续催化合成子链；荧光探针水解后发出的荧光可被荧光监测系统接收到，且每扩增一个DNA，就有一个荧光分子生成。如图为荧光定量PCR技术的部分过程，下列说法正确的是（ ） A. TaqDNA聚合酶与模板结合时遵循碱基互补配对原则 B. 若用cDNA作模板，上述技术也可估计某基因的转录效率 C. 探针完整时，有荧光，Taq酶延伸至探针处时切断探针，荧光消失 D. 达到某荧光强度所需的循环次数与起始模板DNA量呈负相关 【答案】BD 【分析】据题干分析可知，荧光积累的越快，样本中目标DNA序列越多,达到设定阈值所需的循环数越少，即Ct值越小。 【详解】A、TaqDNA聚合酶与模板结合是酶与底物的结合，不是因为碱基互补配对原则结合的，A错误； B、由于cDNA是以某基因转录形成的mRNA为模板逆转录形成的，若用cDNA作模板，需要检测出总mRNA数目和某基因的mRNA数目，故上述技术也可检测某基因的转录效率，B正确； C、探针完整时，荧光被淬灭基团淬灭，不会发出荧光，当Taq酶延伸至探针处时切断探针，荧光基团与淬灭基团分离，从而发出荧光，C错误； D、由荧光定量PCR技术原理“每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链部分互补的荧光探针”且“每扩增一个DNA，就有一个荧光分子生成”，起始模板DNA量越多，经过较少的循环次数就能达到某一荧光强度，起始模板DNA量越少，则需要较多的循环次数才能达到该荧光强度，所以达到某荧光强度所需的循环次数与起始模板DNA量呈负相关，D正确。 故选BD。 7. （2025·山东淄博·一模）米曲霉中pyrG基因编码的OMP脱羧酶是尿嘧啶生物合成的关键酶。该酶还能将无毒的5-FOA转化为毒性产物抑制自身生长。pyrG基因发生突变，将无法合成该酶。现有5株米曲霉突变菌株，欲判断其是否为pyrG突变型，将野生菌株（WT）和突变菌株按图1位置接种在不同培养基上，结果如图2～4。下列说法正确的是（ ） A. 利用紫外线照射米曲霉，通过定向突变获得突变菌株 B. 本实验中，需用稀释涂布平板法才能将米曲霉接种到培养基上 C. 在2培养基的基础上，添加5-FOA配制成4培养基 D. 实验结果说明以上5株米曲霉突变菌株均为pyrG突变型 【答案】D 【分析】分析题文描述和题图可知：在2培养基中没有添加5-FOA，野生菌株（WT）能生长，突变菌株1～5均不能生长；在4培养基中添加了5-FOA，突变菌株1～5均能生长，野生菌株（WT）中pyrG基因编码的OMP脱羧酶将无毒的5-FOA转化为毒性产物抑制自身生长，所以4培养基上无WT形成的菌落。 【详解】A、紫外线照射能诱发基因突变，而基因突变是不定向的，利用紫外线照射米曲霉，通过不定向突变和筛选才能获得突变菌株，A错误； B、从图2～4呈现的菌落分布状态来看，本实验中采用的是稀释涂布平板法将米曲霉接种到培养基上，除此之外，还可以采用平板划线法将米曲霉接种到培养基上，B错误； C、在2培养基的基础上，添加5-FOA和尿嘧啶配置成4培养基，C错误。 D、结合题意并分析题图可知：在2培养基上，只有接种WT的位置上长出菌落，说明2培养基中没有添加5-FOA，突变菌株1～5均无法合成OMP脱羧酶而导致其不能利用5-FOA，因而都不能生长；在4培养基上，只有接种突变菌株1～5的位置上长出菌落，说明4培养基中添加了5-FOA，野生菌株（WT）中pyrG基因编码的OMP脱羧酶将无毒的5-FOA转化为毒性产物抑制自身生长。可见，实验结果说明以上5株米曲霉突变菌株均为pyrG突变型，D正确。 故选D。 三、非选择题 8．（2025·山东聊城·一模）水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因（如图1所示）的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将斑马鱼的vtg基因，与人工构建的含萤火虫荧光素酶基因（无启动子）的载体（如图2所示）连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼。图2中Luc表示萤火虫荧光素酶基因，可以催化荧光素氧化产生荧光；为氨苄青霉素抗性基因，表示四环素抗性基因，BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、BsrGⅠ为限制酶。 (1)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体并降低“空载”概率，可选用限制酶 进行双酶切Luc基因载体，其优点是 。 (2)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，通过PCR技术扩增vtg基因时，需设计合适的加端引物。依据图1、图2信息推测引物2包含的碱基序列为 。一个vtg基因经过4轮循环后，得到的子代DNA分子中，只含有1种引物的DNA分子所占的比例为 。 (3)若筛选导入vtg-Luc基因重组载体的大肠杆菌，可将大肠杆菌依次放在含有氨苄青霉素、四环素的培养基中培养，筛选 的大肠杆菌即为目的菌；若要判断斑马鱼转基因是否成功，可在水体中添加 进行检测。 【答案】(1) EcoRI、HindⅢ 防止质粒和目的基因的自身环化和目的基因的反向连接 (2) 5'-AAGCTTAGAGGC-3' 1/8 (3) 能在含有氨苄青霉素的培养基中生长但不能在含有四环素的培养基中生长 雌激素和荧光素 【分析】基因工程技术的基本步骤：   1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。   2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。   3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。   4、目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）要使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体并降低“空载”概率，应选用两种不同的限制酶进行双酶切。观察图2，EcoRI和HindⅢ的酶切位点分别位于Luc基因载体的不同位置，用这两种酶双酶切可以满足要求，可以防止质粒和目的基因的自身环化和目的基因的反向连接； （2）引物2要与vtg基因的模板链互补配对，并且要包含与Luc基因载体双酶切后相同的黏性末端（HindⅢ的黏性末端）。