第三章 第一节 第4课时 将目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定-【优化探究】2025-2026学年新教材高中生物学选择性必修3同步导学案配套PPT课件（苏教版）

基因工程 第三章　 第一节　基因工程及其技术 第4课时　将目的基因导入受体细胞和目的基因 及其表达产物的检测鉴定 [目标导学]　1.阐明将目的基因导入受体细胞的方法。2.阐明目的基因及其表达产物的检测鉴定的方法。 内容索引 NEIRONGSUOYIN 学习任务二　目的基因及其表达产物的检测鉴定 学习任务一　将目的基因导入受体细胞 课时作业 素养达标 备选题库 教师独具 将目的基因导入受体细胞 学习任务一 梳理 归纳教材知识 1.将目的基因导入植物细胞 (1)主要方法: 。 (2)农杆菌 ①感染对象:能在自然条件下感染 植物或裸子植物,但不会感染大多数单子叶植物。 ②感染原因:当双子叶植物或裸子植物受到损伤时,伤口处的细胞会分泌大量的 化合物,吸引农杆菌向伤口处移动。 ③特点:农杆菌含有Ti质粒,上面有一段 (T⁃DNA),能进入受体细胞,并整合到受体细胞 的DNA上。 农杆菌转化法 双子叶 酚类 转移DNA 染色体 (3)农杆菌转化法原理:将目的基因插到农杆菌Ti质粒的 特定区段上,再通过T⁃DNA将其插入植物细胞染色体的DNA上,使目的基因得到稳定的遗传和表达。 T⁃DNA 2.将目的基因导入哺乳动物细胞 (1)方法 ①主要方法: 。 ②其他方法:用病毒DNA与目的基因构建载体,再去感染受体动物细胞,使目的基因导入动物细胞内。 显微注射法 (2)转基因动物的制备过程 使母畜在预先确定的时间排卵并受精 ↓ 收集__________ ↓ 在显微镜下用口径为1 μm的玻璃微管向受精卵注射含500~600个拷贝的目的基因的载体 ↓ 把这些受精卵移植到处于 的母畜子宫内 ↓ 转基因动物 受精卵 相同发情周期 3.将目的基因导入微生物细胞 (1)感受态细胞:经过适当处理(如用 处理)后,细胞质膜对DNA的 会发生改变,细胞变得容易接受外来的DNA,处于这种状态的细胞称为感受态细胞。 (2)过程:一定浓度的CaCl2溶液处理细胞 细胞→感受态细胞和重组的 混合 转化后的细胞 带有目的基因的微生物。 Ca2+ 通透性 感受态 基因表达载体 [正误辨析] (1)农杆菌Ti质粒上的T⁃DNA可转移到植物细胞内,并且与其染色体DNA整合在一起。( ) (2)培育转基因动物时,常选择受精卵作为受体细胞,利用显微注射法将目的基因直接注入受精卵中。 ( ) (3)将目的基因导入原核细胞时,通常用大肠杆菌作为受体细胞,并需要用Ca2+处理大肠杆菌,使其处于一种能接受外来DNA分子的状态。( ) √ √ √ 探究 要点合作突破 如图表示利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程,据图回答下列问题。 (1)重组Ti质粒的构建需要哪些酶的作用? 提示:限制酶、DNA连接酶。 (2)在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中,一定要将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上的原因是什么? 提示:农杆菌中的Ti质粒上的T⁃DNA(转移DNA)可转移至被感染的细胞,并且整合到该细胞的染色体DNA上。 (3)构建的基因表达载体是直接导入植物细胞吗?说明理由。 提示:不是。构建的基因表达载体是先转入农杆菌,然后农杆菌再去感染植物细胞。 (4)在制备转基因动物的过程中常用受精卵作为受体细胞的原因是什么? 提示:因为受精卵具有全能性。 (5)若制备转基因动物过程中用体细胞作受体细胞,如何得到转基因个体? 提示:可利用核移植技术。 [核心知识] 1.农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析 (1)两次拼接:第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上;第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。 (2)两次导入:第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌;第二次导入(非人工操作)是将含目的基因的T-DNA导入受体细胞。 2.将目的基因导入不同细胞的方法 种类 项目 　 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 农杆菌转化法 显微注射法 Ca2+处理法 受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞 转化过程 将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上→导入农杆菌→侵染植物细胞→整合到受体细胞染色体的DNA上→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取受精卵→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2+处理细胞→感受态细胞→基因表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子 3.大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞,但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞,而酵母菌为真核细胞(具有多种细胞器),所以酵母菌在用于生产需要加工和分泌的蛋白质时比大肠杆菌更有优势。 