第3章 第1节 第2课时 利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定-【新课程学案】2025-2026学年高中生物选择性必修3 生物技术与工程配套课件PPT（苏教版）

该高中生物学课件聚焦PCR技术原理及电泳鉴定，从DNA半保留复制切入，通过对比体内DNA复制与PCR的异同搭建学习支架，系统讲解PCR的条件、步骤及结果，衔接电泳操作与产物鉴定，帮助学生构建完整知识脉络。 其亮点在于融合科学思维与探究实践，通过对比表格解析PCR与体内复制差异，图示法直观呈现反应过程，培养分析能力。实验环节详细说明PCR循环参数、电泳凝胶制备及异常原因分析，引导学生动手实践，典例结合流感病毒检测等实际情境，增强社会责任意识，为教师提供分层训练资源，助力提升教学效率与学生应用能力。

第2课时 利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定 学习目标 1.简述PCR的原理、条件及过程。　　 2.尝试进行PCR的基本操作并电泳鉴定PCR的产物。 知识点（一） 聚合酶链式反应 (PCR)技术 知识点（二） 利用PCR技术扩增 DNA片段并完成 电泳鉴定 课时跟踪检测 目录 课堂小结与随堂训练 知识点（一） 聚合酶链式反应 (PCR)技术 教材知识梳理 (一)PCR的含义及反应条件 含义 PCR是________________的缩写，是________________ ________的体外扩增技术 原理 DNA半保留复制 条件 模板DNA、_______、4种______ (能量和原料)、缓冲液和热稳定的___________________、Mg2+等 聚合酶链式反应 目的DNA片段(目的基因) 引物对 dNTP DNA聚合酶(Taq酶) (二)PCR的反应步骤和结果 1.PCR反应的一般步骤 (1)变性：在约94 ℃高温下，作为模板的双链DNA___________为两 条单链DNA。 (2)退火：反应体系的温度降至约55 ℃，_________分别与对应单链 DNA上的_________配对。 (3)延伸：反应体系的温度回升到约72 ℃(Taq酶催化作用的最适反应温度)，4种脱氧核苷三磷酸根据_____________原则，在Taq酶的作用下连接到_________之后，使引物链延伸，并形成互补的DNA双链。 　　 解旋(变性) 2条引物 特定部位 碱基互补配对 引物3'端 (4)重复循环多次。 2.PCR的结果：理论上，每经过一个循环，样本中DNA片段的数量增加一倍，经过n个循环后，DNA片段数量可以扩增至原先的2n倍。 (三)PCR技术的应用 1.广泛应用于医学及分子生物学等领域，如：病原体鉴定、____________、免疫学研究、癌基因探索及某些疾病治疗等。 2.在古生物学、法医学等方面也有广泛的应用。 遗传病诊断 (一)图示法理解PCR反应过程 核心要点点拨 (二)PCR技术与生物体内DNA复制的比较 比较项目 PCR 细胞核内DNA复制 区别 场所 试管中 细胞内 方式 半保留全连续局部区域复制 半保留半不连续全链复制 起始位点 引物3'端 复制起始位点 酶 仅一种DNA聚合酶(Taq酶) 多种酶(DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等) 反应条件 温度变幅大 温和 解旋 高温解旋 解旋酶解旋 区别 引物 DNA片段，保留在复制的子链中 RNA片段，不保留在复制的子链中 产物 引物界定的片段 核基因组 循环次数 人为设置 与细胞分裂同步 联系 ①模板：均需要脱氧核苷酸链作为模板进行物质合成； ②原料：均为四种脱氧核苷酸； ③酶：均需要DNA聚合酶进行催化； ④引物：均需要引物，使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 续 表 (三)与引物相关的问题分析 1.PCR技术需要引物的原因 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3'端延伸DNA链，因此，DNA的复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3'端开始延伸DNA链，因此DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸。 2.PCR扩增中需要引物数目的计算规律 若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗引物数为2n+1-2个，第n轮循环需要消耗的引物数为2n个。 3.关于引物设计应注意的问题 依据目的基因两端的部分核苷酸序列设计。两种引物之间以及每种引物内部不能发生碱基互补配对。有时候引物5'端需要含有某种限制酶的识别序列。 [典例]　(2025·南京期末)科研人员利用PCR技术扩增X基因片段，需加入两种引物，引物结合位置如图甲所示。PCR循环后产生五种DNA分子，如图乙所示。下列叙述正确的是 (　　) A.利用DNA聚合酶和DNA连接酶才能完成PCR扩增过程 B.如果加入大量引物1和引物2，会干扰正常的PCR扩增过程 C.在第四轮复制后，会出现8个⑤片段 D.经过第二轮PCR后会出现①②③④⑤五种DNA分子 √ [解析]　PCR扩增过程中不需要DNA连接酶，A错误。由图甲可知，利用PCR技术扩增X基因片段需要引物1和引物2，加入大量引物1和引物2，不会干扰正常的PCR扩增过程，B错误。若图乙表示第三轮复制的产物，则①②各有1个，③④⑤各有2个，第四次复制将得到16个DNA分子：①复制得①和③，②复制得②和④，2个③复制得2个③和2个⑤，2个④复制得2个④和2个⑤，2个⑤复制得4个⑤，C正确。第一轮PCR后得到2个两种DNA分子：①和②；第二轮PCR后得到4个四种DNA分子：①复制得①和③，②复制得②和④，所以经过第二轮PCR后会出现①②③④四种DNA分子，D错误。 [归纳拓展]　PCR中的数量关系 复制次数 1 2 3 n DNA分子数 2 4 8 2n 含引物的DNA 分子数 2 4 8 2n 含其中一种引物的DNA分子数 1=21-1 3=22-1 7=23-1 2n-1 同时含两种引物的DNA分子数 0=21-2 2=22-2 6=23-2 2n-2 共消耗引物的对数 1=21-1 3=22-1 7=23-1 2n-1 含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0=21-2 0=22-4 2=23-6 2n-2n 续表 (一)澄清概念 1.判断下列叙述的正误 (1)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应。( ) (2)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。( ) (3)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高。( ) 层级训练评价 × √ √ (二)落实知能 2.下列有关细胞内DNA的复制与PCR的叙述，错误的是(　　) A.都需要以亲代DNA的两条链分别作为模板 B.都需要DNA聚合酶和解旋酶进行催化 C.都需要四种脱氧核苷酸作为原料 D.都遵循相同的碱基互补配对方式 √ 解析：PCR是一项根据细胞内DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。细胞内DNA的复制与PCR都需要以亲代DNA的两条链分别作为模板，A正确；细胞内DNA的复制需要DNA聚合酶和解旋酶，PCR需要热稳定的DNA聚合酶，但不需要解旋酶，B错误；DNA的基本单位是脱氧核苷酸，细胞内DNA的复制与PCR都是为了合成DNA，故都需要四种脱氧核苷酸作为原料，C正确；DNA结构遵循碱基互补配对原则，故细胞内DNA的复制与PCR都遵循相同的碱基互补配对方式，D正确。 3.(2025·南京月考)PCR引物的3'端为结合模板DNA的关键，5'端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列，dNTP是DNA合成的原料，还可供能。下列相关说法错误的是 (　　) A.图示环节所需的温度比上一个环节的低 B.设计引物时，要有一段目的基因的已知核苷酸序列 C.热稳定的DNA聚合酶只能从引物的3'端开始延伸DNA链 D.1个循环后，子代DNA双链的脱氧核苷酸数量相同 √ 解析：图示环节为引物与模板碱基互补配对，表示的是复性环节，复性的上一环节为变性，复性的温度比变性的温度低，A正确；设计引物时，要有一段目的基因的已知核苷酸序列，保证其与已知模板能碱基互补配对，在后续扩增的过程中才能进行子链的延伸，B正确；子链是从5'端向3'端延伸的，热稳定的DNA聚合酶只能从引物的3'端开始延伸DNA链，C正确；由于两个引物均不在该片段的端点，因此一个循环后，子代DNA双链的脱氧核苷酸数量不一定相同，D错误。 (三)迁移应用 4.导致流感的病原体是一种单链RNA病毒。PCR是一项在生物体外能快速扩增DNA片段的技术。如图为流感病毒核酸检测的部分过程，图中引物是能与模板DNA碱基互补配对的单链DNA片段，是子链合成延伸的基础，DNA复制后将成为新合成子链的一部分。 (1)据图分析，核酸检测时首先以______________________为模板，以____________为原料合成杂交双链，将杂交双链用核酸酶H处理的目的是________________________ ___________________。  　　 将杂交双链中的RNA单链水解，得到DNA单链 病毒RNA(或RNA单链) 脱氧核苷酸 解析：据图分析，核酸检测时首先 以病毒RNA(或RNA单链)为模板，以脱氧核苷酸为原料合成杂交双链，将杂交双链用核酸酶H处理的目的是将杂交双链中的RNA单链水解，得到DNA单链。 (2)图中变性过程是将DNA双链间的　　　　　_____破坏，方法是用约94 ℃高温，该过程相当于体内DNA复制中的_____。退火过程需要降低反应体系的温度，目的是使引物与DNA模板链结合，该温度的高低与引物分子中含有的(A+T)/(G+C)有关，原因是_________________________ ______________________________________________________________________________________________________________________。  　　 引物与DNA模板链之间通过形成氢键结合，碱基对A—T之间可形成2个氢键，碱基对G—C之间可形成3个氢键，所以(A+T)/(G+C)越高，退火需要的温度越低 氢键 解旋 解析：图中变性过程是将DNA双链间的氢键破坏，使双链分开，方法是用约94 ℃高温，该过程相当于体内DNA复制中的解旋。退火过程需要降低反应体系的温度，目的是使引物与DNA模板链结合，该温度的高低与引物分子中含有的(A+T)/(G+C)有关，是因为引物与DNA模板链之间通过形成氢键结合，碱基对A—T之间可形成2个氢键，碱基对G—C之间可形成3个氢键，所以(A+T)/(G+C)越高，退火需要的温度越低。 (3)利用1个双链DNA分子完成35轮循环共需要______个引物分子。 236-2 解析：利用1个双链DNA分子完成35轮循环共合成235个DNA分子，有236条单链，最初的两条链不需要引物，故需要236-2个引物分子。 知识点（二） 利用PCR技术扩增 DNA片段并完成 电泳鉴定 教材知识梳理 (一)实验目的 1.尝试运用PCR仪扩增DNA片段。 2.关注PCR技术的应用。 3.学习_______________检测DNA片段的方法和技术。 (二)实验原理 1.