根据图1中vtg基因的序列以及图2中HindⅢ的识别序列，引物2包含的碱基序列为5'-AAGCTTAGAGGC-3'；一个vtg基因经过4轮循环后，共得到24 = 16个DNA分子。其中只含有1种引物的DNA分子有2个，只含有1种引物的DNA分子所占的比例为1/8； （3）重组载体中含有氨苄青霉素抗性基因，而四环素抗性基因因酶切被破坏，所以导入vtg - Luc基因重组载体的大肠杆菌能在含有氨苄青霉素的培养基中生长，不能在含有四环素的培养基中生长，筛选能在氨苄青霉素培养基中生长，不能在四环素培养基中生长的大肠杆菌即为目的菌；水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。因为转基因斑马鱼含有萤火虫荧光素酶基因，该酶可以催化荧光素氧化产生荧光，所以若要判断斑马鱼转基因是否成功，可在水体中添加雌激素和荧光素进行检测。 9．（2025·山东青岛·一模）水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将图1中的vtg基因与图2中Luc基因载体连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼，当极微量雌激素污染水体，斑马鱼的肝脏就发出荧光。Luc表示荧光素酶基因（无启动子），Kanr为卡那霉素抗性基因，ori为复制起点，BamHI、BclI、HindIII、BsrGI为限制酶，→表示转录方向。 注：图1DNA片段不含有图2所示限制酶的识别序列 (1)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，选用限制酶 切割Luc基因载体可降低“空载”概率。通过PCR技术获取vtg基因时，需设计合适的引物。依据图示信息，推测引物1包含的碱基序列为5′ 3′。（写出已知的所有碱基序列） (2)将“vtg-Luc基因重组载体”导入大肠杆菌中进行扩增，为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含 的培养基中，转基因成功的斑马鱼只在肝脏中发出荧光指示污染，其原因是 。 (3)Luc基因载体上有一段P2A序列，其功能如图所示，据此推测P2A的作用 。 (4)进一步研究发现，E蛋白能与vtg基因启动子的特定序列结合，启动该基因的表达。已知vtg基因启动子含区域1和区域2，为研究E蛋白的结合位点，设计如下实验：用限制酶将启动子切割成含区域1和区域2的两个片段，将两个酶切片段分别与Luc基因载体连接，连接位点位于Luc基因的上游，形成两种重组载体。将重组载体分别导入斑马鱼的 ，待发育成熟后，往水体中添加 进行检测。 【答案】(1) Bcl I和Hind Ⅲ 5'-TGATCAAACTAT-3' (2) 卡那霉素 vtg基因在肝脏中特异性表达 (3)有助于序列两侧的基因表达成独立的蛋白质 (4) 受精卵 雌激素和荧光素 【分析】基因工程的步骤： （1）提取目的基因：基因组文库中获取、cDNA文库中获取。 （2）目的基因与运载体结合：将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒作为运载体，首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。 （3）将目的基因导入受体细胞：将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。目的基因的片段与运载体在生物体外连接形成重组DNA分子后，下一步是将重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增。 （4）目的基因的检测和表达。 【详解】（1）由图可知，限制酶BsrGI会破坏Luc，因此不能选择BsrGI，Luc基因载体上存在两个BamHI识别位点，因此不能选择BamHI，为防止目的基因和载体的自身环化和反向连接，因此需选用两种限制酶，即选择BelI、HindIII切割Luc基因载体可降低“空载”概率。根据启动子的位置和基因载体上限制酶的位置，因此需要在引物1上添加限制酶BelI识别序列，因此引物1包含的碱基序列为5′TGATCAAACTAT3′。 （2）Kanr为卡那霉素抗性基因做为标记基因，供重组DNA的鉴定和选择，因此为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含卡那霉素的培养基中；转基因成功的斑马鱼只在肝脏中发出荧光指示污染，说明vtg基因只在肝脏中特异性表达。 （3）由图可知2A肽的作用可使两侧基因形成完整蛋白，即P2A有助于序列两侧的基因表达成独立的蛋白质。 （4）可利用显微注射法将目的基因导入动物的受精卵中。由题意可知，在含有雌激素的污水中，转基因斑马鱼可发出荧光，因此可在斑马鱼发育成熟后，往水体中添加雌激素和荧光素检测是否发荧光。 10．（2025·山东济宁·一模）为筛选出能与SARS病毒的S蛋白特异性结合的受体蛋白，研究人员利用基因工程技术，在S蛋白末端添加TAP标签（能特异性地与人和哺乳动物体内IgG类抗体结合）形成S-TAP融合蛋白，再利用该标签在病毒敏感细胞中纯化出S蛋白及其相互作用的蛋白质，部分过程如图。回答下列问题。    注：XhoI、SmaI、EcoRI、BamHI表示限制酶识别序列，各限制酶识别序列及切割后产生的DNA末端均不同；F、R表示引物；T7表示启动子；Kozak序列是调控基因表达的重要序列且不含限制酶识别序列。 (1)为成功构建重组质粒pcDNA3．1-S-TAP，在利用PCR扩增S基因时，需在F引物的5'端外侧依次添加 序列。PCR时新合成链的延伸方向是 （填“5′→3′”或“3′→5′”）。 (2)使用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，DNA分子的迁移速率与 有关。 (3)在该重组质粒pcDNA3.1-S-TAP中，T7的作用是 ，重组质粒中还应该有的结构有 。 (4)为检测转染细胞中是否表达出了S-TAP融合蛋白，科研人员将转染细胞置于载玻片，洗涤、固定后，滴加带有荧光标记的 稀释液，荧光显微镜下观察，若出现荧光标记，则说明转染细胞中表达出了S-TAP融合蛋白。 