强化 题点对应训练 1.土壤农杆菌含有一个大型的Ti质粒,在侵染植物细胞的过程中,其中的T⁃DNA片段转入植物的基因组。若想用基因工程手段获取抗旱植株,以下说法错误的是(　　) A.若用Ti质粒作为抗旱基因的载体,目的基因的插入位置应该在T⁃DNA片段内 B.将重组Ti质粒导入土壤农杆菌前,可以用钙离子处理农杆菌 C.用含有重组Ti质粒的土壤农杆菌感染植物细胞,可培养出有抗旱基因的植株 D.在自然条件下,土壤农杆菌可感染大多数单子叶植物 D 解析:土壤农杆菌含有一个大型的Ti质粒,在侵染植物细胞的过程中,其中的T⁃DNA片段转入植物的基因组,所以若用Ti质粒作为抗旱基因的载体时,目的基因的插入位置应该在T⁃DNA片段内,A正确;将目的基因导入细菌时,需要用Ca2+处理细菌,使其处于易于吸收周围环境中DNA分子的状态,B正确;用含有重组Ti质粒的土壤农杆菌去感染植物细胞,使其具有抗旱基因,然后再通过植物组织培养技术将受体细胞培养成具有抗旱基因的植物,C正确;在自然条件下,土壤农杆菌可感染双子叶植物或裸子植物,不会感染大多数单子叶植物,D错误。 2.通常禽流感病毒只能侵染鸟类,人流感病毒只能侵染哺乳类。现用高致病性禽流感病毒和低致病性人流感病毒(哺乳类感染病毒后基本无症状)的核酸完成如图所示实验,下列说法错误的是 (　　) A.步骤①说明流感病毒的遗传物质是 DNA片段 B.步骤②需要限制酶和DNA连接酶处 理cDNA和质粒 C.通过③和④产生的活病毒可能是不同病毒间核酸重组的结果 D.步骤⑤说明牛的呼吸道上皮细胞可作为活病毒的宿主细胞 A 解析:cDNA是以RNA为模板逆转录形成的,说明流感病毒的基因是有遗传效应的RNA片段,A错误;步骤②为构建基因表达载体,需要用同种限制酶和DNA连接酶处理cDNA和质粒,B正确;禽流感病毒只能侵染鸟类,人流感病毒只能侵染哺乳类,且哺乳类感染病毒后基本无症状,而通过③和④产生的活病毒可导致牛(哺乳动物)患流感,这可能是不同病毒间核酸重组的结果,C正确;步骤⑤的结果是牛患流感,这说明牛的呼吸道上皮细胞可作为活病毒的宿主,D正确。 目的基因及其表达产物的检测鉴定 学习任务二 梳理 归纳教材知识 1.检测与鉴定的原因:基因导入受体细胞后,能否有效地表达目的基因并产生相应的性状,需要进一步做筛选和鉴定。 2.分子水平的检测 (1)从DNA方面进行检测 ①检测方法:DNA分子杂交法。 ②检测原理:具有一定 的两条DNA单链,在一定条件下(适宜的温度等)可以按照 原则形成双链。 同源性 碱基互补配对 ③基因探针:用放射性同位素或 标记的已知DNA片段。 ④检测过程 荧光 ⑤结果分析:若待测DNA中有能与基因探针 的特异性DNA片段,用于示踪的放射性同位素标记或荧光标记会指示出其所在的位置,表明目的基因已经插入转基因生物的DNA分子中。 (2)从RNA方面进行检测 ①检测目的:检测目的基因是否能发挥其 ,即是否 出相应的mRNA分子。 ②检测方法: 。 互补 功能 转录 分子杂交技术 ③检测原理:由目的基因转录形成的 ,在一定条件下可以按照碱基互补配对原则与目的基因的 片段形成双链。 ④检测过程:从待测转基因生物细胞中提取mRNA分子,用已标记的 片段作为探针与mRNA杂交。 ⑤结果分析:如果有 出现,表明目的基因转录出相应的mRNA分子。 mRNA DNA单链 目的基因 杂交带 (3)从蛋白质方面进行检测 ①检测目的:检测目的基因是否 出相应的蛋白质分子。 ②检测方法:抗原—抗体杂交法。 ③检测原理:抗原—抗体结合具有特异性。 ④检测过程:从待测转基因生物中提取蛋白质,再用相应的抗体进行 杂交。 ⑤结果分析:如果有 出现,说明目的基因已经表达出相应的蛋白质。 翻译 抗原—抗体 杂交带 3.个体水平的检测 (1)检测目的:对生物的某些 进行鉴定。 (2)实例:对于导入某种鱼的抗冻蛋白基因的转基因番茄进行个体检测,需要栽培转基因番茄获得果实后,再与 比较,确定其是否具有了抗冻性状。 特定性状 天然产品 [正误辨析] (1)抗原—抗体杂交遵循碱基互补配对原则。 ( ) (2)基因探针是用放射性同位素或荧光标记的已知DNA片段。 ( ) (3)检测目的基因是否成功表达，可以用DNA分子杂交法。 ( ) (4)基因工程是否成功需进行个体生物学水平的鉴定。 ( ) × × √ √ 根据图示回答相关问题。 探究 要点合作突破 (1)根据图示过程分析,检测结果能说明什么? 提示:杂交带的出现说明目的基因已插入受体细胞的DNA分子上。 (2)分析①过程如何操作? 提示:使用相关限制酶。 (3)②过程是用什么方法? 提示:琼脂糖凝胶电泳法。 (4)③④过程是如何达到目的的? 提示:通过调控温度来控制DNA的解旋和结合。 [核心知识] 1.目的基因的检测鉴定的方法汇总 2.常见转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法 转基因生物 检测方法 观察目标 抗虫植物 饲喂害虫 害虫死亡 抗病毒(菌)植物 病毒(菌)感染 未感染上病斑 抗盐植物 盐水浇灌 正常生长 抗除草剂植物 喷洒除草剂 正常生长 1.如图为培育转基因抗植物病毒番茄的过程示意图。下列叙述正确的是 (　　) A.过程A需要的启动子位于基因的 下游,有了它才能驱动基因转录出 mRNA B.过程B需要用Ca2+处理,以提高番茄细胞壁的通透性 C.抗植物病毒基因一旦整合到番茄细胞的染色体上,就能正常表达 D.转基因抗植物病毒番茄是否培育成功可以通过病毒接种实验进行鉴定 强化 题点对应训练 D 解析:启动子应位于基因的上游,有了它才能驱动基因转录出mRNA,A错误;Ca2+处理只能提高微生物细胞细胞质膜对DNA的通透性,不能提高番茄细胞壁的通透性,B错误;抗植物病毒基因整合到番茄细胞的染色体上后不一定能表达,还需在RNA和蛋白质方面进行检测,C错误;转基因抗植物病毒番茄是否培育成功可从个体水平通过病毒接种实验进行鉴定,D正确。 