扩增DNA片段的过程包括_____、_____和_____等步骤的多次循环。 琼脂糖凝胶电泳 变性 退火 延伸 2.理论上，每经过一个循环，样本中DNA片段的数量增加_____，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过n个循环后，DNA片段数量可扩增至原来的_____倍。  3.PCR反应体系包括：DNA模板、____________、dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、人工合成的____________、Taq酶等。 4.在不同阶段，还需要控制PCR仪反应系统的_____温度。 一倍 　2n　 反应缓冲液 DNA引物对 不同 (三)实验步骤 1.PCR扩增目的基因 (1)配制反应体系。 (2)按程序进行扩增。 延伸 预变性 变性 退火 2.电泳分析 电泳 进行此实验需要配制质量分数为1%的琼脂糖凝胶液(1×TAE)、50 μL PCR扩增产物和6 μL凝胶加样缓冲液等试剂，操作时维持恒压_____1.5~2 h 电泳 鉴定 采用凝胶成像仪或____________观察和记录电泳结果 80 V 紫外透射仪 (四)实验注意事项 1.微量取液器不能超量程使用。使用一次性屏蔽式吸液枪头有助于防止吸取的液体流入微量取液器，从而减少实验过程中的交叉污染。 2.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的PCR管、枪头和双蒸水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 3.为保证加入反应体系中的各试剂体积的准确性，要按照加入体积的大小，由大到小依次加入各试剂，即最先加入双蒸水。为保护酶的活性，一般最后加入Taq酶。 4.在向PCR管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，取液器上的枪头都必须更换。 (一)图示法理解PCR扩增及电泳分析的实验步骤 1.PCR扩增目的基因AKP 核心要点点拨 2.电泳分析 (二)PCR扩增中扩增条带异常的原因分析 未出现 扩增条带 ①Taq酶失活；②引物出现质量问题；③Mg2+浓度过低；④变性时的温度低，变性时间短 出现非特异 性扩增条带 ①模板DNA出现污染；②引物特异性不强或形成引物二聚体；③Mg2+浓度过高；④退火时的温度过低等 [典例]　(2025·启东高二阶段测)PCR产物常用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，下列与PCR和琼脂糖凝胶电泳有关叙述错误的是 (　　) A.利用PCR扩增目的基因时，需要已有的目的基因作模板 B.需将扩增得到的PCR产物与内含指示剂的电泳缓冲液混合后加样 C.PCR使用的缓冲液和酶应分装后冷冻保存，使用前取出并缓慢融化 D.琼脂糖溶液中加入的核酸染料利于DNA在紫外灯下被检测 √ [解析]　利用PCR扩增目的基因时，需要已有的目的基因作模板，A正确；加样时需将扩增得到的PCR产物与内含指示剂的凝胶加样缓冲液混合，B错误；PCR所用缓冲液和酶应分装成小份后冷冻保存，使用前应放在冰块上缓慢融化，这样才能不破坏缓冲液中稳定性较差的成分，同样保护酶的活性不被破坏，C正确；DNA分子的大小和构象等有关，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在紫外灯下被检测出来，D正确。 (一)澄清概念 1.判断下列叙述的正误 (1)PCR的引物为DNA片段并保留在子链中，细胞核内DNA复制所需引物为RNA片段，并且不保留在子链中。( ) (2)DNA分子的大小影响其在凝胶中的迁移速率。( ) (3)利用PCR扩增DNA片段时，在第一轮循环的变性之前，通常要用94 ℃的高温处理反应液5 min进行预变性。( ) (4)设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列。( ) 层级训练评价 √ × √ √ (二)落实知能 2.关于PCR扩增DNA片段和电泳检测扩增产物实验的描述中，不正确的是(　　) A.PCR过程需要Taq酶 B.PCR过程需要DNA连接酶 C.PCR扩增区域由2种引物来决定 D.不同大小的DNA在电场中迁移速率不同 √ 解析：PCR反应需要高温使DNA变性解旋，所以复制过程中要用热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)，A正确；PCR过程中用热稳定的DNA聚合酶来催化脱氧核苷酸的聚合，不需要DNA连接酶，B错误；PCR过程中DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物的3'端延伸DNA链，因此PCR扩增区域由2种引物来决定，C正确；不同大小的DNA在电场中的迁移速率不同，因此可通过电泳的方法检测扩增产物，D正确。 3.(2025·淮安月考)[多选]为优化目的基因(700 bp)的PCR条件，研究者设计不同的复性温度进行实验，产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图所示。据图分析，下列表述正确的是 (　　) A.对照组可用无菌蒸馏水代替模板DNA，其他成分相同 B.电泳条带的宽度、亮度与扩增产物大小呈正相关 C.复性温度的高低会影响PCR扩增产物的纯度 D.58 ℃是本实验中扩增该基因的最佳复性温度 √ √ √ 解析：实验设计应遵循对照原则与单一变量原则，故对照组可用无菌蒸馏水代替模板DNA，其他成分相同，A正确；PCR技术中，反应最终的电泳条带的宽度、亮度与PCR起始状态的模板DNA含量呈正相关，B错误；PCR扩增时，温度会影响PCR扩增产物的纯度，故复性温度的设定是成败的关键，C正确；据图可知，58 ℃条件下条带最宽，即PCR扩增产物中目的基因含量最多，故该温度是本实验中扩增该基因的最佳复性温度，D正确。 (三)迁移应用 4.[多选]免疫PCR是对微量抗原的一种检测方法。下图是利用该技术检测牛乳中微量抗生素的流程图：首先将抗体1固定在微板上，冲洗后加入待检的牛乳，再加入DNA标记的抗体2，进行PCR扩增，最后进行电泳检测，相关叙述错误的是(　　) A.抗体1和抗体2是由同一种浆细胞分泌的两种不同抗体 B.如果第三次冲洗不充分则有可能出现假阳性现象 C.图示中的DNA是牛乳基因中的DNA片段 D.PCR扩增产物的量与牛乳中抗生素的量呈负相关 √ √ √ 解析：每一种浆细胞只分泌一种抗体，则抗体1和抗体2是由不同种浆细胞分泌的两种不同抗体，A错误；免疫PCR利用的是PCR技术扩增“固定抗体1—抗生素—抗体2”上连接的DNA，如果第三次冲洗不充分，可能使残留的、呈游离状态的抗体2上的DNA也作为PCR的模板参与扩增，会出现假阳性现象，B正确；待检测的牛乳中可能含有牛乳腺细胞的DNA(其上含有牛乳基因的DNA片段)，若图示中的DNA用牛乳基因中的DNA片段，经过PCR扩增后的产物中，不仅有抗体2上的DNA扩增产物，还可能有牛乳中本身含有的牛乳基因片段的扩增产物，使检测结果偏大，C错误；免疫PCR是通过PCR技术扩增抗体2上连接的DNA，最后通过检测扩增产物——DNA的量来确定抗生素的量的方法。因此，PCR扩增产物的量与牛乳中抗生素的量呈正相关，D错误。 5.流感病毒是RNA病毒。检测流感病毒特异序列的方法常见的是荧光定量PCR。由于PCR反应模板仅为DNA，因此在进行PCR反应前，首先合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。在PCR反应体系中，包含一对特异性引物以及一个Taqman探针，该探针为一种寡核苷酸链，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。 (1)检测流感病毒的过程中，反应体系中应加入的酶是____________ ___________________________。 逆转录酶和热稳定的DNA聚合酶(Taq酶) 解析：由于PCR反应模板仅为DNA，因此在进行PCR反应前，先将流感病毒核酸RNA逆转录为cDNA，再以cDNA为模板，PCR扩增合成目的片段。所以检测流感病毒的过程中，反应体系中应加入的酶是逆转录酶和热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)。 (2)在检测过程中要用到两种引物，引物的作用是_____________ ________________________________。进行引物设计时需要注意的问题是_______________________________________________________ (答出2点即可)。  　引物长度要适宜、引物自身或两种引物之间不能存在互补序列 使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 解析：在检测过程中要用到两种引物，引物的作用是使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸；进行引物设计时需要注意的问题是引物长度要适宜、引物自身或两种引物之间不能存在互补序列。 (3)核酸检测过程中需要大量探针，若仅扩增探针这段单链，需要利用不对称PCR，即采用不等量的一对引物，经若干次循环后，低浓度的引物被耗尽，以后的循环只产生高浓度引物的延伸产物，结果产生大量的单链DNA。这两种引物分别为限制性引物与非限制性引物，其最佳比例一般为1∶50~1∶100。据此分析，下图中的引物___应该为非限制性引物。假设反应体系中原来有1个模板DNA分子，最初20个循环扩增产生双链DNA，后15个循环均只扩增一条链，则需要限制性引物_____个，需要非限制性引物_____个。  　224-1 1 　220-1 解析：由题意分析可知，图中的引物1应该为非限制性引物；假设反应体系中原来有1个模板DNA分子，最初20个循环扩增产生双链DNA，产生的DNA分子数为220个，最初的两条模板链不需引物，所以需要限制性引物220-1(个)；前20个循环需要非限制性引物的个数和限制性引物一样，也为220-1个，后15个循环，需要利用前20个循环扩增得到的DNA为模板，需要非限制性引物个数为220×15，所以一共需要非限制性引物个数为220-1+220×15=220×16-1=224-1(个)。 /课堂小结与随堂训练/ 一、知识体系构建 二、关键语句必背 1.聚合酶链式反应(PCR)技术所需条件：模板DNA、引物对、四种dNTP、缓冲液和热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)、Mg2+等。 2.PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。由于PCR过程在高温下进行，因此需要使用热稳定的DNA聚合酶。目的是通过指数式扩增获取大量的目的基因；前提是要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便合成引物。 3.DNA迁移速率取决于琼脂糖凝胶的浓度、迁移分子的形状及大小等。 三、素养好题训练 1.实时荧光RT-PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是在PCR退火过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT-PCR进行核酸检测的相关过程如下图所示。下列有关叙述错误的是(　　) A.该技术需要用到解旋酶和Taq酶 B.该技术的原理是DNA半保留复制 C.该技术过程中需加入一对碱基序列不互补的引物 D.