专题05 基因工程（湖南专用）-【好题汇编】备战2024-2025学年高二生物下学期期中真题分类汇编

专题05 基因工程 一、单选题 1．(23-24高二下·湖南永州道县道县第一中学·期中)下列实验需要利用光学显微镜进行观察或统计的是（　　） A．计数平板上尿素分解菌的菌落数量 B．利用二苯胺鉴定DNA的粗提物 C．计数培养液中酵母菌种群数量变化 D．观察菊花外植体的生长状况 2．(23-24高二下·湖南雅礼教育集团·期中)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是（　　） A．可选用菜花、香蕉、菠菜和猪血等DNA含量丰富的材料进行实验，但提取DNA的方法可能稍有不同 B．向含DNA的滤液中加入预冷的体积分数70%的酒精溶液中，有利于获得较纯净的DNA C．DNA析出过程中应用玻璃棒沿同一方向进行轻缓搅拌，以免DNA断裂 D．将提取的丝状物溶解在2mol/LNaCl溶液中，将二苯胺试剂加入就能出现蓝色 3．(22-23高二下·湖南多校联考·期中)多重PCR-电泳技术，是指同一个PCR反应体系中包含多对引物，各引物特异性地结合到相应的目的基因上，扩增产生不同长度的片段，再通过电泳进行分离和识别，从而对病原体进行鉴别检测。下列相关叙述错误的是（　　） A．多重PCR过程中，不同的引物之间不能互补 B．PCR和电泳都必须无菌条件下操作，防止外源DNA污染 C．该技术可同时进行多种病原微生物的检测 D．不同大小的DNA分子在电泳时，迁移的速率不同 4．(22-23高二下·湖南怀化五中·期中)基因工程中“分子缝合针”指的是（    ） A．限制酶 B．DNA连接酶 C．DNA聚合酶 D．RNA聚合酶 5．(21-22高二下·湖南长沙南雅中学·期中)现代生物科学技术中涉及的一些生物学概念，不符合集合图所示关系的是（    ） A．①动物细胞核移植②动物细胞工程③细胞工程 B．①一个将发育为胎盘的细胞②内细胞团③囊胚 C．①植物组织培养②植物细胞工程③细胞工程 D．①质粒②载体③基因工程的分子工具 6．(20-21高二上·湖南衡阳田家炳实验中学·期中)目前市面上许多疫苗是应用基因工程技术生产的，在基因工程的实验过程中，把目的基因和运载体连接起来的是（    ） A．核酸酶 B．限制性核酸内切酶 C．DNA连接酶 D．运载体 7．(20-21高二上·湖南衡阳田家炳实验中学·期中)科学家成功将“抗多聚半乳糖醛酸酶基因”导入番茄，能有效防止细胞壁的分解，获得防腐烂抗软化的转基因番茄，该技术利用的原理是（    ） A．基因突变 B．基因重组 C．染色体结构变异 D．染色体数目变异 8．(20-21高二上·湖南常德临澧县一中·期中)基因工程中剪切目的基因的工具是（    ） A．DNA连接酶 B．解旋酶 C．DNA聚合酶 D．限制性核酸内切酶 二、多选题 9．(22-23高二·湖南益阳桃江县七中·期中)腈水合酶（N0）广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域,但不耐高温。利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1）。下列有关叙述正确的是（    ）。 A．N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一 B．加入连接肽需要通过改造基因来实现 C．获得N1的过程需要进行转录和翻译 D．自然界中的酶都可以通过蛋白质工程进行改造 10．(22-23高二下·湖南长沙雅礼中学·期中)以下是有关分离与鉴别DNA的技术，其中说法正确的是（    ） A．DNA在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最大 B．PCR的两种引物一般20-30个核苷酸，过长易发生引物内部的折叠 C．对PCR循环30次之后的DNA分子进行琼脂糖凝胶电泳，与标样对照判断是否存在目的基因片段 D．琼脂糖凝胶电泳从阴极加样，分子量较大的接近于加样孔 三、非选择题 11．(22-23高二下·湖南怀化五中·期中)回答下列利用转基因动物生产药物的问题： (1)家蚕细胞具有高效表达外源基因的能力。将人干扰素基因导入家蚕细胞并大规模培养，可提取干扰素用于制药。为使干扰素基因在家蚕细胞中高效表达，需要把干扰素基因片段正确插入表达载体的 和 之间。采用 技术可验证干扰素基因是否已经导入家蚕细胞。 (2)若要获得含有人干扰素基因的转基因牛，将基因表达载体导入受体细胞。导入并培养成功后，该基因在 （填“任意体细胞”或“乳腺细胞”）中表达。构建基因工程表达载体时，若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生 （填“相同”或“不同”）黏性末端的限制酶。 12．(21-22高二下·湖南长沙明德中学·期中)新型冠状病毒（RNA病毒）可通过表面的棘突蛋白（S蛋白）与人呼吸道黏膜上皮细胞的ACE2受体结合，侵入人体，引起肺炎。抗体可阻断病毒的黏附或入侵，故抗体药物的研发已成为治疗新冠肺炎的研究热点之一。下图为筛选、制备抗S蛋白单克隆抗体的示意图，序号①~④表示细胞。据图回答下列问题： (1)诊断是否感染新型冠状病毒，可通过咽拭子取样，其检测的是病毒的RNA．但由于采集的样品量较少，为了增加检材数量可进行 。 (2)获取小鼠新鲜的骨髓瘤组织，需在37℃下用 处理30-40分钟形成离散细胞，在CO2培养箱中培养，CO2的作用是 。 (3)细胞①、②融合常用的诱导因素有 。 (4)用HAT选择培养基筛选获得的③为 ，细胞③至细胞④还要进行 ，该细胞④的特点是 。 13．(20-21高二·湖南湖湘教育三新探索协作体·期中)棉铃虫是一种严重危害棉花的害虫。我国科学家发现一种生活在棉铃虫消化道内的苏云金芽孢杆菌能分泌一种毒蛋白使棉铃虫致死，而此毒蛋白对人畜无害。科学家通过基因工程，将苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因转入到普通棉株细胞内，并成功地实现了表达，从而培育出了能抗棉铃虫的棉花植株——抗虫棉，其过程大致如图所示。回答下列问题： （1）基因工程需要两种工具酶，分别是 、 。 （2）基因工程的操作程序主要包括的四个步骤是：目的基因的获取 、 、 。 （3）生产抗虫棉的整个过程中需要基因工程操作和 技术，将转基因受体细胞培育成转基因植株。 （4）从个体水平鉴定抗虫棉是否培育成功，取一定量长势良好的转基因棉花植株接种适量的棉铃虫作为实验组，对照组的设置是： 。在相同且适宜的条件下培养一段时间，观察并统计两组棉花叶片的受损程度。 （5）该项科学成果在环境保护上的重要作用是 。 一、单选题 1．母乳来源的胆盐激活酯酶(BSSL)是一种脂肪酶，具有广泛的底物水解活性，对乳脂消化吸收具有重要作用。因此，对胆盐激活酯酶的研究是“人乳化牛奶”计划的重要组成部分。下图表示含有BSSL基因的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，限制性内切核酸酶MspI、SmaI识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、CCC↓GGG。下列叙述错误的是（    ） A．限制酶能识别双链DNA中特定核苷酸序列，并断开特定位置的磷酸二酯键 B．若用MspI酶切割BSSL基因产生的黏性末端只能用E.coliDNA连接酶连接 C．若要将外源基因导入细胞，可以用质粒、噬菌体、动植物病毒等作为载体 D．若用限制酶Sma I完全切割图中DNA片段，其产物长度为339 bp、9844 bp、533 bp 2．(23-24高二下·湖南株洲炎陵县·期中)多种实验材料都可以用于DNA的粗提取与鉴定，用香蕉也可以取得较好的实验效果。下列叙述错误的是（    ） A．将粗提取的DNA加入2 mol/L的NaCl溶液的目的是为了溶解DNA B．冷却的体积分数为95%的酒精可以溶解某些蛋白质，得到粗提取的DNA C．向剪碎的香蕉果肉组织中加入蒸馏水并研磨，以释放核DNA D．将DNA溶于NaCl溶液后加入现配的二苯胺试剂，沸水浴冷却后会出现蓝色 3．(23-24高二下·湖南雅礼教育集团·期中)基因工程自20世纪70年代兴起后，在农牧业、医药卫生和食品工业等方面得到了飞速的发展。下列关于基因工程应用的叙述，正确的是（　　） A．通过将肠乳糖酶导入到奶牛乳腺细胞中，以降低乳汁中乳糖含量，从而解决部分人群的乳糖不耐受问题 B．通过X射线、紫外线综合处理，将青霉素产量低的菌种培育成产量高的菌株属于基因工程技术的应用 C．通过制备山羊膀胱生物反应器，使人乳铁蛋白基因只存在于膀胱细胞中，进而可以从尿液中分离纯化出所需要的人乳铁白蛋白，实现大量制备的目的 D．与人细胞分泌的天然生长激素相比，将人的生长激素基因导入大肠杆菌制备的工程菌无法对生长激素进行正常的加工和修饰 4．(23-24高二下·湖南雅礼教育集团·期中)下图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列叙述错误的是（　　） A．用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸，在设计引物时，应尽量避免引物自身或引物之间发生碱互补配对，影响扩增的效果 B．从理论上推测，第n轮循环后同时含有引物A、B的DNA分子占的比例为（2n-1）/2n C．在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段 D．PCR的产物一般可以利用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定，DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度都会影响DNA在凝胶中的迁移速率 5．(23-24高二下·湖南岳阳岳阳县岳阳县第一中学·期中)OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽（引导合成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多基因表达载体（载体中部分序列如图所示），利用农杆菌转化法转化水稻，在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列叙述正确的是（　　） A．可用抗原﹣抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达量 B．四个基因转录时都以DNA的同一条单链为模板 C．应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞 D．四个基因都在水稻叶绿体内进行转录翻译 6．(22-23高二·湖南长沙湖南师大附中·期中)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段（Fn与R），将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。下列有关叙述错误的是（    ）    A．为将扩增后的产物定向插入载体，指导荧光蛋白基因表达，需用MunI和XhoI处理载体 B．从产物扩增到载体构建完成的整个过程需6种酶 C．将构建的载体导入去除BCL1IA基因的受体细胞，可能出现含F1与R扩增产物的受体细胞无荧光，而含F2-F7与R扩增产物的受体细胞有荧光 D．向培养液中添加适量的雌激素，可导致部分受体细胞不再有荧光 7．(22-23高二·湖南益阳桃江县七中·期中)动物乳腺生物反应器是一项利用转基因动物的乳腺代替传统的生物发酵，进行大规模生产可供治疗人类疾病或用于保健的活性蛋白质的现代生物技术。目前科学家已在牛和羊等动物的乳腺生物反应器中表达出了抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素等重要药品。其大致过程如下图所示，下列有关说法错误的是（    ） A．重组质粒只具有人的药用蛋白基因、启动子、终止子和标记基因 B．④通常采用显微注射技术 C．可以从转基因母牛乳汁中提取药物 D．该技术生产药物的优点是产量高、质量好、易提取 8．(22-23高二·湖南长沙湖南师大附中·期中)日本存在Oryzias  latipes和Oryzias  sakaicumii两种鳞鱼，可以相互交配，形成杂种。将纯系O.latipes的雌雄个体各一条与O.sakaizumii的雌雄个体各一条放入同一水槽中，过一段时间从中采集两个胚（胚1和胚2），并提取DNA；另外，还提取了纯系O.latipes和O.sakaizumii的DNA，对所有提取物进行核基因与线粒体基因PCR并凝胶电泳，结果如图1所示。另外还利用某种限制酶进行了处理，结果如图2所示。请推测胚1和胚2的父母组合为（    ）    胚1 胚2 A ♀O.latipes×♂O.latipes ♀O. sakaizumii×♂O.latipes B ♀O.latipes×♂O. sakaizumii ♀O.latipes×♂O.latipes C ♀O. sakaizumii×♂O.latipes ♀O.sakaizumii×♂O.sakaizumii D ♀O.sakaizumii×♂O. sakaizumii ♀O.sakaizumii×♂O.latipes A．A B．B C．C D．D 9．(21-22高二下·湖南长沙长郡中学·期中)CRISPR/Cas9是一种生物学工具，能够通过“剪切和连接”脱氧核糖核酸（DNA）序列的机制来编辑基因组。这套系统源自细菌的防御机制，是一种对任何生物基因组均有效的基因编辑工具。CRISPR/Cas9基因组编辑系统由向导RNA（也叫sgRNA）和Cas9蛋白组成，向导RNA识别并结合靶基因DNA．Cas9蛋白切断双链DNA使其形成两个末端。这两个末端通过“断裂修复”重新连接时通常会有个别碱基对的插入或缺失，从而实现基因敲除，如图所示。CRISPR/Cas9基因组编辑技术有时存在编辑出错而造成脱靶。下列叙述正确的是（　　）    A．Cas9蛋白能作用于脱氧核糖和碱基之间的化学键 B．对不同目标DNA进行编辑时，使用Cas9蛋白和相同的sgRNA进行基因编辑 C．CRISPR/Cas9基因组编辑系统使细菌获得抵抗溶菌酶或抗生素的能力 D．其他DNA序列含有与 sgRNA互补配对的序列，会造成 sgRNA错误结合而脱靶 10．(22-23高二下·湖南长沙雅礼中学·期中)心肌长期负荷过重引起的心肌细胞肥大、间质纤维化等过程称为心肌重塑，与基因Snhg5过表达相关，Snhg5转录出的RNA并不翻译产生蛋白质，而是以RNA的形式发挥调节作用。通过基因工程构建了人心肌细胞特异性过表达Snhg5的转基因载体α‑MHC‑Snhg5‑hGH，将其导入动物的受精卵中，通过受精卵移植得到稳定携带外源目的基因的动物子代为心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠。结合题干信息，以下说法中不合理的是（    ） A．可以使用促性腺激素作用于雌性小鼠超数排卵 B．可以使用显微注射法将转基因载体α‑MHC‑Snhg5‑hGH导入到小鼠受精卵中 C．该小鼠可以作为研究心肌重塑疾病的模型小鼠，利于人类用来研究相关的治疗药物 D．可以使用凝胶电泳法分离心肌细胞的蛋白质，检查目的基因是否表达 11．(22-23高二下·湖南长沙雅礼中学·期中)生物工程应用广泛，成果丰硕，下列对应工程技术应用正确的是（    ） A．利用乳腺反应器生产药物，属于基因工程与动物细胞工程 B．制造一种能降解石油的“超级细菌”属于发酵工程 C．利用苏云金芽孢杆菌制成生物农药属于基因工程 D．人工生产牛胰岛素属于蛋白质工程 12．(22-23高二下·湖南多校联考·期中)甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质，将甜蛋白基因导入番茄可提高番茄甜味，改善番茄品质。下图是甜蛋白基因和Ti质粒上限制酶切割位点示意图。下列叙述正确的是（　　） A．可使用XbaⅠ和HindⅢ处理切割甜蛋白基因和Ti质粒 B．可使用XbaⅠ和EcoRⅠ处理切割甜蛋白基因和Ti质粒 C．启动子能被DNA聚合酶识别，启动转录 D．重组质粒成功导入受体细胞后，受体细胞能合成卡那霉素 二、多选题 13．(23-24高二下·湖南雅礼教育集团·期中)用A和B两种限制酶同时和分别处理同一DNA片段，限制酶对应切点一定能切开。两种酶切位点及酶切产物电泳分离结果如图1和图2所示。下列叙述正确的是（　　）      A．图1中X代表的数值为4500，Y是限制酶A的酶切位点 B．图1中的两种限制酶与解旋酶都能催化氢键的断裂，图2中①是限制酶A处理得到的酶切产物 C．用A和B两种限制酶同时处理图1中同一个DNA片段后，产物中共含有6个游离的磷酸基团 D．若要将图1中的DNA片段完整地复制，则需要用到的引物对为引物1和引物4 14．(22-23高二·湖南益阳桃江县七中·期中)下图为利用生物技术获得生物新品种的过程，有关说法正确的是（    ） A．A→B过程中用到的原料有4种，加入的引物有2种 B．A→B过程利用了DNA半保留复制原理，需要使用耐高温的DNA聚合酶 C．B→C为转基因绵羊的培育过程，常选用的受体细胞是卵母细胞 D．B→D为转基因植物的培育过程，其中④过程常用的方法是农杆菌转化法 15．(22-23高二下·湖南长沙雅礼中学·期中)蜘蛛丝（丝蛋白）有着超强的抗张强度，可制成防弹背心、降落伞绳等。科学家研究出集中生产蜘蛛丝的方法——培育转基因蜘蛛羊。以下叙述正确的是（    ） A．从蜘蛛细胞中直接提取的丝蛋白基因与逆转录获得的丝蛋白基因，两者的主要区别在于启动子、终止子 B．在PCR中获取引物可以从GenBank获得丝蛋白基因序列，设计两个不同的引物 C．该过程需要在蜘蛛羊的泌乳期定向诱导蜘蛛丝蛋白基因基因选择性表达 D．可以使用PCR等技术检测山羊的染色体DNA是否插入了丝蛋白基因或者检测丝蛋白基因是否转录出mRNA 16．(21-22高二下·湖南长沙长郡中学·期中)蛋白酶应用于洗涤剂、制革及丝绸工业。某研究小组利用蛋白质工程将该蛋白酶中第188位丙氨酸替换为脯氨酸、第239位谷氨酰胺替换为精氨酸、第262位缬氨酸替换为亮氨酸，结果发现该酶的催化活性大幅度提高。下列叙述正确的是（    ） A．对枯草杆菌蛋白酶进行改造通过直接改造蛋白酶的分子结构来实现 B．通过基因工程和蛋白质工程生产的枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列相同 C．改造后的枯草杆菌蛋白酶可能使空间结构发生改变导致其催化活性提高 D．对枯草杆菌蛋白酶进行分子设计必须从预期蛋白酶的功能特点入手 三、非选择题 17．(23-24高二下·湖南常德沅澧共同体·期中)2019年新冠疫情爆发以来，疫情防控成为社会关注的热点问题。下图所示某科研团队运用基因工程研制新冠病毒疫苗的过程。质粒中lacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。回答下列问题： (1)获取目的基因时，首先提取新冠病毒的RNA，再通过逆转录过程获得cDNA，该过程需要的酶是 。 (2)图中过程①有两种限制酶选择方案（注：图中几种限制酶切割产生的末端不同）：方案一：选用1种限制酶；方案二：选用2种限制酶，最佳选择是 ；方案二优于方案一的原因是 。 (3)需要用一定浓度的 处理大肠杆菌，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后将重组质粒导入其中。筛选含重组质粒的大肠杆菌时，须在培养大肠杆菌的通用培养基中加入 ，培养一段时间后，挑选出 色的菌落进一步培养获得大量目的菌。 (4)利用PCR技术获取目的基因时，PCR扩增仪中要加入缓冲液、目的基因、引物、 、 等。据下图分析，应选择甲、乙、丙、丁四种引物中的 。 18．(23-24高二下·湖南雅礼教育集团·期中)稻田生物固氮作用是稻田氮素循环的关键环节，某些蓝细菌是自生固氮菌（独立生活时能够利用空气中游离的氮分子作为氮源，并将氮分子转化为氨，氨转化为铵盐后是植物良好的氮素营养）。蓝细菌中B基因（长度为0.9kb）表达的B蛋白是一种有助于蓝细菌高效吸收NO3的载体蛋白，科学家利用基因工程等技术，尝试将蓝细菌的B基因导入水稻细胞，以期获得吸收NO5能力较强的转基因水稻，从而增加粮食产量。下图1是农杆菌的Ti质粒结构图（Tet、Amp'分别为四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因），图2为蓝细菌B基因的结构模式图。回答下列有关问题： 限制酶 BamH I Bcl I Sma I Sau3A I 酶切位点 5’-G↓GATCC-3’ 5’-T↓GATCG-3’ 5’-CCC↓GGG-3’ 5’-↓GATC-3’ (1)目的基因的获取：利用从细菌中提取的DNA通过PCR技术获取B基因时，除了需要向反应体系中加入DNA模板，缓冲液（含Mg2+），还需要加入 （至少写两种）等。为使目的基因与载体正确连接，在扩增目的基因时，应在其一对引物的5’端分别引入 两种不同限制酶的识别序列。 (2)基因表达载体的构建：①用（1）中选取的限制酶同时对目的基因和载体进行酶切，得到酶切产物后，再选用 （填“E.coli DNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）将目的基因和载体进行连接，得到重组载体，随后进行转化操作。②为筛选获得目的菌株，将转化后的大肠杆菌接种在含 的固体培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（1）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如下图， 号菌落的质粒很可能是含B基因的重组质粒，并进行测序验证。 注：M为指示分子大小的标准参照物：小于0.2kb的DNA分子条带未出现在图中 (3)将重组的Ti质粒转入农杆菌，利用农杆菌的转化作用将目的基因导入水稻细胞。目的基因的检测与鉴定：为检测B基因在转基因水稻细胞中是否成功表达，可通过PCR、抗原-抗体杂交等技术在分子水平上检测，还可以在个体水平上检测，请写出个体水平检测的实验思路 。 19．(23-24高二下·湖南株洲炎陵县·期中)脂肪酶在食品工业中有着广泛的应用，食品生产常需要在高温条件下进行，天然脂肪酶难以满足生产需求。科学家对已知氨基酸序列的脂肪酶进行改造，获得了耐高温的脂肪酶，提高了食品工业的生产效率。回答下列问题。 (1)根据耐高温脂肪酶的结构特点，推测其氨基酸序列，然后重新设计新脂肪酶的基因序列，获得耐高温的脂肪酶的技术称为 。一般来说，新的脂肪酶基因脱氧核苷酸序列会有多种可能，其原因是 。 (2)在设计出耐高温的脂肪酶基因后，对其进行PCR扩增的过程包括 、复性和延伸。延伸过程中由于DNA聚合酶的特性，子链延伸的方向为 。 (3)利用质粒将改造后的耐高温脂肪酶基因导入大肠杆菌，构建基因工程菌甲，若要检测工程菌甲中的耐高温脂肪酶基因是否成功表达，则需利用到 杂交技术，若出现杂交带，则说明基因能在工程菌内正常表达。 (4)利用工程菌甲生产耐高温脂肪酶的过程中，传代多次后，生产条件未变，但某子代菌株不再产生耐高温脂肪酶。分析可能的原因是 (答出两点即可)。 20．(23-24高二下·湖南岳阳岳阳县岳阳县第一中学·期中)赖氨酸是人体细胞不能合成的必需氨基酸。科学家把某种必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因（R）导入玉米中，使玉米中赖氨酸的含量提高30%。回答下列问题。    (1)利用PCR技术扩增R基因时，需要在一定的缓冲液中才能进行，其中需要加入 酶和激活该酶所需的 。为了特异性扩增R基因序列，需根据 设计特异性引物。 (2)在构建基因表达载体时，若为了避免R基因和质粒的自连或反向连接，提高重组效率，应该选择的限制酶是 。 (3)随着转化方法的突破，农杆菌侵染玉米这种单子叶植物也取得了成功。科研人员从新鲜的玉米叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，当农杆菌侵染玉米细胞后，能将 上的T﹣DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到 。 (4)检测R基因是否表达的方法是 。 (5)在基因工程中若要培养转基因小鼠，将基因表达载体导入受体细胞常用的方法是 ，常用的受体细胞是 。 该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。    (1)基因工程中，为了防止插入片段的反向连接，对载体一般采用 （填“单酶切”或“双酶切”）。将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是 。本实验中，从产物扩增到载体构建完成除使用上述限制酶外，还需使用 酶。 (2)基因表达载体必须含有的组分是 ，将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是 。 (3)向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于 。 22．(22-23高二下·湖南邵阳绥宁县一中·期中)1965年中国科学家人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，摘取了人工合成蛋白质的桂冠。人胰岛素基因表达的最初产物是一条肽链构成的前胰岛素原，经下图1所示的过程形成具生物活性的胰岛素。此后科学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；BCA法是利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因，表达出胰岛素原后再用特定酶切掉C肽段。这两种方法使用同一种质粒作为载体。请据下图分析并回答下列问题：      (1)由于密码子具有简并性，AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列。 （填“AB”、“BCA”或“AB和BCA”）法获取的目的基因中不含人胰岛素基因启动子。 (2)图2是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为使目的基因与载体正确连接，在设计PCR引物时可添加限制酶 的识别序列。通过上述方法获得人的胰岛素基因后，需要通过PCR技术进行扩增，已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为-CCTTTCAGCTCA-，则其中一种引物设计的序列是5’ 3’。 (3)β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。经Ca2+处理的大肠杆菌与重组质粒混合培养一段时间后，采用 法将大肠杆菌接种到添加了 的培养基上筛选出 色的菌落即为工程菌种。 23．(22-23高二·湖南益阳桃江县七中·期中)如图是将乙肝病毒表面主蛋白基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程图。巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母，能将甲醇作为其唯一碳源。该酵母菌体内无天然质粒，科学家改造出了图中所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表达。已知当甲醇作为唯一碳源时，该酵母菌中AOX1基因受到诱导而表达[5′AOX1和3′AOX1（TT）分别是AOX1基因的启动子和终止子]。请分析回答下列问题： (1)为实现HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该选择 切割质粒，并在HBsAg基因两侧的A和B位置接上 ，这样设计的优点是 。 (2)酶切获取HBsAg基因后，需用 将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取 。 (3)步骤3中应选用限制酶 来切割重组质粒以获得重组DNA，然后再将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。 (4)为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入 以便筛选；若要检测转化后的细胞中是否含有HBsAg基因转录产物，可以用 技术进行检测。 24．(22-23高二·湖南邵阳邵东一中·期中)人的血清白蛋白（HSA）在临床上需求量很大，通常从人血中提取。但由于艾滋病病毒（HIV）等人类感染性病原体造成的威胁与日俱增，使人们对血液制品顾虑重重，图一是以基因工程技术获取HSA的两条途径，其中报告基因表达的产物能催化无色物质K呈现蓝色。图二为HSA基因两侧的核苷酸序列。图三为相关限制酶的识别序列和切割位点。据图回答下列问题：        (1)基因工程的核心步骤是 。 (2)采用PCR技术扩增HSA基因，根据图二分析，需选择的一对引物序列是______ A．引物Ⅰ是5′-AATGGATCCTTC-3′，引物Ⅱ是5′-GAGAATTGAATG-3′ B．引物Ⅰ是5′-AATGGATCCTTC-3′；引物Ⅱ是5′-CATTCAATTCTC-3′ C．引物Ⅰ是5′-GAAGGATCCATT-3′，引物Ⅱ是5′-GTAAGTTAAGAG-3′ D．引物Ⅰ是5′-GAAGGATCCATT-3′，引物Ⅱ是5′-GAGAATTGAATG-3′ (3)依据图一、图二和图三分析，切割含HSA基因的DNA片段选用的限制酶是 ；切割质粒应选用的限制酶是 。 (4)图一过程①中需将植物细胞与 混合后共同培养，旨在让 整合到植物细胞染色体DNA上，除尽农杆菌后，还须转接到含 的培养基上筛选出转化的植物细胞。 25．(22-23高二下·湖南怀化五中·期中)甘蓝型油菜中，抑制PEP基因的表达可提高油菜籽的含油量。通过基因工程将PEP基因反向连接在启动子后，构建转反义PEP基因油菜是提高油菜籽含油量的常用技术路径。请回答下列问题： (1)为将PEP基因反向连接在启动子后，构建反义PEP基因，需要将限制酶酶切位点设计在引物上，PEP基因的上游引物和下游引物中应分别引入 酶切位点。 (2)用激光照射油菜愈伤组织时，可在细胞膜上打出一个穿孔，转反义PEP基因表达载体由此小孔进入油菜细胞，几秒钟后小孔封闭，该过程体现了细胞膜具有 。目的基因表达载体进入细胞后，Ti质粒上的T－DNA区段可转移到油菜细胞的基因组中。 (3)筛选时，需在油菜愈伤组织培养基中加入 进行初步选择。在激光照射下，存活的细胞一般会发出 。为检测反义PEP基因是否整合到染色体上，研究者通常检测细胞中是否存在ntp基因，而不检测PEP基因。不直接检测PEP基因的原因是 。 26．(22-23高二下·湖南株洲渌口区三中·期中)新型冠状病毒可通过表面的棘突蛋白（S蛋白）与人呼吸道黏膜上皮细胞的ACE2受体结合，这是当前新冠肺炎的研究热点之一、下图为筛选、制备抗S蛋白单克隆抗体的示意图。请据图回答下列问题： (1)为判断疑似患者是否为新型冠状病毒感染者，采集鼻咽拭子主要用于病原学检查，检测病毒的 。 (2)据图所示，研制抗S蛋白单克隆抗体，需先向小鼠注射 以激活小鼠的免疫细胞，再提取激活的B细胞与骨髓瘤细胞融合，用HAT培养基筛选获得 细胞，之后，还需继续筛选的原因是： 。 (3)单克隆抗体具有的优点有： 、 、 。 (4)制备单克隆抗体涉及到的生物技术有 、 。 27．(22-23高二下·湖南长沙雅礼中学·期中)人乳头瘤病毒HPV是双链DNA病毒，可以引起人皮肤黏膜上皮增生。HPV病毒的DNA分子与健康细胞的细胞核结合，利用细胞产生出两种蛋白E6、E7，它们会附着在抑癌基因p53和pRb上，并关闭它们的功能。默沙东九价HPV疫苗是利用酿酒酵母菌进行生产。 (1)相较于其他模式生物而言，酵母菌具有 等特点，能更快获得工程目标。 (2)下图为重组质粒构建的过程，其中AvrⅡ的酶切序列与位点是C↓CTAGG；SnaBI的酶切序列与位点是TAC↓GTA；SacI 的酶切序列与位点是GAGCT↓C；BglII 的酶切序列与位点是 A↓GATCT。在对HPV的DNA进行PCR扩增时，需要设计两种引物以保证目的基因和质粒有相同的限制酶识别序列，根据选择的质粒及各限制酶识别序列，引物中需要有序列 。将得到的重组质粒置于含有Ca2+的酿酒酵母培养液中，酵母菌吸收后，接种到 培养基上进行初步筛选，得到含有该质粒的酵母菌，挑取菌落转移到96孔板上培养，利用 技术鉴定筛选确实表达了HPV的E6、E7蛋白质的酿酒酵母，再进行扩大培养。 (3)在宫颈癌筛查中有HPV检查，取病宫颈组织和局部粘液、分泌物进行HPV-DNA检测。病毒DNA的检测一般采取Real-time PCR技术即实时荧光测序（如下图所示），需要的物质有 、4种脱氧核苷酸、患者的组织或分泌物、水、缓冲液、两种引物 。探针序列含有HPV的特定序列，随着PCR循环次数的增加，很快就检测到了荧光，说明该患者 （有\没有）HPV病毒。 28．(22-23高二下·湖湘教育三新探索协作体·期中)下图是获得转基因动物和植物的流程图，请据图回答： (1)培育转基因动物和植物的核心工作是 。 (2)图示获得大量目的基因的方法是 ，若模板双链DNA的数量为n个，经过32次循环需要消耗的引物数量是 。 (3)图中过程③使用的激素是 。过程⑥常用的方法是 。 (4)研究人员按照上图所示将白羊草的抗旱基因转入莴苣细胞中，培育出转基因莴苣，欲进一步确定白羊草的抗旱基因与转基因莴苣的抗旱性是否有关，请写出简要的实验设计思路。 。 29．(22-23高二下·湖南多校联考·期中)某种病毒可通过其S蛋白和RBD蛋白与人体细胞表面的受体结合而进入细胞，是宿主抗体的重要作用位点。下图是科研人员利用该病毒S蛋白基因和RBD蛋白基因，研制该病毒双抗原疫苗的技术路线。 (1)PCR扩增时，需在 催化下，在两种引物的 端进行DNA链的延伸，获得扩增产物。 (2)为使S-RBD基因能与pX质粒相连接，并在工程菌中表达时先合成S蛋白，则PCR过程中，应在引物1的5′端添加的限制酶序列是 。 (3)将重组pX质粒导入工程菌前，需用钙离子处理工程菌，使其处于一种 的生理状态，便于重组质粒的导入。 (4)在工程菌的筛选时，可先后用两种抗生素进行影印培养实验（即先将工程菌接种到培养基A上，待长出菌落后使用无菌的绒毡布压在培养基A的菌落上，带出少许菌种，平移并压在培养基B上），则培养基A上应添加的抗生素为 （填“青霉素”或“四环素”）。若培养基B中有存活的菌落，则这些菌落的细胞内 （填“含”或“不含”）S-RBD基因。鉴定pX质粒和重组pX质粒是否导入工程菌还可以采用的方法是 。 30．(21-22高二下·湖南长沙明德中学·期中)在培育转基因植物的研究中。卡那霉素抗性基因（kan）常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。下图为获得抗虫棉的技术流程。请据图回答： (1)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能 ；质粒DNA分子上有 ，便于外源DNA插入；载体上还必须含有 ，其位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位。 (2)A过程需要的酶有限制性内切核酸酶和DNA连接酶，有4种限制性内切核酸酶的切割位点如下图所示。 上图中 酶切割后的DNA片段可以用E。coli  DNA连接酶连接；DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 。 (3)D过程检测植株是否产生抗虫蛋白，所用的方法是 。 (4)转基因植物所携带的目的基因可能传递给非转基因植物，造成基因污染。如果将目的基因导入叶绿体DNA中，就可以有效避免基因污染，原因是 。 31．(21-22高二下·湖南长沙长郡中学·期中)科研人员将酵母菌的DAK基因导入天竺葵的叶绿体中，获得了同化甲醛能力较强的天竺葵。为测定转基因天竺葵同化甲醛的能力，科研人员进行了实验，获得如图所示的结果。回答下列问题： (1)将DAK基因和载体选用双酶法进行切割而不是选用一种限制酶进行切割，原因是 （答2点）。限制酶具有专一性，从限制酶的作用特点分析，具体体现是 （答１点）。 (2)常使用PCR特异性地快速扩增目的基因，原理是 。PCR反应需要在一定缓冲溶液中进行，需要加入DNA聚合酶，其作用是 。用设计的引物和合适的条件进行PCR，其产物用电泳鉴定，结果发现有目的基因以外的杂带存在，分析可能原因是： 。 (3)将DAK基因导入天竺葵的叶绿体中，可以避免花粉扩散引起的基因污染，原因是 。 (4)据曲线图分析可知，实验结论是 。欲获得上述曲线中的实验数据，如何进行实验，大体实验思路是 。 32．(21-22高二下·湖南长沙南雅中学·期中)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，沿海滩涂盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐碱基因培育出了耐盐碱水稻新品系。请据图回答下列问题： 限制酶 Alu I EcoR I Pat I Sma I 切割位点 AG↓CT TC↑GA G↓AATTC CTTAA↑G CTGCA↓G G↑ACGTC CCC↓GGG GGG↑CCC 表2 几种限制酶识别序列及切割位点表 (1)限制酶主要是从 生物中获得，其特点是能够识别DNA分子某种 ，并在特定位点切割。 (2)获取真核生物的基因通常采用人工合成法，通过图示中①方法合成的耐盐碱基因中是不含 的，如果要将耐盐碱基因和质粒重组，应该在基因两侧的A和B位置除了接上以上两个结构外还需分别加入 限制酶识别序列，这样设计的优点是避免质粒和目的基因自身环化以及定向连接。 (3)过程②采用PCR技术扩增目的基因时，在PCR反应体系的主要成分中应该包含：扩增缓冲液（含Mg2﹢）、水，4种脱氧核糖苷酸、模板DNA、TaqDNA聚合酶和引物Ⅰ和引物Ⅱ，若在该反应体系中，目的基因扩增了4代，则共用了引物Ⅰ 个。 (4)PCR反应中温度呈现周期性变化，其中加热到90～95℃的目的是 ，然后冷却到55-60℃使引物与互补DNA链结合，继续加热到70～75℃，目的是 。 (5)在步骤⑤⑥过程中都需用 处理两类细菌。为了确认目的基因通过⑦过程导入植物细胞中后是否成功表达目的蛋白质，通常从分子水平进行检测的方法是用 法。 (6)假设该抗盐碱基因D，通过基因工程导入水稻后连接到水稻的一条染色体上，则该水稻进行减数分裂的细胞在联会时有 个D基因。 33．(21-22高二下·湖南湖湘教育三新探索协作体·期中)β1，3葡聚糖酶可以水解许多病原真菌细胞壁外层的β-1，3葡聚糖和几丁质，降解真菌细胞壁，从而抑制真菌的生长与繁殖。研究人员在植物中克隆到β-1，3葡聚糖酶基因（BG2）并转入苹果主栽品种，以减少苹果真菌病害、实现无公害生产。据图和所学知识回答下列问题： (1)BG2的克隆可利用PCR技术，需要一小段能与该基因碱基序列互补配对的 作为引物，BG2的克隆前，需准备 种引物。两种引物序列不能互补的最可能原因是 。 (2)上图为利用PATC940（经农杆菌Ti质粒改造获得）构建BG2抗病质粒的过程。