2.用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时,得到以下电泳图谱,其中1号为DNA标准样液(Marker),10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。下列叙述错误的是 (　　) A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间 B.3号样品为不含目的基因的载体DNA C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株 D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰 答案:B 解析:PCR过程中,可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段。4~9号是转基因植株,理论上应包含目的基因,结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果,推测包含目的基因的片段大小应为250~500 bp,A正确;3号PCR结果包含250~500 bp片段,应包含目的基因,B错误;9号PCR结果不包含250~500 bp片段,所以不是所需转基因植株,C正确;10号放入蒸馏水,可排除反应体系等对结果的干扰,由图可知,10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰,D正确。 备选题库 教师独具 1.下列关于目的基因导入受体细胞的方法,不正确的是(　　) A.将目的基因导入植物细胞的方法主要是农杆菌转化法 B.用一定浓度的氯化钙溶液处理大肠杆菌细胞,使细胞处于一种能接受外来DNA分子的生理状态 C.将目的基因导入哺乳动物细胞最常用、最有效的方法是显微注射法 D.利用农杆菌转化法可培育大多数单子叶转基因植物 D 解析:将目的基因导入植物细胞的方法主要是农杆菌转化法,A正确;为使大肠杆菌易吸收DNA分子,应先用一定浓度的氯化钙溶液进行处理,使大肠杆菌处于易于接受外来DNA分子的生理状态,B正确;显微注射技术是将目的基因导入动物细胞最常用、最有效的一种方法,C正确;农杆菌转化法可将目的基因导入双子叶植物或祼子植物的细胞,D错误。 2.基因工程中常采用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞。某科研小组欲将某抗虫基因导入某植物,下列分析错误的是 (　　) A.应该将抗虫基因插入农杆菌Ti质粒的T-DNA片段内 B.用酚类化合物处理伤口细胞后,可以用农杆菌侵染水稻、玉米等单子叶植物 C.目的基因与Ti质粒的结合未涉及碱基互补配对原则 D.转基因是否成功,最简便的方法是观察该植物有没有抗虫性状 C 解析:农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞,并且整合到受体细胞染色体的DNA上,因此应该将抗虫基因插入农杆菌Ti质粒的 T-DNA片段内,A正确;若在单子叶植物的伤口处涂抹酚类化合物,则可以用农杆菌侵染水稻、玉米等单子叶植物,B正确;目的基因的黏性末端与质粒的黏性末端依赖碱基互补配对原则连接在一起,C错误;转基因是否成功,最简便的方法是从个体水平上观察该植物有没有抗虫性状,D正确。 3.为了增加菊花花色类型,研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1),拟将其与质粒(图2)重组,再借助农杆菌导入菊花中。 下列操作与实验目的不符的是 (　　) A.用限制酶EcoR Ⅰ和DNA连接酶构建重组质粒 B.用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织,将C基因导入细胞 C.在培养基中添加卡那霉素,筛选被转化的菊花细胞 D.用DNA分子杂交法检测C基因是否整合到菊花染色体上 C 解析:根据目的基因两侧的限制酶切割位点可知,可用限制酶EcoRⅠ和DNA连接酶构建重组质粒,A正确;将目的基因导入到植物细胞常用农杆菌转化法,即用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织,将C基因导入细胞,B正确;图2中显示的标记基因是潮霉素抗性基因,因此可在培养基中添加潮霉素,以筛选被转化的菊花细胞,C错误;检测C基因是否整合到菊花染色体上,常采用DNA分子杂交法。 4.(多选)如图是利用基因工程培育抗虫植物的流程示意图。下列说法错误的是 (　　) A.①过程中重组Ti质粒的构建需要限制酶和DNA连接酶参与 B.②过程中农杆菌的重组Ti质粒整合到了植物细胞的染色体上 C.图中植物细胞N染色体上若含抗虫基因就能够表现出抗虫性状 D.植株M是否发生定向变异需做个体生物学水平的抗虫性状鉴定 BC 解析:重组Ti质粒的构建过程中需要用到限制酶和DNA连接酶,A正确;②过程中重组Ti质粒上的T⁃DNA整合到了植物细胞的染色体上,B错误;受体细胞的染色体上含抗虫基因,只能说明抗虫基因成功整合到受体细胞的染色体上,不代表该基因就一定能成功表达,因此不能确定是否会表现出抗虫性状,C错误;检测植株M是否能表现出抗虫的性状,需要进行个体水平检测,即进行害虫饲喂实验,若抗虫,说明植株M发生了定向变异,D正确。 5.近年来,科学家利用基因工程技术创造出许多优良品种或产品。如图表示获得抗除草剂转基因玉米的技术路线,其中含有内含子的报告基因只能在真核生物中正确表达,其产物能催化无色物质K呈现蓝色。请回答以下问题。 (1)为防止酶切产物自身环化,需使用　　种限制酶分别对含除草剂抗性基因G的DNA片段和Ti质粒上的　　　　 (填“报告基因”“T⁃DNA”或“氨苄青霉素抗性基因”)进行酶切。  (2)为提高转化成功率,常用一定浓度的　　　　溶液处理农杆菌,使其成为感受态细胞。转化成功的农杆菌应在含　　　　　　的培养基上进行筛选。  2 T-DNA CaCl2 氨苄青霉素 (3)农杆菌细胞内报告基因表达后　　　　(填“能”或“不能”)催化无色物质K呈现蓝色,原因是　  　。  (4)农杆菌转化愈伤组织的过程中,愈伤组织表面常残留农杆菌,会导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长。所以进行过程筛选2时,应在培养基中加入　 　　　　　　,并挑选____________________ 　　　　　的植物细胞,进行　　　　　　　获得抗除草剂转基因玉米幼苗。  不能 报告基因只能在真核生物中正确表达 除草剂和物质K 愈伤组织细胞内 呈现蓝色 植物组织培养 解析:(1)基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。为防止酶切产物自身环化,需使用两种限制酶分别对含除草剂抗生基因G的DNA片段和Ti质粒上的T-DNA进行酶切。 (3)“报告基因”含有内含子序列,内含子转录产生的RNA序列在农杆菌中不能被切除,导致农杆菌内“报告基因”翻译的蛋白质结构不同,不具相应的酶活性,无法催化无色物质K呈现蓝色。 (4)由于农杆菌细胞可以吸附在植物愈伤组织细胞表面。导致未转化的愈伤组织可能在含除草剂的培养基中生长,所以应对愈伤组织细胞进行“双筛选”,使其既能抗除草剂,又能在植物细胞内部催化无色物质K呈现蓝色,这样的植物细胞才是真正的转基因植物细胞。所以进行筛选2过程时,应在培养基中加入除草剂和物质K,并挑选愈伤组织细胞内呈现蓝色的植物细胞,进行植物组织培养获得抗除草剂转基因玉米幼苗。 课时作业 素养达标 [基础巩固练] 1.Ti质粒是根癌农杆菌拟核外的遗传物质,常作为植物基因工程的载体。下列关于Ti质粒的叙述,正确的是(　　) A.每个脱氧核糖均与2个磷酸基团和1个碱基相连 B.Ti质粒复制时具有多起点和双向复制特点 C.用Ca2+处理植物细胞有利于重组Ti质粒的导入 D.Ti质粒可随机整合到农杆菌的拟核DNA上 A 解析:Ti质粒是双链环状DNA分子,每个脱氧核糖均与2个磷酸基团和1个碱基相连,A正确;Ti质粒通常具有单起点复制特性,在宿主细胞中,质粒能够自主复制,一般只含有一个复制起始点,B错误;用Ca2+处理农杆菌有利于重组Ti质粒的导入,C错误;Ti质粒的T⁃DNA片段可随机整合到受体细胞染色体的DNA上,D错误。 2.科研人员以抗四环素基因为标记基因,通过基因工程的方法让大肠杆菌生产鼠的β-珠蛋白,治疗鼠的镰刀型细胞贫血症。下列相关实验设计合理的是 (　　) A.基因表达载体中的启动子是DNA聚合酶识别和结合的位点 B.利用小鼠的成熟红细胞提取mRNA可获得β⁃珠蛋白基因的编码序列 C.常用Ca2+处理大肠杆菌使其成为易于吸收DNA的感受态细胞 D.用含有四环素的培养基筛选出的大肠杆菌一定能产生β⁃珠蛋白 C 解析:基因表达载体中的启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点,可用于驱动基因的转录,A错误;哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和核糖体等结构,因此也没有mRNA,所以不能利用小鼠的成熟红细胞提取mRNA,B错误;将目的基因导入微生物细胞常用感受态细胞法,常用Ca2+处理大肠杆菌使其成为易于吸收DNA的感受态细胞,C正确;标记基因的作用是筛选含有目的基因的受体细胞,用含有四环素的培养基筛选出的大肠杆菌,可能导入的是不含β-珠蛋白基因的质粒,即使导入的是重组质粒,目的基因也不一定表达,D错误。 3.电穿孔法通过将高浓度动物细胞悬液短暂暴露于高压脉冲电流中,外源DNA可经高电压在细胞质膜上形成的可复性闭合小孔进入细胞并整合到染色体上,以实现细胞转染。下列叙述正确的是 (　　) A.培养动物细胞悬液需要定期添加KCl以维持pH稳定 B.小孔形成后,适当降温可以延长外源DNA分子可进入的时间 C.贴壁生长细胞比悬浮生长细胞更适合用电穿孔法进行转染 D.高电压会导致大部分细胞凋亡,采用高浓度细胞悬液可提高转染成功率 B 解析:培养动物细胞悬液需要定期提供CO2以维持pH稳定,A错误;小孔形成后,适当降温可以降低细胞膜的流动性,延长外源DNA分子可进入的时间,B正确;电穿孔法通过将高浓度动物细胞悬液短暂暴露于高压脉冲电流中,所以悬浮生长细胞比贴壁生长细胞更适合用电穿孔法进行转染,C错误;高电压会导致大部分细胞坏死,采用高浓度细胞悬液可提高转染成功率,D错误。 4.基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业等多方面的应用发展迅速,如图表示利用基因工程技术生产人血清白蛋白的两条途径。下列相关叙述正确的是 (　　) A.导入人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞是乳腺细胞 B.扩增目的基因时,利用耐高温的DNA连接酶从引物a、b的3'端进行子链合成 C.若某基因是从人的细胞内提取mRNA经逆转录形成的,则该基因中不含启动子序列 D.