若检测结果有荧光发出，说明被检测者可能感染了病毒 √ 解析：逆转录合成cDNA的过程中，反应体系中需要加入逆转录酶，在PCR技术中需要用到Taq酶，不需要解旋酶，A错误；该技术运用了DNA半保留复制的原理，B正确；该技术需要一对特异性的引物，要求一对引物的碱基序列不能互相配对，否则引物之间会相互结合，C正确；若检测结果有荧光发出，说明被检测者可能感染了病毒，D正确。 2.(2025·连云港模拟)[多选]琼脂糖凝胶电泳通常用于鉴定PCR产物，如图为电泳图谱，相关叙述正确的是 (　　) A.DNA分子所带电荷越多，在凝胶中的迁移速率越快 B.在一定条件下，电泳条带的宽度、亮度与PCR起始状态的模板DNA含量呈正相关 C.样品组出现图示结果可能是因为复性温度过低，引物浓度过高 D.通过与Marker对比，可知待测样品的大小，其核苷酸组成要进一步测定 √ √ √ 解析：在琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子在凝胶中的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，并不是DNA分子所带电荷越多，在凝胶中的迁移速率越快，A错误；在一定条件下，电泳条带的宽度、亮度与PCR起始状态的模板DNA含量呈正相关，B正确；复性温度过低、引物浓度过高，易导致引物与模板非特异性结合增强，出现多条杂带，与样品组电泳结果(多条带)相符，C正确；琼脂糖凝胶电泳只能分析DNA片段的大小，碱基的排列顺序要进行基因测序，D正确。 3.(2024·湖南高考)[多选]最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则。以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为原脱氧核苷三磷酸(dATP)，继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是 (　　) A.上述PCR反应体系中只加入一种引物 B.电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢 C.5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列 D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为G √ √ 解析：利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A正确。电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢，B错误。依据题干信息中双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中条带(DNA片段)的3'终端的碱基，如+ddATP的泳道中出现的条带(DNA片段)的3'终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，即对应的 DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3'→5'，如对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5'端第一个碱基为C。因此对照个体的测序结果为5'-CTACCCGTGAT-3'，患者的测序结果为5'-CTACCTGTGAT-3'，C正确。对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，D错误。 4.PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题： (1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是_________ (用序号表示)。  ④②③① 解析：利用PCR技术检测病原菌的步骤：采集病人组织样本→从病人组织样本中提取DNA→利用PCR扩增DNA片段→分析PCR扩增结果，即④②③①。 (2)操作③中使用的酶是____________________。PCR中的每次循环可分为变性、退火、_____三步，其中退火的结果是__________ _________________________。  　　 引物通过碱基互补配对与单链DNA结合 热稳定的DNA聚合酶 延伸 解析：利用PCR扩增DNA片段需要热稳定的DNA聚合酶；PCR反应中的每次循环可分为变性、退火、延伸三步，其中退火的结果是引物通过碱基互补配对与单链DNA结合。 (3)为了做出正确的诊断，PCR所用的引物应该能与___________特异性结合。  病原菌DNA 解析：在DNA复制中引物所起的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸，为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物必须与病原菌DNA碱基互补配对。 (4)PCR是______________的缩写。它是一项根据______________的原理，在生物体外大量快速扩增特定DNA片段的技术。PCR的产物常用_______________来鉴定。  　　琼脂糖凝胶电泳 聚合酶链式反应 DNA半保留复制 解析： PCR全称为聚合酶链式反应，是在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术；PCR依据的原理是DNA半保留复制，其产物DNA常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。 