【答案】(1) Kozak和SmaⅠ酶 5′→3′ (2)凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象 (3) RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 终止子、标记基因、复制原点 (4)IgG类抗体 【分析】基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。基因工程包括四个基本步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）依题意，Kozak序列是调控基因表达的重要序列且不含限制酶识别序列，T7表示启动子，根据构建的重组质粒图示可分析，在S基因的上游加入了Kozak序列以调控S基因表达，故要在F引物的5'端外侧添加Kozak序列；目的基因和质粒要连接构成表达载体，根据T7启动子的方向及质粒上的酶切位点可知，S基因上游不能用XhoI（S基因会被XhoI酶切），应该有用Smal酶切，故F引物的5'端外侧还要添加SmaI酶识别序列；PCR是体外DNA复制技术，DNA复制的方向是新链的5′→3′，故PCR时新合成链的延伸方向是5′→3′。 （2）PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。 （3）依题意，T7表示启动子，启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。基因表达载体是载体的一种，包含目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点等。结合图示可知，基因表达载体中已有启动子、目的基因，还应有的结构是终止子、标记基因、复制原点。 （4）依题意，S蛋白末端添加TAP标签能特异性地与人和哺乳动物体内IgG类抗体结合，若要检测转染细胞中是否表达出了S-TAP融合蛋白，可滴加带有荧光标记的IgG类抗体稀释液，置荧光显微镜下观察，若出现荧光标记，则说明转染细胞中表达出了S-TAP融合蛋白。 11．（2025·山东临沂·一模）RCA是一种核基因（rca）编码的叶绿体蛋白。为研究RCA对光合作用的影响及机理，科研人员构建反义rca基因表达载体（rca基因反向插入表达载体），利用农杆菌转化法导入大豆细胞，成功获得rca基因沉默的转基因品种（如图1），①~⑥表示相关过程。 (1)参与过程①的酶有 （至少写两种）。在设计引物扩增rca基因时，不能选定rca基因的M端的5'－TCAGAGCCAATTGGCT－3'和N端的5'－AGTTCACTG－GCCAGTG－3'序列，分别作为引物2和引物1的设计区，原因是 。已知①过程rca基因的b链和获取它的模板mRNA互补，依据图1中给出的引物1设计区的碱基序列及限制酶的信息，从5'端到3'端写出引物1的碱基序列 （只写出前8个碱基即可）。 (2)过程②用C4pdk启动子替换Ti质粒上原有启动子的目的是 ，过程④常用的方法是 ，⑤过程后可用含抗生素 的培养基筛选出转化成功的大豆细胞。 (3)科研人员将野生型大豆和转基因大豆在适宜的光照条件下进行培养，一段时间后分别测定相关指标，结果如图2（Rubisco是光合作用暗反应中的一种关键酶）。据图分析，RCA对光合作用的影响及机理是 。 【答案】(1) 反（逆）转录酶、热稳定DNA聚合酶、RNA酶（核酸酶H） 引物1（2）中或两个引物1（2）之间因存在互补序列而相互连接成双链结构，不能和模板链结合 5'－CTCGAGGT－3' (2) 驱动目的基因在光诱导下在叶肉细胞中特异性表达 钙离子处理法（或感受态细胞法） 潮霉素 (3)通过提高Rubisco活力来促进光合作用 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：可利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测；①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因；②检测目的基因是否转录出了mRNA；③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）过程①为反转录PCR，因此需要的酶有反（逆）转录酶、热稳定DNA聚合酶、RNA酶（核酸酶H），在设计引物扩增rca基因时，不能选定rca基因的M端的5'－TCAGAGCCAATTGGCT－3'和N端的5'－AGTTCACTG－GCCAGTG－3'序列，分别作为引物2和引物1的设计区，这是因为引物1（2）中或两个引物中存在互补的碱基序列，因而会形成双链结构，进而无法和模板链结合，导致扩增失败。 目的基因rca基因中已经存在BamH Ⅰ和Sal Ⅰ的酶切位点（质粒上也已有Sal Ⅰ的酶切位点”，所以在rca基因的上游不宜再选用Sal Ⅰ，这样会破坏目的基因，而应该选用与Sal Ⅰ产生相同黏性末端的Xho Ⅰ（同尾酶）。所以引物Ⅰ的碱基序列应该是5'-CTCGAGGT-3'。这样，质粒上用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ切割，rca基因用BglⅡ（与BamH Ⅰ属于同尾酶）和Xho Ⅰ切割。 （2）启动子是一段DNA序列，因此启动子的基本单位是脱氧核苷酸，C4pdk启动子是受光诱导的强启动子，驱动目的基因在光诱导下载叶肉细胞中特异性表达，经过程②替换 Ti质粒上原有启动子的目的是可使目的基因在大豆叶肉细胞中特异性表达。过程④是将重组质粒导入到农杆菌中，常用的方法Ca2+处理农杆菌（感受态细胞法）。由图可知T-DNA内部含有潮霉素抗性基因，因此⑤过程后可用含潮霉素的培养基筛选出转染成功的大豆细胞。 （3）与野生型大豆相比，转基因大豆的rac基因沉默，无RAC蛋白，光合速率降低，则可知RCA对玉米的光合作用具有促进作用。由图可知，rac基因沉默时Rubisco活力下降，因此可推测RCA对大豆的光合作用的作用机理为RAC可提高Rubisco活力，促进暗反应，进而促进光合作用。 12．（2025·山东菏泽·一模）北京紫眼果蝇（基因型hh）是从野生型红眼果蝇（基因型HH）中分离出来的隐性突变体。对控制果蝇眼色的H、h基因进行了相关研究。F1、F2、F3、P1、P2、P3这六种引物及H基因结构如图1所示。    (1)为获取h基因，以北京紫眼果蝇体细胞的总DNA作为 ，用图1中F1、P1作为引物进行PCR，推测这对引物中与α链结合的引物碱基序列为5’- -3'（写出前6个碱基），扩增得到的DNA片段长度超过7000bp，说明北京紫眼的h基因是由于H基因中插入外来片段形成的。 (2)根据图1，运用PCR继续探究突变位点在H基因上的大致位置，简要写出实验思路： 。 (3)为验证H基因突变是北京紫眼性状产生的原因，运用UAS-GAL4转基因体系将H基因导入北京紫眼果蝇中，流程如图2。GAL4基因的表达产物是一种转录因子，UAS是一段特殊的具有调控功能的DNA片段。UAS上有GAL4蛋白的结合位点，只有当GAL4和UAS存在于同一个体时，GAL4才能激活与UAS相连接的下游基因的转录。 ①H基因在品系1、2中均不表达，只在两个品系杂交的后代中表达，H基因应该插入到位点 （填“a”、“b”或“c”）。 ②若受体中只有其中一条常染色体上导入一个外来基因，品系1和品系2杂交的F1代中红眼果蝇所占比例为 ，F1代红眼果蝇雌雄杂交得到的F2代中红眼所占比例可能为 。 【答案】(1) 模板 GAACCT (2)分别用引物P1和F3、P2和F2、P3和F1，以北京紫眼果蝇体细胞的总DNA为模板进行PCR，在通过电泳检测产物片段的长度 (3) b 1/4/25% 1/2或9/16 【分析】1、基因的分离定律实质上是指减数分裂产生配子时，一对等位基因随着同源染色体的分离而分离，进入不同的配子，随配子遗传给后代。 2、基因自由组合定律实质上是指减数分裂产生配子时，随着同源染色体携带等位基因分离，非同源染色体携带着非等位基因自由组合。 【详解】（1）为获取h基因，PCR技术中，以北京紫眼果蝇体细胞的总DNA作为模板，以图中的P1、P1作为引物进行PCR扩增，根据引物P1对应的α链的羟基端可推知，与α链结合的引物碱基序列为5'-GAACCT-3'。 （2）由图，结合题意可知，h基因是H基因中插入外来片段形成的，欲探究突变位点在H基因上的位置，可分别用引物P1和F3、P2和F2、P3和F1，以北京紫眼果蝇体细胞的全DNA为模板进行PCR，分段扩增出H基因的相关片段，再通过电泳检测产物片段的长度，若出现长度与H基因的长度不同片段，即不是1200bp、2400bp、3785bp，则对应片段为H基因的突变位点。 （3）①由题意可知，UAS 上有 GAL4 蛋白的结合位点，只有当 GAL4 和 UAS 存在于同一个个体中时，GAL4才能激活与UAS 相连接的下游基因的转录，H基因在品系1、2中均不表达，只在两个品系杂交的后代中表达，则H基因应该插入到位点b，品系1、2的杂交后代同时含有GAL4 和 UAS ，且b位点位于UAS的下游，才能正常表达。 ②若受体中只有其中一条常染色体上导入一个外来基因，在UAS-GAL4系统中，红眼性状表现需要GAL4和UAS同时存在于同一果蝇中才能激活H基因的表达。假设品系1携带GAL4基因，品系2携带UAS-H基因，则在F1代杂交中，同时获得这两部分的比例为1/2（GAL4）×1/2（UAS-H）=1/4。因此F₁代中红眼果蝇比例为1/4。若GAL4与UAS-H在一对同源染色体上（GAL4位于其中一条染色体上，UAS-H位于另一染色体上），则F1杂交产生的F2中红眼为GAL4-UAS-H的概率为1/2，若GAL4与UAS-H位于非同源染色体上，要同时含有GAL4 、UAS和H才能表现出红眼，则杂交得到的F₂代中红眼GAL4-UAS-H比例为9/16。 13．（2025·山东枣庄·一模）中国“干扰素之父”侯云德院士于1982年成功研发我国第一个基因工程创新药物——干扰素。干扰素是一种白细胞产生的具有抗病毒能力的分泌蛋白。研究人员从感染病毒的鸡白细胞提取全基因组mRNA，利用PCR技术获取鸡干扰素基因，图1表示鸡干扰素蛋白有关的基因片段，序号①~④表示引物。然后将获取的目的基因连接在大肠杆菌的pET32a质粒（5900bp，注：bp表示碱基对）上，图2表示pET32a质粒及其上部分限制酶切割位点。最后将重组质粒导入大肠杆菌后获得成熟干扰素。 (1)利用鸡白细胞总mRNA获得干扰素蛋白基因，需要在 酶的作用下先合cDNA。图1表示成熟干扰素蛋白序列及其前端的信号肽序列，信号肽是分泌蛋白合成过程中开始合成的一段肽链，其在干扰素合成中的作用是 。 (2)为了获取不含信号肽序列的干扰素基因，在进行PCR扩增时需要用到的一对引物是 ，为了将目的基因准确连接到pET32a质粒上需要在目的基因的两端添加 限制酶的序列。PCR扩增过程除了引物，还需要的条件有 （答出2点）。 (3)为了检测目的基因是否插入pET32a质粒，利用目的基因两端添加的限制酶切割质粒，然后对产物进行电泳，结果如图3，样品 最可能是插入了目的基因的重组质粒，判断的理由是 。 【答案】(1) 逆转录/逆转录酶 引导游离的核糖体转移到内质网上继续肽链的合成 (2) ②④ EcoRI、XhoI 模板；4种游离的脱氧核苷酸（dNTP）；耐高温的DNA聚合酶；含Mg2+缓冲液 (3) 2 EcoRⅠ、XhoⅠ可以把重组质粒切成约500bp和5800bp的两个片段 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样； （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）利用鸡白细胞总mRNA获得干扰素蛋白基因，需要经过RNA变成相应的DNA逆转录过程，需要逆转录酶的作用下先合cDNA。图1表示成熟干扰素蛋白序列及其前端的信号肽序列，信号肽是分泌蛋白合成过程中开始合成的一段肽链，指导新生的多肽链和核糖体与内质网膜结合，使蛋白质的合成和加工在粗面内质网上进行，所以其在干扰素合成中的作用是引导游离的核糖体转移到内质网上继续肽链的合成。 （2）为了获取不含信号肽序列的干扰素基因，在进行PCR扩增时需要用到的一对引物是②④，其他引物会导致含信号肽序列的干扰素基因的合成，为了将目的基因准确连接到pET32a质粒上，需要在目的基因两端添加可以与质粒酶切位点互补的限制酶识别序列，需要在目的基因的两端添加EcoRI、XhoI限制酶的序列，PCR扩增过程除了引物，还需要的条件有相应的模板；原料是4种游离的脱氧核苷酸（dNTP）；耐高温的DNA聚合酶；含Mg2+缓冲液。 （3）为了检测目的基因是否插入pET32a质粒，利用目的基因两端添加的限制酶切割质粒，然后对产物进行电泳，结果如图3，因为一个切割位点只会将环状的质粒切割成一条线性的DNA，有两个切割位点才能切成2条片段，根据题图分析EcoRⅠ、XhoⅠ可以把重组质粒切成约500bp和5800bp的两个片段，所以样品2最可能是插入了目的基因的重组质粒。 14. （2025·山东泰安·一模）磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体的过程如图。 （1）无缝连接时，过程①中使用T5核酸外切酶目的是______。过程③所需的酶有______。 （2）PCR技术分别扩增PABD和GFP基因时，配制的两个反应体系中不同的有______。引物的设计需依据______的核苷酸序列。据图分析引物F1和R2分别为______（填序号）。 A．5'-TCCGGACTCAGATAGC-3' B．5'-AGGCCTGAGTCTATCGTTATGTCCGGACTCAGATAGC-3' C．5'-GCTATCTGACTCCGGACTTGTACAGCTCGTCGTCTCA-3' D．5'-TCCGGACTCAGATAGCTATCGATGCGCAGCTGACGA-3' （3）将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要是______。 （4）利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子（T1）进行表面消毒，均匀铺在含有______的MS培养基上进行筛选。T1代阳性植株自交，按单株收种并播种后获得的T2代中抗性幼苗占比为______，说明T1可能为单个位点插入的转基因株系。通过观测转基因拟南芥根尖细胞中______，了解PA的动态变化。 【答案】（1）①. 沿5'→3'的方向水解DNA形成黏性末端 ②. DNA 聚合酶和DNA连接酶 （2）①. 模板和引物 ②. PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列 ③. AC （3）限制性核酸内切酶 （4）①. 草胺膦 ②. 3/4 ③. 绿色荧光点的分布 【分析】PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：（1）模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。（2）模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。（3）延伸：DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。 【解析】（1）结合图示可知，过程①使用T5核酸外切酶目的是沿5'→3'的方向水解DNA形成黏性末端。过程③缺口处DNA链的补齐，可以看作DNA分子的复制过程，所需的酶有DNA 聚合酶（DNA聚合酶将脱氧核苷酸加到子链3′-OH末端）和DNA连接酶（将两个DNA片段进行连接）。 （2）PCP扩增需要模板、原料、引物和TaqDNA聚合酶，扩增PABD和GFP这两种不同的基因，分别需要两种基因的单链DNA作为模板，即所需的模板不同，引物是根据目的基因复制起始端序列人工合成的，不同种类的基因所需的引物不同，综上分析，配制的两个反应体系中不同的有模板和引物。用于PCR扩增的引物是根据一段已知目的基因（PABD基因）的核苷酸序列来设计的，由图可知，PABD基因（目的基因）需要用载体进行连接，因此PCR扩增PABD基因时需依据PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列引物R1。由重组DNA图可知，GFP基因和PABD基因进行连接，PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列引物R2，而设计引物F1仅需根据PABD基因一端的核苷酸序列，因此引物F1的碱基序列比引物R2的碱基序列短，因此扩增目的片段的引物F1对应于下表中的A。PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列引物R2，即引物R2的一部分能与引物F1进行碱基互补配对，综上所述，R2对应于下表中的C。 （3）传统的酶切再连法需要用特定的限制性核酸内切酶将目的基因和质粒先进行切割，再用DNA连接酶对目的基因和质粒进行连接，而无缝克隆技术构建重组质粒是不需要限制性核酸内切酶，使用的是限制性核酸外切酶和DNA连接酶。 （4）由图可知，bar（草胺膦抗性基因）为标记基因，位于T-DNA上，农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子（T1）进行表面消毒，均匀铺在含有草胺膦的MS培养基上进行筛选和鉴定。若T1为单位点插入的转基因株系，假设抗性基因用A表示，非抗性为a，则T1的基因型为Aa，T1代自交获得的T2代幼苗的基因型及比例为A_:aa= 3：1，因此抗草胺膦：不抗草胺膦= 3：1。由题意“将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量”可知，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中绿色荧光点的分布，了解PA的动态变化。 15.（2025·山东淄博·一模） 研究两种蛋白质（如X和Y）能否相互作用常用酵母双杂交技术。BD和AD是构成GAL4转录因子的两个独立结构域，X和Y能相互作用时，BD和AD在空间上才能靠近，形成完整的GAL4转录因子，激活酵母菌报告基因的转录（图甲）。酵母菌中的His3、Trp1、Leu2和Ade2四个基因分别合成组氨酸、色氨酸、亮氨酸、腺嘌呤等生存必需的营养物质。科研人员用酵母双杂交技术探究植物中的WRKY17蛋白能否与MPK3蛋白相互作用。用于实验的酵母菌经过基因改造后不能产生GAL4转录因子，也不能合成上述四种营养物质。BD质粒上携带Trp1基因，AD质粒上携带Leu2基因。 （1）首先利用PCR获取MPK3和WRKY17这两个目的基因，设计引物时常需添加保护碱基以提高酶切效率，保护碱基最好添加在引物的______（填“端”或“端”）。PCR反应缓冲液中一般要添加，作用是______。之后分别将MPK3基因和WRKY17基因拼接到BD和AD质粒上。 （2）将不同类型的质粒导入酵母菌进行双杂交实验，结果如图乙。 ①四组酵母菌均可在只缺少亮氨酸和色氨酸培养基上生长，说明______，该实验的报告基因为______ ②结果显示WRKY17与MPK3______（填“能”或“不能”）相互作用，判断理由是______。设置实验组②的目的是______。 （3）酵母双杂交技术能否用于筛选宿主细胞膜上与甲流病毒表面HA蛋白特异性结合的受体，并说明理由______。 【答案】（1）①. 5'端    ②. 激活耐高温的DNA聚合酶 （2）①. 两种质粒均转入酵母菌并成功表达Trp1和Leu2基因，合成色氨酸和亮氨酸 ②. His3和Ade2 ③. 能 ④. 只有第④组酵母菌能在四缺培养基上生长，说明His3和Ade2这两个报告基因成功表达，WRKY17与MPK3可以相互作用 ⑤. 排除AD与MPK3的相互作用 （3）能，HA蛋白和特异性受体的化学本质均为蛋白质，可将HA基因和细胞膜上的受体基因利用酵母双杂交技术导入酵母细胞，能激活报告基因表达的即为HA的特异性受体 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【解析】（1）由于PCR过程中在合成子链DNA时是从5’端向3’端延伸的，保护碱基添加在5’端不会影响PCR扩增的效率；Mg²⁺能够激活耐高温的DNA聚合酶，从而提高PCR反应的效率和特异性，故PCR反应缓冲液中一般要添加。 （2）①分析题意可知，酵母菌中的His3、Trp1、Leu2和Ale2四个基因分别合成组氨酸、色氨酸、亮氨酸、腺嘌呤等生存必需的营养物质，而四组酵母菌均可在只缺少亮氨酸和色氨酸的培养基上生长，说明两种质粒均转入酵母菌并成功表达Trp1和Leu2基因，且酵母菌能够利用质粒上的Trp1和Leu2基因合成色氨酸和亮氨酸；分析题意，只有当GAL4转录因子形成时，His3和Ade2基因才会被激活，酵母菌才能在缺少对应氨基酸的培养基上生长，故该实验的报告基因为His3和Ade2。 ②只有第④组酵母菌能在四缺培养基上生长，说明His3和Ade2这两个报告基因成功表达，WRKY17与MPK3可以相互作用；实验组②中添加AD和MPK3-BD，目的是排除AD与MPK3的相互作用。 （3）由于HA蛋白和特异性受体的化学本质均为蛋白质，可将HA基因和细胞膜上的受体基因利用酵母双杂交技术导入酵母细胞，能激活报告基因表达的即为HA的特异性受体，故酵母双杂交技术能用于筛选宿主细胞膜上与甲流病毒表面HA蛋白特异性结合的受体。 2 / 15 1 / 5 学科网（北京）股份有限公司 $$ 专题08基因工程 考点概览 考点01基因工程 基因工程考点01 一、单选题 1．（2025·山东青岛·一模）野生大豆的SAMS基因具有提高抗逆性的作用。水稻是一种盐敏感型作物，为提高水稻的抗盐碱胁迫能力，研究者将野生大豆的SAMS基因转入水稻细胞内，从而培养出转基因水稻株系，具体过程如图。下列说法错误的是（    ） A．图示过程中发生了两次转化 B．Ⅰ和Ⅲ都需使用固体培养基 C．Ⅰ中的筛选可使用PCR技术 D．获得的转基因水稻苗都具备抗盐碱能力 2．（2025·山东青岛·一模）采用PCR技术可获取并扩增目的基因。下列说法正确的是（    ） A．若PCR的模板是mRNA，完成扩增只需要逆转录酶 B．预变性有利于模板DNA充分解聚为单链 C．复性温度太高会导致引物和模板的非特异性结合增加 D．一个DNA模板完成第20轮循环需要（220-2）个引物 3. （2025·山东泰安·一模）关于“DNA粗提取与鉴定”、“琼脂糖凝胶电泳”、“PCR扩增”实验，下列说法正确的是（ ） A. 将洋葱切碎、研磨、过滤，滤液放置4℃冰箱中静置几分钟后，DNA存在于沉淀物中 B. 鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变 C. 凝胶载样缓冲液中加入的核酸染料能与DNA分子结合，便于在紫外灯下观察 D. 对2个双链DNA分子进行PCR扩增，第n次循环共需引物2n+1个 4. （2025·山东淄博·一模）科研人员利用花菜对DNA的粗提取实验进行改进。使用不同的研磨液过滤提取DNA、加酒精后用不同的去杂质方法纯化DNA，并进行相关检测，结果如下表。的比值可检查DNA纯度，纯DNA的为1.8，当存在蛋白质污染时，这一比值会明显降低。下列说法正确的是（ ） 研磨提取 加酒精后去杂质 研磨液的NaCl浓度 （mol/L） 沉淀质量 （g） 提取的 DNA浓度 （ng/μL） OD260/OD280 去杂质方式 沉淀质量 （g） 纯化的 DNA浓度 （ng/μL） OD260/OD280 0.14 0.0789 59.5 1.29 离心 0.068 81.5 1.53 2 0.0409 100.6 1.57 4℃冰箱静置 0.1028 336.4 1.41 A. 研磨液配置过程中，需用2mol/L的HCl溶液将研磨液调至弱碱性 B. 与0.14mol/L相比，用2mol/L的NaCl溶液研磨得到的沉淀物中的DNA浓度更高 C. 去杂质时应用1500 r/min离心转速将DNA沉淀下来，且离心法获得的纯度高 D. DNA分子在碱性溶液中加热降解后可与二苯胺反应生成蓝色络合物 二、多选题 5．（2025·山东枣庄·一模）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”（实验1）和“DNA的粗提取与鉴定”（实验2）的实验操作，下列相关叙述错误的是（　　） A．实验1中，DNA电泳时需要在琼脂糖熔化之后凝固之前加入核酸染料 B．实验1中，将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳，加样前应先接通电源 C．实验2中，取洋葱研磨液的上清液，加入等体积的体积分数为70%的冷酒精后析出DNA D．实验2中，需先将白色丝状物溶于2mol/L的NaCl溶液中，再加二苯胺试剂并进行沸水浴，用于鉴定DNA 6. （2025·山东泰安·一模）荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量，其原理是：在PCR反应体系中每加入一对引物同时加入一个与某条模板链部分互补的荧光探针，在PCR反应过程中，子链延伸至荧光探针处，TaqDNA聚合酶会将其水解以便继续催化合成子链；荧光探针水解后发出的荧光可被荧光监测系统接收到，且每扩增一个DNA，就有一个荧光分子生成。如图为荧光定量PCR技术的部分过程，下列说法正确的是（ ） A. TaqDNA聚合酶与模板结合时遵循碱基互补配对原则 B. 