利用显微注射法可将含有目的基因的重组质粒整合到植物受体细胞的染色体DNA上 答案:C 解析:导入人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞一般是受精卵,A错误;DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链,扩增目的基因时,利用耐高温的DNA聚合酶从引物a、b的3'端进行子链合成,B错误;成熟的mRNA是由基因转录后经剪切而成,不含启动子序列,故若某基因是从人的细胞内提取的mRNA经逆转录形成,则该基因中不含启动子序列,C正确;农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞,并且整合到受体细胞染色体的DNA上,根据农杆菌的这一特点,可将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上,通过农杆菌的转化作用把目的基因整合到植物细胞染色体的DNA上。将目的基因转入动物细胞常用显微注射法,但显微注射法不能将含有目的基因的重组质粒整合到植物受体细胞的染色体DNA上,D错误。 5.用于判断目的基因是否转移成功的方法中,不属于分子检测的是(　　) A.饲喂害虫棉花的叶片观察其是否死亡 B.目的基因片段与DNA探针能否形成杂交带 C.目的基因表达产物蛋白质能否与抗体形成杂交带 D.目的基因转录形成的mRNA与DNA探针能否形成杂交带 A 解析:饲喂害虫棉花的叶片观察其是否死亡,属于个体水平上的鉴定,A符合题意;目的基因片段与DNA探针能否形成杂交带,属于分子水平上的鉴定,B不符合题意;目的基因表达产物蛋白质能否与抗体形成杂交带,属于分子水平上的鉴定,C不符合题意;目的基因转录形成的mRNA与DNA探针能否形成杂交带,属于分子水平上的鉴定,D不符合题意。 6.如图是将人的生长激素基因导入细菌细胞B内制“工程菌”的示意图。已知细菌细胞B内不含质粒A,也不含质粒A上的基因。下列说法正确的是 (　　) A.将重组质粒导入细菌细胞B常用的方法是农杆菌转化法 B.将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上,能生长的只是导入了普通质粒的细菌 C.为提高特异性引物的特异性,PCR获取人生长激素基因设计的特异性引物不宜过长 D.目的基因成功表达的标志是受体细胞中含有人的生长激素基因 答案:B 解析:将基因表达载体导入细菌B之前,一般要先用Ca2+处理细胞,使其处于感受态,而农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞的常用方法,A错误;由于重组质粒构建过程中抗四环素基因被破坏,所以能在含有四环素的培养基上生长的是导入普通质粒A的细菌,B正确;PCR引物的设计是获得大量高纯度目的基因的关键,引物中碱基数量越多,则引物的特异性越高,为提高特异性引物的特异性,PCR获取人生长激素基因设计的特异性引物不宜过短,C错误;基因表达的产物是蛋白质,目的基因成功表达的标志是受体细胞中表达出相应的蛋白质,D错误。 7.如图为转基因抗虫烟草的培育流程,下列叙述正确的是 (　　) A.培育过程①需要使用限制酶和DNA聚合酶 B.过程②将重组Ti质粒导入烟草细胞前需要使用CaCO3处理农杆菌 C.培育过程③④仅通过调节生长调节剂可诱导愈伤组织再生出新植株 D.可通过观察害虫吞食转基因烟草后的存活情况进行个体水平检测 答案:D 解析:过程①表示基因表达载体的构建过程,即形成重组Ti质粒的过程,需要使用限制酶和DNA连接酶,不需要DNA聚合酶,A错误;过程②是将目的基因导入受体细胞的过程,在将重组Ti质粒导入烟草细胞前需要先使用CaCl2处理农杆菌将重组Ti质粒导入农杆菌,B错误;过程③④为再分化成植株的过程,该过程中需要通过调节营养物质和生长调节剂的配比实现由愈伤组织诱导出芽和根,并由此再生出新植株,C错误;对转基因抗虫烟草的检测,可通过进行个体水平的检测判断转基因是否成功,即让害虫吞食转基因烟草,观察害虫的存活情况,D正确。 8.启动子可以分为组成型启动子和诱导型启动子。组成型启动子能够持续、高效地启动目的基因在植物各种组织中表达,但往往也会阻碍植物的生长发育;诱导型启动子能与抗逆基因结合,从而使转基因植物更好地适应逆境。沙冬青脱水素基因(AmDHN基因)能使植株具有较强的抗旱作用。科研人员构建Rd29A启动子驱动AmDHN基因表达的载体,过程如图,再利用某种方法转化“敖汉苜蓿”培育耐旱新品种,以期在干旱地区发展苜蓿产业。NeoR是新霉素抗性基因,aadA是链霉素抗性基因。回答下列问题。 限制酶 识别序列和切割位点 BclⅠ ATCA SacⅠ GAGC BamHⅠ ATCC PstⅠ CTGC SmaⅠ CCGG (1)Rd29A启动子是　　　　 (填“组成型”或“诱导型”)启动子,其基本单位是　 　　　　　,能识别Rd29A启动子的酶是　　　　　　。  (2)如图是科研人员扩增Rd29A启动子所设计的引物,根据引物的碱基序列及限制酶的识别序列分析,构建载体2时选用的限制酶是　 　　。  上游引物P1: 5 ' -GACCCGGGTTTCCAAAGATTTTTTTC-3' 下游引物P2: 5 ' -GAGAGCTCTGGGGTTTTGCTTTTGAATGT-3' 诱导型 4种脱氧核苷酸 RNA聚合酶 SmaⅠ和SacⅠ (3)构建载体3时,选用　 　　　酶切割载体1、2成功率较高。载体5需先转入　　　　后再转化苜蓿,转化后应在培养基中添加__________　　　　　　筛选转化成功的愈伤组织。  (4)为检测转基因苜蓿中AmDHN基因的转录水平,挑选10株转基因植株,平均分成2组,利用自来水和20%PEG(模拟干旱条件)处理8 h,提取植株的 　　 　　通过RT⁃PCR检测AmDHN基因和MtActin基因(一种骨架蛋白基因,在各种细胞中表达都相对恒定)的表达水平,扩增产物常用　 　　　 技术进行检测,检测结果如图:  BclⅠ和SacⅠ 农杆菌 新霉素 (总)RNA 琼脂糖凝胶电泳 该图中,自来水处理和20% PEG条件下的AmDHN基因表达水平的差异说明　 　　　　。  