图中右下处的酶为DNA连接酶，人工设计的复合启动子的作用是驱动转录和提高（增强）转录活性，它位于目的基因（BG2）的 （填“上游”或“下游”）。用XbaI酶切、SpeI酶切、NotI酶切目的基因与PATC940的优点是构建基因表达载体时，可以防止 、 以及防止目的基因与质粒反向连接。 (3)中国科学家独创的一种方法，将Bt基因导入棉花细胞，这种方法是 ，例如，可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入 中。研究人员将转入BG2抗病质粒的农杆菌与苹果外植体共培养，进行遗传转化。目的基因BG2将随着T-DNA转移到被侵染的细胞而进入细胞，并随其整合到该细胞的染色体DNA上。 (4)在完成遗传转化后，培养基中至少要加入两种抗生素，请推测其作用分别是：一种用于杀死农杆菌，另一种用于 。这样的培养基在微生物学上称为 。 (5)需要不断观察和检测转基因苹果植株在田间的生长状态，以确定目的基因是否赋予了苹果植株抗真菌特性以及 ，这属于 水平的鉴定。 34．(21-22高二下·湖南三湘名校教育联盟.·期中)生物柴油作为新型能源已经成为世界上应用最广泛、发展迅猛的可再生能源之一、研究人员利用基因工程的方法，将油料作物紫苏的产油基因DGAT1与含有氨苄青霉素抗性基因的PMD克隆质粒构建PMD一DGAT1重组质粒，然后导入大肠杆菌扩大培养；再提取出扩增的pMD-DGAT1克隆质粒，与pBI121空载体同时用Xbal，BamHI两种酶酶切，构建pB121一DGAT1表达载体：最后将表达载体导入四尾栅藻获得产油微藻，利用地热废水培养产油微藻不仅能生产生物柴油，还能治理地热废水。回答下列问题： (1)提取紫苏组织细胞RNA经过 得到cDNA，再利用PCR技术扩增得到DGATI基因。在PCR扩增之前，对DGAT1基因进行一次预变性的目的是 。 (2)在配制培养大肠杆菌的培养基时，要在培养基灭菌并冷却到30℃左右后，加入用无菌水配制的适宜浓度的氨苄青霉素溶液，氨苄青霉素不能与培养基一同灭菌的原因可能是 。 (3)基因工程技术中的转化是指 。将DGAT1基因插入到pBI121空载体的启动子与终止子之间的目的是 。若用DGAT1基因探针检测产油微藻，能检测到细胞中的 。判断产油微藻细胞中DGAT1基因是否成功表达，需要加入 排行检测。 (4)为检测产油微藻对地热废水的去污能力，研究人员设计实验并得到相应实验结果如下表： 指标 总氮（mg/L） 总磷（mg/L） 氟化物（mg/L） 废水培养基 23．2 4．32 4．56 培养转基因产油微藻11天后 1．9 0．45 0．84 该实验不能说明产油微藻显著提高了去污能力。请进一步完善实验设计 。 27 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$ 专题05 基因工程 一、单选题 1．(23-24高二下·湖南永州道县道县第一中学·期中)下列实验需要利用光学显微镜进行观察或统计的是（　　） A．计数平板上尿素分解菌的菌落数量 B．利用二苯胺鉴定DNA的粗提物 C．计数培养液中酵母菌种群数量变化 D．观察菊花外植体的生长状况 【答案】C 【来源】湖南省永州市道县道县第一中学2023-2024学年高二下学期5月期中生物试题 【分析】1.统计菌落数目的方法 （1）显微镜直接计数法：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定体积的样品中微生物的数量。 （2）间接计数法：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测样品中大约含有多个活菌。 2.DNA的鉴定：在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。 【详解】A、计数平板上尿素分解菌的菌落数量可以用肉眼直接观察计数，不需要利用光学显微镜，A不符合题意； B、在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，可以通过肉眼直接观察颜色变化，不需要利用光学显微镜，B不符合题意； C、计数培养液中酵母菌种群数量变化利用的是血细胞计数板，需要在显微镜下进行观察，C符合题意； D、观察菊花外植体的生长状况可以用肉眼直接观察，不需要利用光学显微镜，D不符合题意。 故选C。 2．(23-24高二下·湖南雅礼教育集团·期中)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是（　　） A．可选用菜花、香蕉、菠菜和猪血等DNA含量丰富的材料进行实验，但提取DNA的方法可能稍有不同 B．向含DNA的滤液中加入预冷的体积分数70%的酒精溶液中，有利于获得较纯净的DNA C．DNA析出过程中应用玻璃棒沿同一方向进行轻缓搅拌，以免DNA断裂 D．将提取的丝状物溶解在2mol/LNaCl溶液中，将二苯胺试剂加入就能出现蓝色 【答案】C 【来源】湖南省雅礼教育集团2023-2024学年高二下学期期中考试生物试卷 【分析】1、DNA的粗提取与鉴定的实验原理是：①DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可以选择适当浓度的盐溶液可以将DNA溶解或析出，从而达到分离的目的；②DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离；③DNA对于酶、高温和洗涤剂的耐受性，蛋白酶能水解蛋白质，但是不能水解DNA，蛋白质不能耐受较高温度，DNA能耐受较高温度洗涤剂能瓦解细胞膜，但是对DNA没有影响；④在沸水浴的条件下DNA遇二苯胺会呈现蓝色。 2、DNA粗提取与鉴定的实验中，不同操作步骤中加水的作用不同，破碎细胞获取含DNA的滤液时加蒸馏水的目的是使血细胞涨破；出去滤液中的杂质时，加蒸馏水的目的是降低NaCl溶液浓度使DNA析出。 【详解】A、理论上只要含有DNA的生物组织均可作为该实验的材料，因此菜花、香蕉、菠菜等均可作为提取DNA的材料，但猪血不能作为实验材料，因为其中成熟的红细胞没有细胞核和细胞器，因而不含DNA，A错误； B、DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，向含DNA的滤液中加入预冷的体积分数为95%的酒精溶液,有利于获得较纯净 的DNA，B错误; C、在DNA析出后要用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌，防止DNA分子断裂，卷起的丝状物质就是粗提取得到的DNA，C正确； D、将丝状物溶解在2mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺试剂，经过沸水浴加热才出现蓝色，D错误。 故选C。 3．(22-23高二下·湖南多校联考·期中)多重PCR-电泳技术，是指同一个PCR反应体系中包含多对引物，各引物特异性地结合到相应的目的基因上，扩增产生不同长度的片段，再通过电泳进行分离和识别，从而对病原体进行鉴别检测。下列相关叙述错误的是（　　） A．多重PCR过程中，不同的引物之间不能互补 B．PCR和电泳都必须无菌条件下操作，防止外源DNA污染 C．该技术可同时进行多种病原微生物的检测 D．不同大小的DNA分子在电泳时，迁移的速率不同 【答案】B 【来源】湖南省多校联考2022-2023学年高二下学期期中生物试题 【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。 【详解】A、对于同一DNA片段的不同区段进行扩增时，不同引物的碱基排列顺序不能互补，如果互补，就会造成引物形成双链，不能与模板链结合，降低扩增的效率，A正确； B、电泳无需在无菌条件下操作，B错误； C、分析题意可知，多重PCR-电泳技术包含多对引物，各引物特异性地结合到相应的目的基因上，故该技术可同时进行多种病原微生物的检测，C正确； D、电泳时不同大小的DNA片段移动速率不同，分子量小的DNA迁移速度大，D正确。 故选B。 4．(22-23高二下·湖南怀化五中·期中)基因工程中“分子缝合针”指的是（    ） A．限制酶 B．DNA连接酶 C．DNA聚合酶 D．RNA聚合酶 【答案】B 【来源】湖南省怀化市五中2022-2023学年高二下学期期中生物试题 【分析】DNA重组技术至少需要三种工具： （1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。 （2）DNA连接酶：两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，形成重组DNA。 （3）运载体：常用的运载体有质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。 【详解】A、限制酶能特异性识别特定的核苷酸系列，并在特定的核苷酸序列处切割质粒和目的基因，称为“基因的剪刀”，A不符合题意； B、DNA连接酶让两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，形成重组DNA，是基因工程中的“分子缝合针”，B符合题意； C、DNA聚合酶能将单个脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上，不是基因工程中的“分子缝合针”，C不符合题意； D、RNA聚合酶用于转录过程，合成mRNA，不是基因工程中的“分子缝合针”，D不符合题意。 故选B。 5．(21-22高二下·湖南长沙南雅中学·期中)现代生物科学技术中涉及的一些生物学概念，不符合集合图所示关系的是（    ） A．①动物细胞核移植②动物细胞工程③细胞工程 B．①一个将发育为胎盘的细胞②内细胞团③囊胚 C．①植物组织培养②植物细胞工程③细胞工程 D．①质粒②载体③基因工程的分子工具 【答案】B 【来源】湖南省长沙市南雅中学2021-2022学年高二下学期期中生物试题 【分析】1、基因工程的工具： （1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。 （2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 （3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。 2、细胞工程包括植物细胞工程和动物细胞工程，其中植物细胞工程包括植物组织培养、植物体细胞杂交技术；动物细胞工程包括动物细胞融合、动物细胞核移植、动物细胞培养等技术。 【详解】A、细胞工程包括植物细胞工程和动物细胞工程，动物细胞工程包括动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合等，A正确； B、囊胚中的滋养层细胞将发育为胎盘，内细胞团则发育为胎儿的各种组织，B错误； C、细胞工程包括植物细胞工程和动物细胞工程，植物细胞工程包括植物组织培养和植物体细胞杂交，植物体细胞杂交包括植物体细胞的融合和植物组织培养，C正确； D、质粒、噬菌体和动植物病毒可以作为载体，载体属于基因工程的三种分子工具之一，D正确。 故选B。 6．(20-21高二上·湖南衡阳田家炳实验中学·期中)目前市面上许多疫苗是应用基因工程技术生产的，在基因工程的实验过程中，把目的基因和运载体连接起来的是（    ） A．核酸酶 B．限制性核酸内切酶 C．DNA连接酶 D．运载体 【答案】C 【来源】湖南省衡阳市田家炳实验中学2020-2021学年高二上学期期中生物（学考班）试题 【分析】基因工程的工具：（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂；（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键；（3）运载体：常用的运载体有质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒等。 【详解】A、核酸酶属于水解酶，能够将核苷酸链水解成核苷酸，不能把目的基因和运载体连接起来，A错误； B、限制性核酸内切酶用于切割DNA，获取目的基因和运载体，不能把目的基因和运载体连接起来，B错误； CD、DNA连接酶能够将DNA片段连接起来，目的基因与运载体被限制酶切割后都相当于DNA片段，故基因工程中将目的基因与运载体连接起来的工具是DNA连接酶，C正确；D错误。 故选C。 7．(20-21高二上·湖南衡阳田家炳实验中学·期中)科学家成功将“抗多聚半乳糖醛酸酶基因”导入番茄，能有效防止细胞壁的分解，获得防腐烂抗软化的转基因番茄，该技术利用的原理是（    ） A．基因突变 B．基因重组 C．染色体结构变异 D．染色体数目变异 【答案】B 【来源】湖南省衡阳市田家炳实验中学2020-2021学年高二上学期期中生物（学考班）试题 【分析】转基因技术是指运用科学手段从某种生物中提取所需要的基因，将其转入另一种生物中，使与另一种生物的基因进行重组，从而产生特定的具有变异遗传性状的物质。利用转基因技术可以改变动植物性状，培育新品种，也可以利用其它生物体培育出期望的生物制品。 【详解】转基因技术的原理是基因重组，该技术能按照人们的意愿定向改造生物的遗传性状，故科学家通过转基因技术将“抗多聚半乳糖醛酸酶基因”导入番茄，获得防腐烂抗软化的转基因番茄，利用的原理是基因重组，ACD错误；B正确。 故选B。 8．(20-21高二上·湖南常德临澧县一中·期中)基因工程中剪切目的基因的工具是（    ） A．DNA连接酶 B．解旋酶 C．DNA聚合酶 D．限制性核酸内切酶 【答案】D 【来源】湖南省常德市临澧县一中2020-2021学年高二上学期期中生物试题（非高考） 【分析】DNA重组技术至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。DNA连接酶：两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，形成重组DNA．常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。 【详解】A、DNA连接酶能够将限制酶切割的末端连接，是基因工程的“针线”，A错误； B、解旋酶用于正常细胞内DNA复制和转录时解开DNA分子的双螺旋结构，B错误； C、DNA聚合酶在复制过程中催化合成DNA分子，C错误； D、限制性核酸内切酶内特异性识别特定的核苷酸系列，在基因工程能够在特定的核苷酸序列出切割质粒和目的基因，是基因工程中剪切目的基因的工具，称为基因工程的“剪刀”，D正确。 故选D。 二、多选题 9．(22-23高二·湖南益阳桃江县七中·期中)腈水合酶（N0）广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域,但不耐高温。利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1）。下列有关叙述正确的是（    ）。 A．N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一 B．加入连接肽需要通过改造基因来实现 C．获得N1的过程需要进行转录和翻译 D．自然界中的酶都可以通过蛋白质工程进行改造 【答案】ABC 【来源】湖南省益阳市桃江县七中2022-2023学年高二4月期中生物试题 【分析】蛋白质工程：以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。 【详解】A、利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶（N1），N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一，A正确； B、加入连接肽需要利用蛋白质工程，通过改造基因实现，B正确； C、基因控制蛋白质的合成，获得N1蛋白质的过程需要进行转录和翻译，C正确； D、一些酶的化学本质是RNA，它们并不能通过蛋白质工程进行改造，D错误。 故选ABC。 10．(22-23高二下·湖南长沙雅礼中学·期中)以下是有关分离与鉴别DNA的技术，其中说法正确的是（    ） A．DNA在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最大 B．PCR的两种引物一般20-30个核苷酸，过长易发生引物内部的折叠 C．对PCR循环30次之后的DNA分子进行琼脂糖凝胶电泳，与标样对照判断是否存在目的基因片段 D．琼脂糖凝胶电泳从阴极加样，分子量较大的接近于加样孔 【答案】BC 【来源】湖南省长沙市雅礼中学2022-2023学年高二下学期期中生物试题 【分析】用凝胶色谱法分离蛋白质的原理是蛋白质分子量大小不同导致有些蛋白质能进入凝胶颗粒，另一些不能，所以迁移速度不同，将分子量不同的蛋白质分离，电泳的原理是利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的目的。 【详解】A、DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，在0.14mol/L的NaCl溶液中的最低，A错误； B、PCR的两种引物一般20-30个核苷酸，过长易发生引物内部的折叠，导致PCR扩增失败，B正确； C、PCR产物一般通过琼脂糖凝胶电泳技术进行鉴定，对PCR循环30次之后的DNA分子进行琼脂糖凝胶电泳，与标样对照判断是否存在目的基因片段，C正确； D、DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH条件下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场作用下，这些带电分子就会向着与它所带电荷相反的电极移动，则加样时，可根据DNA分子所带电荷的不同，从阴极或者阳极加样，其中分子量大的蛋白质移动慢，接近于加样孔，D错误。 故选BC。 三、非选择题 11．(22-23高二下·湖南怀化五中·期中)回答下列利用转基因动物生产药物的问题： (1)家蚕细胞具有高效表达外源基因的能力。将人干扰素基因导入家蚕细胞并大规模培养，可提取干扰素用于制药。为使干扰素基因在家蚕细胞中高效表达，需要把干扰素基因片段正确插入表达载体的 和 之间。采用 技术可验证干扰素基因是否已经导入家蚕细胞。 (2)若要获得含有人干扰素基因的转基因牛，将基因表达载体导入受体细胞。导入并培养成功后，该基因在 （填“任意体细胞”或“乳腺细胞”）中表达。构建基因工程表达载体时，若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生 （填“相同”或“不同”）黏性末端的限制酶。 【答案】(1) 启动子 终止子 PCR (2) 乳腺细胞 相同 【来源】湖南省怀化市五中2022-2023学年高二下学期期中生物试题 【分析】基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原抗体杂交技术。④个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定等。 【详解】（1） 在基因工程中，构建表达载体时，需要将目的基因插入启动子和终止子之间，以使目的基因得到高效表达。PCR技术可验证干扰素基因（目的基因）是否已经导入家蚕细胞（受体细胞）。 （2）干扰素是一种蛋白质，其干扰素基因只能在乳腺细胞中表达。构建基因工程表达载体时，若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生相同黏性末端的限制酶。