课时跟踪检测 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 一、选择题 1.在PCR中不会用到的是(　　) A.解旋酶 B.DNA聚合酶 C.脱氧核苷酸 D.引物 √ 解析：在PCR中不会用到的是解旋酶，PCR利用高温使作为模板的双链DNA解旋，A符合题意。 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 √ 2.(2025·苏州月考)下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是 (　　) A.二者子链的延伸方向相同，均为5'端→3'端 B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋 C.体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量 D.二者遵循的碱基互补配对原则相同 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 解析：DNA体内复制与利用PCR技术扩增DNA时，子链的延伸方向相同，均为5'端→3'端，A正确；PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，而是在高温条件下氢键断裂，B错误；DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时都需要能量，但两者所需能量来源不同，C正确；DNA体内复制与利用PCR扩增DNA时，遵循的碱基互补配对原则相同，D正确。 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 3.关于DNA片段的扩增及电泳鉴定实验，下列相关叙述正确的是 (　　) A.PCR仪实质上就是一台能自动调控温度的仪器，但在使用时需根据扩增的DNA片段以及引物的情况人工设定合适的温度 B.PCR反应体系中需加入热稳定的DNA聚合酶，该酶主要在退火过程中起作用 C.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水和移液器等在使用前都必须进行高压灭菌处理 D.电泳完成后，可直接观察凝胶中的DNA分子 √ 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 解析：PCR反应体系中需加入热稳定的DNA聚合酶，该酶主要在延伸过程中起作用，B错误；为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前都必须进行高压灭菌处理，移液器不需要高压灭菌，C错误；电泳完成后，凝胶中的DNA分子可通过凝胶成像仪或紫外透射仪观察，D错误。 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 √ 4.(2025·淮安月考)下图a、b、c均为PCR扩增的DNA片段，下列有关说法正确的是 (　　) A.片段a、b、c的长度均相同 B.片段a、b只是第一次循环的产物 C.片段c最早出现在第二次循环的产物中 D.经过30次循环后，片段c的数量为230 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 解析：图中片段a、b只有一种引物，是以原始DNA链为模板复制而来，其长度比片段c长，A错误。由于原始模板在每次循环中均可作为模板，则每次循环都能产生图中片段a、b，B错误。由于第一次循环的产物只有一种引物，而图中片段c有两种引物，则最早出现在第二次循环的产物中，C正确。经过30次循环后，得到的DNA片段总数为230，这包括图中的片段a、b、c，D错误。 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 √ 5.利用PCR技术分析粪便已成为珍稀野生动物种群调查的有效手段。同种生物不同个体在同源染色体某些位置上DNA片段长度存在差异，这些片段可作为辨别不同个体的依据。下列叙述错误的是 (　　) A.需去除粪便中微生物的DNA以免干扰实验结果 B.设计PCR引物时需要考虑物种特异性 C.反应体系中需加入四种脱氧核苷三磷酸作为原料 D.PCR获得的不同长度片段可通过电泳检测 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 解析：由于不同的生物DNA具有特异性，故利用PCR技术辨别不同个体时不需要去除粪便中微生物的DNA，A错误；引物是一段能与目的基因结合的核苷酸序列，设计PCR引物时需要考虑物种特异性，B正确；PCR是对目的基因进行扩增的技术，反应体系中需加入四种脱氧核苷三磷酸作为原料，C正确；PCR获得的不同长度片段可通过电泳检测，D正确。 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 √ 6.如图是PCR扩增过程的示意图，其中叙述错误的是 (　　) A.①②过程均不需要酶的参与 B.常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物 C.在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内的类似 D.该过程需要设计两种特异性的引物，要求这两种引物的序列互补 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 解析：①表示变性过程，双链DNA解旋在高温条件下进行，不需要酶的催化，②是退火过程，2条引物分别与单链DNA结合，也不需要酶的催化，A正确；不同的DNA片段在电泳时移动的速率不同，可以将PCR产物的电泳结果与标准DNA样品的电泳结果进行比对，从而鉴定PCR的产物，常采用琼脂糖凝胶电泳，B正确；PCR技术扩增DNA的原理是DNA半保留复制，在该过程中DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似，C正确；该过程需要一对特异性的引物，要求一对引物的序列是不互补的，否则会形成引物二聚体，进而影响目的基因的扩增，D错误。 