干旱条件诱导Rd29A启动子驱动AmDHN基因表达 解析:(1)根据题意,沙冬青脱水素基因属于抗旱基因,属于抗逆基因,由题可知诱导型启动子能与抗逆基因结合,使转基因植物更好地适应逆境,因此与AmDHN基因结合的Rd29A启动子属于诱导型启动子;启动子、终止子都是一段DNA序列,故其基本单位为4种脱氧核苷酸;在转录过程中,识别并结合启动子的酶是RNA聚合酶。 (2)分析引物的碱基序列和限制酶识别序列切割位点,引物5'端有SmaⅠ的识别序列CCCGGG和SacⅠ的识别序列GAGCTC,SmaⅠ和SacⅠ能识别并切割质粒,故构建载体2时选用的限制酶是SmaⅠ和SacⅠ。 (3)构建载体3时要将35S启动子切掉,将Rd29A启动子连接在T⁃DNA上,故由载体1和2可得,选用BclⅠ酶和SacⅠ酶成功率较高;将目的基因导入植物细胞用的方法是农杆菌转化法,故载体5需先转入农杆菌后再转化苜蓿,载体5含有的NeoR(新霉素抗性基因)在T⁃DNA内部,而aadA不在T⁃DNA内部,所以转化后应在培养基中添加新霉素以筛选转化成功的愈伤组织。 (4)本实验目的是检测转基因苜蓿中AmDHN基因的转录水平,基因转录产物是RNA,因此需提取植株的RNA检测表达水平;通过PCR扩增获得产物通常用琼脂糖凝胶电泳技术进行检测,在相同浓度的凝胶中,DNA分子的大小和构象不同,迁移速率不同;自来水条件下AmDHN基因不转录,20%PEG条件下AmDHN基因转录,说明干旱条件能诱导Rd29A启动子驱动AmDHN基因表达。 [素能培优练] 9.图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点。下列关于培育转基因大肠杆菌的叙述,正确的是 (　　) A.若通过PCR获取该目的基因,应该选用引物甲和引物丙 B.图中质粒和目的基因构建表达载体,可选用BamHⅠ和HindⅢ剪切 C.若将基因表达载体导入受体细胞中,需选用农杆菌转化法 D.在受体细胞中,氨苄青霉素抗性基因和目的基因可同时表达 答案:A 解析:引物是根据目的基因两侧序列获得,需要与目的基因两端互补,故若通过PCR技术大量扩增该目的基因,应该选用引物甲和引物丙,A正确;图甲中BamHⅠ会破坏两种抗性基因,不能选用,故图乙中目的基因左侧只能选BclⅠ,而质粒上没有目的基因右侧Sau3A的切点,两者都有HindⅢ的切点,为了防止目的基因与质粒随意连接,故质粒和目的基因构建表达载体应选用BclⅠ和Hind Ⅲ剪切,B错误;将基因表达载体导入受体细胞大肠杆菌(微生物细胞)时需要用钙离子等处理,使其处于感受态,C错误;插入目的基因时氨苄青霉素抗性基因被破坏,不能和目的基因同时表达,D错误。 10.甲醇酵母菌是基因工程中常用的受体菌,它可以高效表达外源蛋白,但自身蛋白分泌到培养基中的较少。研究人员将人的胶原蛋白基因导入甲醇酵母中并成功表达。下列有关叙述错误的是 (　　) A.用两种限制酶切割目的基因和质粒,可防止目的基因反向连接和自身环化 B.常用显微注射法将胶原蛋白基因导入甲醇酵母中 C.与大肠杆菌相比,甲醇酵母作受体菌所表达出的胶原蛋白与人体产生的胶原蛋白结构更相近 D.与其他酵母菌相比,甲醇酵母作受体菌便于表达出的胶原蛋白的分离与纯化 B 解析:用两种限制酶切割目的基因和质粒,可以防止目的基因的反向连接和自身环化,保证目的基因与运载体连接的正确性,A正确;甲醇酵母属于微生物细胞,常用制备感受态细胞(钙离子处理)的方法将目的基因导入微生物细胞,B错误;与大肠杆菌做受体相比,甲醇酵母为真核生物,表达出的胶原蛋白可经过内质网和高尔基体的加工,所以与人体产生的胶原蛋白结构更相近,C正确;与其他酵母菌相比,甲醇酵母可以高效表达外源蛋白,且自身蛋白分泌到培养基中的较少,便于目的蛋白的分离和纯化,D正确。 11.幽门螺杆菌(Hp)感染会引发胃炎、 消化性溃疡等多种疾病。研究人员 将Hp的Ipp20基因作为目的基因,用 限制酶XhoⅠ和XbaⅠ切割,通过基因工 程制备相应的疫苗,质粒及操作步骤 如图所示。下列相关叙述错误的是 (　　) A.Ipp20基因整合到大肠杆菌的DNA中属于基因重组 B.基因表达载体导入之前,可用Ca2+处理大肠杆菌 C.培养基A中添加了氯霉素,培养基B中添加了潮霉素 D.能用来生产Hp疫苗的大肠杆菌在菌落3和5中 答案:C 解析:基因重组是指控制不同性状的基因发生重新组合,主要发生在有性生殖过程中,但通过基因工程将不同来源的DNA拼接,可以赋予生物新的遗传特性,也属于基因重组的范畴,故利用基因工程将Ipp20基因整合到大肠杆菌的DNA中属于基因重组,A正确;大肠杆菌细胞属于微生物细胞,可用Ca2+处理受体细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,更容易将基因表达载体导入其中,B正确;该过程使用了限制酶XhoⅠ和XbaⅠ切割质粒和Ipp20基因,结合图示可知,在构建基因表达载体的过程中氯霉素抗性基因被切割掉,只保留了潮霉素抗性基因,不管是正常质粒还是重组质粒都含有潮霉素抗性基因,但只有正常质粒才同时含有氯霉素抗性基因,因此,可以先用含有潮霉素的培养基A筛选出导入正常质粒、重组质粒的大肠杆菌,再采用同位影印接种到含有氯霉素的培养基B和含有潮霉素的培养基A中,此时含有重组质粒的大肠杆菌不能在含有氯霉素的培养基B上生长,从而与培养基A(对照)相比会消失一些菌落,对照两个平板上减少的菌落就是符合要求的大肠杆菌菌落,结合图示可知,符合要求的大肠杆菌菌落是3和5,C错误,D正确。 12.(多选)生命科学院课题组为得到青蒿素产量高的新品系,将青蒿素合成过程的某一关键酶基因fps在野生青蒿中过量表达,其过程如图所示。下列有关叙述正确的是 (　　) A.经图示过程得到的fps基因中含有启动子和终止子 B.酶1、酶2和酶3作用的化学键都是磷酸二酯键 C.