若用cDNA作模板，上述技术也可估计某基因的转录效率 C. 探针完整时，有荧光，Taq酶延伸至探针处时切断探针，荧光消失 D. 达到某荧光强度所需的循环次数与起始模板DNA量呈负相关 7. （2025·山东淄博·一模）米曲霉中pyrG基因编码的OMP脱羧酶是尿嘧啶生物合成的关键酶。该酶还能将无毒的5-FOA转化为毒性产物抑制自身生长。pyrG基因发生突变，将无法合成该酶。现有5株米曲霉突变菌株，欲判断其是否为pyrG突变型，将野生菌株（WT）和突变菌株按图1位置接种在不同培养基上，结果如图2～4。下列说法正确的是（ ） A. 利用紫外线照射米曲霉，通过定向突变获得突变菌株 B. 本实验中，需用稀释涂布平板法才能将米曲霉接种到培养基上 C. 在2培养基的基础上，添加5-FOA配制成4培养基 D. 实验结果说明以上5株米曲霉突变菌株均为pyrG突变型 三、非选择题 8．（2025·山东聊城·一模）水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因（如图1所示）的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将斑马鱼的vtg基因，与人工构建的含萤火虫荧光素酶基因（无启动子）的载体（如图2所示）连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼。图2中Luc表示萤火虫荧光素酶基因，可以催化荧光素氧化产生荧光；为氨苄青霉素抗性基因，表示四环素抗性基因，BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、BsrGⅠ为限制酶。 (1)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体并降低“空载”概率，可选用限制酶 进行双酶切Luc基因载体，其优点是 。 (2)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，通过PCR技术扩增vtg基因时，需设计合适的加端引物。依据图1、图2信息推测引物2包含的碱基序列为 。一个vtg基因经过4轮循环后，得到的子代DNA分子中，只含有1种引物的DNA分子所占的比例为 。 (3)若筛选导入vtg-Luc基因重组载体的大肠杆菌，可将大肠杆菌依次放在含有氨苄青霉素、四环素的培养基中培养，筛选 的大肠杆菌即为目的菌；若要判断斑马鱼转基因是否成功，可在水体中添加 进行检测。 9．（2025·山东青岛·一模）水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原（vtg）基因的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将图1中的vtg基因与图2中Luc基因载体连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼，当极微量雌激素污染水体，斑马鱼的肝脏就发出荧光。Luc表示荧光素酶基因（无启动子），Kanr为卡那霉素抗性基因，ori为复制起点，BamHI、BclI、HindIII、BsrGI为限制酶，→表示转录方向。 注：图1DNA片段不含有图2所示限制酶的识别序列 (1)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，选用限制酶 切割Luc基因载体可降低“空载”概率。通过PCR技术获取vtg基因时，需设计合适的引物。依据图示信息，推测引物1包含的碱基序列为5′ 3′。（写出已知的所有碱基序列） (2)将“vtg-Luc基因重组载体”导入大肠杆菌中进行扩增，为便于筛选，应将大肠杆菌接种在含 的培养基中，转基因成功的斑马鱼只在肝脏中发出荧光指示污染，其原因是 。 (3)Luc基因载体上有一段P2A序列，其功能如图所示，据此推测P2A的作用 。 (4)进一步研究发现，E蛋白能与vtg基因启动子的特定序列结合，启动该基因的表达。已知vtg基因启动子含区域1和区域2，为研究E蛋白的结合位点，设计如下实验：用限制酶将启动子切割成含区域1和区域2的两个片段，将两个酶切片段分别与Luc基因载体连接，连接位点位于Luc基因的上游，形成两种重组载体。将重组载体分别导入斑马鱼的 ，待发育成熟后，往水体中添加 进行检测。 10．（2025·山东济宁·一模）为筛选出能与SARS病毒的S蛋白特异性结合的受体蛋白，研究人员利用基因工程技术，在S蛋白末端添加TAP标签（能特异性地与人和哺乳动物体内IgG类抗体结合）形成S-TAP融合蛋白，再利用该标签在病毒敏感细胞中纯化出S蛋白及其相互作用的蛋白质，部分过程如图。回答下列问题。    注：XhoI、SmaI、EcoRI、BamHI表示限制酶识别序列，各限制酶识别序列及切割后产生的DNA末端均不同；F、R表示引物；T7表示启动子；Kozak序列是调控基因表达的重要序列且不含限制酶识别序列。 (1)为成功构建重组质粒pcDNA3．1-S-TAP，在利用PCR扩增S基因时，需在F引物的5'端外侧依次添加 序列。PCR时新合成链的延伸方向是 （填“5′→3′”或“3′→5′”）。 (2)使用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，DNA分子的迁移速率与 有关。 (3)在该重组质粒pcDNA3.1-S-TAP中，T7的作用是 ，重组质粒中还应该有的结构有 。 (4)为检测转染细胞中是否表达出了S-TAP融合蛋白，科研人员将转染细胞置于载玻片，洗涤、固定后，滴加带有荧光标记的 稀释液，荧光显微镜下观察，若出现荧光标记，则说明转染细胞中表达出了S-TAP融合蛋白。 11．（2025·山东临沂·一模）RCA是一种核基因（rca）编码的叶绿体蛋白。为研究RCA对光合作用的影响及机理，科研人员构建反义rca基因表达载体（rca基因反向插入表达载体），利用农杆菌转化法导入大豆细胞，成功获得rca基因沉默的转基因品种（如图1），①~⑥表示相关过程。 (1)参与过程①的酶有 （至少写两种）。在设计引物扩增rca基因时，不能选定rca基因的M端的5'－TCAGAGCCAATTGGCT－3'和N端的5'－AGTTCACTG－GCCAGTG－3'序列，分别作为引物2和引物1的设计区，原因是 。