利用碱基互补配对，目的基因和质粒便可以直接进行连接。 12．(21-22高二下·湖南长沙明德中学·期中)新型冠状病毒（RNA病毒）可通过表面的棘突蛋白（S蛋白）与人呼吸道黏膜上皮细胞的ACE2受体结合，侵入人体，引起肺炎。抗体可阻断病毒的黏附或入侵，故抗体药物的研发已成为治疗新冠肺炎的研究热点之一。下图为筛选、制备抗S蛋白单克隆抗体的示意图，序号①~④表示细胞。据图回答下列问题： (1)诊断是否感染新型冠状病毒，可通过咽拭子取样，其检测的是病毒的RNA．但由于采集的样品量较少，为了增加检材数量可进行 。 (2)获取小鼠新鲜的骨髓瘤组织，需在37℃下用 处理30-40分钟形成离散细胞，在CO2培养箱中培养，CO2的作用是 。 (3)细胞①、②融合常用的诱导因素有 。 (4)用HAT选择培养基筛选获得的③为 ，细胞③至细胞④还要进行 ，该细胞④的特点是 。 【答案】(1)PCR扩增 (2) 胰蛋白酶或胶原蛋白酶 维持培养液的pH (3)聚乙二醇（PEG）、灭活的病毒、电融合法等 (4) 杂交瘤细胞 克隆化培养和抗体检测 既能迅速大量增殖，又能产生特定抗体 【来源】湖南长沙市明德中学2021-2022学年高二下学期期中生物试题 【分析】分析题图：图中①为浆细胞，②为骨髓瘤细胞，③为杂交瘤细胞，④为能产生特定抗体的杂交瘤细胞。 【详解】（1）为了增加检材数量可进行PCR扩增，增加核酸的数目。 （2）培养动物细胞需要在37℃下用胰蛋白酶或胶原蛋白酶将其分散为单个细胞；在CO2培养箱中培养，CO2可以维持培养液的pH。 （3）常用来诱导动物细胞融合的因素有聚乙二醇（PEG）、灭活的病毒、电融合法等。 （4）经过HAT选择培养基筛选获得的③为杂交瘤细胞，是B细胞和骨髓瘤细胞形成的融合细胞，细胞③至细胞④还要进行克隆化培养和抗体检测。④细胞既能迅速大量繁殖，又能产生专一抗体。 13．(20-21高二·湖南湖湘教育三新探索协作体·期中)棉铃虫是一种严重危害棉花的害虫。我国科学家发现一种生活在棉铃虫消化道内的苏云金芽孢杆菌能分泌一种毒蛋白使棉铃虫致死，而此毒蛋白对人畜无害。科学家通过基因工程，将苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因转入到普通棉株细胞内，并成功地实现了表达，从而培育出了能抗棉铃虫的棉花植株——抗虫棉，其过程大致如图所示。回答下列问题： （1）基因工程需要两种工具酶，分别是 、 。 （2）基因工程的操作程序主要包括的四个步骤是：目的基因的获取 、 、 。 （3）生产抗虫棉的整个过程中需要基因工程操作和 技术，将转基因受体细胞培育成转基因植株。 （4）从个体水平鉴定抗虫棉是否培育成功，取一定量长势良好的转基因棉花植株接种适量的棉铃虫作为实验组，对照组的设置是： 。在相同且适宜的条件下培养一段时间，观察并统计两组棉花叶片的受损程度。 （5）该项科学成果在环境保护上的重要作用是 。 【答案】 限制性核酸内切酶（或限制酶） DNA连接酶 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 植物组织培养 取等量长势一致的普通棉花植株接种等量的棉铃虫 减少了农药对环境的污染，保护了生态环境 【来源】湖南省湖湘教育三新探索协作体2020-2021学年高二4月期中联考生物试题 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成； （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等； （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法； （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】（1）基因工程需要两种工具酶，分别是限制性核酸内切酶（或限制酶）切割DNA、DNA 连接酶连接DNA片段。 （2）基因工程的操作程序主要包括的四个步骤是∶ 目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 （3）根据图示可得，生产抗虫棉的整个过程中需要基因工程操作和植物组织培养技术，将转基因受体细胞培育成转基因植株。 （4）为了保证实验单一自变量原则，无关变量相同且适宜，实验组接种棉铃虫给转基因植株，则对照组应取等量长势一致的普通棉花植株接种等量的棉铃虫。 （5）转基因抗虫棉减少了农药对环境的污染，保护了生态环境，是该项科学成果在环境保护上的重要作用。 【点睛】本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理、操作工具及操作步骤，掌握各操作工具的作用及各操作步骤中需要注意的细节，能结合所学的知识准确答题。 一、单选题 1．母乳来源的胆盐激活酯酶(BSSL)是一种脂肪酶，具有广泛的底物水解活性，对乳脂消化吸收具有重要作用。因此，对胆盐激活酯酶的研究是“人乳化牛奶”计划的重要组成部分。下图表示含有BSSL基因的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，限制性内切核酸酶MspI、SmaI识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、CCC↓GGG。下列叙述错误的是（    ） A．限制酶能识别双链DNA中特定核苷酸序列，并断开特定位置的磷酸二酯键 B．若用MspI酶切割BSSL基因产生的黏性末端只能用E.coliDNA连接酶连接 C．若要将外源基因导入细胞，可以用质粒、噬菌体、动植物病毒等作为载体 D．若用限制酶Sma I完全切割图中DNA片段，其产物长度为339 bp、9844 bp、533 bp 【答案】B 【来源】湖南省三湘名校教育联盟2023-2024年高二下学期4月期中联考生物试题 【分析】限制性核酸内切酶切断的化学键所处的具体部位是磷酸二酯键。 【详解】A、限制酶的作用是识别双链DNA中特定核苷酸序列，并断开特定位置的磷酸二酯键，A正确； B、MspI酶切割后，BSSL基因和质粒产生的黏性末端可以用E．coliDNA连接酶或T4DNA连接酶连接，平末端的连接只能用T4DNA连接酶连接，B错误； C、可以利用质粒、噬菌体、动植物病毒等作为载体将外源基因导入细胞，C正确； D、根据题意可知，SmaI的酶切位点CCC↓GGG，结合图示可知，若用限制酶Sma I完全切割图中DNA片段，其产物长度为339 bp、9844 bp、533 bp，D正确。 故选B。 2．(23-24高二下·湖南株洲炎陵县·期中)多种实验材料都可以用于DNA的粗提取与鉴定，用香蕉也可以取得较好的实验效果。下列叙述错误的是（    ） A．将粗提取的DNA加入2 mol/L的NaCl溶液的目的是为了溶解DNA B．冷却的体积分数为95%的酒精可以溶解某些蛋白质，得到粗提取的DNA C．向剪碎的香蕉果肉组织中加入蒸馏水并研磨，以释放核DNA D．将DNA溶于NaCl溶液后加入现配的二苯胺试剂，沸水浴冷却后会出现蓝色 【答案】C 【来源】湖南省株洲市炎陵县2023-2024学年高二下学期4月期中生物试题 【分析】根据DNA的溶解性提取DNA：（1）DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaC中的溶解度不同；（2）DNA不溶于酒精，但是某些蛋白质则溶于酒精；（3）DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性不同。 【详解】A、DNA在不同浓度的 NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol/L 的NaCl溶液；将粗提取的DNA加入2mol/L的NaCl溶液中的目的是为了溶解DNA，A正确； B、DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶解于酒精，可用体积分数为95%冷酒精溶解某些蛋白质，析出DNA，获得粗提取的DNA，B正确； C、香蕉果肉组织细胞有细胞壁保护，因此加蒸馏水不会破坏细胞，不能将DNA释放出来，C错误； D、在一定温度下，DNA遇二苯 胺试剂会呈现蓝色；将DNA溶于NaCl溶液后，加入现配的二苯胺试剂，沸水浴冷却后出现蓝色，D正确。 故选C。 3．(23-24高二下·湖南雅礼教育集团·期中)基因工程自20世纪70年代兴起后，在农牧业、医药卫生和食品工业等方面得到了飞速的发展。下列关于基因工程应用的叙述，正确的是（　　） A．通过将肠乳糖酶导入到奶牛乳腺细胞中，以降低乳汁中乳糖含量，从而解决部分人群的乳糖不耐受问题 B．通过X射线、紫外线综合处理，将青霉素产量低的菌种培育成产量高的菌株属于基因工程技术的应用 C．通过制备山羊膀胱生物反应器，使人乳铁蛋白基因只存在于膀胱细胞中，进而可以从尿液中分离纯化出所需要的人乳铁白蛋白，实现大量制备的目的 D．与人细胞分泌的天然生长激素相比，将人的生长激素基因导入大肠杆菌制备的工程菌无法对生长激素进行正常的加工和修饰 【答案】D 【来源】湖南省雅礼教育集团2023-2024学年高二下学期期中考试生物试卷 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测： ①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术； ②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术； ③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 【详解】A、将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，乳糖酶可降解乳糖，可降低乳汁中乳糖含量，A错误； B、通过X射线、紫外线综合处理，将青霉素产量低的菌种培育成产量高的菌株属于诱变育种，B错误； C、通过制备山羊膀胱生物反应器，使人乳铁蛋白基因只存在于膀胱细胞中，由于尿液是肾脏产生的，膀胱只起储藏作用，因此不能从尿液中分离纯化出所需要的人乳铁白蛋白，实现大量制备的目的，C错误； D、由于大肠杆菌缺乏对蛋白质进行加工和分装的内质网和高尔基体，因此与人细胞分泌的天然生长激素相比，将人的生长激素基因导入大肠杆菌制备的工程菌无法对生长激素进行正常的加工和修饰，D正确。 故选D。 4．(23-24高二下·湖南雅礼教育集团·期中)下图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列叙述错误的是（　　） A．用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸，在设计引物时，应尽量避免引物自身或引物之间发生碱互补配对，影响扩增的效果 B．从理论上推测，第n轮循环后同时含有引物A、B的DNA分子占的比例为（2n-1）/2n C．在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段 D．PCR的产物一般可以利用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定，DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度都会影响DNA在凝胶中的迁移速率 【答案】B 【来源】湖南省雅礼教育集团2023-2024学年高二下学期期中考试生物试卷 【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术，所利用的原理为DNA分子的复制，因此PCR技术一般用于基因扩增。①原理：DNA复制；②条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、耐高温的DNA聚合酶；③方式：以指数的方式扩增，即约2n；④过程：变性→复性→延伸。 【详解】A、用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸（引物过长或过短其特异性都较差），在设计引物时，应尽量避免引物自身或引物之间发生碱互补配对，影响扩增的效果，A正确； B、PCR技术的原理是DNA的半保留复制，只有亲本DNA分子对应两条链新形成的DNA分子中只含有引物A或B，其余DNA分子均含有引物A和B，故从理论上推测，第n轮循环后同时含有引物A、B的DNA分子占的比例为（2n-2）/2n，B错误； C、图中的引物A和引物B均不在该片段的端点，因此复制出的子链的长短从引物开始一直延伸至模板链的末端，在第二轮复制中才会出现两个引物之间的单链，因此以此单链为模板在第三轮循环产物中可出现两条核苷酸链等长的DNA片段，即引物之间的核苷酸序列，C正确； D、PCR的产物一般可以利用琼脂糖凝胶电泳技术来鉴定，DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度都会影响DNA在凝胶中的迁移速率 ，D正确。 故选B。 5．(23-24高二下·湖南岳阳岳阳县岳阳县第一中学·期中)OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽（引导合成的蛋白质进入叶绿体）基因连接，构建多基因表达载体（载体中部分序列如图所示），利用农杆菌转化法转化水稻，在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列叙述正确的是（　　） A．可用抗原﹣抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达量 B．四个基因转录时都以DNA的同一条单链为模板 C．应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞 D．四个基因都在水稻叶绿体内进行转录翻译 【答案】A 【来源】湖南省岳阳市岳阳县岳阳县第一中学2023-2024学年高二下学期4月期中生物试题 【分析】1、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 2、目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。 3、将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞中染色体的DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。 【详解】A、可用抗原-抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达量，杂交带相对量越多，表明目的基因翻译成的蛋白质含量越高，A正确； B、由题图可知，在同一个T-DNA中OsGLO1启动子启动转录的方向与其他三个基因的不同，四个基因转录时不都以DNA的同一条单链为模板，B错误； C、卡那霉素抗性基因不在T-DNA中，而潮霉素抗性基因在T-DNA中，应选用含潮霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞，C错误； D、由题意知，利用农杆菌转化法转化水稻，可使目的基因插入到水稻细胞中染色体的DNA上，所以与叶绿体转运肽基因连接的四个基因，在水稻细胞核内进行转录，在核糖体中进行翻译，D错误。 故选A。 6．(22-23高二·湖南长沙湖南师大附中·期中)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段（Fn与R），将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。下列有关叙述错误的是（    ）    A．为将扩增后的产物定向插入载体，指导荧光蛋白基因表达，需用MunI和XhoI处理载体 B．从产物扩增到载体构建完成的整个过程需6种酶 C．将构建的载体导入去除BCL1IA基因的受体细胞，可能出现含F1与R扩增产物的受体细胞无荧光，而含F2-F7与R扩增产物的受体细胞有荧光 D．向培养液中添加适量的雌激素，可导致部分受体细胞不再有荧光 【答案】C 【来源】湖南省长沙市湖南师大附中2022-2023学年高二4月期中生物试题 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。 （4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、观察载体的部分结构的图示，荧光蛋白基因的左侧为终止子，为了将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，扩增后的产物的插入点应在荧光蛋白基因的右侧，而荧光蛋白基因的右侧有三个限制酶切点，分别是MunI、EcoRI和XhoI限制酶的切点，但因为用EcoRI会破坏荧光蛋白基因，所以只能用MunI和XhoI限制酶切割，A正确； B、从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是Taq酶、限制酶EcoRI、限制酶SalI、限制酶MunI、限制酶XhoI、DNA连接酶，B正确； C、据图可知，F1与R的序列要长于F2～F7与R序列，故不可能出现含F1与R扩增产物的受体细胞无荧光，而含F2～F7与R扩增产物的受体细胞有荧光的现象，C错误； D、分析题意可知，P是在雌激素诱导下发挥作用的启动子，向培养液中添加适量的雌激素，雌激素能诱导启动子发挥作用，构建的载体含有BCL11A基因，导入构建载体的受体细胞能合成BCL11A蛋白，γ基因的表达被抑制，故向培养液中添加适量的雌激素，可导致部分受体细胞不再有荧光，D正确。 故选C。 7．(22-23高二·湖南益阳桃江县七中·期中)动物乳腺生物反应器是一项利用转基因动物的乳腺代替传统的生物发酵，进行大规模生产可供治疗人类疾病或用于保健的活性蛋白质的现代生物技术。目前科学家已在牛和羊等动物的乳腺生物反应器中表达出了抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素等重要药品。其大致过程如下图所示，下列有关说法错误的是（    ） A．重组质粒只具有人的药用蛋白基因、启动子、终止子和标记基因 B．④通常采用显微注射技术 C．可以从转基因母牛乳汁中提取药物 D．该技术生产药物的优点是产量高、质量好、易提取 【答案】A 【来源】湖南省益阳市桃江县七中2022-2023学年高二4月期中生物试题 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取；（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、要让药用蛋白基因在乳腺细胞内表达并分泌含药物的乳汁，重组质粒上还必须具有乳腺蛋白基因的启动子等调控组件；A错误； B、转基因动物通常利用的受体细胞是受精卵，采用显微注射技术；B正确； C、只有母牛到达泌乳期，乳腺细胞才会表达相应的药用蛋白基因，乳汁中含有药物；C正确； D、从乳汁里提取药物，优点突出且产量高、质量好、易提取，D正确。 故选A。 8．(22-23高二·湖南长沙湖南师大附中·期中)日本存在Oryzias  latipes和Oryzias  sakaicumii两种鳞鱼，可以相互交配，形成杂种。将纯系O.latipes的雌雄个体各一条与O.sakaizumii的雌雄个体各一条放入同一水槽中，过一段时间从中采集两个胚（胚1和胚2），并提取DNA；另外，还提取了纯系O.latipes和O.sakaizumii的DNA，对所有提取物进行核基因与线粒体基因PCR并凝胶电泳，结果如图1所示。