农杆菌转化法多用于双子叶植物和裸子植物 D.导入fps基因的青蒿植株中该基因不一定都能过量表达 答案:BCD 解析:真核细胞的mRNA不含有启动子和终止子的对应序列,故逆转录得到的基因不含启动子和终止子,A错误;酶1促进逆转录的过程,故为逆转录酶,酶2、酶3用于切割目的基因和质粒,为限制酶和DNA连接酶,都作用于两个核苷酸之间的磷酸二酯键,B正确;在自然条件下,农杆菌能感染双子叶植物和裸子植物,所以可用农杆菌转化法转化双子叶植物和裸子植物,C正确;导入fps基因的青蒿植株中基因不一定能过量表达,故必须检测转基因青蒿植株中的青蒿素产量,若产量增高,则说明达到了目的,D正确。 13.(多选)双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达,研究人员构建了如图所示的表达载体,以检测双向启动子作用效果。下列分析错误的是(　　) A.为连入GUS基因,需用SalⅠ和SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒 B.表达载体中GUS基因和LUC基因转录时使用T⁃DNA的同一条DNA单链为模板 C.可以用农杆菌转化法将表达载体导入植物细胞,在培养基中添加壮观霉素进行筛选 D.可以通过观察是否出现荧光和蓝色物质确认双向启动子是否发挥了作用 答案:ABC 解析:用SphⅠ酶切已整合了双向启动子及LUC基因的质粒会破坏LUC基因,A错误;表达载体中GUS基因和LUC基因转录时双向启动子的转录方向不同,使用T-DNA的模板链也不同,B错误;将基因表达载体导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法,但壮观霉素抗性基因位于T-DNA序列之外,只能筛选出成功导入表达载体的微生物受体细胞,C错误;双向启动子如果正常表达,就会合成萤光素酶和β-葡萄糖苷酶,催化底物分别产生荧光或生成蓝色物质,从而确定双向启动子的作用,D正确。 14.人绒毛膜促性腺激素是女性怀孕后胎盘滋养层细胞分泌的一种糖蛋白,由α链和β链(hCGβ)结合而成。近年研究显示,hCGβ可表达于结肠癌等多种恶性肿瘤细胞,与肿瘤的发生、发展及转移有一定关系。研发抗hCGβ疫苗已成为近年来肿瘤生物治疗新的热点,图1为其制备的基本方案。请分析并回答下列有关问题。 注1:甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔 注2:AOX1为甲醇氧化酶基因的启动子,只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达 (1)图中hCGβ基因需要与甲序列一起构建形成融合基因,其目的是 　 　　　　　。  (2)当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时,就可以发生同源切割,将目的基因直接插入。同源切割是一种代替_________　　　　　　将目的基因导入基因表达载体的方法。  (3)阶段Ⅱ将环化质粒导入用　　　处理的大肠杆菌,然后在含有 　　　　　　的培养基中筛选得到含hCGβ基因表达载体的大肠杆菌后进行扩增。  有利于hCGβ进入内质网加工 限制酶 Ca2+ 氨苄青霉素 (4)鉴定基因表达载体。为了检验目的基因 是否融合成功,提取大肠杆菌中的质粒为模 板,设计相应的引物对融合基因进行PCR扩 增,PCR反应体系中需加入模板、 　　　　　 　、引物、 Mg2+、缓冲液等,再将扩增产物进行电泳。 电泳时，需将待测样品与上样缓冲液混合后加入加样孔,缓冲液中含有的溴酚蓝作为电泳指示剂,以防　 　　　　　。电泳后得到图2所示结果,据图可以判断　　号样品最符合要求。  Taq酶、dNTP(4种脱氧核苷酸) 条带迁移出凝胶 3 (5)阶段Ⅳ需将处理后的酵母菌接种在培养基上培养,该培养基不需要添加以下哪些成分？　　　　　(a.氨苄青霉素 b.组氨酸 c.无机盐 d.琼脂),可在此培养基上生长的酵母菌即为含有hCGβ基因表达载体的目的菌株。将此菌株扩大培养后,离心取上清液,用　 　　　　法进行检测。若上清液中能检测到hCGβ蛋白,则说明hCGβ基因得以表达。  (6)从生产控制的角度分析,选用AOX1作为hCGβ基因启动子的优点是 　　　　 　　。  a、b 抗原—抗体杂交 可以通过控制培养液中甲醇作为唯一碳源,来控制hCGβ基因表达 解析:(1)甲序列指导合成的信号肽能引导后续合成的肽链进入内质网腔,因此hCGβ基因需要与甲序列一起构建形成融合基因,其目的是有利于hCGβ进入内质网中加工,并分泌到细胞外。 (2)传统重组质粒构建过程需要使用限制酶和DNA连接酶,而该过程是运用同源切割的方式在hCGβ基因两端加上一组同源序列A、B,然后将hCGβ基因与线性质粒载体混合后,在重组酶和DNA连接酶的作用下可形成环化质粒,该过程没有使用限制酶,所以同源切割是一种代替限制酶将目的基因导入基因表达载体的方法。 (3)将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法(钙离子处理法),即用Ca2+处理;由于线性质粒上含有氨苄青霉素抗性基因,因此导入环化质粒的大肠杆菌具有氨苄青霉素抗性,因此应在含有氨苄青霉素的培养基中筛选得到含hCGβ基因表达载体的大肠杆菌后进行扩增。 (4)PCR反应体系中需加入模板、Taq酶、dNTP(4种脱氧核苷酸)、引物、Mg2+、缓冲液等;缓冲液中含有溴酚蓝作为电泳指示剂,以防条带迁移出凝胶;由图1可知,hCGβ基因的长度为630 bp,甲序列长度是320 bp,因此融合基因长度950 bp,结合图2可知,3号样品电泳出现约1 000(950) bp条带,故3号样品最符合要求。 (5)由于环状质粒中含有组氨酸合成酶基因,因此培养基中不需要再加入b组氨酸,而且氨苄青霉素不对酵母菌起作用,不需要加入氨苄青霉素,但需要加入无机盐和琼脂,形成固体培养基,以筛选目的菌体;hCGβ是一种分泌蛋白,可被分泌到细胞外,将培养物离心后分出细胞和培养液两部分,细胞经破碎处理后,再次离心取上清液,可获得较多的hCGβ,再用抗hCGβ单克隆抗体分别进行检测,即抗原—抗体杂交法。 (6)AOX1为甲醇氧化酶基因的启动子,只能在以甲醇为唯一碳源的培养基中正常表达,因此选用AOX1作为hCGβ基因启动子,可以通过控制培养液中甲醇的有无,来控制hCGβ基因的表达hCGβ蛋白的合成。 15.甜味蛋白具有高甜度、低热量、安全性高等优点,并且具有一定的营养价值。科研人员将甜味蛋白基因(G基因)转入普通的甜玉米细胞中,培育出了超量表达G蛋白的转基因甜玉米新品种,提高了玉米的商品价值。在超量表达G基因载体的构建中,所用DNA片段和Ti质粒及酶切位点如图1、2所示。 (1)图1中,强启动子是一段特殊序列的DNA片段。位于基因的________　　　 (填“上游”“下游”或“上下游均可”),强启动子能被　 　　　识别并驱动基因持续转录。该转录过程中模板链的5'端位于　　 (“M”或“N”)端。  上游 RNA聚合酶 M (2)利用T-DNA的　　　　特性,最终使强启动子和G基因整合到玉米细胞染色体DNA上。为使DNA片段能定向插入T-DNA中,可以用PCR技术在DNA片段的两端添加限制酶识别序列,M、N端添加的序列所对应的限制酶分别是　 　　　。构建G基因的超表达载体,还需用到DNA连接酶,其中DNA连接酶作用的底物为图3中的　　 (填“A”“B”或“A和B”)。  可转移 NotⅠ和SacⅠ B (3)外植体经脱分化形成的愈伤组织放入农杆菌液浸泡后,进行植物组织培养时培养基中需加入　　　　进行筛选。对获得的Y1、Y2、Y3、Y4四个玉米株系用G基因的探针作DNA分子杂交检测,结果均为阳性,但进一步对G蛋白表达量测定时,发现Y4株系的表达量与野生型相近,原因可能是　 　　　。  潮霉素 Y4株系玉米中目的基因未表达 (4)图4为淀粉合成酶基因片段,其转录后形成的前体RNA需通过加工方能用于翻译。科研人员希望通过降低淀粉合成酶基因的表达,进一步提高甜玉米中可溶性糖的含量,将吗啉反义寡核苷酸导入玉米受精卵中,发现淀粉合成酶基因表达受阻。其受阻机制存在两种假说。 假说1:吗啉反义寡核苷酸导致前体RNA上内含子1的对应序列不能被剪切; 假说2:吗啉反义寡核苷酸导致前体RNA上内含子1和外显子2的对应序列同时被剪切。 为验证上述假说,在受精卵发育后3天的胚细胞中,分别从实验组和对照组提取　　　　,逆转录形成cDNA。  总RNA ①若假说1成立,使用图示引物2和引物4进行PCR后电泳的结果为　　　　。  A.实验组有目的条带 B.对照组有目的条带 C.实验组无目的条带 D.对照组无目的条带 ②若要证明假说2,需选择图示引物　　　　进行PCR扩增后,进一步鉴定。  A、D 3和4 ③若某次实验电泳结果发现实验组和对照组都没有任何条带,从PCR操作过程角度解释可能的原因是_________________________________________ 　　　　(至少写出2点)。  退火温度太高、引物自连或互连(合理 即可) 解析:(1)强启动子是一段特殊序列的DNA片段,位于基因的上游,启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点,可以驱动基因转录。在基因表达载体构建时,G基因位于启动子的下游,转录时RNA聚合酶和启动子结合,子链延伸的方向是5'端到3'端,模板链方向与子链方向相反,因此模板链的5'端位于M端。 (2)农杆菌侵染植物细胞后能将Ti质粒的T-DNA转移到被侵染的细胞,并且将其整合到该细胞的染色体DNA上,利用T-DNA的可转移特性,最终使强启动子和G基因整合到玉米细胞染色体DNA上。构建基因表达载体时,应确保强启动子和G基因不被破坏,所以不能选用EcoRⅠ、BamHⅠ和HindⅢ切割质粒,应选用NotⅠ和SacⅠ切割质粒;且G基因应位于强启动子和终止子之间。为保证强启动子和G基因能与质粒正确连接,M、N端添加的序列所对应的限制酶分别是NotⅠ和SacⅠ,然后再用DNA连接酶将两者进行连接。3'端为-OH端,5'端为磷酸基团端,因此DNA连接酶作用的底物为图3中的B。 (3)由图2可知潮霉素抗性基因位于Ti质粒的T-DNA上,随T-DNA整合到玉米细胞的染色体DNA上,所以将农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养后,在培养基中需加入潮霉素进行筛选。对获得的Y1、Y2、Y3、Y4四个玉米株系用G基因的探针作DNA分子杂交检测,结果均为阳性,说明目的基因已成功导入这4个玉米株系,但Y4株系的表达量与野生型相近,原因可能是Y4株系玉米中目的基因未表达。 (4)为验证上述假说,分别从受精卵发育后3天的实验组和对照组胚细胞中提取总RNA逆转录形成cDNA。 ①根据引物2和引物4在淀粉酶合成基因片段上的位置,通过PCR扩增能得到内含子1的序列,若假说1成立,即吗啉反义寡核苷酸导致RNA前体上内含子1的对应序列不能被剪切,故实验组中应含有内含子1的序列,而对照组的该片段被切除了,因此用引物2和引物4进行PCR反应,其结果为实验组中有杂交带,而对照组中无杂交带。A、D正确,B、C错误。故选A、D。 ②若要证明假说2成立,即RNA前体上外显子2的对应序列同时被剪切下去,则可以选择图示引物3和引物4进行PCR,观察是否有杂交带出现,如果RNA前体上外显子2的对应序列同时被剪切下去,PCR后电泳不会出现杂交带。 ③若某次实验电泳结果发现实验组和对照组都没有任何条带,从PCR操作过程角度解释可能的原因是退火温度太高、引物自连或互连。 $$