已知①过程rca基因的b链和获取它的模板mRNA互补，依据图1中给出的引物1设计区的碱基序列及限制酶的信息，从5'端到3'端写出引物1的碱基序列 （只写出前8个碱基即可）。 (2)过程②用C4pdk启动子替换Ti质粒上原有启动子的目的是 ，过程④常用的方法是 ，⑤过程后可用含抗生素 的培养基筛选出转化成功的大豆细胞。 (3)科研人员将野生型大豆和转基因大豆在适宜的光照条件下进行培养，一段时间后分别测定相关指标，结果如图2（Rubisco是光合作用暗反应中的一种关键酶）。据图分析，RCA对光合作用的影响及机理是 。 12．（2025·山东菏泽·一模）北京紫眼果蝇（基因型hh）是从野生型红眼果蝇（基因型HH）中分离出来的隐性突变体。对控制果蝇眼色的H、h基因进行了相关研究。F1、F2、F3、P1、P2、P3这六种引物及H基因结构如图1所示。    (1)为获取h基因，以北京紫眼果蝇体细胞的总DNA作为 ，用图1中F1、P1作为引物进行PCR，推测这对引物中与α链结合的引物碱基序列为5’- -3'（写出前6个碱基），扩增得到的DNA片段长度超过7000bp，说明北京紫眼的h基因是由于H基因中插入外来片段形成的。 (2)根据图1，运用PCR继续探究突变位点在H基因上的大致位置，简要写出实验思路： 。 (3)为验证H基因突变是北京紫眼性状产生的原因，运用UAS-GAL4转基因体系将H基因导入北京紫眼果蝇中，流程如图2。GAL4基因的表达产物是一种转录因子，UAS是一段特殊的具有调控功能的DNA片段。UAS上有GAL4蛋白的结合位点，只有当GAL4和UAS存在于同一个体时，GAL4才能激活与UAS相连接的下游基因的转录。 ①H基因在品系1、2中均不表达，只在两个品系杂交的后代中表达，H基因应该插入到位点 （填“a”、“b”或“c”）。 ②若受体中只有其中一条常染色体上导入一个外来基因，品系1和品系2杂交的F1代中红眼果蝇所占比例为 ，F1代红眼果蝇雌雄杂交得到的F2代中红眼所占比例可能为 。 13．（2025·山东枣庄·一模）中国“干扰素之父”侯云德院士于1982年成功研发我国第一个基因工程创新药物——干扰素。干扰素是一种白细胞产生的具有抗病毒能力的分泌蛋白。研究人员从感染病毒的鸡白细胞提取全基因组mRNA，利用PCR技术获取鸡干扰素基因，图1表示鸡干扰素蛋白有关的基因片段，序号①~④表示引物。然后将获取的目的基因连接在大肠杆菌的pET32a质粒（5900bp，注：bp表示碱基对）上，图2表示pET32a质粒及其上部分限制酶切割位点。最后将重组质粒导入大肠杆菌后获得成熟干扰素。 (1)利用鸡白细胞总mRNA获得干扰素蛋白基因，需要在 酶的作用下先合cDNA。图1表示成熟干扰素蛋白序列及其前端的信号肽序列，信号肽是分泌蛋白合成过程中开始合成的一段肽链，其在干扰素合成中的作用是 。 (2)为了获取不含信号肽序列的干扰素基因，在进行PCR扩增时需要用到的一对引物是 ，为了将目的基因准确连接到pET32a质粒上需要在目的基因的两端添加 限制酶的序列。PCR扩增过程除了引物，还需要的条件有 （答出2点）。 (3)为了检测目的基因是否插入pET32a质粒，利用目的基因两端添加的限制酶切割质粒，然后对产物进行电泳，结果如图3，样品 最可能是插入了目的基因的重组质粒，判断的理由是 。 14. （2025·山东泰安·一模）磷脂酸（PA）是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白（PABD）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体的过程如图。 （1）无缝连接时，过程①中使用T5核酸外切酶目的是______。过程③所需的酶有______。 （2）PCR技术分别扩增PABD和GFP基因时，配制的两个反应体系中不同的有______。引物的设计需依据______的核苷酸序列。据图分析引物F1和R2分别为______（填序号）。 A．5'-TCCGGACTCAGATAGC-3' B．5'-AGGCCTGAGTCTATCGTTATGTCCGGACTCAGATAGC-3' C．5'-GCTATCTGACTCCGGACTTGTACAGCTCGTCGTCTCA-3' D．5'-TCCGGACTCAGATAGCTATCGATGCGCAGCTGACGA-3' （3）将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要是______。 （4）利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子（T1）进行表面消毒，均匀铺在含有______的MS培养基上进行筛选。T1代阳性植株自交，按单株收种并播种后获得的T2代中抗性幼苗占比为______，说明T1可能为单个位点插入的转基因株系。通过观测转基因拟南芥根尖细胞中______，了解PA的动态变化。 15.（2025·山东淄博·一模） 研究两种蛋白质（如X和Y）能否相互作用常用酵母双杂交技术。BD和AD是构成GAL4转录因子的两个独立结构域，X和Y能相互作用时，BD和AD在空间上才能靠近，形成完整的GAL4转录因子，激活酵母菌报告基因的转录（图甲）。酵母菌中的His3、Trp1、Leu2和Ade2四个基因分别合成组氨酸、色氨酸、亮氨酸、腺嘌呤等生存必需的营养物质。科研人员用酵母双杂交技术探究植物中的WRKY17蛋白能否与MPK3蛋白相互作用。用于实验的酵母菌经过基因改造后不能产生GAL4转录因子，也不能合成上述四种营养物质。BD质粒上携带Trp1基因，AD质粒上携带Leu2基因。 （1）首先利用PCR获取MPK3和WRKY17这两个目的基因，设计引物时常需添加保护碱基以提高酶切效率，保护碱基最好添加在引物的______（填“端”或“端”）。PCR反应缓冲液中一般要添加，作用是______。之后分别将MPK3基因和WRKY17基因拼接到BD和AD质粒上。 （2）将不同类型的质粒导入酵母菌进行双杂交实验，结果如图乙。 ①四组酵母菌均可在只缺少亮氨酸和色氨酸培养基上生长，说明______，该实验的报告基因为______ ②结果显示WRKY17与MPK3______（填“能”或“不能”）相互作用，判断理由是______。设置实验组②的目的是______。 （3）酵母双杂交技术能否用于筛选宿主细胞膜上与甲流病毒表面HA蛋白特异性结合的受体，并说明理由______。 2 / 15 1 / 5 学科网（北京）股份有限公司 $$