另外还利用某种限制酶进行了处理，结果如图2所示。请推测胚1和胚2的父母组合为（    ）    胚1 胚2 A ♀O.latipes×♂O.latipes ♀O. sakaizumii×♂O.latipes B ♀O.latipes×♂O. sakaizumii ♀O.latipes×♂O.latipes C ♀O. sakaizumii×♂O.latipes ♀O.sakaizumii×♂O.sakaizumii D ♀O.sakaizumii×♂O. sakaizumii ♀O.sakaizumii×♂O.latipes A．A B．B C．C D．D 【答案】A 【来源】湖南省长沙市湖南师大附中2022-2023学年高二4月期中生物试题 【分析】据图分析：将纯系O.latipes的雌雄个体各一条与O.sakaizumii的雌雄个体各一条放入同一水槽中，过一段时间从中采集两个胚（胚1和胚2），并提取DNA利用某种限制酶进行了处理，结果如图2所示，图中包括核基因和线粒体基因，胚1的母本是O.latipes，胚2的母本是O.sakaixumii；胚1的父本是O.latipes，胚2的父本是O.latipes。 【详解】结合图2，图中包括核基因和线粒体基因，对于胚1和胚2而言，核基因来自于父母双方，线粒体基因来自于母方；就线粒体基因来说，胚1的线粒体DNA的酶切片段与O.latipes线粒体DNA的酶切片段电泳条带位置相同，可推知胚1的母本是O.latipes，同理可推知胚2的线粒体DNA的酶切片段与O.sakaixumii线粒体DNA的酶切片段电泳条带位置相同，可推知胚2的母本是O.sakaixumii；再分析核基因的情况，胚1的核DNA的酶切片段与O.latipes核DNA的酶切片段电泳条带位置相同，可知胚1的父本是O.latipes，胚2的核DNA的酶切片段与O.latipes和O.sakaixumii核DNA的酶切片段电泳条带位置相同，可知胚2的父本是O.latipes，A正确 ，BCD错误。 故选A。 9．(21-22高二下·湖南长沙长郡中学·期中)CRISPR/Cas9是一种生物学工具，能够通过“剪切和连接”脱氧核糖核酸（DNA）序列的机制来编辑基因组。这套系统源自细菌的防御机制，是一种对任何生物基因组均有效的基因编辑工具。CRISPR/Cas9基因组编辑系统由向导RNA（也叫sgRNA）和Cas9蛋白组成，向导RNA识别并结合靶基因DNA．Cas9蛋白切断双链DNA使其形成两个末端。这两个末端通过“断裂修复”重新连接时通常会有个别碱基对的插入或缺失，从而实现基因敲除，如图所示。CRISPR/Cas9基因组编辑技术有时存在编辑出错而造成脱靶。下列叙述正确的是（　　）    A．Cas9蛋白能作用于脱氧核糖和碱基之间的化学键 B．对不同目标DNA进行编辑时，使用Cas9蛋白和相同的sgRNA进行基因编辑 C．CRISPR/Cas9基因组编辑系统使细菌获得抵抗溶菌酶或抗生素的能力 D．其他DNA序列含有与 sgRNA互补配对的序列，会造成 sgRNA错误结合而脱靶 【答案】D 【来源】湖南省长沙市长郡中学2021-2022学年高二下学期期中生物试题 【分析】由题意可知，CRISPR-Cas9体系是由靶基因的向导RNA和Cas9蛋白构成的复合体。向导RNA在基因组中负责寻找靶基因并与其结合；Cas9蛋白在向导RNA的引导下切割靶基因，使DNA双链断裂产生平末端。在随后DNA自我修复的过程中，容易随机引起一些碱基对的插入或缺失，导致基因功能改变。 【详解】A、Cas9蛋白识别并切断双链DNA形成两个末端，相当于限制酶，能作用于脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键即脱氧核糖与磷酸之间的磷酸二酯键，A错误； B、在对不同目标DNA进行编辑时，应使用Cas9蛋白和“不同”的sgRNA结合进而实现对不同基因的编辑，B错误； C、噬菌体是通过将自身的DNA注入细菌内，利用细菌内的物质进行自我复制而完成侵染的，而CRISPR−Cas9系统可以定向切割外源DNA，故该系统使细菌获得抵抗噬菌体的能力，但不能获得抵抗溶菌酶或抗生素的能力，C错误； D、CRISRP−Cas9基因编辑技术有时存在编辑出错而造成脱靶，其最可能的原因是其他DNA序列也含有与向导RNA（sgRNA）互补配对的序列，造成向导RNA（sgRNA）错误结合而脱靶，D正确。 故选D。 10．(22-23高二下·湖南长沙雅礼中学·期中)心肌长期负荷过重引起的心肌细胞肥大、间质纤维化等过程称为心肌重塑，与基因Snhg5过表达相关，Snhg5转录出的RNA并不翻译产生蛋白质，而是以RNA的形式发挥调节作用。通过基因工程构建了人心肌细胞特异性过表达Snhg5的转基因载体α‑MHC‑Snhg5‑hGH，将其导入动物的受精卵中，通过受精卵移植得到稳定携带外源目的基因的动物子代为心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠。结合题干信息，以下说法中不合理的是（    ） A．可以使用促性腺激素作用于雌性小鼠超数排卵 B．可以使用显微注射法将转基因载体α‑MHC‑Snhg5‑hGH导入到小鼠受精卵中 C．该小鼠可以作为研究心肌重塑疾病的模型小鼠，利于人类用来研究相关的治疗药物 D．可以使用凝胶电泳法分离心肌细胞的蛋白质，检查目的基因是否表达 【答案】D 【来源】湖南省长沙市雅礼中学2022-2023学年高二下学期期中生物试题 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】A、为了获得较多卵母细胞，用促性腺激素对雌性小鼠进行超数排卵处理，A正确； B、将目的基因导入动物细胞的方法是显微注射法，由于受精卵的全能性较高，故可以使用显微注射法将转基因载体α‑MHC‑Snhg5‑hGH导入到小鼠受精卵中，B正确； C、分析题意，心肌长期负荷过重引起的心肌细胞肥大、间质纤维化等过程称为心肌重塑，与基因Snhg5过表达相关，而该小鼠是心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠，故该小鼠可以作为研究心肌重塑疾病的模型小鼠，利于人类用来研究相关的治疗药物，C正确； D、凝胶电泳法鉴定蛋白质时，迁移速度最快的是相对分子量最小的蛋白质，利用凝胶电泳法可以分离不同大小的蛋白质，但不能确定是哪种蛋白质，不能用于检查目的基因是否表达，D错误。 故选D。 11．(22-23高二下·湖南长沙雅礼中学·期中)生物工程应用广泛，成果丰硕，下列对应工程技术应用正确的是（    ） A．利用乳腺反应器生产药物，属于基因工程与动物细胞工程 B．制造一种能降解石油的“超级细菌”属于发酵工程 C．利用苏云金芽孢杆菌制成生物农药属于基因工程 D．人工生产牛胰岛素属于蛋白质工程 【答案】C 【来源】湖南省长沙市雅礼中学2022-2023学年高二下学期期中生物试题 【分析】动物基因工程的应用：培育快速生长的转基因动物，如转基因绵羊、转基因鲤鱼；改善畜产品品质的转基因动物，如乳汁中含乳糖较少的转基因牛；生产药物的转基因动物，如利用乳腺生物反应器生产药物；作器官移植供体的转基因动物，如无免疫排斥的转基因猪。 【详解】A、科学家们将药用蛋白基因导入动物的受精卵中，培养出转基因动物，让药用蛋白基因只在乳腺细胞中表达，利用乳腺生物反应器生产药物，这属于动物基因工程的应用，A错误； B、野生型的假单胞杆菌只能分解石油中的一种烃类，科学家利用基因工程技术，制造出一种能分解石油中3种烃类的“超级细菌”，提高了石油的降解速率，这属于基因工程的应用，B错误； C、我国科学家将苏云金芽孢杆菌中能够产生杀虫毒素的基因转移到棉花体内，成功培育了一系列抗虫棉品种，该项生物技术属于基因工程，C正确； D、将人的基因导入大肠杆菌体内，使其产生大量胰岛素属于基因工程，D错误。 故选C。 12．(22-23高二下·湖南多校联考·期中)甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质，将甜蛋白基因导入番茄可提高番茄甜味，改善番茄品质。下图是甜蛋白基因和Ti质粒上限制酶切割位点示意图。下列叙述正确的是（　　） A．可使用XbaⅠ和HindⅢ处理切割甜蛋白基因和Ti质粒 B．可使用XbaⅠ和EcoRⅠ处理切割甜蛋白基因和Ti质粒 C．启动子能被DNA聚合酶识别，启动转录 D．重组质粒成功导入受体细胞后，受体细胞能合成卡那霉素 【答案】A 【来源】湖南省多校联考2022-2023学年高二下学期期中生物试题 【分析】基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 选择合适的限制酶对目的基因和质粒进行切割的原则：①不能破坏目的基因②不能破坏所有的抗性基因（至少保留一个）③最好选择两种限制酶分别切割质粒和目的基因，防止目的基因和质粒反向连接，同时要防止目的基因自身环化和质粒的自身环化。 【详解】A、目的基因内有BamHⅠ识别序列，因此不能选择BamHⅠ切割目的基因，因此目的基因左侧应选择限制酶XbaⅠ切割，由目的基因的转录方向可以推测，目的基因右侧应选择靠近终止子的限制酶HindⅢ，而不能选择靠近启动子的EcoRⅠ，因此需要用XbaⅠ和HindⅢ处理切割甜蛋白基因和Ti质粒，A正确； B、若用XbaⅠ和EcoRⅠ处理切割甜蛋白基因，则目的基因与质粒会发生反向连接，不能正常按转录方向转录，B错误； C、启动子能被RNA聚合酶识别，启动转录，C错误； D、重组质粒中含有的是卡那霉素抗性基因，不是卡那霉素合成基因，不能合成卡那霉素，D错误。 故选A。 二、多选题 13．(23-24高二下·湖南雅礼教育集团·期中)用A和B两种限制酶同时和分别处理同一DNA片段，限制酶对应切点一定能切开。两种酶切位点及酶切产物电泳分离结果如图1和图2所示。下列叙述正确的是（　　）      A．图1中X代表的数值为4500，Y是限制酶A的酶切位点 B．图1中的两种限制酶与解旋酶都能催化氢键的断裂，图2中①是限制酶A处理得到的酶切产物 C．用A和B两种限制酶同时处理图1中同一个DNA片段后，产物中共含有6个游离的磷酸基团 D．若要将图1中的DNA片段完整地复制，则需要用到的引物对为引物1和引物4 【答案】AD 【来源】湖南省雅礼教育集团2023-2024学年高二下学期期中考试生物试卷 【分析】限制酶酶切，是一项基于DNA限制酶的基因工程技术，其基本原理是利用限制酶对DNA上特定序列的识别，来确定切割位点并实现切割，从而获得所需的特定序列。 【详解】A、由题可知，图2中三列条带分别对应用A和B两种限制酶同时以及单独使用限制酶A、限制酶B处理DNA片段的酶切产物电泳分离结果，根据②的电泳结果形成了8000和2000两种条带，结合图1可知，②是被限制酶B切割的结果，且在DNA片段上只含有一个限制酶B的识别位点，①被切割形成6000、3500和500三个片段，可知图1的DNA中含有两个限制酶A的识别位点，即Y为限制酶A的识别位点，X=6000－1500=4500，A正确； B、根据A项分析可知，图1中两种限制酶能催化磷酸二酯键的断裂，解旋酶能催化氢键的断裂，由于图1的DNA中含有两个限制酶A的识别位点，因此单独使用酶A会得到三段产物，因此图2中①是限制酶A处理得到的酶切产物，B错误； C、用A和B两种限制酶同时处理可获得四个DNA片段，每个DNA含有两个游离的磷酸集团，故用A和B两种限制酶同时处理图1中同一DNA片段可获得8个游离的磷酸基团，C错误； 电泳凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子大小和构象等有关， D、设计引物从图1中DNA片段中扩增出完整NA片段，需要设计与DNA片段两端碱基序列互补的引物，则需要用到的引物对为引物1和引物4，D正确。 故选AD。 14．(22-23高二·湖南益阳桃江县七中·期中)下图为利用生物技术获得生物新品种的过程，有关说法正确的是（    ） A．A→B过程中用到的原料有4种，加入的引物有2种 B．A→B过程利用了DNA半保留复制原理，需要使用耐高温的DNA聚合酶 C．B→C为转基因绵羊的培育过程，常选用的受体细胞是卵母细胞 D．B→D为转基因植物的培育过程，其中④过程常用的方法是农杆菌转化法 【答案】ABD 【来源】湖南省益阳市桃江县七中2022-2023学年高二4月期中生物试题 【分析】基因工程中获取并扩增目的基因的方法——PCR技术：原理：DNA双链复制原理；物质条件：一段已知核苷酸序列的引物，含目的基因的DNA模板，四种原料即dATP、dTTP、dGTP、dCTP和具有热稳定性的DNA聚合酶；过程：高温解旋 →引物与模板结合 →子链延伸 →反复循环→…… 【详解】A、分析题图可以看出，图中A→B过程为利用PCR技术扩增目的基因，原料是四种脱氧核苷酸，需要两种引物，A正确； B、PCR技术的原理是DNA半保留复制，需要耐高温的DNA聚合酶，B正确； C、B→C为转基因绵羊的培育过程，培育转基因动物时，常用受精卵作为受体细胞，C错误； D、培育转基因植物时，常用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞，D正确。 故选ABD。 15．(22-23高二下·湖南长沙雅礼中学·期中)蜘蛛丝（丝蛋白）有着超强的抗张强度，可制成防弹背心、降落伞绳等。科学家研究出集中生产蜘蛛丝的方法——培育转基因蜘蛛羊。以下叙述正确的是（    ） A．从蜘蛛细胞中直接提取的丝蛋白基因与逆转录获得的丝蛋白基因，两者的主要区别在于启动子、终止子 B．在PCR中获取引物可以从GenBank获得丝蛋白基因序列，设计两个不同的引物 C．该过程需要在蜘蛛羊的泌乳期定向诱导蜘蛛丝蛋白基因基因选择性表达 D．可以使用PCR等技术检测山羊的染色体DNA是否插入了丝蛋白基因或者检测丝蛋白基因是否转录出mRNA 【答案】ABD 【来源】湖南省长沙市雅礼中学2022-2023学年高二下学期期中生物试题 【分析】PCR技术：（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。（2）原理：DNA复制。（3）前提条件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一对引物。（4）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。（5）过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。 【详解】A、从蜘蛛细胞中直接提取的丝蛋白基因与逆转录获得的丝蛋白基因，两者的主要区别在于逆转录获得的丝蛋白基因没有启动子、终止子，A正确； B、在PCR中获取引物可以从GenBank（基因库）获得丝蛋白基因序列，设计两个不同的引物，以保证两条子链从5'--3'端延伸，B正确； C、该过程无需诱导，在蜘蛛羊的泌乳期，蜘蛛丝蛋白基因会自行在相应细胞进行选择性表达，C错误； D、在分子水平的检测，可以使用PCR等技术检测山羊的染色体DNA是否插入了丝蛋白基因或者检测丝蛋白基因是否转录出mRNA，D正确。 故选ABD。 16．(21-22高二下·湖南长沙长郡中学·期中)蛋白酶应用于洗涤剂、制革及丝绸工业。某研究小组利用蛋白质工程将该蛋白酶中第188位丙氨酸替换为脯氨酸、第239位谷氨酰胺替换为精氨酸、第262位缬氨酸替换为亮氨酸，结果发现该酶的催化活性大幅度提高。下列叙述正确的是（    ） A．对枯草杆菌蛋白酶进行改造通过直接改造蛋白酶的分子结构来实现 B．通过基因工程和蛋白质工程生产的枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列相同 C．改造后的枯草杆菌蛋白酶可能使空间结构发生改变导致其催化活性提高 D．对枯草杆菌蛋白酶进行分子设计必须从预期蛋白酶的功能特点入手 【答案】CD 【来源】湖南省长沙市长郡中学2021-2022学年高二下学期期中生物试题 【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或者制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产生活需求。 【详解】A、对枯草杆菌蛋白酶进行改造通过基因来实现，A错误； B、基因工程生产的蛋白质是自然界已有的蛋白质，而蛋白质工程能生产出自然界中不存在的新型蛋白质分子，两者的氨基酸序列不同，B错误； C、该蛋白酶中第188位丙氨酸替换为脯氨酸、第239位谷氨酰胺替换为精氨酸、第262位缬氨酸替换为亮氨酸，结果发现该酶的催化活性大幅度提高，其原因可能是改变了蛋白酶的空间结构，提高了酶与底物的亲和力，C正确； D、对蛋白质进行分子设计应从预期的蛋白质功能出发，对蛋白质的结构进行设计，D正确。 故选CD。 三、非选择题 17．(23-24高二下·湖南常德沅澧共同体·期中)2019年新冠疫情爆发以来，疫情防控成为社会关注的热点问题。下图所示某科研团队运用基因工程研制新冠病毒疫苗的过程。质粒中lacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。回答下列问题： (1)获取目的基因时，首先提取新冠病毒的RNA，再通过逆转录过程获得cDNA，该过程需要的酶是 。 (2)图中过程①有两种限制酶选择方案（注：图中几种限制酶切割产生的末端不同）：方案一：选用1种限制酶；方案二：选用2种限制酶，最佳选择是 ；方案二优于方案一的原因是 。 (3)需要用一定浓度的 处理大肠杆菌，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后将重组质粒导入其中。筛选含重组质粒的大肠杆菌时，须在培养大肠杆菌的通用培养基中加入 ，培养一段时间后，挑选出 色的菌落进一步培养获得大量目的菌。 (4)利用PCR技术获取目的基因时，PCR扩增仪中要加入缓冲液、目的基因、引物、 、 等。据下图分析，应选择甲、乙、丙、丁四种引物中的 。 【答案】(1)逆转录酶、耐高温的DNA聚合酶 (2) 方案二 既防止了目的基因和质粒的自身环化，又能保证目的基因和质粒的正向连接 (3) Ca2+ 青霉素和X-gal 白 (4) 耐高温的DNA聚合酶 原料 乙、丙 【来源】湖南省常德市沅澧共同体2023-2024学年高二下学期期中考试生物试题 【分析】基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取；基因表达载体的构建；将目的基因导入受体细胞；目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）首先提取新冠病毒的RNA，再通过逆转录过程获得cDNA，PCR的原理是DNA半保留复制，其中逆转录需要的酶是逆转录酶，PCR需要耐高温的DNA聚合酶。 （2）如果用一种限制酶，可能切割后的目的基因会自身环化，同时会使目的基因反接在质粒上。为避免目的基因在质粒反向连接，可选用两种不同的限制酶切割，既防止了目的基因和质粒的自身环化，又能保证目的基因和质粒的正向连接。 （3）将重组质粒导入大肠杆菌之前，需要用一定浓度的Ca2+处理大肠杆菌，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，便于重组DNA导入。将重组质粒导入双子叶植物细胞和裸子植物，常用的方法是农杆菌转化法。目的基因拼接在质粒的lacZ基因上，打破了lacZ基因的序列，故筛选含重组质粒的大肠杆菌时，须在培养大肠杆菌的通用培养基中加入青霉素（检测抗性基因）和X-gal（检测是否导入目的基因）培养一段时间后，挑选出白色（若导入目的基因，lacZ基因被破坏，不能分解X-gal而呈白色）的菌落进一步培养获得大量目的菌。 （4）用PCR技术在体外扩增外源基因时，PCR扩增仪中要加入缓冲液、目的基因、耐高温的DNA聚合酶、原料、引物等。PCR时，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的，因此，据如图分析，利用PCR技术获取目的基因时，应选择乙、丙作为引物。 18．(23-24高二下·湖南雅礼教育集团·期中)稻田生物固氮作用是稻田氮素循环的关键环节，某些蓝细菌是自生固氮菌（独立生活时能够利用空气中游离的氮分子作为氮源，并将氮分子转化为氨，氨转化为铵盐后是植物良好的氮素营养）。蓝细菌中B基因（长度为0.9kb）表达的B蛋白是一种有助于蓝细菌高效吸收NO3的载体蛋白，科学家利用基因工程等技术，尝试将蓝细菌的B基因导入水稻细胞，以期获得吸收NO5能力较强的转基因水稻，从而增加粮食产量。下图1是农杆菌的Ti质粒结构图（Tet、Amp'分别为四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因），图2为蓝细菌B基因的结构模式图。回答下列有关问题： 限制酶 BamH I Bcl I Sma I Sau3A I 酶切位点 5’-G↓GATCC-3’ 5’-T↓GATCG-3’ 5’-CCC↓GGG-3’ 5’-↓GATC-3’ (1)目的基因的获取：利用从细菌中提取的DNA通过PCR技术获取B基因时，除了需要向反应体系中加入DNA模板，缓冲液（含Mg2+），还需要加入 （至少写两种）等。为使目的基因与载体正确连接，在扩增目的基因时，应在其一对引物的5’端分别引入 两种不同限制酶的识别序列。 (2)基因表达载体的构建：①用（1）中选取的限制酶同时对目的基因和载体进行酶切，得到酶切产物后，再选用 （填“E.coli DNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）将目的基因和载体进行连接，得到重组载体，随后进行转化操作。②为筛选获得目的菌株，将转化后的大肠杆菌接种在含 的固体培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（1）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如下图， 号菌落的质粒很可能是含B基因的重组质粒，并进行测序验证。 注：M为指示分子大小的标准参照物：小于0.2kb的DNA分子条带未出现在图中 (3)将重组的Ti质粒转入农杆菌，利用农杆菌的转化作用将目的基因导入水稻细胞。目的基因的检测与鉴定：为检测B基因在转基因水稻细胞中是否成功表达，可通过PCR、抗原-抗体杂交等技术在分子水平上检测，还可以在个体水平上检测，请写出个体水平检测的实验思路 。 【答案】(1) （耐高温的）DNA聚合酶、引物、4种脱氧核苷酸 Bcl Ⅰ和Sma Ⅰ (2) T4DNA连接酶 氨苄青霉素 3 (3)将同等数量、生长状态相同的普通水稻和转基因水稻，分别置于含相同浓度的NO3-完全培养液中，在适宜条件下培养一段时间，检测并比较两组培养液中NO3-的剩余量 【来源】湖南省雅礼教育集团2023-2024学年高二下学期期中考试生物试卷 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）PCR技术的反应体系中包括模板DNA、缓冲液（含Mg2+）、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。限制酶Sau3A I会破坏目的基因，BamH I会破坏Amp'氨苄青霉素抗性基因，因此在构建基因表达载体时，应用Bcl Ⅰ和Sma Ⅰ切割Ti质粒，因此在扩增目的基因时，应在其一对引物的5’端分别引入Bcl Ⅰ和Sma Ⅰ两种不同限制酶的识别序列。 （2）由于Sma I酶切后是平末端，而T4 DNA连接酶既能连接黏性末端也能连接平末端，故用（1）中选取的限制酶同时对目的基因和载体进行酶切，得到酶切产物后，再选用T4 DNA连接酶将目的基因和载体进行连接，得到重组载体。由图可知，Tet（四环素抗性基因）被破坏，因此重组质粒上含有的抗性基因为Amp'（氨苄青霉素抗性基因），为筛选获得目的菌株，将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的固体培养基上进行培养。用（1）中选用的两种限制酶进行酶切，B基因（目的基因）会被分离出来，蓝细菌中B基因（目的基因）的长度为0.9kb，由图可知，3号菌落中含有0.9kb的DNA片段，因此3号菌落的质粒很可能是含B基因的重组质粒。 （3）蓝细菌中B基因（长度为0.9kb）表达的B蛋白是一种有助于蓝细菌高效吸收NO3的载体蛋白，在个体水平检测时，可将同等数量、生长状态相同的普通水稻和转基因水稻，分别置于含相同浓度的NO3-完全培养液中，在适宜条件下培养一段时间，检测并比较两组培养液中NO3-的剩余量，NO3-的剩余量较少的即为转基因水稻。 19．(23-24高二下·湖南株洲炎陵县·期中)脂肪酶在食品工业中有着广泛的应用，食品生产常需要在高温条件下进行，天然脂肪酶难以满足生产需求。科学家对已知氨基酸序列的脂肪酶进行改造，获得了耐高温的脂肪酶，提高了食品工业的生产效率。回答下列问题。 (1)根据耐高温脂肪酶的结构特点，推测其氨基酸序列，然后重新设计新脂肪酶的基因序列，获得耐高温的脂肪酶的技术称为 。一般来说，新的脂肪酶基因脱氧核苷酸序列会有多种可能，其原因是 。 (2)在设计出耐高温的脂肪酶基因后，对其进行PCR扩增的过程包括 、复性和延伸。延伸过程中由于DNA聚合酶的特性，子链延伸的方向为 。 (3)利用质粒将改造后的耐高温脂肪酶基因导入大肠杆菌，构建基因工程菌甲，若要检测工程菌甲中的耐高温脂肪酶基因是否成功表达，则需利用到 杂交技术，若出现杂交带，则说明基因能在工程菌内正常表达。 (4)利用工程菌甲生产耐高温脂肪酶的过程中，传代多次后，生产条件未变，但某子代菌株不再产生耐高温脂肪酶。分析可能的原因是 (答出两点即可)。 【答案】(1) 蛋白质工程 密码子的简并性 (2) 变性 5'端→3'端 (3)抗原-抗体 (4)耐高温脂肪酶基因突变、缺失或丢失；工程菌甲在分裂过程中质粒丢失，未遗传给下一代 【来源】湖南省株洲市炎陵县2023-2024学年高二下学期4月期中生物试题 【分析】题干信息：科学家对已知氨基酸序列的脂肪酶进行改造，获得耐高温的脂肪酶，由此可知该过程属于蛋白质工程。蛋白质工程流程：首先要建立蛋白质功能与结构的联系，然后依据所需蛋白质的功能，设计改造天然蛋白质的空间结构，推测出其氨基酸的序列，并根据“中心法则”逆推出基因的核苷酸序列，进而利用基因工程技术改变DNA上特定位点的核苷酸序列，最终将改造了的基因导入受体细胞后进行表达。可见，蛋白质工程是通过设计和改造编 码蛋白质的基因获得特定功能的蛋白质。 【详解】（1）蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质或者制造一种新的蛋白质的过程，因此题干获得耐高温的脂肪酶的技术称蛋白质工程。由于密码子具有简并性，所以新的脂肪酶基因脱氧核苷酸序列会有多种可能。 （2）目的基因通过PCR扩增，其过程包括变性，复性和延伸三个步骤；由于DNA聚合酶只能将脱氧核苷酸连在子链的3'端，故子链的延伸方向为5'→3'。 （3）基因表达的产物为蛋白质，检测蛋白质的方法为抗原-抗体杂交。 （4）利用工程菌甲生产耐高温脂肪酶的过程中，传代多次后，生产条件未变，但某子代菌株不再产生耐高温脂肪酶，说明该菌种可能没有该基因，因此子代菌株不再产生耐高温脂肪酶的原因可能是耐高温脂肪酶基因突变、缺失或丢失或工程菌甲在分裂过程中质粒丢失，未遗传给下一代。 20．(23-24高二下·湖南岳阳岳阳县岳阳县第一中学·期中)赖氨酸是人体细胞不能合成的必需氨基酸。科学家把某种必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因（R）导入玉米中，使玉米中赖氨酸的含量提高30%。回答下列问题。    (1)利用PCR技术扩增R基因时，需要在一定的缓冲液中才能进行，其中需要加入 酶和激活该酶所需的 。为了特异性扩增R基因序列，需根据 设计特异性引物。 (2)在构建基因表达载体时，若为了避免R基因和质粒的自连或反向连接，提高重组效率，应该选择的限制酶是 。 (3)随着转化方法的突破，农杆菌侵染玉米这种单子叶植物也取得了成功。科研人员从新鲜的玉米叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，当农杆菌侵染玉米细胞后，能将 上的T﹣DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到 。 (4)检测R基因是否表达的方法是 。 (5)在基因工程中若要培养转基因小鼠，将基因表达载体导入受体细胞常用的方法是 ，常用的受体细胞是 。 【答案】(1) 耐高温的DNA聚合酶 Mg2+ R基因两端的碱基（核苷酸）序列 (2)PstI、EcoRI (3) Ti质粒 该细胞的染色体DNA上 (4)抗原﹣抗体杂交技术 (5) 显微注射法 受精卵 【来源】湖南省岳阳市岳阳县岳阳县第一中学2023-2024学年高二下学期4月期中生物试题 【分析】基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程的工具有限制酶、DNA连接酶、基因的载体。 基因工程的基本操作程序：（1）目的基因的获取。（2）基因表达载体的构建。（3）将目的基因导入受体细胞。（4）目的基因的检测和鉴定。 【详解】（1）利用PCR技术扩增R基因时，需要在一定的缓冲液中才能进行，其中需要加耐高温的DNA聚合酶和激活该酶所需的Mg2+。为了特异性扩增R基因序列，需根据R基因两端的碱基（核苷酸）序列设计特异性引物，其中引物的作用能使DNA聚合酶从引物的3’端链接脱氧核苷酸。 （2）在构建基因表达载体时，需要用限制酶切割质粒和目的基因，然后用DNA连接酶连接目的基因和质粒。为了避免R基因和质粒的自连或反向连接，应选择两种不同的限制酶去切割质粒和目的基因。图中T-DNA区域只有PstⅠ、EcoRⅠ两种限制酶切口，而R基因左边可被PstⅠ切割、右边可被EcoRⅠ切割，所以可以选择PstⅠ、EcoRⅠ两种限制酶。 （3） 农杆菌转化法进行时，农杆菌要将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到玉米的染色体DNA上。 （4） 检测R基因是否表达，需要检测R基因控制的蛋白质是否合成，可以用抗原-抗体杂交技术，观察是否产生杂交带。 （5）进行转基因动物操作时，需要用显微注射技术将目的基因转入受体细胞，为了发育出转基因小鼠，应选择受精卵作为受体细胞。 21．(23-24高二下·湖南名校联考联合体·期中)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。    (1)基因工程中，为了防止插入片段的反向连接，对载体一般采用 （填“单酶切”或“双酶切”）。将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是 。本实验中，从产物扩增到载体构建完成除使用上述限制酶外，还需使用 酶。 (2)基因表达载体必须含有的组分是 ，将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是 。 (3)向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于 。 【答案】(1) 双酶切 SalI Taq酶、限制酶EcoR Ⅰ 、限制酶Mun Ⅰ 、限制酶Xho Ⅰ 、DNA连接酶 (2) 启动子、目的基因、终止子、标记基因、复制原点 F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达 (3)引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上 【来源】湖南省名校联考联合体2023-2024学年高二下学期期中考试生物试题 【分析】1、据题意可知，科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，据图中注释可知，F1~F7以及R位置均为引物，故扩增的序列分别是引物F1和引物R之间的序列，引物F2和引物R之间的序列，引物F3和引物R之间的序列，引物F4和引物R之间的序列，引物F5和引物R之间的序列，引物F6和引物R之间的序列，引物F7和引物R之间的序列； 2、据图中对限制酶的注释可知，限制酶Mun Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoR Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同，限制酶Xho Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶Sal Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同。 【详解】（1）若质粒和目的基因两端的黏性末端相同，可能会出现质粒和目的基因自身环化以及反向连接的现象，为了防止插入片段的反向连接，对载体一般采用双酶切的方法，形成不同的黏性末端。据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R端与荧光蛋白基因中限制酶Mun Ⅰ 识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有Mun Ⅰ 和 Xho Ⅰ 的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 所识别，故应该选用添加限制酶EcoR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，据图中对限制酶的注释可知，限制酶Mun Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoR Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同，故 R 末端添加的序列所对应的限制酶是EcoR Ⅰ ，在 F1～F7 末端添加的序列所对应的限制酶是Sal Ⅰ ；荧光蛋白基因中含有限制酶EcoR Ⅰ 的识别位点，故对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 切割。综上所述，对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xho Ⅰ 切割，对扩增后的产物用限制酶EcoR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用Taq酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是Taq酶、限制酶EcoR Ⅰ 、限制酶Sal Ⅰ、限制酶Mun Ⅰ 、限制酶Xho Ⅰ 、DNA连接酶。 （2）基因表达载体必须含有的组分是启动子、目的基因、终止子、标记基因、复制原点，受体细胞中已经除去 BCL11A 基因，故扩增产物中的 BCL11A 蛋白结合位点，不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要RNA聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达。 （3）向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的BCL11A基因表达，产生 BCL11A 蛋白， BCL11A 蛋白与BCL11A 蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含 F1～F4 与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F4与引物R之间的序列上；含 F5～F6 与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F5的上游序列，故据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上。 22．(22-23高二下·湖南邵阳绥宁县一中·期中)1965年中国科学家人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，摘取了人工合成蛋白质的桂冠。人胰岛素基因表达的最初产物是一条肽链构成的前胰岛素原，经下图1所示的过程形成具生物活性的胰岛素。此后科学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；BCA法是利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因，表达出胰岛素原后再用特定酶切掉C肽段。这两种方法使用同一种质粒作为载体。请据下图分析并回答下列问题：      (1)由于密码子具有简并性，AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列。 （填“AB”、“BCA”或“AB和BCA”）法获取的目的基因中不含人胰岛素基因启动子。 (2)图2是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为使目的基因与载体正确连接，在设计PCR引物时可添加限制酶 的识别序列。通过上述方法获得人的胰岛素基因后，需要通过PCR技术进行扩增，已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为-CCTTTCAGCTCA-，则其中一种引物设计的序列是5’ 3’。 (3)β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。经Ca2+处理的大肠杆菌与重组质粒混合培养一段时间后，采用 法将大肠杆菌接种到添加了 的培养基上筛选出 色的菌落即为工程菌种。 【答案】(1)AB和BCA (2) XhoⅠ和MunⅠ -CTCGAGCCTTTCAGCTCA- (3) 稀释涂布平板 氨苄青霉素和X-gaⅠ 白色 【来源】湖南省邵阳市绥宁县一中2022-2023学年高二下学期期中生物试题 【分析】PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术；因为DNA合成时，新链的延伸方向是5’→3’，因此，设在计PCR引物时需要在5’端加上酶切位点。 【详解】（1）由于密码子具有简并性，同一个氨基酸可能有多个密码子编码，对应的碱基序列可能有多种，所以以肽链为模板合成DNA时可能具有多种序列。由于启动子是不转录的，此外转录产生的肽链经过加工起始的一段大部分会被切除，所以以肽链或mRNA为模板合成的DNA分子上都不具有启动子，所以AB和BCA法获取的目的基因中不含人胰岛素基因启动子。 （2）为使目的基因与载体正确连接，因为目的基因中含有Sa1I和NheI酶切位点，因此，结合质粒中含有的限制酶识别系列，在设计PCR引物时可添加限制酶XhoⅠ和MunⅠ的识别序列。目的基因要插在启动子和终止子之间，以便目的基因能够正常表达，为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，可使用不同的限制酶共同切割目的基因和质粒。通过上述方法获得人的胰岛素基因后，需要通过PCR技术进行扩增，已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为-CCTTTCAGCTCA-，则其中一种引物设计的序列是5’ -CTCGAGCCTTTCAGCTCA-3’。