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 7.(2025·镇江月考)应用农杆菌转化法时，目的基因插入T-DNA后，需要对T-DNA测序。测序前根据目的基因的序列设计引物对T-DNA进行PCR扩增的过程如图所示，下列说法正确的是(　　) 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 A.实验需要清楚目的基因的全部碱基序列 B.L、R酶切位点需要在T-DNA外侧，且需用同种限制酶切割 C.引物设计时需要考虑目的基因两侧序列，选择引物b、c D.1个环状DNA分子首次PCR后得到的DNA分子含有两个游离的 磷酸基团 √ 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 解析：实验只需要清楚目的基因两侧的碱基序列，以便设计引物，A错误；L、R酶切位点需要在T-DNA内侧，且需用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割，B错误；引物设计时需要考虑目的基因两侧序列，选择引物a、d对T-DNA进行PCR扩增，C错误；1个环状DNA分子首次PCR后得到的DNA分子为链状，含有两个游离的磷酸基团，D正确。 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 8.(2025·常州模拟)[多选]下图1表示限制酶SpeⅠ、XbaⅠ的识别序列和切割位点，图2表示基因P(960 bp)、基因Q(840 bp) 的限制酶SpeⅠ或XbaⅠ的酶切图谱和融合基因，图3表示几种基因经限制酶SpeⅠ或XbaⅠ处理后进行电泳(电泳条带表示特定长度的DNA片段)得到的带谱图，下列相关分析正确的是 (　　) 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 A.基因P经限制酶SpeⅠ处理后进行电泳的结果与图3中的Ⅰ相符合 B.基因Q经限制酶XbaⅠ处理后进行电泳的结果与图3中的Ⅱ相符合 C.融合基因经限制酶SpeⅠ处理后进行电泳的结果与图3中的Ⅲ相符合 D.融合基因经限制酶XbaⅠ处理后进行电泳的结果与图3中的Ⅳ相符合 √ √ √ 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 解析：根据图2所示，基因P上有限制酶SpeⅠ的一个酶切位点，基因P的总长度960 bp，所以经酶切后可以得到两个小于960的片段，图3中的Ⅰ符合酶切后的基因P，同理，图3中的Ⅱ符合酶切后的基因Q，A、B正确；由图1可知，融合基因中没有限制酶SpeⅠ和限制酶XbaⅠ的酶切位点，所以用这两种酶处理融合基因，融合基因不会断开，因此处理之后只有一个片段，与图3中的Ⅳ相符合，C错误，D正确。 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 二、非选择题 9.PCR是聚合酶链式反应的缩写，是一项在体外提供参与DNA复制的组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。下图为PCR获取并扩增目的基因的示意图，引物的3'端有结合模板DNA的关键碱基，5'端碱基无严格限制。据图回答下列问题： 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 (1)PCR的原理是________________，PCR过程中所用的酶是__________________________。  　热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)　 DNA半保留复制 解析：PCR的原理是DNA半保留复制，PCR过程中所用的酶是热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)。 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 (2)PCR的每次循环一般包括__________________三步，在PCR过程中，新合成的DNA子链的延伸方向是__________，PCR获取目的基因时；在第___次循环后反应体系中可出现目的基因。  　3 变性、退火、延伸 　5'端→3'端 解析： PCR的每次循环一般包括变性、退火、延伸三步，在PCR过程中，新合成的DNA子链的延伸方向是5'端→3'端；利用图示片段通过PCR获取目的基因时，在第3次循环后反应体系中可出现目的基因。 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 (3)PCR获取目的基因时，引物的作用是_________________________ __________________________________________________________。 为了方便目的基因与质粒的连接，可在引物的____端添加限制酶识 别序列。若引物上的限制酶识别序列为　CCCGGG，在用一种酶连接目的基因与质粒时，所用的酶为______________。  ↓ 　　T4 DNA连接酶 界定目的基因，为DNA聚合酶提供结合位点并使DNA聚合酶能够从引物的3'端连接脱氧核苷酸 5' 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 解析： PCR获取目的基因时，引物的作用是界定目的基因，为DNA聚合酶提供结合位点并使DNA聚合酶能够从引物的3'端连接脱氧核苷酸。