引物是一小段能与DNA母联的一段碱基序列互补配对的段单链核酸。因为DNA合成时，新链的延伸方向是5’到3’，因此在设计引物时要在5’端加上酶切位点。 （3）β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。经Ca2+处理的大肠杆菌与重组质粒混合培养一段时间后，其目的是提高转化的效率，为筛选成功导入目的基因的受体细胞，其操作为：为了获得单菌落可采用稀释涂布平板法将大肠杆菌接种到添加了氨苄青霉素和X-gaⅠ的培养基上，由于重组质粒中含有抗氨苄青霉素的基因，且IacZ基因被破坏，因此能在该培养基上生长且不能使X-gal变为蓝色的菌落为目的菌，即从培养基上筛选出白色的菌落即为工程菌种。 23．(22-23高二·湖南益阳桃江县七中·期中)如图是将乙肝病毒表面主蛋白基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程图。巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母，能将甲醇作为其唯一碳源。该酵母菌体内无天然质粒，科学家改造出了图中所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表达。已知当甲醇作为唯一碳源时，该酵母菌中AOX1基因受到诱导而表达[5′AOX1和3′AOX1（TT）分别是AOX1基因的启动子和终止子]。请分析回答下列问题： (1)为实现HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该选择 切割质粒，并在HBsAg基因两侧的A和B位置接上 ，这样设计的优点是 。 (2)酶切获取HBsAg基因后，需用 将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取 。 (3)步骤3中应选用限制酶 来切割重组质粒以获得重组DNA，然后再将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。 (4)为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入 以便筛选；若要检测转化后的细胞中是否含有HBsAg基因转录产物，可以用 技术进行检测。 【答案】(1) SnaBⅠ、AvrⅡ 相应的限制酶识别序列 确保定向连接（避免质粒和目的基因自身环化及目的基因和质粒反向连接） (2) DNA连接酶 大量重组质粒 (3)BglⅡ (4) 卡拉霉素 PCR 【来源】湖南省益阳市桃江县七中2022-2023学年高二4月期中生物试题 【分析】分析题图：图中质粒含有SnaBⅠ、AvrⅡ、BglⅡ和SacI限制酶切割位点，其中SacI位于启动子上，BglⅡ位于终止子上。要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，只能用限制酶SnaBⅠ和AvrⅡ切割质粒，要获取含有5′AOX1--3′AOX1段基因，应选用限制酶BglⅡ来切割。 【详解】（1）图中质粒含有SnaBⅠ、AvrⅡ、BglⅡ和SacI限制酶切割位点，其中SacI位于启动子上，BglⅡ位于终止子上。如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，只能用限制酶SnaBⅠ和AvrⅡ切割质粒，所以应在HBsAg基因两侧的A和B位置接上SnaBⅠ、AvrⅡ限制酶识别序列。这两种酶切割产生的黏性末端不同，这样可以避免质粒和目的基因自身环化，还可以防止目的基因和质粒反向连接。 （2）获取目的基因后，需要用DNA连接酶将目的基因和载体连接形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取大量重组质粒。 （3）步骤3是要获取含有5′AOX1……3′AOX1段基因，应选用限制酶BglⅡ来切割重组质粒获得重组DNA，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。 （4）5′AOX1……3′AOX1段基因含有卡拉霉素抗性基因，因此在培养基中加入卡拉霉素以便筛选导入重组质粒的目的菌。若要检测转化后的细胞中是否含有HBsAg基因转录产物，可以用分子杂交方法进行检测，先用PCR技术扩增目的基因，再与转录产物mRNA杂交。 24．(22-23高二·湖南邵阳邵东一中·期中)人的血清白蛋白（HSA）在临床上需求量很大，通常从人血中提取。但由于艾滋病病毒（HIV）等人类感染性病原体造成的威胁与日俱增，使人们对血液制品顾虑重重，图一是以基因工程技术获取HSA的两条途径，其中报告基因表达的产物能催化无色物质K呈现蓝色。图二为HSA基因两侧的核苷酸序列。图三为相关限制酶的识别序列和切割位点。据图回答下列问题：        (1)基因工程的核心步骤是 。 (2)采用PCR技术扩增HSA基因，根据图二分析，需选择的一对引物序列是______ A．引物Ⅰ是5′-AATGGATCCTTC-3′，引物Ⅱ是5′-GAGAATTGAATG-3′ B．引物Ⅰ是5′-AATGGATCCTTC-3′；引物Ⅱ是5′-CATTCAATTCTC-3′ C．引物Ⅰ是5′-GAAGGATCCATT-3′，引物Ⅱ是5′-GTAAGTTAAGAG-3′ D．引物Ⅰ是5′-GAAGGATCCATT-3′，引物Ⅱ是5′-GAGAATTGAATG-3′ (3)依据图一、图二和图三分析，切割含HSA基因的DNA片段选用的限制酶是 ；切割质粒应选用的限制酶是 。 (4)图一过程①中需将植物细胞与 混合后共同培养，旨在让 整合到植物细胞染色体DNA上，除尽农杆菌后，还须转接到含 的培养基上筛选出转化的植物细胞。 【答案】(1)基因表达载体的构建 (2)A (3) 酶B和酶C 酶B和A (4) 农杆菌 T-DNA 物质K 【来源】湖南省邵阳市邵东市一中2022-2023学年高二4月期中生物试题 【分析】1、基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与鉴定。 2、用核移植的方法得到的动物是克隆动物。用体外受精技术获得的动物是试管动物。 【详解】（1）基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。 （2）PCR中需要一对特异性的引物，该引物能与目的基因需要碱基互补配对，子链延伸时是从引物的5′向3′端延伸，根据图2中目的基因HSA处于中间位置，所以符合条件的引物Ⅰ是5'-AATGGATCCTTC-3'，引物Ⅱ是5'- GTAAGTTAAGAG-3′。 故选A。 （3）图2目的基因所在DNA中只有酶B和酶C的识别序列，可以用限制酶B和C进行切割，质粒的T-DNA在酶A和酶B之间，所以切割质粒时用酶A和酶B切割。 （4）图一过程①中需将植物细胞与农杆菌混合后共同培养，旨在让T-DNA整合到植物细胞染色体DNA上；除尽农杆菌后，为筛选出转化的植物细胞，利用重组质粒上的报告基因表达产物能催化无色物质K呈蓝色的特性。 25．(22-23高二下·湖南怀化五中·期中)甘蓝型油菜中，抑制PEP基因的表达可提高油菜籽的含油量。通过基因工程将PEP基因反向连接在启动子后，构建转反义PEP基因油菜是提高油菜籽含油量的常用技术路径。请回答下列问题： (1)为将PEP基因反向连接在启动子后，构建反义PEP基因，需要将限制酶酶切位点设计在引物上，PEP基因的上游引物和下游引物中应分别引入 酶切位点。 (2)用激光照射油菜愈伤组织时，可在细胞膜上打出一个穿孔，转反义PEP基因表达载体由此小孔进入油菜细胞，几秒钟后小孔封闭，该过程体现了细胞膜具有 。目的基因表达载体进入细胞后，Ti质粒上的T－DNA区段可转移到油菜细胞的基因组中。 (3)筛选时，需在油菜愈伤组织培养基中加入 进行初步选择。在激光照射下，存活的细胞一般会发出 。为检测反义PEP基因是否整合到染色体上，研究者通常检测细胞中是否存在ntp基因，而不检测PEP基因。不直接检测PEP基因的原因是 。 【答案】(1)ScaⅠ、HamHⅠ (2)流动性 (3) 新霉素 绿色荧光 油菜细胞的基因组中本身有PEP基因 【来源】湖南省怀化市五中2022-2023学年高二下学期期中生物试题 【分析】细胞膜的结构特性是具有一定的流动性，功能特性是选择透过性。 基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取。（2）基因表达载体的构建。（3）将目的基因导入受体细胞。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）为将PEP基因反向连接在启动子后，构建反义PEP基因，根据图中启动子和终止子的位置以及质粒上的限制酶种类分析，若要构成反义PEP基因表达载体，需要将限制酶切位点设计在引物上，PEP 基因的上游引物和下游引物中应分别引入Sca Ⅰ、HamH Ⅰ酶切位点。 （2）在细胞膜上打出一个穿孔，转反义PEP基因表达载体由此小孔进入油菜细胞，几秒种后小孔封闭，该过程依赖细胞膜具有一定的流动性来实现。 （3） 由图可知，Ti质粒上的标记基因是新霉素抗性基因，故筛选时，需在油菜愈伤组织培养基中加入新霉素进行初步选择。在激光照射下，存活的细胞一般会发出绿色荧光，因为目的基因与新霉素抗性基因以及绿色荧光蛋白基因同时进行了转移从而能检测目的基因是否进行了成功导入。由题干可知，油菜细胞的基因组中本身有PEP基因，而没有ntp基因，而ntp基因的存在能说明目的基因成功导入，故为检测反义PEP基因是否整合到染色体上，研究者通常检测细胞中是否存在ntp基因，而不检测PEP基因。 26．(22-23高二下·湖南株洲渌口区三中·期中)新型冠状病毒可通过表面的棘突蛋白（S蛋白）与人呼吸道黏膜上皮细胞的ACE2受体结合，这是当前新冠肺炎的研究热点之一、下图为筛选、制备抗S蛋白单克隆抗体的示意图。请据图回答下列问题： (1)为判断疑似患者是否为新型冠状病毒感染者，采集鼻咽拭子主要用于病原学检查，检测病毒的 。 (2)据图所示，研制抗S蛋白单克隆抗体，需先向小鼠注射 以激活小鼠的免疫细胞，再提取激活的B细胞与骨髓瘤细胞融合，用HAT培养基筛选获得 细胞，之后，还需继续筛选的原因是： 。 (3)单克隆抗体具有的优点有： 、 、 。 (4)制备单克隆抗体涉及到的生物技术有 、 。 【答案】(1)核酸 (2) 棘突蛋白（或S蛋白） 杂交瘤 同一种抗原可能激活多种B细胞，还需继续筛选才能获得分泌所需单克隆抗体的杂交瘤细胞 (3) 特异性强 灵敏度高 可大量制备 (4) 动物细胞融合 动物细胞培养 【来源】湖南省株洲市渌口区三中2022-2023学年高二下学期期中生物试题 【分析】单克隆抗体制备利用的就是动物细胞融合技术，在该过程中需要进行两次筛选，第一次筛选需要用到选择培养基，其目的是筛选获得杂交瘤细胞，第二次筛选需要进行单克隆培养和抗体检测，其目的是获得能产生特异性抗体的杂交瘤细胞。单克隆抗体能准确的识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备。 【详解】（1）临床上为判断疑似患者是否为新型冠状病毒感染者，采集鼻咽拭子主要用于病原学检查，主要是利用PCR技术扩增病毒核酸，来进行检测。 （2）由题干可知，新型冠状病毒可通过表面的棘突蛋白（S蛋白）与人呼吸道黏膜上皮细胞的ACE2受体结合，因此S蛋白作为抗原注射进入小鼠体内，可以引起其产生特异性免疫，产生激活的B细胞，再与骨髓瘤细胞进行细胞融合，得到的细胞混合液需要用选择培养基即HAT培养基进行筛选，得到杂交瘤细胞。由于同一种抗原可能激活多种B细胞，这些不同种类的B细胞与骨髓瘤细胞融合后能形成多种杂交瘤细胞，因此还要进行第二次筛选以获得能产生特异性抗体的杂交瘤细胞。 （3）与传统血清抗体相比，单克隆抗体能准确的识别抗原的细微差异，因此特异性较强，同时灵敏度较高，也便于大量制备。 （4）制备单克隆抗体需要首先利用动物细胞融合技术获得杂交瘤细胞，再利用动物细胞培养技术对杂交瘤细胞进行大量培养，以获得较多单克隆抗体。 27．(22-23高二下·湖南长沙雅礼中学·期中)人乳头瘤病毒HPV是双链DNA病毒，可以引起人皮肤黏膜上皮增生。HPV病毒的DNA分子与健康细胞的细胞核结合，利用细胞产生出两种蛋白E6、E7，它们会附着在抑癌基因p53和pRb上，并关闭它们的功能。默沙东九价HPV疫苗是利用酿酒酵母菌进行生产。 (1)相较于其他模式生物而言，酵母菌具有 等特点，能更快获得工程目标。 (2)下图为重组质粒构建的过程，其中AvrⅡ的酶切序列与位点是C↓CTAGG；SnaBI的酶切序列与位点是TAC↓GTA；SacI 的酶切序列与位点是GAGCT↓C；BglII 的酶切序列与位点是 A↓GATCT。在对HPV的DNA进行PCR扩增时，需要设计两种引物以保证目的基因和质粒有相同的限制酶识别序列，根据选择的质粒及各限制酶识别序列，引物中需要有序列 。将得到的重组质粒置于含有Ca2+的酿酒酵母培养液中，酵母菌吸收后，接种到 培养基上进行初步筛选，得到含有该质粒的酵母菌，挑取菌落转移到96孔板上培养，利用 技术鉴定筛选确实表达了HPV的E6、E7蛋白质的酿酒酵母，再进行扩大培养。 (3)在宫颈癌筛查中有HPV检查，取病宫颈组织和局部粘液、分泌物进行HPV-DNA检测。病毒DNA的检测一般采取Real-time PCR技术即实时荧光测序（如下图所示），需要的物质有 、4种脱氧核苷酸、患者的组织或分泌物、水、缓冲液、两种引物 。探针序列含有HPV的特定序列，随着PCR循环次数的增加，很快就检测到了荧光，说明该患者 （有\没有）HPV病毒。 【答案】(1)繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 (2) CTAGG-和-TAC（或-GGATC和-ATG） 含有氨苄青霉素 抗原-抗体杂交 (3) 耐高温的DNA聚合酶 有 【来源】湖南省长沙市雅礼中学2022-2023学年高二下学期期中生物试题 【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）酵母菌属于单细胞生物，具有繁殖快、传物质相对较少等特点，可更快获得工程目标，故常用酵母菌做受体细胞。 （2）分析题意可知 ，在对HPV的DNA进行PCR扩增时，需要设计两种引物以保证目的基因和质粒有相同的限制酶识别序列，据图可知，SacI 和BglII 会破坏启动子，而SnaBI和AvrⅡ位于启动子和终止子之间，故可选择这两种酶进行切割，故引物中需要有-CTAGG-和-TAC（或-GGATC和-ATG）的识别序列；据图可知，质粒中含有氨苄青霉素抗性基因，故可在含有氨苄青霉素的培养基上进行初步筛选；抗原与抗体的结合具有特异性，且E6、E7属于蛋白质，故可利用抗原-抗体杂交技术鉴定筛选确实表达了HPV的E6、E7蛋白质的酿酒酵母。 （3）PCR是一项体外扩增DNA的技术，该过程主要通过控制温度实现，由于温度可高达90℃以上，故该反应体系中需要有耐高温的DNA聚合酶、4种脱氧核苷酸、患者的组织或分泌物、水、缓冲液、两种引物；分析题意，探针序列含有HPV的特定序列，若随着PCR循环次数的增加，很快就检测到了荧光，说明该患者含有相应的能与HPV互补配对的碱基序列，即有HPV病毒。 28．(22-23高二下·湖湘教育三新探索协作体·期中)下图是获得转基因动物和植物的流程图，请据图回答： (1)培育转基因动物和植物的核心工作是 。 (2)图示获得大量目的基因的方法是 ，若模板双链DNA的数量为n个，经过32次循环需要消耗的引物数量是 。 (3)图中过程③使用的激素是 。过程⑥常用的方法是 。 (4)研究人员按照上图所示将白羊草的抗旱基因转入莴苣细胞中，培育出转基因莴苣，欲进一步确定白羊草的抗旱基因与转基因莴苣的抗旱性是否有关，请写出简要的实验设计思路。 。 【答案】(1)基因表达载体的构建 (2) PCR（扩增技术） 2n（232-1） (3) 促性腺激素 农杆菌转化法 (4)将转基因莴苣与非转基因莴苣（野生型莴苣）分别置于干旱环境中培养，一段时间后观察比较两组莴苣的生长状况 【来源】湖湘教育三新探索协作体2022-2023学年高二下学期期中生物试题 【分析】获得大量目的基因的方法是PCR技术，可以大量扩增目的基因；基因工程的核心是基因表达载体的构建；将目的基因导入受体动物细胞最常用的方法是显微注射法，用促性腺激素处理良种奶牛，促其排卵用于体外受精；而对于受体奶牛则需要用激素对其进行同期发情处理；构建重组Ti质粒的过程⑤属于基因工程，则用到的工具酶为限制酶和DNA连接酶。过程⑥导入到莴苣的体细胞方法是农杆菌转化法，发育成完整的转基因莴苣，则需要通过植物组织培养技术才能获得转基因莴苣，该技术的原理是植物细胞的全能性。 【详解】（1）基因工程的核心工作是基因表达载体的构建。 （2）图示94℃变性、55℃复性、72℃延伸，获得大量目的基因的方法是PCR（扩增技术）。每合成一条新的子链消耗一个引物，一个DNA分子经过32次循环新合成的子链条数是2（232-1），所以n个DNA分子经过32次循环需要消耗的引物数量是2n（232-1）。 （3）图中过程③超数排卵使用的激素是促性腺激素，过程将重组Ti质粒导入莴苣体细胞常用的方法是农杆菌转化法。 （4）要进一步确定白羊草的抗旱基因与转基因莴苣的抗旱性是否有关，需要在个体水平进行抗性实验，实验思路为：将转基因莴苣与非转基因莴苣（野生型莴苣）分别置于干旱环境中培养，一段时间后观察比较两组莴苣的生长状况。 29．(22-23高二下·湖南多校联考·期中)某种病毒可通过其S蛋白和RBD蛋白与人体细胞表面的受体结合而进入细胞，是宿主抗体的重要作用位点。下图是科研人员利用该病毒S蛋白基因和RBD蛋白基因，研制该病毒双抗原疫苗的技术路线。 (1)PCR扩增时，需在 催化下，在两种引物的 端进行DNA链的延伸，获得扩增产物。 (2)为使S-RBD基因能与pX质粒相连接，并在工程菌中表达时先合成S蛋白，则PCR过程中，应在引物1的5′端添加的限制酶序列是 。 (3)将重组pX质粒导入工程菌前，需用钙离子处理工程菌，使其处于一种 的生理状态，便于重组质粒的导入。 (4)在工程菌的筛选时，可先后用两种抗生素进行影印培养实验（即先将工程菌接种到培养基A上，待长出菌落后使用无菌的绒毡布压在培养基A的菌落上，带出少许菌种，平移并压在培养基B上），则培养基A上应添加的抗生素为 （填“青霉素”或“四环素”）。若培养基B中有存活的菌落，则这些菌落的细胞内 （填“含”或“不含”）S-RBD基因。鉴定pX质粒和重组pX质粒是否导入工程菌还可以采用的方法是 。 【答案】(1) 耐高温DNA聚合酶（Taq酶） 3’ (2)5’AAGCTT3’ (3)能吸收周围环境中DNA分子 (4) 青霉素 不含 观察菌落是否具有荧光 【来源】湖南省多校联考2022-2023学年高二下学期期中生物试题 【分析】基因工程的步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。 【详解】（1）PCR是体外扩增DNA的技术，PCR扩增时，需在耐高温的DNA聚合酶（即Taq聚合酶）的催化下，又由于子链合成的方向是从5'端到3'端，故在引物的3’端进行DNA链的延伸。 （2）工程菌中表达时先合成S蛋白，则S基因需处于靠近启动子位置，而启动子后为HindⅢ的识别位点，故S基因位置的引物1需接上HindⅢ的识别序列。则PCR过程中，应在引物1的5′端添加的限制酶序列是5’AAGCTT3’。 （3）将重组质粒导入微生物时，需用钙离子处理微生物，使其处于一种能从周围环境中吸收DNA分子的生理状态，即感受态。 （4）在工程菌的筛选时，由于重组质粒中存在抗青霉素基因且抗四环素基因被目的基因破坏，故在影印培养实验中，应先接种到青霉素培养基中，故培养基A上应添加青霉素，若长出菌落，则说明质粒成功导入。再用无菌的绒毡布压在培养基A的菌落上，带出少许菌种，平移并压在含四环素的培养基B上，若有菌落出现，则说明抗四环素基因存在，目的基因没有成功导入，则这些菌落的细胞内不含S-RBD基因；鉴定pX质粒是否导入工程菌还可以采用的方法是观察菌落是否具有荧光，有荧光的则含有pX质粒或重组pX质粒。 30．(21-22高二下·湖南长沙明德中学·期中)在培育转基因植物的研究中。卡那霉素抗性基因（kan）常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。下图为获得抗虫棉的技术流程。请据图回答： (1)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能 ；质粒DNA分子上有 ，便于外源DNA插入；载体上还必须含有 ，其位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位。 (2)A过程需要的酶有限制性内切核酸酶和DNA连接酶，有4种限制性内切核酸酶的切割位点如下图所示。 上图中 酶切割后的DNA片段可以用E。coli  DNA连接酶连接；DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 。 (3)D过程检测植株是否产生抗虫蛋白，所用的方法是 。 (4)转基因植物所携带的目的基因可能传递给非转基因植物，造成基因污染。如果将目的基因导入叶绿体DNA中，就可以有效避免基因污染，原因是 。 【答案】(1) 自我复制 一个至多个限制酶切割位点 启动子 (2) EcoRI、PstI 磷酸二酯键 (3)抗原-抗体杂交 (4)叶绿体基因不会通过花粉传给下一代 【来源】湖南长沙市明德中学2021-2022学年高二下学期期中生物试题 【分析】限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端和平末端两种。 基因表达载体的组成包括：目的基因、启动子、终止子、标记基因和复制原点。 (1) 质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能自我复制、稳定存在；质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点，经过限制酶切后形成黏性末端，便于外源DNA插入；RNA聚合酶识别和结合的部位称为启动子。 (2) E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶都能连接黏性末端，另外T4DNA连接酶还可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低。据图可知，EcoRⅠ和PstⅠ切割DNA后产生的是黏性末端，SmaⅠ和EcoRⅤ切割DNA后产生的是平末端。因此图中EcoRⅠ、PstⅠ酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。DNA连接酶可以催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成磷酸二酯键，从而将其连接。 (3) 检测目的基因是否表达产生蛋白质，用的方法是抗原-抗体杂交。 (4) 由于精子中几乎不携带细胞质，所以将目的基因导入叶绿体DNA中，叶绿体基因不会通过花粉传给下一代，可以有效避免基因污染。 31．(21-22高二下·湖南长沙长郡中学·期中)科研人员将酵母菌的DAK基因导入天竺葵的叶绿体中，获得了同化甲醛能力较强的天竺葵。为测定转基因天竺葵同化甲醛的能力，科研人员进行了实验，获得如图所示的结果。回答下列问题： (1)将DAK基因和载体选用双酶法进行切割而不是选用一种限制酶进行切割，原因是 （答2点）。限制酶具有专一性，从限制酶的作用特点分析，具体体现是 （答１点）。 (2)常使用PCR特异性地快速扩增目的基因，原理是 。PCR反应需要在一定缓冲溶液中进行，需要加入DNA聚合酶，其作用是 。用设计的引物和合适的条件进行PCR，其产物用电泳鉴定，结果发现有目的基因以外的杂带存在，分析可能原因是： 。 (3)将DAK基因导入天竺葵的叶绿体中，可以避免花粉扩散引起的基因污染，原因是 。 (4)据曲线图分析可知，实验结论是 。欲获得上述曲线中的实验数据，如何进行实验，大体实验思路是 。 【答案】(1) 防止目的基因自身环化和目的基因与载体反向连接 能识别特定的核苷酸序列、在特定的位点切割DNA分子 (2) DNA半保留复制 催化合成DNA子链 在基因组DNA中有其他引物结合的位点/引物特异性不强/引物过短 (3)花粉中通常不含有叶绿体 (4) 转基因天竺葵较非转基因天竺葵同化甲醛能力强 将生长状况一致的转基因天竺葵和非转基因天竺葵分别在同种含有等量甲醛的容器中进行培养，并与不种植培养植物的含等量甲醛的空容器做对比，相同一段时间后，测定容器内甲醛浓度 【来源】湖南省长沙市长郡中学2021-2022学年高二下学期期中生物试题 【分析】1、“分子手术刀”--限制性核酸内切酶(限制酶)（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 2、PCR基本原理：PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 (1) 与单酶法相比，构建基因表达载体时使用双酶法可避免目的基因自身环化和避免目的基因和载体反向连接。限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。 (2) PCR反应依据的原理是DNA半保留复制。在PCR扩增目的基因时，要加入耐高温的DNA聚合酶，其作用是催化合成DNA子链。若在基因组DNA中有其他引物结合的位点/引物特异性不强/引物过短，则会导致电泳结果出现杂带。 (3) 目的基因导入叶绿体基因中是因为花粉中通常不含有叶绿体，可以避免花粉扩散引起的基因污染。 (4) 据图分析可知，随着时间的延长，放置天竺葵的容器内甲醛浓度均下降，放置转基因天竺葵的容器内甲醛浓度下降得更明显，表明转基因天竺葵吸收甲醛的能力比非转基因天竺葵的更强。欲获得如图曲线中的实验结果，将生长状况一致的转基因天竺葵和非转基因天竺葵分别在同种含有等量甲醛的容器中进行培养，并与不种植培养植物的含等量甲醛的空容器做对比，相同一段时间后，测定容器内甲醛浓度。 【点睛】本题考查基因工程和PCR技术的有关知识，意在考查考生能从题图中获取相关的生物学信息，并能运用这些信息，结合所学知识解决相关的生物学问题的能力，具有对一些生物学问题进行初步探究的能力。 32．(21-22高二下·湖南长沙南雅中学·期中)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，沿海滩涂盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐碱基因培育出了耐盐碱水稻新品系。请据图回答下列问题： 限制酶 Alu I EcoR I Pat I Sma I 切割位点 AG↓CT TC↑GA G↓AATTC CTTAA↑G CTGCA↓G G↑ACGTC CCC↓GGG GGG↑CCC 表2 几种限制酶识别序列及切割位点表 (1)限制酶主要是从 生物中获得，其特点是能够识别DNA分子某种 ，并在特定位点切割。 (2)获取真核生物的基因通常采用人工合成法，通过图示中①方法合成的耐盐碱基因中是不含 的，如果要将耐盐碱基因和质粒重组，应该在基因两侧的A和B位置除了接上以上两个结构外还需分别加入 限制酶识别序列，这样设计的优点是避免质粒和目的基因自身环化以及定向连接。 (3)过程②采用PCR技术扩增目的基因时，在PCR反应体系的主要成分中应该包含：扩增缓冲液（含Mg2﹢）、水，4种脱氧核糖苷酸、模板DNA、TaqDNA聚合酶和引物Ⅰ和引物Ⅱ，若在该反应体系中，目的基因扩增了4代，则共用了引物Ⅰ 个。 (4)PCR反应中温度呈现周期性变化，其中加热到90～95℃的目的是 ，然后冷却到55-60℃使引物与互补DNA链结合，继续加热到70～75℃，目的是 。 (5)在步骤⑤⑥过程中都需用 处理两类细菌。为了确认目的基因通过⑦过程导入植物细胞中后是否成功表达目的蛋白质，通常从分子水平进行检测的方法是用 法。 (6)假设该抗盐碱基因D，通过基因工程导入水稻后连接到水稻的一条染色体上，则该水稻进行减数分裂的细胞在联会时有 个D基因。 【答案】(1) #原核生物/微生物# 特定的核苷酸序列 (2) 启动子和终止子 EcoRⅠ和SmaI (3)15 (4) #解链/变性/解旋/受热变性后解链为单链# #在DNA聚合酶作用下进行延伸/Taq酶从引物起始进行互补链的合成# (5) Ca2+ 抗原—抗体结合 (6)2 【来源】湖南省长沙市南雅中学2021-2022学年高二下学期期中生物试题 【分析】分析题图：图示表示应用耐盐碱基因培育出了耐盐碱水稻新品系的过程，其中①表示以mRNA为模板逆转录形成DNA；②表示采用PCR技术扩增目的基因；③表示用限制酶切割运载体；④表示基因表达载体的构建过程；⑤表示将目的基因导入大肠杆菌，使其大量繁殖；⑥⑦表示采用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞。 （1） 限制酶主要是从原核生物（或微生物）中获得，其特点是能够识别DNA分子某种特定的核苷酸序列，并在特定位点切割DNA。 （2） ①表示采用逆转录法人工合成目的基因（耐盐碱基因），而人工合成的目的基因不含启动子和终止子； 切割运载体时采用的是限制酶EcoRⅠ、SmaⅠ，为了便于目的基因与运载体定向连接形成重组DNA，还应在基因两侧的A和B位置接上限制酶EcoRⅠ、SmaⅠ的识别序列。 （3） 目的基因扩增4代后共得到16个DNA分子，除了含有模板DNA链的1个DNA分子外，其余的DNA分子都含有引物I，因此共用了引物Ⅰ 15个。 （4） PCR反应中温度呈现周期性变化，其中加热到90～95℃的目的是双链DNA解聚为单链，然后冷却到55-60℃使引物与互补DNA链结合，继续加热到70～75℃，目的是在DNA聚合酶作用下进行延伸。 （5） 将目的导入微生物细胞时，需要用Ca2+处理微生物细胞，使其成为易于吸收周围环境中DNA的感受态。因此步骤⑤⑥过程中都需用Ca2+处理两类细菌。从分子水平检测目的基因是否表达，采用抗原-抗体杂交法。 （6） 假设该抗盐碱基因D，通过基因工程导入水稻后连接到水稻的一条染色体上，则该水稻的基因型可表示为Dd，在减数第一次分裂间期细胞中进行了DNA复制，因此联会时细胞中有2个D基因。 【点睛】本题结合耐盐碱水稻新品系的培育过程图解，考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理及操作步骤，能准确判断图中各过程的含义，再结合图中信息准确答题。 33．(21-22高二下·湖南湖湘教育三新探索协作体·期中)β1，3葡聚糖酶可以水解许多病原真菌细胞壁外层的β-1，3葡聚糖和几丁质，降解真菌细胞壁，从而抑制真菌的生长与繁殖。研究人员在植物中克隆到β-1，3葡聚糖酶基因（BG2）并转入苹果主栽品种，以减少苹果真菌病害、实现无公害生产。据图和所学知识回答下列问题： (1)BG2的克隆可利用PCR技术，需要一小段能与该基因碱基序列互补配对的 作为引物，BG2的克隆前，需准备 种引物。两种引物序列不能互补的最可能原因是 。 (2)上图为利用PATC940（经农杆菌Ti质粒改造获得）构建BG2抗病质粒的过程。图中右下处的酶为DNA连接酶，人工设计的复合启动子的作用是驱动转录和提高（增强）转录活性，它位于目的基因（BG2）的 （填“上游”或“下游”）。用XbaI酶切、SpeI酶切、NotI酶切目的基因与PATC940的优点是构建基因表达载体时，可以防止 、 以及防止目的基因与质粒反向连接。 (3)中国科学家独创的一种方法，将Bt基因导入棉花细胞，这种方法是 ，例如，可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入 中。研究人员将转入BG2抗病质粒的农杆菌与苹果外植体共培养，进行遗传转化。目的基因BG2将随着T-DNA转移到被侵染的细胞而进入细胞，并随其整合到该细胞的染色体DNA上。 (4)在完成遗传转化后，培养基中至少要加入两种抗生素，请推测其作用分别是：一种用于杀死农杆菌，另一种用于 。这样的培养基在微生物学上称为 。 (5)需要不断观察和检测转基因苹果植株在田间的生长状态，以确定目的基因是否赋予了苹果植株抗真菌特性以及 ，这属于 水平的鉴定。 【答案】(1) 短单链核酸 2 PCR技术过程中，复性时，引物之间可配对形成双链，母链缺少引物结合就不能得到目的基因产物 (2) 上游 Ti质粒自身环化 目的基因自身环化 (3) 花粉管通道法 子房 (4) 成功转化质粒细胞（组织）的筛选（或检测目的基因是否导入受体细胞） 选择培养基 (5) 抗性的程度 个体 【来源】湖南省湖湘教育三新探索协作体2021-2022学年高二下学期期中联考生物试题 【分析】PCR技术扩增目的基因： （1）原理：DNA双链复制 （2）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步冷却到55~60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70~75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。 【详解】（1）β–1，3葡聚糖酶基因（BG2）在体外大量克隆，可利用PCR技术，PCR技术扩增目的基因时，需要一小段能与该基因（BG2）碱基序列互补配对的短单链核酸作为引物，BG2的克隆前，需准备2种引物。PCR技术过程中，如果两种引物序列互补，复性时，引物可与引物结合，母链没有引物结合就不能得到子链，得不到目的基因产物。 （2）人工设计的复合启动子的作用是驱动转录和提高（增强）转录活性，它位于目的基因（BG2）上游，启动子是RNA聚合酶识别与结合结构，有它才能驱动基因转录出mRNA，用XbaI酶切、SpeI酶切、NotI酶切目的基因与PATC940的优点是构建基因表达载体时，可以一定程度上防止Ti质粒自身环化与目的基因自身环化。 （3）花粉管通道法可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中，故将Bt基因导入棉花细胞的方法是花粉管通道法。 （4）在完成遗传转化后，需要杀死农杆菌以及检测含有目的基因的质粒是否成功转入到受体细胞，因此选择培养基中至少要加入两种抗生素，一种用于杀死农杆菌，另一种用于成功转化质粒细胞（组织）的筛选（或检测目的基因是否导入受体细胞），起到选择作用。 （5）转基因苹果植株能产生β–1，3葡聚糖酶，能抑制真菌的生长与繁殖，需要不断观察和检测转基因苹果植株在田间的生长状态，以确定目的基因是否赋予了苹果植株抗真菌特性以及抗性的程度。苹果植株属于个体层次。 【点睛】本题考查PCR技术、基因工程的相关知识，要求考生识记PCR技术的原理和过程、基因工程的操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节问题，能结合所学的知识准确答题。 34．(21-22高二下·湖南三湘名校教育联盟.·期中)生物柴油作为新型能源已经成为世界上应用最广泛、发展迅猛的可再生能源之一、研究人员利用基因工程的方法，将油料作物紫苏的产油基因DGAT1与含有氨苄青霉素抗性基因的PMD克隆质粒构建PMD一DGAT1重组质粒，然后导入大肠杆菌扩大培养；再提取出扩增的pMD-DGAT1克隆质粒，与pBI121空载体同时用Xbal，BamHI两种酶酶切，构建pB121一DGAT1表达载体：最后将表达载体导入四尾栅藻获得产油微藻，利用地热废水培养产油微藻不仅能生产生物柴油，还能治理地热废水。回答下列问题： (1)提取紫苏组织细胞RNA经过 得到cDNA，再利用PCR技术扩增得到DGATI基因。在PCR扩增之前，对DGAT1基因进行一次预变性的目的是 。 (2)在配制培养大肠杆菌的培养基时，要在培养基灭菌并冷却到30℃左右后，加入用无菌水配制的适宜浓度的氨苄青霉素溶液，氨苄青霉素不能与培养基一同灭菌的原因可能是 。 (3)基因工程技术中的转化是指 。将DGAT1基因插入到pBI121空载体的启动子与终止子之间的目的是 。若用DGAT1基因探针检测产油微藻，能检测到细胞中的 。判断产油微藻细胞中DGAT1基因是否成功表达，需要加入 排行检测。 (4)为检测产油微藻对地热废水的去污能力，研究人员设计实验并得到相应实验结果如下表： 指标 总氮（mg/L） 总磷（mg/L） 氟化物（mg/L） 废水培养基 23．2 4．32 4．56 培养转基因产油微藻11天后 1．9 0．45 0．84 该实验不能说明产油微藻显著提高了去污能力。请进一步完善实验设计 。 【答案】(1) 逆转录 提高DGAT1基因的变性概率 (2)高温会破坏氨苄青霉素的结构而导致失效 (3) 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程 保证DGAT1基因能在产油微藻细胞中表达 DGAT1基因及其转录出的mRNA DGAT1抗体 (4)添加用地热废水培养四尾栅藻的对照组，11天后检测总氮、总磷和氟化物的含量 【来源】湖南省三湘名校教育联盟.2021-2022学年高二下学期期中期中生物试题 【分析】基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因，DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA，分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质，抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。 (1) 以RNA为模板产生cDNA的过程是逆转录；在PCR扩增之前，需要对DGAT1基因进行一次预变性的目的是破坏其中可能存在的较难破坏的二级结构，提高DGAT1基因的变性概率。 (2) 氨苄青霉素不耐高温，高压灭菌会破坏氨苄青霉素的结构而导致失效。 (3) 基因工程技术中的转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定并表达的过程。基因的表达需要启动子和终止子，启动子与RNA聚合酶结合驱动转录发生，终止子：DNA分子上(基因末端)的转录停止信号序列，具有使RNA聚合酶停止合成R和释放RNA链的作用。所以将DGAT1基因插入到pBI121空载体的启动子与终止子之间的目的是保证DGAT1基因能在产油微藻细胞中表达。 DGAT1基因探针能与DGAT1基因及其转录出的mRNA形成杂交带，所以可以检测到DGAT1基因及其转录出的mRNA；检测目的基因是否翻译成蛋白质，用抗原-抗体杂交技术，需要加入DGAT1抗体检测。 (4) 实验缺少对照组，不能让确定是不是受体四尾栅藻本身有去污能力，所以需要增加一组实验，即添加用地热废水培养四尾栅藻的对照组，11天后检测总氮、总磷和氟化物的含量，如果11天后检测总氮、总磷和氟化物的含量比培养转基因产油微藻11天后数据高，说明培养转基因产油微藻有去污能力。 【点睛】本题主要考查基因工程与PCR技术的相关知识，意在考查考生的识记能力和理解所学知识要点，把握知识间内在联系，形成知识网络结构的能力；能运用所学知识，准确理解问题的能力。 1 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 学科网（北京）股份有限公司 $$