为了方便目的基因与质粒的连接，可在引物的5'端添加限制酶识别序列，使目的基因和载体能够产生相同的黏性末端。若引物上的限制酶识别序列为CCCGGG，则被限制酶切割后形成平末端，在用一种酶连接目的基因与质粒时，所用的酶为T4 DNA连接酶。 ↓ 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 (4)科学设计引物是PCR能否成功的关键。若引物的碱基过多或引物的G、C含量过高，会造成PCR的效率偏低，收获的目的基因较少，原因是___________________________________________________________ ______。  若对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现有两个或多个条带，从引物角度分析，原因可能是______________________________。  　引物过短导致引物的特异性下降 引物与模板链结合过于紧密，变性时引物不易与模板链脱离(影响变性) 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 解析：科学设计引物是PCR能否成功的关键。若引物的碱基过多或引物的G、C含量过高，会造成PCR的效率偏低，收获的目的基因较少，原因是C、G之间含有3个氢键，引物与模板链结合过于紧密，变性时引物不易与模板链脱离(影响变性)。若对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现有两个或多个条带，从引物角度分析，原因可能是引物过短导致引物的特异性下降，错误配对导致扩增片段出错。 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 10.如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoRⅠ酶切为例)： 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 请据图回答问题： (1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种_____ ___________________酶，它通过识别特定的_________________切割特定位点。  　(脱氧)核苷酸序列 限制性内切核酸(或限制) 解析：根据题图可知，步骤Ⅰ是获取 目的DNA片段，所用的酶EcoRⅠ是一种限制酶，其能识别特定的(脱氧)核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个(脱氧)核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 (2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3'-羟基与5'-磷酸间形成___________；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得__________；Taq酶的作用是催化_____________ ______________。  　 以DNA为模板的DNA链的延伸 磷酸二酯键 　DNA单链 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 解析：步骤Ⅱ是将目的DNA片段连接成环状，其中DNA连接酶的作用是催化相邻核苷酸之间的3'-羟基和5'-磷酸间形成磷酸二酯键。PCR循环中，升高温度到95 ℃是为了打开氢键使双链解旋，获得DNA单链，Taq 酶的作用是催化游离的脱氧核苷酸连接到引物3'端，合成DNA子链。 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 (3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是______ (从引物①②③④中选择，填编号)。    DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列) 已知 序列 PCR 引物 ②④ 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 解析：引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始延伸DNA子链，因为DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸，故为扩增未知序列，选择的与模板链相结合的引物应为5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'(引物④)和5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3'(引物②)。 1 5 6 7 8 9 10 2 3 4 (4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是____。  A.5'-AACTATGCG……AGCCCTT-3' B.5'-AATTCCATG……CTGAATT-3' C.5'-GCAATGCGT……TCGGGAA-3' D.5'-TTGATACGC……CGAGTAC-3' B 解析：分析题意可知，片段F的两端为限制酶EcoRⅠ切割后产生的黏性末端，因此其5'端序列应为AATT-，3'端序列应为-TTAA，B正确。 本课结束 更多精彩内容请登录：www.zghkt.cn $